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Summary
Das hier vorgestellte Protokoll bietet einen schrittweisen Ansatz für die Isolierung von kardialen residenten Makrophagen aus der Region des Sinusknotens (SAN) und des atrioventrikulären Knotens (AVN) von Mäuseherzen.
Abstract
Es wurde gezeigt, dass residente Herzmakrophagen die elektrische Leitung im Herzen erleichtern. Der physiologische Herzrhythmus wird durch elektrische Impulse initiiert, die im Sinusknoten (SAN) erzeugt und dann über den atrioventrikulären Knoten (AVN) zu den Ventrikeln geleitet werden. Um die Rolle residenter Makrophagen im Herzleitungssystem weiter zu untersuchen, ist eine ordnungsgemäße Isolierung der residenten Makrophagen aus SAN und AVN erforderlich, bleibt jedoch eine Herausforderung. Hier stellen wir ein Protokoll für die zuverlässige Mikrodissektion des SAN und AVN in murinen Herzen zur Verfügung, gefolgt von der Isolierung und Kultur residenter Makrophagen.
Sowohl SAN, das sich an der Kreuzung des Crista-Terminalis mit der oberen Hohlvene befindet, als auch AVN, das sich an der Spitze des Koch-Dreiecks befindet, werden identifiziert und mikroseziert. Die korrekte Lokalisation wird durch histologische Analyse des Gewebes bestätigt, die mit Massons Trichrom-Färbung und durch Anti-HCN4 durchgeführt wird.
Mikrosezierte Gewebe werden dann enzymatisch verdaut, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten, gefolgt von der Inkubation mit einem spezifischen Panel von Antikörpern, die gegen zelltypspezifische Oberflächenmarker gerichtet sind. Dies ermöglicht es, verschiedene Zellpopulationen durch fluoreszierend aktivierte Zellsortierung zu identifizieren, zu zählen oder zu isolieren. Um kardiale residente Makrophagen von anderen Immunzellen im Myokard zu unterscheiden, insbesondere von rekrutierten Monozyten-abgeleiteten Makrophagen, ist eine sorgfältig entwickelte Gating-Strategie erforderlich. Zunächst werden lymphatische Linienzellen nachgewiesen und von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Dann werden myeloische Zellen mit residenten Makrophagen identifiziert, die durch eine hohe Expression von CD45 und CD11b und eine niedrige Expression von Ly6C bestimmt werden. Mit der Zellsortierung können dann isolierte Herzmakrophagen über mehrere Tage in vitro kultiviert werden, um weitere Untersuchungen durchzuführen. Wir beschreiben daher ein Protokoll zur Isolierung kardialer Makrophagen, die sich innerhalb des Herzleitungssystems befinden. Wir diskutieren Fallstricke bei der Mikrozerlegung und Verdauung von SAN und AVN und bieten eine Gating-Strategie zur zuverlässigen Identifizierung, Zählung und Sortierung von Herzmakrophagen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung.
Introduction
Der Sinusknoten (SAN) initiiert physiologisch den elektrischen Impuls und ist somit der primäre Schrittmacher des Herzens. Der atrioventrikuläre Knoten (AVN) leitet den elektrischen Impuls von den Vorhöfen zu den Ventrikeln und fungiert auch als Hilfsschrittmacher1. Im Allgemeinen ist die Erzeugung und Leitung elektrischer Impulse ein komplexer Prozess, der durch verschiedene Faktoren2 moduliert werden kann, einschließlich residenter Makrophagen in SAN/AVN-Regionen. Eine aktuelle Studie von Hulsmans et al. zeigt eine spezifische Population von kardialen residenten Makrophagen, die im AVN angereichert sind und als Schlüsselakteure bei der Aufrechterhaltung eines gleichmäßigen Herzschlags fungieren3. Sie fanden heraus, dass Makrophagen elektrisch an die Kardiomyozyten gekoppelt sind und die elektrischen Eigenschaften gekoppelter Kardiomyozyten verändern könnten. Die Autoren stellen auch fest, dass solche leitenden Zellen, die mit Makrophagen verschachtelt sind, auch in anderen Komponenten des Herzleitungssystems, wie dem SAN, vorhanden sind.
Derzeit ist nicht vollständig bekannt, ob sich der Phänotyp der residenten Herzmakrophagen zwischen den Herzregionen unterscheidet. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Mikroumgebung des Gewebes die Transkription und proliferative Erneuerung von Gewebemakrophagen beeinflussen kann4. Da der Kardiomyozyten-Phänotyp zwischen den Regionen unterschiedlich ist, können die funktionellen Wirkungen von Makrophagen auf Kardiomyozyten auch regionsspezifisch sein, auch wenn der Makrophagen-Phänotyp selbst derselbe sein kann. Daher sind weitere Studien zu bestimmten Herzregionen erforderlich.
Neuere Studien haben gezeigt, dass die geweberesidenten Makrophagen im Steady State pränatal etabliert sind, unabhängig von der definitiven Hämatopoese entstehen und bis ins Erwachsenenalter bestehenbleiben 5. Nach Makrophagen-Depletion oder während einer Herzentzündung tragen Ly6c-Hi-Monozyten jedoch zur Auffüllung der kardialen Makrophagenpopulation bei6. Studien zur genetischen Abstammungsverfolgung, Parabiose, Schicksalskartierung und Zellverfolgung zeigten die Koexistenz einer Vielzahl von geweberesidenten Makrophagenpopulationen in Organen und Geweben sowie ein unterschiedliches zelluläres Verhalten von Makrophagen-Untergruppen, die möglicherweise mit ihrer Ontogenese assoziiert sind 7,8,9.
Die Charakterisierung residenter kardialer Makrophagen hat von der Verwendung von magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS) und fluoreszierend aktivierter Zellsortierung profitiert. Diese Methoden sind besonders nützlich, um bestimmte Zellpopulationen aus mehreren Gewebefraktionen zu isolieren, indem sie mit ihren Zelloberflächenmarkern markiert werden. Dies führt nicht nur zu einer höheren Reinheit des isolierten Immunzelltyps, sondern ermöglicht auch eine phänotypische Analyse. Hier präsentieren wir ein Protokoll mit magnetisch perlenbeschichteten Zellen, gefolgt von fluoreszierend aktivierter Zellsortierung zur Anreicherung von kardialen residenten Makrophagen, die spezifisch aus der SAN- und AVN-Region isoliert wurden.
Um die Eigenschaften von kardialen residenten Makrophagen im Leitungssystem und ihre Funktion für die Herzleitung und Arrhythmogenese zu untersuchen, ist eine präzise Lokalisierung und Dissektion von SAN und AVN von entscheidender Bedeutung. Für die Mikrodissektion von SAN und AVN werden anatomische Landmarken für die Regionsidentifikation10 verwendet. Kurz gesagt, SAN befindet sich an der Kreuzung der oberen Hohlvene und des rechten Vorhofs. AVN befindet sich im Dreieck von Koch, das anterior durch das Septumblatt der Trikuspidalklappe und posterior durch die Sehne von Todaro11 begrenzt wird. Wir bieten auch ein genaues Mikrodissektionsverfahren von SAN und AVN in Mäusen, das durch Histologie und Immunfluoreszenzfärbung bestätigt wird.
Isolierte residente Makrophagen könnten für weitere Experimente wie RNA-Sequenzierung verwendet oder für mehr als zwei Wochen geborgen und kultiviert werden, was verschiedene In-vitro-Experimente ermöglicht. Daher beschreibt unser Protokoll ein sehr wertvolles Verfahren für den Immunrhythmologen. Tabelle 1 zeigt die Zusammensetzung aller benötigten Lösungen, Abbildung 1 zeigt die Mikrodissektions-Orientierungspunkte für SAN und AVN. Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung der SAN- und AVN-Lokalisierung. Abbildung 3 zeigt die histologische Färbung von SAN und AVN (Masson-Trichrom- und Immunfluoreszenzfärbung). Abbildung 4 zeigt eine Schritt-für-Schritt-Gating-Strategie zur Isolierung kardialresidenter Makrophagen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung.
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Protocol
Die Tierpflege und alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Tierpflege- und Ethikkommission der Universität München durchgeführt und alle an Mäusen durchgeführten Verfahren wurden von der Bayerischen Regierung, München, Deutschland, genehmigt. C57BL6/J-Mäuse wurden kommerziell gewonnen.
1. Vorbereitungen
- Zellsortierpuffer vorbereiten (Tabelle 1) und bei 4 °C lagern.
HINWEIS: Während des gesamten experimentellen Verfahrens sollte der Zellsortierpuffer immer auf Eis liegen. - Verdauungspuffer (Tabelle 1) kurz vor der Verdauung vorbereiten, da die Aktivität der Kollagenase nur wenige Stunden bei Raumtemperatur nachgewiesen werden konnte.
- Für die Zubereitung der Präparierschale10 beziehen Sie sich auf das zuvor veröffentlichte Protokoll. Kurz gesagt, geben Sie 30 ml Agarosegel (3% -4%) in eine Petrischale mit 100 mm Durchmesser und kühlen Sie sie bei Raumtemperatur ab.
2. Tieropfer und Herzexzision
- Betäuben Sie die Maus mit Isofluran, indem Sie sie in eine Inkubationskammer geben, die mit einem Isofluran-Vaporizer verbunden ist und mit 5% Isofluran / 95% Sauerstoff gespült wird.
- Nach der Injektion von Fentanyl zur Analgesie den Brustkorb öffnen und das Herz durchbluten, indem Sie 5-10 ml eiskaltes 1x PBS direkt in den linken Ventrikel (LV) injizieren. Extrahieren Sie das Herz der Mäuse und legen Sie es auf die Sezierschale. Experimentelle Details wurden zuvor ausführlich beschrieben10.
3. Mikrodissektion von SAN und AVN
- Nach der Isolierung des Herzens führen Sie die folgenden Mikrodissektionsverfahren in der Dissektionsschale mit eiskaltem 1x PBS unter dem Seziermikroskop durch.
- Verwenden Sie die herzanatomischen Orientierungspunkte, d. H. Aorta, Lungenarterie, Koronarsinus, linker / rechter Ventrikel usw. zur Bestimmung des links/rechten (links: LV; rechts: RV) und anterior/posterior (anterior: Aorta; posterior: Koronarsinus) des Herzens. Nachdem die Orientierung bestimmt ist, drehen Sie sich um das Herz mit der Vorderseite am Boden der Schale (um die großen Venen freizulegen, die sich nach hinten befinden).
- Mikrodissektion von SAN
HINWEIS: Die Mikrodissektion des SAN wurde bereits beschrieben10. Der Prozess wird im Folgenden kurz beschrieben.- Belichten Sie die Region zwischen den Kavalen, indem Sie die rechten Vorhofanhänge (RAA) und das Gewebe neben der oberen Hohlvene (SVC) und der unteren Hohlvene (IVC) mit Insektenstiften auf die Mikrodissektionsschale stecken.
- Schneiden Sie das Herz entlang des interatrialen Septums parallel zur Crista terminalis (CT), um die interkavale Region zu trennen und die SAN-Probe zu erhalten (Abbildung 1A, Abbildung 2A). Legen Sie die Probe in ein leeres 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
- Mikrodissektion von AVN
- Stellen Sie nach der Entnahme der SAN-Probe sicher, dass die RAA und Teile des rechten Vorhofs (RA) bereits abgeschnitten wurden, so dass nur das interatriale Septum (IAS) und das interventrikuläre Septum (IVS) übrig bleiben.
- Stecken Sie die verbleibenden Teile des Herzens durch das Gewebe neben IAS und IVS mit Insektenstiften, um die rechte Vorhofseite der IAS nach oben zu zeigen.
- Schauen Sie sich den rechten Vorhof auf der Endokardoberfläche für das Dreieck von Koch an. Es wird anterior durch die Scharnierlinie des Septumblattes der Trikuspidalklappe (TV) und posterior durch die Sehne von Todaro begrenzt. Die Öffnung des Koronarsinus wird an der Basis beobachtet. (Abbildung 1B, Abbildung 2B).
- Schneiden Sie das Koch-Dreieck, das das AVN enthält, ab und legen Sie es direkt in ein leeres 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
4. Verdauung
- Bereiten Sie den Aufschlusspuffer (Tabelle 1) kurz vor Gebrauch vor.
- Zerkleinern Sie das SAN- und AVN-Gewebe gut mit Skalpellen.
HINWEIS: Das Hacken des Gewebes erhöht die Verdauungseffizienz und hilft, eine gute Zellsuspension für die Sortierung zu erhalten. Da die SAN- und AVN-Proben recht klein sind, wird empfohlen, das Gewebe direkt im 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu zerkleinern, um den Probenverlust zu reduzieren. - Fügen Sie 500 μL Verdauungspuffer pro Probe hinzu und waschen Sie das gesamte Hackfleischgewebe von der Wand des 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens ab. Schonendes Pipettieren hilft bei der Verdauung der Probe.
- Homogenisieren Sie das Rohr auf einer Wirbelmaschine (Einstellungen: 37 °C, 750 U/min für 1 h).
- Nach der Verdauung wird die Gewebesuspension durch ein 40-μm-Zellsieb in ein frisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Spülen Sie das Zellsieb mit zusätzlichen 5 ml Zellsortierpuffer, um die Verdauung zu stoppen.
- Zentrifugieren Sie das 15 ml Röhrchen bei 350 x g für 7 min bei 4 °C. Entfernen Sie dann den Überstand vollständig mit der Pipette. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 90 μL Zellsortierpuffer.
HINWEIS: Vor der magnetischen Trennung pipetten Sie die Zellsuspension einige Male vorsichtig oder passieren Sie ein 30-μm-Zellsieb, um bei Bedarf Zellklumpen zu entfernen, um eine Einzelzellsuspension für eine optimale Durchführung der magnetischen Anreicherung interessanter Zellpopulationen zu erhalten.
5. Magnetische Anreicherung von CD45 und Probenfärbung
HINWEIS: Um die Herzmakrophagen mit hoher Sortiereffizienz zu isolieren, wurde der Ausschluss unerwünschter Zellen einschließlich Lymphozyten mit CD45-Mikrokügelchen gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Basierend auf dem Sortierpanel wurden kardiale residente Makrophagen als CD45 hoch CD11b hoch CD64 hoch Ly6Cniedrig / int F4/80 hochidentifiziert.
- 10 μL CD45-Mikrokügelchen pro 107 Zellen in die Zellsuspension im 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben. Die Proben gut mischen und 15 min bei 4 °C inkubieren.
HINWEIS: Die Zellzählung mit einem Hämozytometer sollte kurz durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass jedes Röhrchen nicht mehr als 107 Zellen enthält. Bei der Arbeit mit höheren Zellzahlen muss das Volumen der magnetischen Perlen vergrößert werden. - Bereiten Sie die Antikörpermischung vor, indem Sie die folgenden Antikörper im Zellsortierpuffer verdünnen (1:100 Verdünnung für jeden Antikörper): CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI wird später zur Färbung für Lebend/Toten-Diskriminierung hinzugefügt.
- Nach 15 min magnetischer Bead-Inkubation 100 μL Antikörpergemisch direkt in die Zellsuspension im 15-ml-Röhrchen geben (dann beträgt die Endkonzentration aller Antikörper 1:200) und 20 min bei 4 °C inkubieren.
- Nach 20 min Antikörperinkubation die Zellsuspension waschen, indem Sie 1-2 ml Zellsortierpuffer pro 107 Zellen hinzufügen und bei 350 x g für 10 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand vollständig durch Pipettieren.
- Resuspendieren Sie bis zu 108 Zellen in 500 μL Zellsortierpuffer.
HINWEIS: Die maximale Zellzahl für die magnetische Trennung sollte gemäß dem Protokoll des Herstellers bestimmt werden. - Bereiten Sie das magnetische Trennset vor.
- Befestigen Sie die Magnetsäule an einem geeigneten Magnetabscheider und legen Sie ein Sammelrohr unter die Magnetsäule.
- Bereiten Sie die Magnetsäulen vor, indem Sie mit dem Zellsortierpuffer spülen: Fügen Sie 500 μL Zellsortierpuffer oben in die Säule und lassen Sie den Puffer passieren.
- Tragen Sie die Zellsuspension sofort auf die Säule auf, während der Zellsortierpuffer durchläuft.
HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen in der Säule. Gemäß dem Herstellungsprotokoll kann sich die Kolonnenfüllzeit zwar aufgrund der Lagerbedingungen ändern, hat jedoch keinen Einfluss auf die Qualität der Trennung. - Waschen Sie die Säule mit 3 x 500 μL Zellsortierpuffer. Der Durchfluss in Schritt 5.7 und Schritt 5.8 enthält unmarkierte Zellen, die verworfen werden können, wenn kein weiteres Experiment erforderlich ist.
HINWEIS: Fügen Sie den Zellsortierpuffer sofort hinzu, wenn das Spaltenreservoir fast leer ist. - Entfernen Sie die Säule aus dem Magnetabscheider, und legen Sie sie auf ein neues Sammelrohr.
- Fügen Sie der Spalte 1 ml Zellsortierpuffer hinzu. Spülen Sie die Säule sofort, indem Sie den mitgelieferten Kolben fest auftragen. Der Durchfluss enthält die magnetisch markierten Zellen.
- Fügen Sie DAPI-Lösung in alle gesammelten magnetisch markierten Zellsuspensionen hinzu, kurz bevor sie auf dem Zellsortierer ausgeführt werden. Stellen Sie die Endkonzentration von DAPI auf 0,3-0,5 μg/ml ein.
- Führen Sie eine FACS-Analyse durch.
6. Muster zur Entschädigung
- Bereiten Sie 6 braune 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor, die als "PE", "APC-Cy7", "APC", "PE-Cy7", "FITC" und "DAPI" gekennzeichnet sind, um Antikörper vor Licht zu schützen. Bereiten Sie ein weiteres 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor, das als "ungefärbt" gekennzeichnet ist.
HINWEIS: Dies könnte gleichzeitig mit der Inkubation der Zellsuspension mit den Mikrokügelchen und Antikörpern erfolgen. Die ungefärbte Probe könnte das Kardiomyozytengewebe sein, das zufällig aus dem geschonten Herzgewebe entnommen und ebenfalls gemäß Schritt 4 behandelt wird. - Verdünnen Sie jeden einzelnen fluoreszenzkonjugierten Antikörper mit Zellsortierpuffer in 1:50 in den 1,5 ml braunen Mikrozentrifugenröhrchen, die entsprechend gekennzeichnet sind.
- Einen Tropfen Kompensationsperlenlösung zugeben und 20 min bei 4 °C inkubieren.
- 2 mL Zellsortierpuffer in jedes 1,5 ml braune Mikrozentrifugenröhrchen geben und bei 450 x g für 5 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand vollständig und resuspendieren Sie das perlenhaltige Pellet mit 300 μL Zellsortierpuffer und geben Sie sie in Zellsortierröhrchen, die ebenfalls entsprechend gekennzeichnet sind.
7. Ausführen auf dem Zellsortierer und Gating-Strategie
- Wenden Sie zuerst die ungefärbten Proben- und Kompensationsröhrchen an und passen Sie die Spannungen jedes Kanals an, um sowohl den positiven als auch den negativen Peak an der richtigen Position der Achse auszurichten. Speichern Sie die Kompensationseinstellungen, und wenden Sie sie auf die folgenden Beispiele an.
- Tragen Sie die Proben auf den Zellsortierer auf. Legen Sie die Gating-Strategie wie in Abbildung 4 beschrieben fest. Herzresidente Makrophagen werden als CD45 hoch CD11b hoch CD64 hoch Ly6Cniedrig / int F4/80hochidentifiziert. DAPI wird als Zelllebensfähigkeitsmarker verwendet.
- Überprüfen Sie die Durchflusszytometrie-Diagramme, um zu bestätigen, dass die interessierende Zellpopulation ordnungsgemäß in den Diagrammen angezeigt wird. Wenn nicht, passen Sie die Spannung jedes Kanals an die Mittelansicht jedes Diagramms an.
- Wenn die Spannungseinstellungen zufriedenstellend sind, starten Sie den Sortiervorgang. Sammeln Sie die sortierte Zellpopulation in ein Kulturmedium, das aus DMEM besteht, das 10% fötales Rinderserum enthält, ergänzt mit 100 μg / ml Streptomycin und 100 U / ml Penicillin.
8. Residente Makrophagenkultur
- Nach dem Sammeln der sortierten Makrophagen übertragen Sie die Zellen sofort entweder auf 35 mm Gewebekulturschalen oder 24 Well-Platten oder verwenden Sie sie direkt für nachfolgende Experimente.
- Um sortierte Makrophagen zu kultivieren, inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5%CO2-Inkubator .
- Wechseln Sie das Kulturmedium alle 48-72 h. Schwebende, tote Zellen können durch Mediumwechsel leicht entfernt werden. Verwenden Sie lebende Makrophagen, die am Boden der Kulturschale befestigt sind, für nachfolgende Experimente.
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Representative Results
Wir beschreiben ein praktisches Verfahren zur Isolierung kardialer Makrophagen speziell aus der SAN- und AVN-Region. Um eine korrekte Dissektion zu bestätigen, wird Massons Trichromfärbung und immunfluoreszierende HCN4-Färbung durchgeführt (Abbildung 3)12. Mit diesem Protokoll könnten wir ungefähr 60.000 Makrophagen aus einem ganzen Herzen sammeln. Abbildung 4 zeigt die Gating-Strategie zur Sortierung von Herzmakrophagen. Lebende residente Herzmakrophagen wurden als CD45+CD11b+F4/80+CD64+Ly6C- identifiziert. Abbildung 5 zeigt frisch sortierte Herzmakrophagen, die durch ihre Oberflächenantigene CD45, F4/80 und CD11b identifiziert wurden. Frisch sortierte Zellen wurden unter Hellfeldansicht des Mikroskops beobachtet (Abbildung 5A). Die sortierten Zellen waren positiv für CD45 (CD45+), wenn sie unter dem Fluorophor-PE-Kanal beobachtet wurden (Abbildung 5B). Die gleiche Ansicht der sortierten Zellen, wenn sie unter dem Fluorophor-APC-Cy7-Kanal beobachtet wurde, zeigte den CD11b+-Phänotyp (Abbildung 5C). Die gleiche Ansicht der sortierten Zellen, wenn sie unter dem Fluorophor-PE-Cy7-Kanal beobachtet wurde, zeigte den Phänotyp F4/80+ (Abbildung 5D). Abbildung 5E ist das mit dem Fluoreszenzmikroskop aufgenommene verschmolzene Bild für die sortierten Zellen. Diese dreifach positiven Zellen wurden als kardiale residente Makrophagen identifiziert. Abbildung 6 zeigt isolierte Herzmakrophagen, die in mittleren bis zu 6 Tagen kultiviert wurden. Weiße Pfeile zeigen Makrophagen an, schwarze Pfeile zeigen schwebende runde tote Zellen an.
Abbildung 1: Anatomie des SAN und AVN unter dem Dissektionsmikroskop. (A) Anatomie des SAN unter dem Dissektionsmikroskop. Die Position des SAN wird durch eine rote gestrichelte Linie innerhalb des Zwischenbereichs (schwarze gestrichelte Linien) angezeigt. (B) Anatomie des AVN unter dem Dissektionsmikroskop. Diese Zahl wurde gegenüber dem zuvor veröffentlichten Artikel10 geändert. Der AVN (roter gestrichelter Kreis) befindet sich an der Spitze des Koch-Dreiecks (weißes gestricheltes Dreieck) nahe der Unterseite des membranösen Septums. Das Dreieck von Koch wird gebildet durch die Sehne von Todaro (TT, grüne gestrichelte Linie), Trikuspidalklappe (TV, blaue gestrichelte Linie) und die Öffnung des Koronarsinus (CS, gelbe gestrichelte Linie). SVC, Vena cava superior; IVC, Vena cava inferior; IAS, interatriales Septum; RA, rechter Vorhof; RAA, rechtes Vorhofanhängsel; RV, rechter Ventrikel; CT, Crista terminalis; IVS, interventrikuläres Septum; OF, ovale Fossa. PA, Lungenarterie; RV, rechter Ventrikel; LV, linker Ventrikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der SAN- und AVN-Lokalisierung. (A) Schematische Darstellung der SAN-Lokalisierung. SAN wird durch einen roten gestrichelten Kreis innerhalb des Interkavalbereichs neben dem CT (schwarze gestrichelte Linie) angezeigt. (B) Schematische Darstellung der AVN-Lokalisierung. AVN wird durch einen roten gestrichelten Kreis innerhalb des Koch-Dreiecks (grau gestricheltes Dreieck) angezeigt, das aus TV und der Öffnung von CS besteht. SVC, obere Hohlvene; IVC, Vena cava inferior; IAS, interatriales Septum; RA, rechter Vorhof; RAA, rechtes Vorhofanhängsel; CT, Crista terminalis; IVS, interventrikuläres Septum; OF, ovale Fossa; IVS, interventrikuläres Septum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Identifizierung von SAN und AVN mit histologischer Färbung. Identifikation des SAN (A,B) und AVN (C,D). Immunfluoreszenzfärbung von Zellen des HCN4-positiven Leitungssystems in SAN (A) und AVN (C) sowie Massons Trichromfärbung von SAN (B) und AVN (D). Rote Pfeile zeigen die Sinusknotenarterie (SNA, B) an, der schwarze Pfeil und die schwarze gestrichelte Linie zeigen das kompakte AVN an, der blaue Pfeil zeigt den zentralen Faserkörper (CFB) an. CT, Crista terminalis; CFB, zentraler Faserkörper; CN, kompaktes AVN; RA, rechter Vorhof; RV, rechter Ventrikel; IAS, interatriales Septum; IVS, interventrikuläres Septum; TV, Trikuspidalklappe; MV, Mitralklappe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Gating-Strategie zur Zellsortierung residenter Herzmakrophagen. Mononukleäre Zellen werden identifiziert, Dubletten werden durch FSC-W vs. FSC-A und tote Zellen durch DAPI (A-D) ausgeschlossen. Lebende Zellen werden auf CD45+ Leukozyten (E) und dann auf CD11b + myeloischen Zellen (F) gesteuert. Herzmakrophagen wurden durch die Expression von F4/80 und CD64 (G) identifiziert und schließlich durch Ly6C-Expression (H) stratifiziert. Lebende residente Herzmakrophagen werden als CD45+CD11b+F4/80+CD64+Ly6C- identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Frisch sortierte Herzmakrophagen und Immunfluoreszenzfärbung. (A) Frisch sortierte Herzmakrophagen. Immunfluoreszenzfärbung spezifischer Oberflächenantigene wie CD45 (B), CD11b (C) oder F4/80 (D). Nach der Gating-Strategie werden Herzmakrophagen als dreifach positive Zellen identifiziert (E). Der Maßstabsbalken stellt 50 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Kultur sortierter Makrophagen. Kultur sortierter Makrophagen im Kulturmedium für 48h (A, B), 96 h (C,D) bzw. 6 Tage (E,F). Es werden zwei einzelne Kulturgerichte pro Zeitpunkt gezeigt (Gericht 1: A, C, E; Gericht 2: B, D, F). Weiße Pfeile zeigen lebende Makrophagen mit spindelartiger Form und typischen Vorsprüngenan 3. Schwarze Pfeile zeigen schwebende runde tote Zellen an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Verbindung | Endkonzentration | g oder ml erforderlich |
| FACS-Puffer | ||
| BSA | 0.50% | |
| EDTA | 2 mM | |
| PBS (1X) | 500ml | |
| Verdauungspuffer | ||
| Kollagenase I | 450 U/ml | |
| Kollagenase XI | 125 U/ml | |
| DNase I | 60 U/ml | |
| Hyaluronidase | 60 U/ml | |
| HEPES-Puffer | 20 μl pro 1 ml | |
| PBS (1X) | Fügen Sie bis zu 1 ml für 2 Proben hinzu | |
| Nährmedium | ||
| DMEM | 79 ml | |
| Penicillin/Streptomycin | 1% | 1 ml |
| FBS | 20% | 20 ml |
| TAE (50x) | ||
| Tris-Basis | 24.20% | 24,2 g |
| 100 % Essigsäure | 5.71% | 5,71 ml |
| 0,5 Mio. EDTA | 0,05 m | 10 ml |
| dH2O | Fügen Sie bis zu 100ml hinzu | |
Tabelle 1: Zusammensetzung der benötigten Lösungen.
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Discussion
In diesem Manuskript beschreiben wir ein Protokoll zur Anreicherung von kardialen residenten Makrophagen speziell aus den SAN- und AVN-Regionen in hoher Reinheit.
Makrophagen werden basierend auf ihrer anatomischen Lage und ihrem funktionellen Phänotyp in Subpopulationen unterteilt. Sie können auch von einem funktionellen Phänotyp auf einen anderen als Reaktion auf variable Mikroumgebungssignale umschalten13. Im Vergleich zu anderen Organen wie Knochenmark und Leber enthält Herzgewebe einen geringeren Prozentsatz an Immunzellen und niedrigere absolute Zahlen jeder zellulären Subpopulation14. Daher sind Zellsortierungs-, Anreicherungs- und Reinigungsmethoden notwendige Werkzeuge, um ausreichende Mengen der interessierenden Zellpopulation zu erhalten. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und MACS ermöglichen es, reine, sortierte Zellpopulationen zu erhalten, da sie die gleichzeitige Messung verschiedener Eigenschaften der Zellen ermöglichen.
Zur Identifizierung von Subpopulationen von Herzmakrophagen 3,6,15 wurden verschiedene Durchflusszytometrie-Panels beschrieben. Die Funktion von Makrophagen im stationären Zustand und Krankheit hängt nicht nur von ihrem Entwicklungsursprung, sondern auch von der Gewebeumgebung ab. Im Allgemeinen enthält das erwachsene Herz zwei Hauptuntergruppen von Ly6C-Low/CCR2-residenten Makrophagen, die unterschiedliche MHC-II-Spiegel exprimieren und sich über lokale Proliferation im Steady State erhalten können, während während der Erkrankung klassische Ly6C-hohe Monozyten an Entzündungsherde rekrutiert werden, wo sie sich in Makrophagen differenzieren16 . Während der Entwicklung besetzen verschiedene Subpopulationen von Makrophagen verschiedene kardiale Stellen, die mit unterschiedlichen Funktionen verbunden sind17. Unser Ziel war es, die residenten Makrophagen speziell aus dem Herzleitungssystem zu untersuchen, insbesondere die residenten Makrophagen aus den SAN- und AVN-Regionen. Nach Hulsmans et al. werden kardiale residente Makrophagen als CD45 hoch CD11b hoch CD64 hoch F4/80 hochLy6Cniedrig/int identifiziert.
Die Ernte von herzresidenten Makrophagen aus einer erwachsenen Maus zur Zellsortierung dauert ca. 3 Stunden. Es ist wichtig, die experimentellen Verfahren logisch anzuordnen und eine Inkubation parallel zuzulassen, um Zeit zu sparen und die Handhabung der möglicherweise fragilen Makrophagen in der Suspension zu minimieren. Da das Sortierverfahren Druck auf die sortierten Zellen ausüben könnte, empfahlen wir, die Sortierzeit durch die Verwendung von Magnetperlen zu reduzieren, was die Sortiereffizienz enorm erhöhen und auch eine höhere Reinheit der residenten Makrophagen ermöglichen könnte.
Die Anwendung dieses Protokolls umfasst, ist aber nicht beschränkt auf die Reinigung von Makrophagen und/oder anderen Nicht-Kardiomyozyten-Zelltypen aus dem Herzgewebe und anderen Mäusestämmen. Die sortierten Makrophagen könnten für nachfolgende Experimente verwendet werden, zum Beispiel Zellmotilitätstests, Gen- oder Proteinexpressionsstudien usw. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung ist auch möglich, indem Zellen einzeln direkt aus dem Sammelröhrchen des Zellsortierers entnommen werden.
Die auf Durchflusszytometrie basierende Zellsortierung hat jedoch ihre Grenzen. Ein präzise gestaltetes Antikörperpanel ist wichtig und muss die Expression von Antigenen auf der interessierenden Zellpopulation und dem an die Antikörper konjugierten Fluorophor berücksichtigen. Die Funktion und Lebensfähigkeit der Zellen könnte durch die bindenden Antikörper verändert werden, was die Ergebnisse nachfolgender Experimente beeinflussen könnte. Darüber hinaus sind die komplexen Zellsortiergeräte teuer, anspruchsvoll und anfällig für Probleme mit Fluidik-Systemblockaden und Laserkalibrierung. Daher sind die Wartung durch einen hochqualifizierten Fachmann und die ordnungsgemäße Bedienung durch einen erfahrenen professionellen Techniker erforderlich. Obwohl die Zellsortierung eine reine Zellpopulation von Interesse liefern könnte, ist die Gesamteffizienz immer noch relativ gering.
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Disclosures
Es wurde kein potenzieller Interessenkonflikt gemeldet, der für diesen Artikel relevant ist.
Acknowledgments
Unterstützt wurde diese Arbeit vom China Scholarship Council (CSC, an R. Xia), vom Deutschen Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK; 81X2600255 an S. Clauss, 81Z0600206 an S. Kääb, 81Z0600204 an C.S.), der Corona Foundation (S199/10079/2019 an S. Clauss), dem SFB 914 (Teilprojekt Z01 an S. Massberg), dem ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 to S. Clauss) und der Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (an S. Clauss). Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories |
References
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- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
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- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R.
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
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- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
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Medizin Ausgabe 171 Herzleitungssystem Sinusknoten atrioventrikulärer Knoten residente Herzmakrophagen Durchflusszytometrie magnetisch aktivierte Zellsortierung MACS fluoreszenzaktivierte Zellsortierung Mikrodissektion primäre ZellkulturErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU)
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU)
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU)
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
