ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Protokollet som presenteras här ger en steg-för-steg-metod för isolering av hjärtboende makrofager från sinoatriell nod (SAN) och atrioventrikulär nod (AVN) region av mushjärtan.
Abstract
Bosatta hjärtmakrofager har visat sig underlätta den elektriska ledningen i hjärtat. Den fysiologiska hjärtrytmen initieras av elektriska impulser som genereras i sinoatriell nod (SAN) och leds sedan till ventriklar via atrioventrikulär nod (AVN). För att ytterligare studera rollen som bosatta makrofager i hjärtledningssystemet är en korrekt isolering av bosatta makrofager från SAN och AVN nödvändig, men det är fortfarande utmanande. Här tillhandahåller vi ett protokoll för tillförlitlig mikrodissektion av SAN och AVN i murina hjärtan följt av isolering och kultur av bosatta makrofager.
Båda, SAN som ligger vid korsningen av crista terminalis med den överlägsna vena cava, och AVN som ligger vid toppen av triangeln i Koch, identifieras och mikrodissekeras. Korrekt placering bekräftas genom histologisk analys av vävnaden utförd med Massons trikromfläck och av anti-HCN4.
Mikrodissekerade vävnader smälts sedan enzymatiskt för att erhålla encellssuspensioner följt av inkubation med en specifik panel av antikroppar riktade mot celltypspecifika ytmarkörer. Detta gör det möjligt att identifiera, räkna eller isolera olika cellpopulationer genom fluorescerande aktiverad cellsortering. För att skilja hjärtboende makrofager från andra immunceller i myokardiet, särskilt rekryterade monocyt-härledda makrofager, behövs en delikat utformad gatingstrategi. Först detekteras lymfoida härstamningsceller och utesluts från vidare analys. Därefter identifieras myeloida celler med bosatta makrofager som bestäms av högt uttryck av både CD45 och CD11b och lågt uttryck av Ly6C. Med cellsortering kan isolerade hjärtmakrofager sedan odlas in vitro under flera dagar för vidare undersökning. Vi beskriver därför ett protokoll för att isolera hjärtboende makrofager som finns i hjärtledningssystemet. Vi diskuterar fallgropar vid mikrodissekering och smältning av SAN och AVN, och tillhandahåller en grindstrategi för att på ett tillförlitligt sätt identifiera, räkna och sortera hjärtmakrofager genom fluorescensaktiverad cellsortering.
Introduction
Den sinoatriella noden (SAN) initierar fysiologiskt den elektriska impulsen och är därför hjärtats primära pacemaker. Den atrioventrikulära noden (AVN) leder den elektriska impulsen från förmaken till ventriklarna och fungerar också som en underordnad pacemaker1. I allmänhet är generering och ledning av elektriska impulser en komplex process som kan moduleras av olika faktorer2, inklusive bosatt makrofag i SAN / AVN-regioner. visar en specifik population av hjärtboende makrofager som är berikade i AVN och fungerar som nyckelspelare för att hålla en stadig hjärtslag3. De fann att makrofager är elektriskt kopplade till kardiomyocyterna och kan förändra de elektriska egenskaperna hos kopplade kardiomyocyter. Författarna noterar också att sådana ledande celler som interfolierar med makrofager också finns i andra komponenter i hjärtledningssystemet, såsom SAN.
För närvarande är det inte helt känt om fenotypen hos bosatta hjärtmakrofager skiljer sig mellan hjärtregionerna. Det har emellertid visats att vävnadsmikromiljön kan påverka transkription och proliferativ förnyelse av vävnadsmakrofager4. Eftersom kardiomyocytfenotypen har visat sig vara olika mellan regioner kan makrofagernas funktionella effekter på kardiomyocyter också vara regionspecifika, även om makrofagfenotypen i sig kan vara densamma. Därför behövs ytterligare studier om specifika hjärtregioner.
Nya studier har visat att vid steady state etableras de vävnadsboende makrofagerna prenatalt, uppstår oberoende av definitiv hematopoiesis och kvarstår i vuxen ålder5. Men efter makrofagutarmning eller under hjärtinflammation bidrar Ly6chi-monocyter till att fylla på hjärtmakrofagpopulationen6. Studier som involverade genetisk härstamningsspårning, parabios, ödekartläggning och cellspårning visade samexistensen av en mängd olika vävnadsboende makrofagpopulationer i organ och vävnader, och även olika cellulära beteenden hos makrofagundergrupper som potentiellt är associerade med deras ontogeni 7,8,9.
Karakterisering av bosatta hjärtmakrofager har gynnats av användningen av magnetisk aktiverad cellsortering (MACS) och fluorescerande aktiverad cellsortering. Dessa metoder är särskilt användbara för att isolera specifika cellpopulationer från flera vävnadsfraktioner genom att märka dem med sina cellytmarkörer. Detta leder inte bara till en högre renhet av den isolerade immuncelltypen, utan möjliggör också fenotypisk analys. Här presenterar vi ett protokoll inklusive magnetiska pärlor-belagda celler följt av fluorescerande aktiverad cellsortering för anrikning av hjärtboende makrofager specifikt isolerade från SAN- och AVN-regionen.
För att utforska egenskaperna hos hjärtboende makrofager i ledningssystemet och deras funktion för hjärtledning och arytmogenes är exakt lokalisering och dissektion av SAN och AVN avgörande. För mikrodissektion av SAN och AVN används anatomiska landmärken för regionidentifiering10. I korthet ligger SAN vid korsningen av den överlägsna vena cava och högra atriumet. AVN ligger inom triangeln i Koch, som är främre gränsad av tricuspidventilens septalbroschyr och bakre av senan i Todaro11. Vi tillhandahåller också en exakt mikrodissektionsprocedur av SAN och AVN hos möss som bekräftas av histologi och immunofluorescensfärgning.
Isolerade bosatta makrofager kan användas för ytterligare experiment som RNA-sekvensering eller kan återvinnas och odlas i mer än två veckor vilket möjliggör olika in vitro-experiment. Därför beskriver vårt protokoll ett mycket värdefullt förfarande för immunrytmologen. Tabell 1 visar sammansättningen av alla lösningar som behövs, figur 1 visar mikrodissektionsmärkena för SAN och AVN. Figur 2 är schematisk illustration av SAN- och AVN-lokalisering. Figur 3 visar den histologiska färgningen av SAN och AVN (Massons trikrom- och immunofluorescensfärgning). Figur 4 visar en steg-för-steg-grindstrategi för att isolera hjärtboende makrofager genom fluorescensaktiverad cellsortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurvård och alla experimentella förfaranden genomfördes i enlighet med riktlinjerna från djurvårds- och etikkommittén vid universitetet i München och alla förfaranden som genomfördes på möss godkändes av regeringen i Bayern, München, Tyskland. C57BL6/J-möss erhölls kommersiellt.
1. Förberedelser
- Förbered cellsorteringsbufferten (tabell 1) och förvara vid 4 °C.
OBS: Under hela experimentproceduren bör cellsorteringsbufferten alltid vara på is. - Förbered matsmältningsbufferten (tabell 1) strax före matsmältningen eftersom kollagenasaktiviteten endast kunde detekteras i några timmar vid rumstemperatur.
- Se det tidigare publicerade protokollet för beredning av dissektionsskål10. I korthet, tillsätt 30 ml agarosgel (3% -4%) i en petriskål med en diameter på 100 mm och svalna vid rumstemperatur.
2. Djuroffer och hjärtexcision
- Bedöva musen med isofluran genom att placera den i en inkubationskammare ansluten till en isofluranförångare och spolad med 5% isofluran / 95% syre.
- Efter injektion av fentanyl för analgesi, öppna bröstkorgen och perfusera hjärtat genom att injicera 5-10 ml iskall 1x PBS direkt i vänster kammare (LV). Extrahera mössens hjärta och lägg det på dissektionsskålen. Experimentella detaljer har beskrivits i detalj tidigare10.
3. Mikrodissektion av SAN och AVN
- Efter att ha isolerat hjärtat, utför följande mikrodissektionsprocedurer i dissektionsskålen med iskall 1x PBS under dissekeringsmikroskopet.
- Använd de hjärtanatomiska landmärkena, dvs aorta, lungartär, koronar sinus, vänster / höger kammare, etc. för att bestämma vänster / höger (vänster: LV; höger: RV) och främre / bakre (främre: aorta; bakre: koronar sinus) av hjärtat. När orienteringen är bestämd, vänd runt hjärtat med framsidan av det längst ner på skålen (för att exponera de stora venerna som ligger bakre).
- Mikrodissektion av SAN
OBS: Mikrodissektion av SAN har tidigare beskrivits10. Processen beskrivs i korthet nedan.- Exponera den interkavala regionen genom att fästa de högra förmaksbihangen (RAA) och vävnaden intill överlägsen vena cava (SVC) och underlägsen vena cava (IVC) på mikrodissektionsskålen med hjälp av insektsstift.
- Skär hjärtat längs det interatriella septumet parallellt med crista terminalis (CT) för att separera den interkavala regionen och för att erhålla SAN-provet (figur 1A, figur 2A). Lägg provet i ett tomt 1,5 ml mikrocentrifugrör på is.
- Mikrodissektion av AVN
- Efter insamling av SAN-provet se till att RAA och delar av det högra atriumet (RA) redan har skurits bort och lämnar endast interatrial septum (IAS) och interventrikulär septum (IVS).
- Fäst de återstående delarna av hjärtat genom vävnaden intill IAS och IVS med hjälp av insektsstift för att göra den högra förmakssidan av IAS uppåt.
- Titta på det högra atriumet på endokardialytan för triangeln i Koch. Det kommer att gränsas främre av gångjärnslinjen i septalbladet på tricuspidventilen (TV) och bakåt av todaros sena. Öppningen av koronar sinus observeras vid basen. (Figur 1B, figur 2B).
- Skär triangeln av Koch, som innehåller AVN, och lägg den direkt i ett tomt 1,5 ml mikrocentrifugrör på is.
4. Matsmältning
- Förbered digestionsbufferten (tabell 1) strax före användning.
- Hacka SAN- och AVN-vävnaden väl med skalpeller.
OBS: Att bryta vävnadsbrunnen ökar matsmältningseffektiviteten och hjälper till att få bra cellsuspension för sortering. Eftersom SAN- och AVN-proverna är ganska små rekommenderas att man bryter vävnaden direkt inuti 1,5 ml mikrocentrifugröret för att minska förlusten av provet. - Tillsätt 500 μl rötbuffert per prov och skölj bort all malet vävnad från väggen i 1,5 ml mikrocentrifugröret. Mild pipettering hjälper till att smälta provet.
- Homogenisera röret på en virvelmaskin (inställningar: 37 °C, 750 rpm i 1 h).
- Efter uppslutningen överför du vävnadssuspensionen till ett nytt 15 ml centrifugrör genom att passera genom en 40 μm cellsil. Skölj cellsilen med ytterligare 5 ml cellsorteringsbuffert för att stoppa matsmältningen.
- Centrifugera 15 ml röret vid 350 x g i 7 minuter vid 4 °C. Ta sedan bort supernatanten helt med pipetten. Återsuspendera cellpelleten med 90 μL cellsorteringsbuffert.
OBS: Före magnetisk separation, pipettera cellsuspensionen försiktigt några gånger eller passera genom en 30 μm cellsil för att vid behov avlägsna cellklumpar för att erhålla en enda cellsuspension för optimal prestanda för magnetisk anrikning av intressanta cellpopulationer.
5. Magnetisk anrikning av CD45 och provfärgning
OBS: För att isolera hjärtmakrofagerna med hög sorteringseffektivitet utfördes uteslutning av oönskade celler inklusive lymfocyter med CD45-mikrober enligt tillverkarens protokoll. Baserat på sorteringspanelen identifierades hjärtboende makrofager som CD45 hög CD11b hög CD64 hög Ly6Clåg / int F4 / 80 hög.
- Tillsätt 10 μl CD45-mikrober per 107 celler totalt till cellsuspensionen i 15 ml centrifugröret. Blanda proverna väl och inkubera dem i 15 minuter vid 4 °C.
OBS: Cellräkningen med hjälp av en hemocytometer bör göras kort för att se till att varje rör inte innehåller mer än 107 celler totalt. När du arbetar med högre cellnummer måste volymen magnetiska pärlor skalas upp. - Bered antikroppsblandningen genom att späda ut följande antikroppar i cellsorteringsbufferten (1:100 utspädning för varje antikropp): CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI kommer att läggas till senare i färgningen för levande / död diskriminering.
- Efter 15 minuters magnetisk pärlinkubation, tillsätt 100 μl antikroppsblandning direkt i cellsuspensionen i 15 ml-röret (då är alla antikroppars slutliga koncentration 1:200) och inkubera i 20 minuter vid 4 °C.
- Efter 20 minuters antikroppsinkubation, tvätta cellsuspensionen genom att tillsätta 1-2 ml cellsorteringsbuffert per 107 celler och centrifugera vid 350 x g i 10 min. Ta bort supernatanten helt genom pipettering.
- Återsuspendera upp till 108 celler i 500 μl cellsorteringsbuffert.
OBS: Det maximala cellantalet för magnetisk separation bör bestämmas enligt tillverkarens protokoll. - Förbered den magnetiska separationssatsen.
- Fäst magnetkolonnen på en lämplig magnetisk separator och placera ett uppsamlingsrör under magnetkolonnen.
- Förbered de magnetiska kolumnerna genom att skölja med cellsorteringsbuffert: tillsätt 500 μL cellsorteringsbuffert högst upp i kolonnen och låt bufferten passera igenom.
- Applicera cellsuspensionen omedelbart på kolumnen medan cellsorteringsbufferten passerar igenom.
OBS: Undvik bildandet av luftbubblor i kolonnen. Enligt tillverkarens protokoll, även om kolonnfyllningstiden kan förändras från lagringsförhållandena, har det inget inflytande på separationens kvalitet. - Tvätta kolonnen med 3 x 500 μl cellsorteringsbuffert. Genomströmningen i steg 5.7 och steg 5.8 innehåller omärkta celler, som kan kasseras om inget ytterligare experiment behövs.
Lägg till cellsorteringsbufferten omedelbart när kolumnbehållaren är nästan tom. - Ta bort kolonnen från magnetavskiljaren och placera den på ett nytt uppsamlingsrör.
- Lägg till 1 ml cellsorteringsbuffert i kolumnen. Spola omedelbart kolonnen genom att applicera kolven som medföljer kolonnen ordentligt. Genomströmningen innehåller de magnetiskt märkta cellerna.
- Tillsätt DAPI-lösning i alla insamlade magnetiskt märkta cellsuspensioner strax innan du kör dem på cellsorteraren. Justera den slutliga koncentrationen av DAPI till 0,3-0,5 μg/ml.
- Utför FACS-analys.
6. Prover för ersättning
- Förbered 6 bruna 1,5 ml mikrocentrifugrör märkta som "PE", "APC-Cy7", "APC", "PE-Cy7", "FITC" respektive "DAPI" för att skydda antikroppar från ljus. Förbered ytterligare ett 1,5 ml mikrocentrifugrör märkt som "ofärgat".
OBS: Detta kan göras samtidigt som cellsuspensionen inkuberas med mikroberna och antikropparna. Det ostoppade provet kan vara den kardiomyocytvävnad som samlas slumpmässigt från den skonade hjärtvävnaden och även behandlas enligt steg 4. - Späd varje enskild fluorescenskonjugerad antikropp med cellsorteringsbuffert i 1:50 i de 1,5 ml bruna mikrocentrifugrören som är märkta i enlighet därmed.
- Tillsätt en droppe kompensationspärllösning och inkubera i 20 minuter vid 4 °C.
- Tillsätt 2 ml cellsorteringsbuffert i varje 1,5 ml brunt mikrocentrifugrör och centrifugera vid 450 x g i 5 minuter. Kassera supernatanten helt och återsuspendera pärlan som innehåller pellet med 300 μL cellsorteringsbuffert och överför dem till cellsorteringsrör som också är märkta i enlighet därmed.
7. Kör på cellsorteraren och gatingstrategin
- Applicera de ofärgade prov- och kompensationsrören först och justera spänningarna för varje kanal för att justera både den positiva och negativa toppen till rätt position på axeln. Spara kompensationsinställningarna och tillämpa dem på följande exempel.
- Använd proverna på cellsorteraren. Ställ in grindstrategin enligt beskrivningen i figur 4. Hjärtboende makrofager identifieras som CD45 hög CD11b hög CD64 hög Ly6Clåg / int F4 / 80hög. DAPI används som en cellviabilitetsmarkör.
- Kontrollera flödescytometridiagrammen för att bekräfta att cellpopulationen av intresse visas korrekt på diagrammen. Om inte, justera spänningen för varje kanal till mittvyn för varje diagram.
- Om spänningsinställningarna är tillfredsställande, starta sorteringsproceduren. Samla den sorterade cellpopulationen i odlingsmedium bestående av DMEM innehållande 10% fosterserum från nötkreatur, kompletterat med 100 μg / ml streptomycin och 100 U / ml penicillin.
8. Bosatt makrofagkultur
- Efter att ha samlat de sorterade makrofagerna, överför cellerna omedelbart antingen till 35 mm vävnadsodlingsskålar eller 24 brunnsplattor, eller använd dem direkt för efterföljande experiment.
- För att odla sorterade makrofager, inkubera cellerna vid 37 °C, 5% CO2 inkubator.
- Byt odlingsmedium var 48-72 timmar. Flytande döda celler kan enkelt avlägsnas genom medium förändring. Använd levande makrofager som fästs på botten av kulturskålen för efterföljande experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi beskriver ett praktiskt förfarande för isolering av hjärtboende makrofager specifikt från SAN- och AVN-regionen. För att bekräfta en korrekt dissektion utförs Massons trikromfärgning och immunofluorescerande HCN4-färgning (figur 3)12. Med detta protokoll kunde vi samla cirka 60 000 makrofager från ett helt hjärta. Figur 4 visar grindstrategin för sortering av hjärtmakrofager. Levande bosatta hjärtmakrofager identifierades som CD45 + CD11b + F4 / 80 + CD64 + Ly6C -. Figur 5 visar nysorterade hjärtmakrofager som identifierades av deras ytantigener CD45, F4/80 och CD11b. Nysorterade celler observerades under ljusfältsvy av mikroskop (figur 5A). De sorterade cellerna var positiva för CD45 (CD45+) när de observerades under fluorofor-PE-kanalen (figur 5B). Samma vy av de sorterade cellerna när de observerades under fluorofor-APC-Cy7-kanalen visade CD11b + fenotyp (figur 5C). Samma vy av de sorterade cellerna när de observerades under fluorofor-PE-Cy7-kanalen visade F4/80+ fenotyp (figur 5D). Figur 5E är den sammanslagna bilden som erhållits med det fluorescerande mikroskopet för de sorterade cellerna. Dessa trippelpositiva celler identifierades som hjärtboende makrofager. Figur 6 visar isolerade hjärtmakrofager odlade i medium upp till 6 dagar. Vita pilar indikerar makrofager, svarta pilar indikerade flytande runda döda celler.
Figur 1: Anatomi av SAN och AVN under dissektionsmikroskopet. (A) SAN: s anatomi under dissektionsmikroskopet. Platsen för SAN indikeras med röd streckad linje inom det interkavala området (svarta streckade linjer). (B) AVN: s anatomi under dissektionsmikroskopet. Denna siffra har ändrats från tidigare publicerad artikel10. AVN (röd streckad cirkel) ligger vid toppen av triangeln Koch (vit streckad triangel) nära botten av den membranösa septum. Kochs triangel bildas av todaros sena (TT, grön streckad linje), tricuspidventil (TV, blå streckad linje) och öppningen av koronar sinus (CS, gul streckad linje). SVC, överlägsen vena cava; IVC, sämre vena cava; IAS, interatrial septum; RA, höger atrium; RAA, höger förmaksbihang; Husbil, höger kammare; CT, Crista terminalis; IVS, interventrikulär septum; AV, oval fossa. PA, lungartär; Husbil, höger kammare; LV, vänster kammare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Schematisk illustration av SAN- och AVN-lokalisering. (A) schematisk illustration av SAN-lokalisering. SAN indikeras av en röd streckad cirkel inom interkavalregionen förutom CT (svart streckad linje). (B) schematisk illustration av AVN-lokalisering. AVN indikeras av en röd streckad cirkel inuti Koch-triangeln (grå streckad triangel) bestående av TV och öppningen av CS. SVC, överlägsen vena cava; IVC, sämre vena cava; IAS, interatrial septum; RA, höger atrium; RAA, höger förmaksbihang; CT, Crista terminalis; IVS, interventrikulär septum; AV, oval fossa; IVS, interventrikulär septum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Identifiering av SAN och AVN med histologisk fläck. Identifiering av SAN (A,B) och AVN (C,D). Immunofluorescerande färgning av HCN4-positiva ledningssystemceller i SAN (A) och AVN (C) samt Massons trikromfärgning av SAN (B) och AVN (D). Röda pilar indikerar sinusnodartär (SNA, B), svart pil och svart streckad linje indikerar kompakt AVN, blå pil indikerar den centrala fibrösa kroppen (CFB). CT, crista terminalis; CFB, central fibrös kropp; CN, kompakt AVN; RA, höger atrium; Husbil, höger kammare; IAS, interatrial septum; IVS, interventrikulär septum; TV, tricuspidventil; MV, mitralventil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Gating-strategi för cellsortering av bosatta hjärtmakrofager. Mononukleära celler identifieras, dubbletter utesluts av FSC-W vs. FSC-A och döda celler utesluts av DAPI (A-D). Levande celler är gated på CD45 + leukocyter (E) och sedan gated på CD11b + myeloida celler (F). Hjärtmakrofager identifierades genom uttrycket av både F4/80 och CD64 (G) och stratifierades sedan slutligen med Ly6C-uttryck (H). Levande bosatta hjärtmakrofager identifieras som CD45 + CD11b + F4 / 80 + CD64 + Ly6C-. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Nysorterade hjärtmakrofager och immunofluorescerande färgning. (A) Nysorterade hjärtmakrofager. Immunofluorescerande färgning av specifika ytantigener såsom CD45 (B), CD11b (C) eller F4/80 (D). Enligt grindstrategin identifieras hjärtmakrofager som trippelpositiva celler (E). Skalstrecket representerar 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Kultur av sorterade makrofager. Odling av sorterade makrofager i odlingsmedium i 48h (A, B), 96 h (C,D) respektive 6 dagar (E,F). Två individuella kulturrätter per tidpunkt visas (maträtt 1: A, C, E; maträtt 2: B, D, F). Vita pilar indikerar levande makrofager med spindelliknande form och typiska utsprång3. Svarta pilar indikerar flytande döda celler med rund form. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Förening | Slutlig koncentration | g eller ml krävs |
| FACS-buffert | ||
| BSA | 0.50% | |
| EDTA | 2 mM | |
| Pbs (1X) | 500 ml | |
| Matsmältningsbuffert | ||
| Kollagenas I | 450 U/ml | |
| Kollagenas XI | 125 U/ml | |
| DNase I | 60 U/ml | |
| Hyaluronidase | 60 U/ml | |
| HEPES-buffert | 20 μl per 1 ml | |
| Pbs (1X) | Tillsätt upp till 1 ml för 2 prover | |
| Kultur medium | ||
| DMEM | 79 ml | |
| Penicillin/streptomycin | 1% | 1 ml |
| FBS | 20% | 20 ml |
| TAE (50x) | ||
| Tris-bas | 24.20% | 24,2 g |
| 100 % ättiksyra | 5.71% | 5,71 ml |
| 0,5 miljoner EDTA | 0,05 m | 10 ml |
| dH2O | Tillsätt upp till 100 ml | |
Tabell 1: Sammansättning av lösningar som behövs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta manuskript beskriver vi ett protokoll för anrikning av hjärtboende makrofager specifikt från SAN- och AVN-regionerna vid hög renhet.
Makrofager är indelade i delpopulationer baserat på deras anatomiska läge och funktionella fenotyp. De kan också växla från en funktionell fenotyp till en annan som svar på variabla mikromiljösignaler13. Jämfört med andra organ som benmärg och lever innehåller hjärtvävnad en lägre andel immunceller och lägre absoluta tal för varje cellulär delpopulation14. Därför är cellsorterings-, anriknings- och reningsmetoder nödvändiga verktyg för att erhålla tillräckliga mängder av cellpopulationen av intresse. Fluorescensaktiverad cellsortering och MACS gör det möjligt att erhålla rena, sorterade cellpopulationer eftersom det möjliggör samtidig mätning av olika egenskaper hos cellerna.
Olika flödescytometripaneler har beskrivits för identifiering av delpopulationer av hjärtmakrofager 3,6,15. Makrofagernas funktion i steady state och sjukdom beror inte bara på deras utvecklingsursprung utan också på vävnadsmiljön. I allmänhet innehåller det vuxna hjärtat två stora delmängder av Ly6Clåg / CCR2-bosatta makrofager som uttrycker olika nivåer av MHC-II och som kan upprätthålla sig via lokal proliferation vid steady state medan klassiska Ly6C-höga monocyter under sjukdom rekryteras till inflammationsställen, där de differentieras till makrofager16 . Under utvecklingen upptar olika delpopulationer av makrofager olika hjärtplatser associerade med distinkta funktioner17. Vi syftade till att studera de bosatta makrofagerna specifikt från hjärtledningssystemet, särskilt de bosatta makrofagerna från SAN- och AVN-regionerna. Enligt Hulsmans et al. hjärtboende makrofager identifieras som CD45 hög CD11b hög CD64 hög F4/80 högLy6Clåg / int.
Skörden av hjärtboende makrofager från en vuxen mus för cellsortering kräver cirka 3 timmar. Det är viktigt att ordna de experimentella procedurerna logiskt och att tillåta inkubation parallellt för att spara tid och för att minimera hanteringen av de eventuellt bräckliga makrofagerna i suspensionen. Eftersom sorteringsförfarandet kunde utöva tryck på de sorterade cellerna, rekommenderade vi att minska sorteringstiden genom att använda magnetiska pärlor som kan öka sorteringseffektiviteten enormt och också gör det möjligt att få högre renhet hos bosatta makrofager.
Tillämpningen av detta protokoll inkluderar men är inte begränsat till rening av makrofager och / eller någon annan icke-kardiomyocytcelltyp från hjärtvävnaden och andra mössstammar. De sorterade makrofagerna kan användas för efterföljande experiment, till exempel cellmotilitetsanalyser, gen- eller proteinuttrycksstudier etc. Encells RNA-sekvensering är också möjlig genom att samla celler en efter en direkt från cellsorterarens uppsamlingsrör.
Flödescytometribaserad cellsortering har dock sina begränsningar. En exakt utformad antikroppspanel är viktig och måste ta hänsyn till uttrycket av antigener på cellpopulationen av intresse och fluoroforen konjugerad till antikropparna. Cellernas funktion och livskraft kan förändras av de bindande antikropparna, vilket kan påverka resultaten av efterföljande experiment. Dessutom är de komplexa cellsorteringsinstrumenten dyra, sofistikerade och också benägna att få problem med blockeringar av fluidiksystem och laserkalibrering. Därför krävs underhåll av högutbildad specialist och korrekt drift av en erfaren professionell tekniker. Även om cellsortering skulle kunna ge en ren cellpopulation av intresse är den totala effektiviteten fortfarande relativt låg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen potentiell intressekonflikt som är relevant för denna artikel rapporterades.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av China Scholarship Council (CSC, till R. Xia), det tyska centret för kardiovaskulär forskning (DZHK; 81X2600255 till S. Clauss, 81Z0600206 till S. Kääb, 81Z0600204 till CS), Corona Foundation (S199/10079/2019 till S. Clauss), SFB 914 (projekt Z01 till S. Massberg), ERA-NET om hjärt-kärlsjukdomar (ERA-CVD; 01KL1910 till S. Clauss) och Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (till S. Clauss). Finansiärerna hade ingen roll i manuskriptförberedelserna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories |
References
- Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R.
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Pinto, A. R., et al.
- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
Tags
Medicin utgåva 171 hjärtledningssystem sinoatrial nod atrioventrikulär nod bosatta hjärtmakrofager flödescytometri magnetisk aktiverad cellsortering MACS fluorescensaktiverad cellsortering mikrodissektion primär cellodlingErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU)
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU)
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU)
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
