ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Protokollen, der præsenteres her, giver en trinvis tilgang til isolering af hjerteboende makrofager fra sinoatrialknuden (SAN) og atrioventrikulær knude (AVN) region af musehjerter.
Abstract
Residente hjertemakrofager har vist sig at lette den elektriske ledning i hjertet. Den fysiologiske hjerterytme initieres af elektriske impulser genereret i sinoatrialknude (SAN) og ledes derefter til ventrikler via atrioventrikulær knude (AVN). For yderligere at studere beboermakrofagernes rolle i hjerteledningssystemet er en ordentlig isolering af residente makrofager fra SAN og AVN nødvendig, men det er stadig udfordrende. Her leverer vi en protokol til pålidelig mikrodissektion af SAN og AVN i murinehjerter efterfulgt af isolering og kultur af residente makrofager.
Både SAN, der er placeret ved krydset mellem crista terminalis og den overlegne vena cava, og AVN, der er placeret i toppen af Koch-trekanten, identificeres og mikrodissekeres. Korrekt placering bekræftes ved histologisk analyse af vævet udført med Massons trikrome plet og ved anti-HCN4.
Mikrodissekeret væv fordøjes derefter enzymatisk for at opnå enkeltcellesuspensioner efterfulgt af inkubation med et specifikt panel af antistoffer rettet mod celletypespecifikke overflademarkører. Dette gør det muligt at identificere, tælle eller isolere forskellige cellepopulationer ved fluorescerende aktiveret cellesortering. For at differentiere hjerteboende makrofager fra andre immunceller i myokardiet, især rekrutterede monocytafledte makrofager, er der behov for en delikat udtænkt gatingstrategi. For det første detekteres lymfoide afstamningsceller og udelukkes fra yderligere analyse. Derefter identificeres myeloide celler med residente makrofager, der bestemmes ved høj ekspression af både CD45 og CD11b og lav ekspression af Ly6C. Med cellesortering kan isolerede hjertemakrofager derefter dyrkes in vitro over flere dage til yderligere undersøgelse. Vi beskriver derfor en protokol til isolering af hjerteboende makrofager placeret i hjerteledningssystemet. Vi diskuterer faldgruber ved mikrodissekering og fordøjelse af SAN og AVN og giver en gating-strategi til pålideligt at identificere, tælle og sortere hjertemakrofager ved fluorescensaktiveret cellesortering.
Introduction
Sinoatrialknuden (SAN) initierer fysiologisk den elektriske impuls og er derfor hjertets primære pacemaker. Den atrioventrikulære knude (AVN) leder den elektriske impuls fra atrierne til ventriklerne og fungerer også som en subsidiær pacemaker1. Generelt er generering og ledning af elektriske impulser en kompleks proces, der kan moduleres af forskellige faktorer2, herunder resident makrofag i SAN / AVN-regioner. En nylig undersøgelse af Hulsmans et al. viser en specifik population af hjerteboende makrofager, der er beriget i AVN og fungerer som nøgleaktører i at holde et stabilt hjerteslag3. De fandt ud af, at makrofager er elektrisk koblet til kardiomyocytterne og kunne ændre de elektriske egenskaber af koblede kardiomyocytter. Forfatterne bemærker også, at sådanne ledende celler, der forbinder med makrofager, også er til stede i andre komponenter i hjerteledningssystemet, såsom SAN.
I øjeblikket er det ikke fuldt ud kendt, om fænotypen af hjemmehørende hjertemakrofager adskiller sig mellem hjerteregionerne. Det har imidlertid vist sig, at vævsmikromiljøet kan påvirke transkription og proliferativ fornyelse af vævsmakrofager4. Da kardiomyocytfænotypen har vist sig at være forskellig mellem regioner, kan de funktionelle virkninger af makrofager på kardiomyocytter også være regionsspecifikke, selvom makrofagfænotypen selv kan være den samme. Derfor er der behov for yderligere undersøgelser af specifikke hjerteregioner.
Nylige undersøgelser har vist, at vævsresidente makrofager ved steady state etableres prænatalt, opstår uafhængigt af endelig hæmatopoiesis og vedvarer ind i voksenalderen5. Efter makrofagudtømning eller under hjertebetændelse bidrager Ly6chi monocytter imidlertid til at genopbygge hjertemakrofagpopulationen6. Undersøgelser, der involverer genetisk afstamningssporing, parabiose, skæbnekortlægning og cellesporing, viste sameksistensen af en række vævsresidente makrofagpopulationer i organer og væv og også forskellige cellulære adfærd af makrofagundergrupper, der potentielt er forbundet med deres ontogeni 7,8,9.
Karakterisering af residente hjertemakrofager har nydt godt af brugen af magnetisk aktiveret cellesortering (MACS) og fluorescerende aktiveret cellesortering. Disse metoder er især nyttige til isolering af specifikke cellepopulationer fra flere vævsfraktioner ved at mærke dem med deres celleoverflademarkører. Dette fører ikke kun til en højere renhed af den isolerede immuncelletype, men giver også mulighed for fænotypisk analyse. Her præsenterer vi en protokol, der inkluderer magnetiske perlebelagte celler efterfulgt af fluorescerende aktiveret cellesortering til berigelse af hjerteboende makrofager specifikt isoleret fra SAN- og AVN-regionen.
For at undersøge egenskaberne ved hjerteboende makrofager i ledningssystemet og deres funktion til hjerteledning og arytmogenese er præcis lokalisering og dissektion af SAN og AVN kritisk. Til mikrodissektion af SAN og AVN anvendes anatomiske vartegn til regionsidentifikation10. Kort sagt er SAN placeret ved krydset mellem den overlegne vena cava og højre atrium. AVN er placeret inden for trekanten af Koch, som er anteriort omgivet af septalbrochuren af tricuspidventilen og bagud af senen af Todaro11. Vi leverer også en nøjagtig mikrodissektionsprocedure af SAN og AVN hos mus, som bekræftes af histologi og immunfluorescensfarvning.
Isolerede residente makrofager kunne bruges til yderligere eksperimenter såsom RNA-sekventering eller kunne genvindes og dyrkes i mere end to uger, hvilket tillod forskellige in vitro-eksperimenter. Derfor beskriver vores protokol en meget værdifuld procedure for immuno-rytmikologen. Tabel 1 viser sammensætningen af alle de nødvendige løsninger, figur 1 viser mikrodissektionsmærkerne for SAN og AVN. Figur 2 er skematisk illustration af SAN- og AVN-lokalisering. Figur 3 viser den histologiske farvning af SAN og AVN (Massons trichrom- og immunfluorescensfarvning). Figur 4 viser en trin-for-trin gating-strategi til isolering af hjerteboende makrofager ved fluorescensaktiveret cellesortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrepleje og alle forsøgsprocedurer blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra dyrepleje- og etikkomitéen ved universitetet i München, og alle procedurer, der blev udført på mus, blev godkendt af regeringen i Bayern, München, Tyskland. C57BL6/J mus blev kommercielt opnået.
1. præparater
- Klargør cellesorteringsbuffer (tabel 1), og opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: Under hele forsøgsproceduren skal cellesorteringsbufferen altid være på is. - Forbered fordøjelsesbuffer (tabel 1) kort før fordøjelsen, da kollagenasens aktivitet kun kunne detekteres i få timer ved stuetemperatur.
- Der henvises til den tidligere offentliggjorte protokol til fremstilling af dissektionsret10. Kort sagt tilsættes 30 ml agarosegel (3%-4%) i en petriskål med en diameter på 100 mm og afkøles ved stuetemperatur.
2. Dyreofring og hjerteudskæring
- Anæstetiser musen med isofluran ved at placere den i et inkubationskammer forbundet med en isofluranfordamper og skyllet med 5% isofluran / 95% ilt.
- Efter injektion af fentanyl til analgesi skal du åbne brystkassen og perfuse hjertet ved at injicere 5-10 ml iskold 1x PBS direkte i venstre ventrikel (LV). Træk musenes hjerte ud og læg det på dissektionsskålen. Eksperimentelle detaljer er beskrevet detaljeret tidligere10.
3. Mikrodissektion af SAN og AVN
- Efter isolering af hjertet udføres følgende mikrodissektionsprocedurer i dissektionsskålen med iskold 1x PBS under dissekeringsmikroskopet.
- Brug de hjerteanatomiske landemærker, dvs. aorta, lungearterie, koronar sinus, venstre / højre ventrikel osv. at bestemme venstre / højre (venstre: LV; højre: RV) og forreste / bageste (anterior: aorta; posterior: koronar sinus) af hjertet. Når orienteringen er bestemt, skal du dreje rundt om hjertet med forsiden af det i bunden af skålen (for at udsætte de store vener, der er placeret bagpå).
- Mikrodissektion af SAN
BEMÆRK: Mikrodissektion af SAN er tidligere beskrevet10. Processen er kort beskrevet nedenfor.- Udsæt inter-kavalområdet ved at fastgøre de højre atrievedhæng (RAA) og vævet ved siden af overlegen vena cava (SVC) og ringere vena cava (IVC) på mikrodissektionsskålen ved hjælp af insektstifter.
- Skær hjertet langs det interatriale septum parallelt med crista terminalis (CT) for at adskille interkavalområdet og for at opnå SAN-prøven (figur 1A, figur 2A). Prøven anbringes i et tomt 1,5 ml mikrocentrifugerør på is.
- Mikrodissektion af AVN
- Efter indsamling af SAN-prøven sikres, at RAA og dele af højre atrium (RA) allerede er skåret væk, så kun interatriel septum (IAS) og interventrikulær septum (IVS) er tilbage.
- Fastgør de resterende dele af hjertet gennem vævet ved siden af IAS og IVS ved hjælp af insektstifter for at få den højre atrieside af IAS til at vende opad.
- Se på højre atrium på endokardialoverfladen for Kochs trekant. Det vil blive omkranset anteriort af hængsellinjen på septalbladet på tricuspidventilen (TV) og bagud af Todaros sene. Åbningen af koronar sinus observeres ved bunden. (Figur 1B, figur 2B).
- Skær trekanten af Koch, som indeholder AVN, og læg den direkte i et tomt 1,5 ml mikrocentrifugerør på is.
4. Fordøjelse
- Forbered fordøjelsesbufferen (tabel 1) kort før brug.
- Hak SAN- og AVN-vævet godt med skalpeller.
BEMÆRK: Mincing af vævsbrønden vil øge fordøjelseseffektiviteten og hjælpe med at få god cellesuspension til sortering. Da SAN- og AVN-prøverne er ret små, anbefales det at hakke vævet direkte inde i 1,5 ml mikrocentrifugerøret for at reducere tabet af prøve. - Der tilsættes 500 μL fordøjelsesbuffer pr. prøve, og alt hakket væv vaskes ned fra væggen i 1,5 ml mikrocentrifugerøret. Blid pipettering hjælper med at fordøje prøven.
- Homogeniser røret på en hvirvelmaskine (indstillinger: 37 °C, 750 o / min i 1 time).
- Efter fordøjelsen overføres vævssuspensionen til et frisk 15 ml centrifugerør ved at passere gennem en 40 μm cellesi. Skyl cellesilen med yderligere 5 ml cellesorteringsbuffer for at stoppe fordøjelsen.
- Centrifuge 15 ml røret ved 350 x g i 7 minutter ved 4 °C. Fjern derefter supernatanten helt ved hjælp af pipetten. Resuspender cellepelleten med 90 μL cellesorteringsbuffer.
BEMÆRK: Før magnetisk adskillelse pipetteres cellesuspensionen forsigtigt et par gange eller passerer gennem en 30 μm cellesi for at fjerne celleklumper, hvis det er nødvendigt, for at opnå en enkeltcellesuspension for optimal udførelse af magnetisk berigelse af interessante cellepopulationer.
5. Magnetisk berigelse af CD45 og prøvefarvning
BEMÆRK: For at isolere hjertemakrofagerne med høj sorteringseffektivitet blev udelukkelse af uønskede celler, herunder lymfocytter, udført med CD45 mikroperler i henhold til producentens protokol. Baseret på sorteringspanelet blev hjerteboende makrofager identificeret som CD45 høj CD11b høj CD64 høj Ly6Clav / int F4/80 høj.
- Der tilsættes 10 μL CD45-mikroperler pr. 107 celler i alt til cellesuspensionen i 15 ml centrifugerøret. Prøverne blandes godt og inkuberes i 15 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Celletællingen ved hjælp af et hæmocytometer skal udføres kort for at sikre, at hvert rør ikke indeholder mere end 107 celler i alt. Når man arbejder med højere celletal, skal mængden af magnetiske perler skaleres op. - Antistofblandingen forberedes ved at fortynde følgende antistoffer i cellesorteringsbuffer (1:100 fortynding for hvert antistof): CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI vil senere blive tilføjet til farvningen for levende / død diskrimination.
- Efter 15 minutters magnetisk perleinkubation tilsættes 100 μL antistofblanding direkte i cellesuspensionen i 15 ml røret (derefter er alle antistoffernes endelige koncentration 1:200) og inkuberes i 20 minutter ved 4 °C.
- Efter 20 minutters antistofinkubation vaskes cellesuspensionen ved at tilsætte 1-2 ml cellesorteringsbuffer pr. 107 celler og centrifugeres ved 350 x g i 10 min. Fjern supernatanten helt ved pipettering.
- Resuspender op til 108 celler i 500 μL cellesorteringsbuffer.
BEMÆRK: Det maksimale celleantal til magnetisk adskillelse skal bestemmes i henhold til producentens protokol. - Forbered det magnetiske separationssæt.
- Fastgør den magnetiske søjle til en passende magnetisk separator, og anbring et opsamlingsrør under magnetsøjlen.
- Forbered de magnetiske kolonner ved at skylle med cellesorteringsbuffer: Tilsæt 500 μL cellesorteringsbuffer øverst i kolonnen, og lad bufferen passere igennem.
- Påfør cellesuspensionen straks på kolonnen, mens cellesorteringsbufferen passerer igennem.
BEMÆRK: Undgå dannelse af luftbobler i søjlen. I henhold til producentens protokol, selvom kolonnefyldningstiden kan ændre sig fra opbevaringsforhold, har den ingen indflydelse på kvaliteten af adskillelsen. - Kolonnen vaskes med en cellesorteringsbuffer på 3 x 500 μL. Gennemstrømningen i trin 5.7 og trin 5.8 indeholder umærkede celler, som kan kasseres, hvis der ikke er behov for yderligere forsøg.
BEMÆRK: Tilføj cellesorteringsbufferen med det samme, når kolonnebeholderen er næsten tom. - Fjern søjlen fra magnetseparatoren, og læg den på et nyt opsamlingsrør.
- Tilføj 1 ml cellesorteringsbuffer på kolonnen. Skyl straks søjlen ved at påføre stemplet, der følger med søjlen, fast. Gennemstrømningen indeholder de magnetisk mærkede celler.
- Tilsæt DAPI-opløsning i alle de indsamlede magnetisk mærkede cellesuspensioner kort før de køres på cellesortereren. Den endelige koncentration af DAPI justeres til 0,3-0,5 μg/ml.
- Udfør FACS-analyse.
6. Prøver til kompensation
- Forbered 6 brune 1,5 ml mikrocentrifugerør mærket som henholdsvis "PE", "APC-Cy7", "APC", "PE-Cy7", "FITC" og "DAPI" for at beskytte antistoffer mod lys. Forbered endnu et 1,5 ml mikrocentrifugerør mærket som "ufarvet".
BEMÆRK: Dette kan gøres samtidig med at inkubere cellesuspensionen med mikroperler og antistoffer. Den ufarvede prøve kunne være kardiomyocytvævet indsamlet tilfældigt fra det sparede hjertevæv og også behandlet i henhold til trin 4. - Fortynd hvert enkelt fluorescenskonjugeret antistof med cellesorteringsbuffer i 1:50 i de 1,5 ml brune mikrocentrifugerør, der er markeret i overensstemmelse hermed.
- Tilsæt en dråbe kompensationsperleopløsning og inkuber i 20 minutter ved 4 °C.
- Der tilsættes 2 ml cellesorteringsbuffer i hvert 1,5 ml brunt mikrocentrifugerør og centrifuge ved 450 x g i 5 min. Kassér supernatanten fuldstændigt, og suspender kuglen indeholdende pellet med 300 μL cellesorteringsbuffer og overfør dem til cellesorteringsrør, der også er markeret i overensstemmelse hermed.
7. Kører på cellesorteringen og gating-strategien
- Påfør først de ufarvede prøve- og kompensationsrør, og juster spændingerne i hver kanal for at justere både den positive og negative top til den korrekte position af aksen. Gem kompensationsindstillingerne, og anvend dem på følgende eksempler.
- Anvend prøverne på cellesortereren. Indstil gating-strategien som beskrevet i figur 4. Hjerteboende makrofager identificeres som CD45 høj CD11b høj CD64 høj Ly6Clav / int F4/80høj. DAPI bruges som en cellelevedygtighedsmarkør.
- Kontroller flowcytometridiagrammerne for at bekræfte, at cellepopulationen af interesse vises korrekt på diagrammerne. Hvis ikke, skal du justere spændingen for hver kanal til midtervisningen af hvert diagram.
- Hvis spændingsindstillingerne er tilfredsstillende, skal du starte sorteringsproceduren. Indsaml den sorterede cellepopulation i kulturmedium sammensat af DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum suppleret med 100 μg / ml streptomycin og 100 U / ml penicillin.
8. Resident makrofager kultur
- Efter indsamling af de sorterede makrofager overføres cellerne straks enten til 35 mm vævskulturskåle eller 24 brøndplader eller direkte til efterfølgende forsøg.
- For at dyrke sorterede makrofager inkuberes cellerne ved 37 °C, 5% CO2 inkubator.
- Skift kulturmediet hver 48-72 timer. Flydende døde celler kan let fjernes ved medium forandring. Brug levende makrofager, der fastgøres til bunden af kulturskålen til efterfølgende eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi beskriver en praktisk procedure for isolering af hjerteboende makrofager specifikt fra SAN- og AVN-regionen. For at bekræfte en korrekt dissektion udføres Massons Trichrome-farvning og immunfluorescerende HCN4-farvning (figur 3)12. Med denne protokol kunne vi indsamle ca. 60.000 makrofager fra et helt hjerte. Figur 4 viser gating-strategien for sortering af hjertemakrofager. Levende residente hjertemakrofager blev identificeret som CD45+CD11b+F4/80+CD64+Ly6C-. Figur 5 viser frisksorterede hjertemakrofager, som blev identificeret ved deres overfladeantigener CD45, F4/80 og CD11b. Frisksorterede celler blev observeret under lysfeltvisning af mikroskop (figur 5A). De sorterede celler var positive for CD45 (CD45+), når de blev observeret under fluorophore-PE-kanalen (figur 5B). Den samme visning af de sorterede celler, når den blev observeret under fluorophore-APC-Cy7-kanalen, viste CD11b + fænotype (figur 5C). Den samme visning af de sorterede celler, når den blev observeret under fluorophore-PE-Cy7-kanalen, viste F4/80+ fænotype (figur 5D). Figur 5E er det fusionerede billede opnået med det fluorescerende mikroskop for de sorterede celler. Disse tredobbelte positive celler blev identificeret som hjerteboende makrofager. Figur 6 viser isolerede hjertemakrofager dyrket i medium op til 6 dage. Hvide pile angiver makrofager, sorte pile angiver flydende runde formede døde celler.
Figur 1: SAN'ets anatomi og AVN under dissektionsmikroskopet. (A) SAN'ets anatomi under dissektionsmikroskopet. SAN'ets placering er angivet med rød stiplet linje inden for interkavalområdet (sorte stiplede linjer). (B) AVN's anatomi under dissektionsmikroskopet. Dette tal er ændret i forhold til tidligere offentliggjort artikel10. AVN (rød stiplet cirkel) er placeret i toppen af Kochs trekant (hvid stiplet trekant) nær bunden af den membranøse septum. Kochs trekant er dannet af senen af Todaro (TT, grøn stiplet linje), tricuspidventil (TV, blå stiplet linje) og åbningen af koronar sinus (CS, gul stiplet linje). SVC, overlegen vena cava; IVC, ringere vena cava; IAS, interatrial septum; RA, højre atrium; RAA, højre atrial vedhæng; RV, højre ventrikel; CT, Crista terminalis; IVS, interventrikulær septum; AF, oval fossa. PA, lungearterie; RV, højre ventrikel; LV, venstre ventrikel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk illustration af SAN- og AVN-lokalisering. (A) skematisk illustration af SAN-lokalisering. SAN er angivet med en rød stiplet cirkel inden for inter-kavalområdet udover CT (sort stiplet linje). (B) skematisk illustration af AVN-lokalisering. AVN er angivet med en rød stiplet cirkel inde i Koch-trekanten (grå stiplet trekant) sammensat af tv og åbningen af CS. IVC, ringere vena cava; IAS, interatrial septum; RA, højre atrium; RAA, højre atrial vedhæng; CT, Crista terminalis; IVS, interventrikulær septum; AF, oval fossa; IVS, interventrikulær septum. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Identifikation af SAN og AVN med histologisk plet. Identifikation af SAN (A, B) og AVN (C, D). Immunofluorescerende farvning af HCN4-positive ledningssystemceller i SAN (A) og AVN (C) samt Massons trikrome farvning af SAN (B) og AVN (D). Røde pile angiver sinusknudearterie (SNA, B), sort pil og sort stiplet linje angiver kompakt AVN, blå pil angiver det centrale fibrøse legeme (CFB). CT, crista terminalis; CFB, central fibrøs krop; CN, kompakt AVN; RA, højre atrium; RV, højre ventrikel; IAS, interatrial septum; IVS, interventrikulær septum; TV, tricuspid ventil; MV, mitralventil. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Gatingstrategi for cellesortering af hjemmehørende hjertemakrofager. Mononukleære celler identificeres, dubletter udelukkes af FSC-W vs. FSC-A og døde celler udelukkes af DAPI (A-D). Levende celler er gated på CD45+ leukocytter (E), og derefter gated på CD11b + myeloide celler (F). Hjertemakrofager blev identificeret ved ekspression af både F4/80 og CD64 (G) og derefter endelig stratificeret ved Ly6C-ekspression (H). Levende residente hjertemakrofager identificeres som CD45+CD11b+F4/80+CD64+Ly6C-. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Frisksorterede hjertemakrofager og immunfluorescerende farvning. (A) Frisksorterede hjertemakrofager. Immunofluorescerende farvning af specifikke overfladeantigener såsom CD45 (B), CD11b (C) eller F4/80 (D). Ifølge gating-strategien identificeres hjertemakrofager som tredobbelt positive celler (E). Skalabjælken repræsenterer 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Kultur af sorterede makrofager. Kultur af sorterede makrofager i kulturmedium i henholdsvis 48 timer (A, B), 96 timer (C, D) og 6 dage (E, F). Der vises to individuelle kulturretter pr. tidspunkt (ret 1: A, C, E; ret 2: B, D, F). Hvide pile angiver levende makrofager med spindellignende form og typiske fremspring3. Sorte pile angiver flydende runde formede døde celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Forbindelse | Endelig koncentration | g eller ml kræves |
| FACS-buffer | ||
| BSA | 0.50% | |
| EDTA | 2 mM | |
| Pbs (1X) | 500 ml | |
| Fordøjelsesbuffer | ||
| Kollagenase I | 450 U/ml | |
| Kollagenase XI | 125 U/ml | |
| DNase I | 60 U/ml | |
| Hyaluronidase | 60 U/ml | |
| HEPES buffer | 20 μl pr. 1 ml | |
| Pbs (1X) | Tilsæt op til 1 ml til 2 prøver | |
| Kulturmedium | ||
| DMEM | 79 ml | |
| Penicillin/streptomycin | 1% | 1 ml |
| FBS | 20% | 20 ml |
| TAE (50x) | ||
| Tris-base | 24.20% | 24,2 g |
| 100 % eddikesyre | 5.71% | 5,71 ml |
| 0,5 mio. kr. | 0,05 M | 10 ml |
| dH2O | Tilføj op til 100 ml | |
Tabel 1: Sammensætning af nødvendige løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskript beskriver vi en protokol for berigelse af hjerteboende makrofager specifikt fra SAN- og AVN-regionerne ved høj renhed.
Makrofager er opdelt i subpopulationer baseret på deres anatomiske placering og funktionelle fænotype. De kan også skifte fra en funktionel fænotype til en anden som reaktion på variable mikromiljøsignaler13. Sammenlignet med andre organer såsom knoglemarv og lever indeholder hjertevæv en lavere procentdel af immunceller og lavere absolutte tal for hver cellulær subpopulation14. Derfor er cellesorterings-, berigelses- og rensningsmetoder nødvendige værktøjer til at opnå tilstrækkelige mængder af cellepopulationen af interesse. Fluorescensaktiveret cellesortering og MACS giver mulighed for at opnå rene, sorterede cellepopulationer, da det tillader samtidig måling af cellernes forskellige egenskaber.
Forskellige flowcytometripaneler er blevet beskrevet til identifikation af underpopulationer af hjertemakrofager 3,6,15. Makrofagernes funktion i steady state og sygdom afhænger ikke kun af deres udviklingsmæssige oprindelse, men også af vævsmiljøet. Generelt indeholder det voksne hjerte to store delmængder af Ly6Clav / CCR2-residente makrofager, der udtrykker forskellige niveauer af MHC-II, og som kan opretholde sig selv via lokal spredning ved steady state, mens klassiske Ly6C-høje monocytter under sygdom rekrutteres til steder med betændelse, hvor de differentierer sig til makrofager16 . Under udviklingen indtager forskellige subpopulationer af makrofager forskellige hjerteplaceringer forbundet med forskellige funktioner17. Vi havde til formål at studere de residente makrofager specifikt fra hjerteledningssystemet, især de residente makrofager fra SAN- og AVN-regionerne. Ifølge Hulsmans et al. hjerteboende makrofager identificeres som CD45 høj CD11b høj CD64 høj F4/80 højLy6Clav / int.
Høsten af hjerteboende makrofager fra en voksen mus til cellesortering kræver ca. 3 timer. Det er vigtigt at arrangere de eksperimentelle procedurer logisk og tillade inkubation parallelt for at spare tid og minimere håndteringen af de muligvis skrøbelige makrofager i suspensionen. Da sorteringsproceduren kunne lægge pres på de sorterede celler, anbefalede vi at reducere sorteringstiden ved hjælp af magnetiske perler, hvilket kunne øge sorteringseffektiviteten enormt og også give mulighed for at opnå højere renhed af residente makrofager.
Anvendelsen af denne protokol omfatter, men er ikke begrænset til, oprensning af makrofager og/eller enhver anden ikke-kardiomyocytcelletype fra hjertevævet og andre musestammer. De sorterede makrofager kunne bruges til efterfølgende eksperimenter, for eksempel cellemotilitetsassays, gen- eller proteinekspressionsundersøgelser osv. Enkeltcellet RNA-sekventering er også mulig ved at samle celler en efter en direkte fra cellesortererens opsamlingsrør.
Flowcytometribaseret cellesortering har dog sine begrænsninger. Et præcist designet antistofpanel er vigtigt og skal overveje ekspressionen af antigener på cellepopulationen af interesse og fluoroforen konjugeret til antistofferne. Cellernes funktion og levedygtighed kan ændres af bindingsantistofferne, hvilket kan påvirke resultaterne af efterfølgende eksperimenter. Derudover er de komplekse cellesorteringsinstrumenter dyre, sofistikerede og også tilbøjelige til problemer med fluidiksystemblokeringer og laserkalibrering. Derfor kræves vedligeholdelse af højtuddannet specialist og korrekt drift af en erfaren professionel tekniker. Selvom cellesortering kunne give en ren cellepopulation af interesse, er den samlede effektivitet stadig relativt lav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der blev ikke rapporteret om nogen potentiel interessekonflikt, der er relevant for denne artikel.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af China Scholarship Council (CSC, til R. Xia), det tyske center for kardiovaskulær forskning (DZHK; 81X2600255 til S. Clauss, 81Z0600206 til S. Kääb, 81Z0600204 til CS), Corona Foundation (S199/10079/2019 til S. Clauss), SFB 914 (projekt Z01 til S. Massberg), ERA-NET om hjerte-kar-sygdomme (ERA-CVD; 01KL1910 til S. Clauss) og Heinrich-og-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (til S. Clauss). Bidragyderne havde ingen rolle i manuskriptforberedelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories |
References
- Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R.
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Pinto, A. R., et al.
- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
Tags
Medicin udgave 171 hjerteledningssystem sinoatrialknude atrioventrikulær knude residente hjertemakrofager flowcytometri magnetisk aktiveret cellesortering MACS fluorescensaktiveret cellesortering mikrodissektion primær cellekulturErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU)
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU)
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU)
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
