Summary
تقدم هذه الدراسة نموذجا حيوانيا كبيرا قابلا للاستنساخ للغاية لإصابة نقص التروية الكلوية في الخنازير باستخدام انسداد ثنائي ثنائي مؤقت للقسطرة بالون عن طريق الجلد للشرايين الكلوية لمدة 60 دقيقة وإعادة التروية لمدة 24 ساعة.
Abstract
ترتبط الإصابات الكلوية الحادة بارتفاع خطر الإصابة بالمراضة والوفيات بعد الجراحة. إصابة الإسكيمية والتشويش (IRI) هي السبب الأكثر شيوعا ل AKI. لمحاكاة هذا السيناريو السريري، تقدم هذه الدراسة نموذجا حيواني كبير قابل للاستنساخ للغاية من IRI الكلوي في الخنازير باستخدام انسداد ثنائي ثنائي عن طريق الجلد مؤقت للقسطرة بالون من الشرايين الكلوية. يتم انسداد الشرايين الكلوية لمدة 60 دقيقة عن طريق إدخال قسطرات البالون عبر الشريان الفخذي وال السباتي ودفعها إلى الجزء القريب من الشرايين. يتم حقن التباين Iodinated في الشريان الأورطي لتقييم أي عتامة في الأوعية الكلوية وتأكيد نجاح انسداد الشريان. ويؤكد ذلك كذلك من خلال تسطيح شكل الموجات النبضية في طرف قسطرة البالون. يتم تفريغ البالونات وإزالتها بعد 60 دقيقة من انسداد الشريان الكلوي الثنائي ، ويسمح للحيوانات بالتعافي لمدة 24 ساعة. في نهاية الدراسة ، يزداد الكرياتينين البلازما ونيتروجين اليوريا في الدم بشكل كبير ، في حين ينخفض إنتاج eGFR والبول بشكل كبير. الحاجة إلى التباين iodinated هو الحد الأدنى ولا يؤثر على وظيفة الكلى. الانسداد الشريان الكلوي الثنائي يحاكي بشكل أفضل السيناريو السريري لنقص التروية الكلوية في العراء ، ويقلل النهج عن طريق الجلد من تأثير الاستجابة الالتهابية وخطر العدوى التي ينظر إليها بنهج مفتوح ، مثل استئصال البطن. القدرة على إنشاء وإعادة إنتاج هذا النموذج الخنازير ذات الصلة سريريا يخفف من الترجمة السريرية للبشر.
Introduction
إصابة الكلى الحادة (AKI) هي حالة يتم تشخيصها عادة بين المرضى الجراحيين المرتبطين بالمراضة والوفيات الكبيرة1،2. وتظهر البيانات المتاحة أن AKI يمكن أن تؤثر حتى على نصف جميع المرضى في المستشفيات في جميع أنحاء العالم ويؤدي إلى 50٪ معدل الوفيات في المرضى في وحدة العناية المركزة1،3. على الرغم من انتشاره المرتفع، لا يزال العلاج الحالي ب AKI يقتصر على الاستراتيجيات الوقائية، مثل إدارة السوائل وغسيل الكلى. لذلك ، هناك اهتمام مستمر باستكشاف العلاجات البديلة ل AKI4و5و6.
AKI تصنف عادة إلى ما قبل الكلوي، الجوهرية، وبعد الكلوية على أساس المسبباتلها 4،5،6. ترتبط غالبية المرضى الجراحيين الذين يعانون من AKI بأسباب ما قبل الكلى بسبب نقص الدم ، مما يؤدي إلى إصابة نقص التروية -reperfusion (IRI) للكلى2. سريريا, انخفاض انتاج البول, وزيادة مستويات الكرياتينين بسبب انخفاض وظيفة الكلى. الكلى هي عضو عالي معدل الأيض وعرضة للكيمياء. نموذج حيواني كبير قابل للاستنساخ للغاية من IRI الكلوي ضروري للحصول على رؤية أفضل في الفيزيولوجيا المرضية ل AKI ونهجها العلاجية المحتملة5.
لمحاكاة السيناريو السريري لنقص التروية الكلوية في الفترة المحيطة بال المنطوق ، يعتبر نموذج انسداد الشريان الكلوي الثنائي مناسبا. النماذج الموصوفة سابقا التي تنطوي على انسداد الشريان الكلوي من جانب واحد مع أو بدون استئصال الكلى الكونترالاتال لا توفر ما يكفي من التطبيق السريري7،8. على الرغم من أن هذه النماذج كافية للتسبب في AKI، فإنها لا تشبه سيناريوهات الحياة الحقيقية السريرية لا من حيث نوع ولا مدة الإصابة.
الهدف من هذه الورقة هو تقديم نموذج porcine من انسداد مؤقت ثنائي عن طريق الجلد من الشرايين الكلوية عن طريق انسداد بالون القسطرة تحت تصوير الأوعية. انسداد الشريان الكلوي الثنائي يحاكي السيناريو السريري لنقص التروية الكلوية ، يليه الإزالة اللاحقة للبالون لإعادة التروية9،10. يتم وصف الخطوات التقنية، بما في ذلك القسطرة، وتوجيه القسطرة، وتصوير الأوعية، ورصد الدورة الدموية. هذا الأسلوب لا يسمح فقط لانسداد الشرايين الكلوية التي تسيطر عليها للغاية ويمكن تكرارها، ولكن النهج عن طريق الجلد يقلل من تأثير الاستجابة الالتهابية عن طريق الحد من كمية من إهانة للجسم مقارنة بنهج مفتوح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع الدراسات الحية وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة بشأن رعاية الحيوانات واستخدامها ووافقت عليها لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في مستشفى بوسطن للأطفال (البروتوكول 18-06-3715). وتلقى جميع الحيوانات رعاية إنسانية امتثالا لدليل رعاية واستخدام المختبر. يوضح الشكل 1 الجدول الزمني بما في ذلك التخدير والتحضير الجراحي والنقاط الزمنية لقياسات النتائج الأولية لهذه الدراسة.
1. الحث والتخدير والتنبيب
- لمنع الإجهاد وعدم الراحة لا لزوم لها، وتخدير الخنازير عن طريق الحقن العضلي من خليط من tiletamine / zolazepam 4-6 ملغ / كغ وxylazine 1.1-2.2 ملغ / كغ، فضلا عن isoflurane 3٪ باستخدام قناع الوجه.
- كانول الوريد الأذن للحصول على الوصول الوريدي مع قنية 20 G IV بعد تطهير المنطقة مع الإيثانول 95٪. بدء ضخ الصيانة (0.9٪ NaCl في 5 مل / كجم / ساعة).
- قم بتنبيب الخنزير بأنبوب القصبة الهوائية (مقاس 7 للخنازير التي تزن 40-50 كجم) بمجرد التأكد من كفاية التخدير. أداء بالون التهوية مع تردد 12 نفسا / دقيقة ونقل الخنزير إلى غرفة العمليات.
- ضع الحيوان على طاولة العمليات في وضعية النهم. ابدأ فورا تهوية الضغط الإيجابي الميكانيكية مع FiO2 0.50، 10 مل/كجم حجم المد والجزر، وتردد 12 نفسا / دقيقة تحت capnography المستمر.
- ضع مقياس أكسدة النبض على الأذن أو الشفة السفلية لمراقبة مستمرة.
- الحفاظ على normothermia (37 درجة مئوية) باستخدام وسادة الهواء ساخنة.
- للحفاظ على التخدير العام، حافظ على إدارة الأيزوفلوران عند 0.5-4٪ من خلال أنبوب القصبة الهوائية. طوال العملية، مراقبة تخطيط القلب باستمرار، ضغط الدم الشرياني، درجة الحرارة، والكابنوغرافيا لقياس عمق التخدير.
- أدخل قسطرة فولي للتحقق من حالة السائل للحيوان ومراقبة إخراج البول عن طريق جمع البول في كيس الصرف الصحي.
ملاحظة: يفضل الخنازير الإناث على الذكور بسبب السمات التشريحية لمجرى البول الذي يسمح أسهل القسطرة.
2. التحضير الجراحي والوصول إلى الأوعية الدموية
- ستارة الحيوان بطريقة عقيمة.
- تطهير المنطقة الجانبية اليمنى من الرقبة عن طريق تطبيق بيتادين ثم 95٪ الإيثانول لمدة 3 مرات.
- إجراء خفض القسطرة الشريان السباتي الأيمن والوريد الوداجي الأيمن. تراجع عن العضلة القصية الجانبية وتشريحها وصولا إلى الشريان السباتي الأيمن والوريد الوداجي الأيمن.
- أدخل غمد تصوير الأوعية 5F في كل من الشريان والوريد. تأمينه مع خياطة الحرير 2-0.
- أدخل غمد تصوير الأوعية 5F باستخدام تقنية Seldinger في الشريان الفخذي الأيسر.
- لإجراء تقنية Seldinger ثقب الشريان الفخذي باستخدام إبرة جوفاء. أدخل سلكا إرشاديا ناعما من خلال التجويف وتقدمه إلى الشريان الفخذي.
- عقد الدليل آمنة مع اليد أثناء إزالة الإبرة. تمرير غمد تصوير الأوعية عبر الدليل في الشريان الفخذي وسحب الدليل. استخدام التوجيه بالموجات فوق الصوتية، إذا لزم الأمر.
3. تحريض إصابة نقص التروية الكلوية
- إعطاء 200 وحدة IU/kg هيبارين الصوديوم عن طريق الوريد لتحقيق تخثر الجهازية (الهدف تنشيط وقت التخثر (ACT) > 300 ثانية).
- إجراء تصوير الأوعية عن طريق حقن عامل تباين يوديناتيد تحت تنظير الفلور لتحديد الشرايين الكلوية.
ملاحظة:لتقليل خطر السمية الكلوية الناجمة عن التباين، قم بتخفيف عامل التباين iodinated في محلول 1:1 مع المالحة العادية. جدولة الجرعة لجميع الحيوانات لضمان الجرعات المكافئة. - تحديد الشرايين الكلوية، وتقدم يدويا في الدليل القسطرة التوجيهية.
- ضع القسطرة التوجيهية 5F JL4 في الشريان الكلوي الأيسر عبر الشريان السباتي الأيمن (الشكل 1A).
- وضع القسطرة التوجيهية الثانية 5F JL4 في الشريان الكلوي الأيمن من خلال الشريان الفخذي الأيسر (الشكل 1A).
- استخدم الأسلاك الإرشادية لتوجيه قسطرة تزلطية 5F عن طريق الجلد (PTA) في كل شريان كلوي.
ملاحظة: من الأفضل وضع البالون في الشريان الكلوي القريب بحيث لا تترك فروع أو ضمانات الشريان الكلوي براءة اختراع بعد تضخم البالون. - ضع كل قسطرة بالون في مكانها وربط خط ضغط بكل قسطرة.
- تحقق من وجود أشكال موجية للنبض الشرياني في شاشة الضغط لضمان تحديد الموضع الصحيح للقسطرة.
- تضخيم كل بالون وتهدف لضغط ما يقرب من 2.5 أجهزة الصراف الآلي داخل البالون(الشكل 1B).
- لتأكيد توقف تدفق الدم إلى الكلى مراقبة تسطيح الموجي نبض في غيض من قسطرة البالون.
- حقن المتوسطة التباين iodinated (1:1 التخفيف) والتحقق من أي عتامة الأوعية الكلوية.
ملاحظة: من الممكن أيضا ملء البالون بعامل تباين iodinated لتصور البالون المتضخم. ومع ذلك، هذه الطريقة ليست حساسة مثل تسطيح شكل الموجات النبضية لتأكيد انسداد الشرايين الكلوية. - بعد 60 دقيقة من انسداد، تفريغ بعناية وإزالة القسطرة بالون من الشرايين الكلوية.
- إجراء تصوير الأوعية (باستخدام 1:1 المتوسطة النقيض المخفف) لتأكيد الشبع الشريان الكلوي وإنشاء التروية الكلوية(الشكل 1C).
- إزالة غمد تصوير الأوعية 5F من الشريان الفخذي الأيسر.
- تطبيق ضغط ثابت في موقع القسطرة لمدة 30 دقيقة.
- عكس تأثير الهيبارين عن طريق إدارة البروتامين (3 ملغم / كغ) حتى تطبيع ACT.
- لعينة البول خلال فترة ما بعد الجراحة، قم بتأمين أنبوب إلى قسطرة فولي مع خياطة حريرية 2-0 باستخدام غرزة متقطعة على الجلد.
- اترك أغماد تصوير الأوعية في الشريان السباتي الأيمن والوريد الوداجي الأيمن في مكانه وآمنها بخياطة حريرية 2-0 باستخدام غرزة متقطعة للسماح بأخذ عينات الدم طوال الدراسة.
- أغلق شق الرقبة بخياطة حرير 2-0 باستخدام غرزة مستمرة في طبقتين.
- قم بإعطاء bupivacaine (3 ملغم/كغ) في موقع الشق لتقليل الألم.
- استمر في ترطيب الحيوان بنسبة 0.9٪ من NaCl بمعدل 5 مل/كجم/ساعة لما مجموعه 2 ساعة بعد نهاية الإقفارية.
- ضع رقعة الفنتانيل (25-50 ميكروغرام / ساعة) على الجزء الخلفي من الحيوان لتقليل الألم بعد الجراحة.
- إعطاء حقنة عضلية من البوبرينورفين (0.005-0.1 ملغم /كغ) لتقليل الألم بعد العملية الجراحية.
- مراقبة الحيوان والحفاظ عليه على التهوية الميكانيكية حتى الاستيقاظ.
4. استعادة الحيوان
- بعد الاستيقاظ، استيعاب الحيوان في غرفة التحكم في درجة الحرارة.
- الاستمرار في تحويل الحيوان من جانب جانبي واحد إلى آخر حتى يستعيد وعيه الكامل والقدرة على الالتهاب.
- توفير المياه والغذاء الإعلانية libitum.
5. التقييم الوظيفي
- جمع عينات الدم والبول وفقا للبروتوكول المطلوب.
ملاحظة:في هذه الدراسة، تم تعيين النقاط الزمنية التالية: خط الأساس (1 ساعة بعد بدء بروتوكول الترطيب وقبل انسداد الشرايين الكلوية)، ونهاية نقص التروية، والتشويش (2 ساعة، 6 ح، 24 ساعة). - جمع عينات الدم الشرياني وال وريدي. تخزينها في الهيبارين الليثيوم أو EDTA vacutainers المغلفة للتحليل اللاحق.
ملاحظة:ارسم الدم مباشرة من القسطرة في الشريان السباتي والوريد الوداجي. - جمع عينات البول من القسطرة فولي وتخزينها في أنابيب 15 مل للتحليل.
ملاحظة:جمع البول من كيس الصرف الصحي متصلة القسطرة فولي. - لتحديد إخراج البول، إفراغ كيس الصرف وجمع البول لمدة ساعة واحدة.
ملاحظة:بالنسبة للنقطة الزمنية 6 ساعة التي لا يتم فيها توصيل كيس الصرف بقسطرة فولي، أغلق الأنبوب المتصل بقسطرة فولي لمدة 30 دقيقة ثم اجمع البول بحقنة سعة 60 مل لتحديد إخراج البول.
6. القتل الرحيم
- بعد نهاية فترة التروية، قم بإجراء التخدير والمراقبة كما هو موضح أعلاه.
- استمر في الترطيب بنسبة 0.9٪ من الناقل عند 5 مل/كغ/ساعة.
- استخدم القسطرة الشريانية وال وريدية لأخذ عينات الدم وقسطرة فولي لتحديد إخراج البول. جمع عينات الدم والبول النهائي وحساب انتاج البول.
- إجراء شق استئصال البطن خط الوسط 15 سم باستخدام حجم 10 شفرة من xiphoid وصولا الى الحوض منتصف.
- استخدم متراجعا الجانبي المستقيم لسحب جلد البطن.
- تشريح المرفقات الصفاق الجانبية لجدار البطن لفضح الرجعية اليمنى واليسارية.
- تحديد وتشريح بصراحة كل من الشرايين الكلوية والأوردة.
- Ligate كل من الشرايين الكلوية والأوردة مع خياطة الحرير 2-0 وإجراء استئصال الكلية الثنائية لجمع عينات الأنسجة الكاملة للتحليل النسيجي والأيضي.
- قتل الحيوان باستخدام الطريقة المفضلة للقتل الرحيم (على سبيل المثال، الإستئصال، البنتوباربيتال)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التحليل الوظيفي
النتائج التمثيلية لهذه الدراسة تنشأ من 6 والبيانات المعروضة هي متوسط ± خطأ قياسي في المتوسط. يتم تقييم وظيفة الكلى عن طريق تحديد إخراج البول، ومعدل الترشيح الكبيبي المقدر (eGFR)، والكرياتين البلازما، ونيتروجين اليوريا في الدم (BUN). يتم تقييم المؤشرات الحيوية للوظيفة الكلوية باستخدام محلل كيمياء محمول. يتم حساب eGFR وفقا للصيغة التالية: eGFR = 1.879 × BW1.092/ PCr0.6 (BW: وزن الجسم بالكيلوغرام؛ PCr: الكرياتينين البلازما في ملغم / ديسيلت)10,11.
بعد 60 دقيقة من انسداد الشريان الكلوي الثنائي، انخفض إنتاج البول بشكل كبير من 3.6 مل/كجم/ساعة ± 0.5 مل/كجم/ساعة إلى 0.2 مل/كجم/ساعة ± 0.1 مل/كجم/ساعة (ص < 0.01). وظل هذا الانخفاض كبيرا عند 6 ح (1.2 مل/كغ/ساعة ± 0.1 مل/كغ/ساعة؛ p = 0.02 مقابل خط الأساس) و24 ساعة (1.3 مل/كغ/ساعة ± 0.4 مل/كغ/ساعة؛ ص = 0.02 مقابل خط الأساس) بعد إعادة التروية. وبالمثل، لوحظ انخفاض كبير في eGFR، التي انخفضت من 2.5 مل/كغ/ساعة ± 0.1 مل/كغ/ساعة عند خط الأساس إلى 1.7 مل/كغ/ساعة ± 0.1 مل/كغ/ساعة (p < 0.001) في نهاية الإقفارية وإلى 1.5 مل/كغ/ساعة ± 0.1 مل /kg/h (< 0.001)، و1.2 مل/كغ/ساعة ± 0.1 مل/كغ/ساعة (ص < 0.001) و0.9 مل/كغ/ساعة ± 0.1 مل/كغ/ساعة (ص < 0.001) عند 2 ساعة، 6 ساعة و 24 ساعة reperfusion، على التوالي (الشكل 2A-B).
وزاد الكرياتينين البلازما بشكل ملحوظ في 2 ساعة (2.7 ملغم / ديسيلتر ± 0.2 ملغ / ديسيلتر; ص < 0.01), 6 ح (3.7 ملغم / ديسيلتر ± 0.3 ملغم / ديسيلتر; ص < 0.001) و 24 ساعة (5.6 ملغم/ديسيلتر ± 0.7 ملغم/ديسيلتر؛ ص < 0.001) من التروية مقارنة بخط الأساس (1.1 ملغم/ديسيلتر ± 0.1 ملغم/ديسيلتر). كان BUN 6.5 ملغم/ديسيلتر ± 0.8 ملغم/ديسيلتر عند خط الأساس وارتفع إلى 17.8 ملغم/ديسيلتر ± 3.3 ملغم/ديسيلتر (ص < 0.. 001) و 36.2 ملغم/ديسيلتر ± 2.9 ملغم/ديسيلتر (ص < 0.001) عند 6 و24 ساعة من التروية، على التوالي (الشكل 2C- D).
التشريح الإجمالي وعلم الأنسجة
كانت هناك مناطق نخرية ونزيفية واضحة تم توزيعها بشكل غير متساو في كل من الكليتين في نهاية 60 دقيقة من نقص التروية الكلوية الثنائية و 24 ساعة من التروية(الشكل 3A). كشف تلطيخ ثلاثي الألوان في ماسون عن نخر تخثري التقاءي كان موجودا في الأنابيب القريبة من قشرة الكلى. (الشكل3ب). كما تم تقييم الأقسام البلاستيكية المضمنة (1 ميكرومتر) لأنها توفر تفاصيل هامة عن الأنسجة(الشكل 3C). تم تقييم جميع الشرائح Trichrome ماسون لنخر الخلية، وفقدان الحدود فرشاة، وتشكيل المدلى بها، وتمدد أنبوبي. ثم تم تنفيذ نظام تسجيل شبه كمي لنخر أنبوبي حاد (ATN) على النحو التالي: 0 إن لم يكن؛ 0 إذا لم يكن أي منها؛ 0 إذا لم يكن هناك أي وظيفة. 1 إذا كان أقل من 10٪؛ 2 إذا كان بين 11٪ -25٪؛ 3 إذا كان بين 26٪ - 45٪؛ 4 إذا كان بين 46٪ -75٪؛ و5 إذا كان أكبر من 76٪. وأظهرت ATN سجل إصابة كبيرة في قشرة الكلى (درجة 4.5 ± 0.3) وإصابة كبيرة في النخاع (درجة 2.7 ± 0.4).
الشكل 1. وصف النموذج التجريبي. (أ) تم تخدير الخنازير يوركشاير الإناث (40-60 كجم) وتنبيبها. تم قسطرة الشريان الفخذي الأيسر والشريان السباتي الأيمن بغمد تصوير الأوعية 5F. كما تم وضع خطوط وريدية وابريقية وقسطرة بولية فولي. تم إجراء قسطرة انتقائية للشرايين الكلوية باستخدام قسطرة إرشادية متعددة الأغراض 5F. (ب) تم إجراء انسداد الشرايين الكلوية باستخدام قسطرة تجويف 5F عبر الجلد (PTA) تضخمت في الجزء القريب من الشريان الكلوي ، مما أدى إلى انسداد تدفق الدم إلى الكلى لمدة 60 دقيقة. تم الحصول على تأكيد الانسداد عن طريق حقن وسيط التباين iodinated في الشريان الأورطي والتحقق من أي عتامة في أوعية الكلى. (ج) بعد 60 دقيقة من الانسداد، تم تفريغ البالونات وإزالتها بعناية. تم إجراء تصوير الأوعية لتأكيد الشبع الشريان الكلوي وإنشاء التروية الكلوية. ثم سمح للحيوانات بإعادة صياغة الكلى في ظل ظروف فسيولوجية لمدة 24 ساعة التالية وتم قتلها بالرصاص في وقت لاحق. تم جمع عينات الدم والبول مباشرة قبل وبعد نقص التروية الكلوية الثنائية، في 2 و 6 و 24 ساعة بعد انسداد (النقاط الزمنية المشار إليها مع مثلثات). وقد تم تعديل هذا الرقم من دولميس وآخرون11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. وظيفة الكلى قبل وبعد إصابة نقص التروية الكلوية. (أ) إخراج البول؛ (ب) معدل الترشيح الكبيبي المقدر (eGFR)؛ (ج) الكرياتينين البلازما و (د) نيتروجين اليوريا الدم (BUN). يتم عرض كافة النتائج على أنها متوسط انحراف معياري لكل نقطة زمنية. ويمكن رؤية انخفاض كبير في إخراج البول وeGFR بعد إصابة نقص التروية- reperfusion. وفقا لذلك، لوحظ زيادة كبيرة في الكرياتينين البلازما وBUN. تم تحليل البيانات من خلال تدابير متكررة في اتجاهين ANOVA مع معدل اكتشاف بنياميني وهوشبرغ الزائف (n =6). *p < 0.05 مقابل الأساس؛ **p < 0.01 مقابل خط الأساس؛ p < 0.001 مقابل خط الأساس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تشريح الكلى الإجمالي وإصابة الأنسجة الكلوية في 24 ساعة من التروية بعد إصابة نقص التروية الكلوية. (أ) التشريح الإجمالي للكلى اليسرى التي تظهر مناطق شاحبة تدل على احتشاء ومناطق نزفية حمراء بعد 60 دقيقة من انسداد الشريان الكلوي الثنائي و 24 ساعة من التروية. (ب) القشرة الكلوية للسيارة يظهر نخر التخثر واسعة من الأنابيب القريبة في المقام الأول، بعد 60 دقيقة من نقص التروية و 24 ساعة من التخثر (تريكروم ماسون، التكبير الأصلي 20x). (ج) هذه 1 ميكرومتر من البلاستيك (araldite-epon) الأجزاء المضمنة توضح بمزيد من التفصيل نخر أنبوبي التقاء تتكون في المقام الأول من مصفوفة مع تورم والتغيرات التنكسية من العضيات (Toluidine الأزرق، التكبير الأصلي 40x). شريط المقياس = 200 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من دولميس وآخرون11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AKI هو اضطراب سريري شائع يؤثر على ما يصل إلى 50٪ من المرضى البالغين في المستشفى في جميع أنحاء العالم6،12. وهناك حاجة إلى نموذج حيواني ذي صلة سريريا لمواصلة التحقيق في الفيزيولوجيا المرضية للمرض والأهداف العلاجية المحتملة. على الرغم من أن هناك العديد من نماذج مورين تكرار AKI، وهذه لا تحاكي تماما سيناريوهات السريرية الخاصة بهم وتشريح الكلى البشرية. تقترح هذه الدراسة نموذج الخنازير ذات الصلة سريريا للسماح للترجمة إلى البشر13.
هنا، يصف البروتوكول نهجا عن طريق الجلد لا يكون مناسبا سريريا فحسب، بل يقلل أيضا من الاستجابة الالتهابية وخطر العدوى التي تصاحب النهج المفتوح. وينبغي أيضا أن يسلط الضوء على أن بروتوكول الترطيب متسقة ينبغي أن تستخدم لجميع الحيوانات من أجل تحقيق السيطرة المثلى على الهمودية وتجنب نقص الترويةالكلوية 11. ويمكن القيام بذلك بسهولة عندما يتم تخدير الحيوان ولكن لا يمكن دائما أن يؤديها بدقة خلال فترة الانتعاش عندما يتم توفير المياه libitum الإعلانية.
وينبغي استخدام المتوسطة التباين Iodinated بحذر من أجل تجنب السمية الكلوية الناجمة عن التباين. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق تخفيف 1:1 أو 1:2 مع المالحة العادية. في هذه الدراسة، استخدمنا جرعة أقل بعشر مرات من عتبة السلامة المقدرة للبشر (3.33 مل/كجم)9و14.
من بين أمور أخرى، تستخدم الدراسة eGFR لتقييم وظيفة الكلى على أساس صيغة المحاسبة لوزن الجسم ومستويات الكرياتينين البلازما10،11. وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن استخدام الإنولين لتحديد GFR قد تم توثيقه سابقا ، فقد تم تأجيل استخدامه في البروتوكول الحالي بسبب رد الفعل الوعائي القصور الشديد بعد ضخ الإنولين. ويمكن تجنب ذلك باستخدام المنشطات أو الإبينفرين قبل إدارة إينولين. ومع ذلك ، قد لا يكون استخدام هذه الأدوية مناسبا وفقا لكل تصميم دراسة. لهذا السبب، تم استخدام صيغة التحقق من صحة لتقدير eGFR على أساس الكرياتينين البلازما ووزن الجسم11. وهناك طريقة بديلة لتحديد GFR يكون استخدام الصيغة: (البول الكرياتينين x معدل تدفق البول) / (البلازما الكرياتينين x وزن الكلى).
لتقييم درجة ATN ، فإن استخدام تلطيخ Trichrome من Masson أفضل من تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوسين التقليدي لأنه يمكن أن يتتبع إصابة الأنسجة بشكل أفضل. بديل آخر قد يكون استخدام الأقسام المضمنة البلاستيكية ، والتي توفر تفاصيل أكبر لأنها تسمح بتقطيع أرق للعينة11. يمكن استخدام هذا النموذج قبل السريري ل AKI لمحاكاة العديد من السيناريوهات السريرية مثل زرع الكلى ، نقص التروية الكلوية بعد الصدمة القلبية (على سبيل المثال ، احتشاء عضلة القلب ، تمزق تمدد الأوعية الدموية ، تشريح الأبهر) ، إجراءات التحويل عبر القسطرة المعرضة لخطر كبير من نقص التروية الكلوية وإجراءات القلب والأوعية الدموية مع فترات اعتقال القلب والشرايين لفترات طويلة.
هذه الدراسة لديها بعض القيود. واستخدمت الدراسة الحيوانات الإناث فقط. وقد تم ذلك للحد من أي آثار محتملة تتعلق قسطرة البولية، والتي هي أقل صدمة في الإناث من الذكور. بالإضافة إلى هذا القيد، استخدمت الدراسة شابة وصحية، وبالتالي القضاء على المتغيرات المحيرة التي قد تكون مرتبطة بالأمراض المتعايشة. في الختام، تصف الدراسة الحالية نموذجا حيواني كبير قابل للاستنساخ للغاية من IRI الكلوي، والذي يمكن استخدامه لتقليل عبء AKI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
ونود أن نشكر الدكتور آرثر نيدر على مساعدته وتوجيهاته. وقد دعم هذا العمل جائزة ريتشارد أ. وسوزان ف. سميث للابتكار، ومايكل ب. كلاين والأسرة، ومؤسسة سيدمان العائلية، ومؤسسة مايكل ب. روكين الخيرية، وصندوق كينيث غريفين للبحوث الخيرية، ومجلس الاستثمار في بوسطن.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride injection, usp, 100 ml viaflex plastic container | Baxter | 2B1302 | For animal hydration |
| Agent contrast 100.0ml injection media btl ioversal 74% | CARDINAL HEALTH | 133311 | For visualizing the vasculature |
| Bard Bardia Closed System Urinary Drainage Bag | BARD Inc | 802001 | For urine collection |
| BD Vacutainer K2 EDTA | BD | 367841 | For blood sample storage |
| BD Vacutainer Lithium Heparin | BD | 366667 | For blood sample storage |
| Betadine | Henry Schein | 6906950 | For skin disinfection |
| Bookwalker retractor | Codman | For skin retraction | |
| Bupivacaine 0.25% | Hospira | Administer at incision site for analgesia | |
| Buprenorphine SR | Zoo Pharm | 10mg/ml bottle, Dose: 0.2mg/kg SC | |
| Cath angio 5.0 Fr x100.0 cm 0.038 in JR4 | MERIT MEDICAL SYSTEM INC | 7523-21 | For identification of the renal arteries |
| Cuffed endotracheal tube | Emdamed | To establish a secure airway for the duration of the operation | |
| EKG Medtronics- Physiocontrol LifePak 20 Oxygen saturation monitor | GE Healthcare Madison WI | For oxygen saturation monitoring | |
| Encore 26 inflator | BOSTON SCIENTIFIC | 710113 | For inflating the balloon catheters |
| Ethanol 95% (Ethyl alcohol) | Henry Schein | For skin disinfection | |
| Fentanyl patch | Mylan | Dose: 25-50mcg/hr, TD | |
| Gold silicone coated Foley | TELEFLEX MEDICAL INC | 180730160 | For urine collection |
| Heparin sodium | LEO Pharma A/S | Dose: 200 IU/kg IV | |
| i33 ultrasound machine | Phillips | Use ultrasonographic guidance for femoral catherization if necessary | |
| Inqwire diagnostic guide wire - 0.035" (0.89 mm) - 260 cm (102") - 1.5 mm j-tip | MERIT MEDICAL SYSTEM INC | 6609-33 | For guiding the balloon catheters to the renal arteries |
| Intravenous catheter, size 20 gauge | Santa Cruz Biotechnology | Inc SC-360097 | For fluid administration |
| Isoflurane | Patterson Veterinary Supply, Inc. | 21283620 | Dose: 3%, INH |
| Metzenbaum blunt curved 14.5 cm - 5(3/4)" | Rudolf Medical | RU-1311-14M | For tissue dissection and cutting |
| Neonatal disposable transducer kit with 30ml/hr flush device and double 4-way stopcocks for continuous monitoring | Argon Medical | 041588505A | For pressure measurement |
| Powerflex pro PTA dilatation catheter 6 x 20 mm - shaft length (135cm) | CARDINAL HEALTH | 4400602X | For occlusion of the renal arteries |
| Pressure monitoring lines mll/mll - 12" clear, mll/mll | Smiths Medical | B1571/MX571 | For pressure measurement |
| Procedure pack | Molnlycke Health Care | 97027809 | Surgical drape, gauze pads, syringes, beaker etc |
| Protamine | Henry Schein | 1044148 | For heparin reversal |
| Scalpel blade - size #10 | Cardinal Health (Allegiance) | 32295-010 | For the skin incisions |
| Stopcock iv 4 way lrg bore rotg male ll adptr strl | Peoplesoft | 1550 | For connecting tubings |
| Straight lateral retractor | Codman | For skin retraction | |
| Suture perma hnd 18in 2-0 braid silk blk | CARDINAL HEALTH 1 | A185H | For suturing incision site and securing catheters |
| Syringe contrast injection 10ml fixed male luer red | MERIT MEDICAL SYSTEM INC | MSS111-R | To administer the contrast agent |
| Syringe medical 60ml ll plst strl ltx free disp | CARDINAL HEALTH 1 | BF309653 | For urine collection and flushing of the angiocath |
| Tilzolan (tiletamine/zolazepam) | Patterson Veterinary Supply, Inc. | 07-893-1467 | Dose: 4-6 mg/kg, IM |
| Xylazine | Putney, INC | Dose: 1.1-2.2 mg/kg, IM |
References
- Ali Pour, P., Kenney, M. C., Kheradvar, A. Bioenergetics consequences of mitochondrial transplantation in cardiomyocytes. Journal of the American Heart Association. 9 (7), 014501 (2020).
- Giraud, S., Favreau, F., Chatauret, N., Thuillier, R., Maiga, S., Hauet, T. Contribution of large pig for renal ischemia-reperfusion and transplantation studies: The Preclinical Model. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 14 (2011).
- Amdisen, C., et al. Testing Danegaptide effects on kidney function after ischemia/reperfusion injury in a new porcine two week model. PLoS ONE. 11 (10), 1-13 (2016).
- Bhargava, P., Schnellmann, R. G.
- Bonventre, J. V., Weinberg, J. M. Recent advances in the pathophysiology of ischemic acute renal failure. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (8), 2199-2210 (2003).
- Case, J., Khan, S., Khalid, R., Khan, A. Epidemiology of Acute Kidney Injury in the Intensive Care Unit. Critical Care Research and Practice. 2013, 9 (2013).
- Jabbari, H., et al. Mitochondrial transplantation ameliorates ischemia/reperfusion-induced kidney injury in rat. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1866 (8), 165809 (2020).
- Malagrino, P. A., et al. Catheter-based induction of renal ischemia/reperfusion in swine: Description of an experimental model. Physiological Reports. 2 (9), 1-13 (2014).
- Freeman, R. V., et al. Nephropathy requiring dialysis after percutaneous coronary intervention and the critical role of an adjusted contrast dose. American Journal of Cardiology. 90 (10), 1068-1073 (2002).
- Gasthuys, E., et al. Postnatal maturation of the glomerular filtration rate in conventional growing piglets as potential juvenile animal model for preclinical pharmaceutical research. Frontiers in Pharmacology. 8 (431), 1-7 (2017).
- Doulamis, I. P., et al. Mitochondrial transplantation by intra-arterial injection for acute kidney injury. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 319 (3), 403-413 (2020).
- Rewa, O., Bagshaw, S. M. Acute kidney injury-epidemiology, outcomes and economics. Nature Reviews Nephrology. 10 (4), 193-207 (2014).
- Grossini, E., et al. Levosimendan Protection against Kidney Ischemia/Reperfusion Injuries in Anesthetized Pigs. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 342 (2), 376-388 (2012).
- Laskey, W. K., et al. Volume-to-creatinine clearance ratio. A pharmacokinetically based risk factor for prediction of early creatinine increase after percutaneous coronary intervention. Journal of the American College of Cardiology. 50 (7), 584-590 (2007).
