ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Het hier gepresenteerde protocol biedt een stapsgewijze aanpak voor de isolatie van cardiale residente macrofagen uit het sinoatriale knooppunt (SAN) en atrioventriculaire knoop (AVN) gebied van muizenharten.
Abstract
Van residente cardiale macrofagen is aangetoond dat ze de elektrische geleiding in het hart vergemakkelijken. Het fysiologische hartritme wordt geïnitieerd door elektrische impulsen gegenereerd in sinoatriale knoop (SAN) en vervolgens geleid naar ventrikels via atrioventriculaire knoop (AVN). Om de rol van residente macrofagen in het hartgeleidingssysteem verder te bestuderen, is een goede isolatie van residente macrofagen van SAN en AVN noodzakelijk, maar het blijft een uitdaging. Hier bieden we een protocol voor de betrouwbare microdissectie van de SAN en AVN in muizenharten, gevolgd door de isolatie en cultuur van residente macrofagen.
Zowel SAN, dat zich op de kruising van de crista terminalis met de superieure vena cava bevindt, als AVN dat zich op de top van de driehoek van Koch bevindt, worden geïdentificeerd en gemicrodisseceerd. De juiste locatie wordt bevestigd door histologische analyse van het weefsel uitgevoerd met Masson's trichrome kleuring en door anti-HCN4.
Microdissected weefsels worden vervolgens enzymatisch verteerd om eencellige suspensies te verkrijgen, gevolgd door de incubatie met een specifiek panel van antilichamen gericht tegen celtypespecifieke oppervlaktemarkers. Dit maakt het mogelijk om verschillende celpopulaties te identificeren, te tellen of te isoleren door fluorescentie geactiveerde celsortering. Om cardiale residente macrofagen te onderscheiden van andere immuuncellen in het myocardium, met name gerekruteerde van monocyten afgeleide macrofagen, is een delicate bedachte gatingstrategie nodig. Ten eerste worden lymfoïde afstammingscellen gedetecteerd en uitgesloten van verdere analyse. Vervolgens worden myeloïde cellen geïdentificeerd met residente macrofagen die worden bepaald door hoge expressie van zowel CD45 als CD11b en lage expressie van Ly6C. Met celsortering kunnen geïsoleerde hartmacrofagen vervolgens gedurende meerdere dagen in vitro worden gekweekt voor verder onderzoek. We beschrijven daarom een protocol om cardiale residente macrofagen te isoleren die zich in het hartgeleidingssysteem bevinden. We bespreken valkuilen bij het microdissecteren en verteren van SAN en AVN, en bieden een gating-strategie om cardiale macrofagen betrouwbaar te identificeren, tellen en sorteren door fluorescentie-geactiveerde celsortering.
Introduction
De sinoatriale knoop (SAN) initieert fysiologisch de elektrische impuls en is daarom de primaire pacemaker van het hart. De atrioventriculaire knoop (AVN) geleidt de elektrische impuls van de boezems naar de ventrikels en fungeert ook als een secundaire pacemaker1. Over het algemeen is het genereren en geleiden van elektrische impulsen een complex proces dat kan worden gemoduleerd door verschillende factoren2, waaronder residente macrofaag in SAN / AVN-regio's. Een recente studie van Hulsmans et al. toont een specifieke populatie van cardiale macrofagen die verrijkt zijn in de AVN en functioneren als belangrijke spelers bij het houden van een stabiele hartslag3. Ze ontdekten dat macrofagen elektrisch gekoppeld zijn aan de cardiomyocyten en de elektrische eigenschappen van gekoppelde cardiomyocyten kunnen veranderen. De auteurs merken ook op dat dergelijke geleidende cellen die interleaving met macrofagen ook aanwezig zijn in andere componenten van het hartgeleidingssysteem, zoals het SAN.
Momenteel is het niet volledig bekend of het fenotype van residente cardiale macrofagen verschilt tussen de hartregio's. Het is echter aangetoond dat de weefselmicro-omgeving de transcriptie en proliferatieve vernieuwing van weefselmacrofagen kan beïnvloeden4. Aangezien is aangetoond dat het fenotype van cardiomyocyten verschilt tussen regio's, kunnen de functionele effecten van macrofagen op cardiomyocyten ook regiospecifiek zijn, zelfs als het macrofaagfenotype zelf hetzelfde kan zijn. Daarom zijn verdere studies over specifieke hartregio's nodig.
Recente studies hebben aangetoond dat, in steady state, de weefselresidente macrofagen prenataal worden vastgesteld, onafhankelijk van definitieve hematopoëse ontstaan en aanhouden tot in de volwassenheid5. Echter, na macrofaag uitputting of tijdens hartontsteking, Ly6chi monocyten bijdragen aan het aanvullen van cardiale macrofaag populatie6. Studies met betrekking tot genetische afstammingstracering, parabiose, lotkartering en celtracking toonden de coëxistentie aan van een verscheidenheid aan weefselresidente macrofagenpopulaties in organen en weefsels, en ook verschillend cellulair gedrag van macrofaagsubsets die mogelijk geassocieerd zijn met hun ontogenie 7,8,9.
Karakterisering van residente cardiale macrofagen heeft geprofiteerd van het gebruik van magnetische geactiveerde celsortering (MACS) en fluorescente geactiveerde celsortering. Deze methoden zijn vooral nuttig voor het isoleren van specifieke celpopulaties van meerdere weefselfracties door ze te labelen met hun celoppervlakmarkers. Dit leidt niet alleen tot een hogere zuiverheid van het geïsoleerde immuunceltype, maar maakt ook fenotypische analyse mogelijk. Hier presenteren we een protocol met magnetische kralen-gecoate cellen gevolgd door fluorescente geactiveerde celsortering voor de verrijking van cardiale residente macrofagen die specifiek geïsoleerd zijn uit het SAN- en AVN-gebied.
Om de kenmerken van cardiale macrofagen in het geleidingssysteem en hun functie voor hartgeleiding en aritmogenese te onderzoeken, zijn nauwkeurige lokalisatie en dissectie van SAN en AVN van cruciaal belang. Voor microdissectie van SAN en AVN worden anatomische oriëntatiepunten gebruikt voor de regio-identificatie10. Kortom, SAN bevindt zich op de kruising van de superieure vena cava en het rechter atrium. AVN bevindt zich binnen de driehoek van Koch, die vooraan wordt begrensd door de septumfolder van de tricuspidalisklep en achteraan door de pees van Todaro11. We bieden ook een nauwkeurige microdissectieprocedure van SAN en AVN bij muizen, die wordt bevestigd door histologie en immunofluorescentiekleuring.
Geïsoleerde residente macrofagen kunnen worden gebruikt voor verdere experimenten zoals RNA-sequencing of kunnen worden hersteld en gedurende meer dan twee weken worden gekweekt, waardoor verschillende in vitro experimenten mogelijk zijn. Daarom beschrijft ons protocol een zeer waardevolle procedure voor de immunoritmoloog. Tabel 1 toont de samenstelling van alle benodigde oplossingen, figuur 1 toont de microdissectie-oriëntatiepunten voor SAN en AVN. Figuur 2 is een schematische illustratie van SAN- en AVN-lokalisatie. Figuur 3 toont de histologische kleuring van SAN en AVN (Masson's trichrome en immunofluorescentiekleuring). Figuur 4 toont een stapsgewijze gatingstrategie om cardiale residente macrofagen te isoleren door fluorescentie-geactiveerde celsortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierverzorging en alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Animal Care and Ethics-commissie van de Universiteit van München en alle procedures die op muizen werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door de regering van Beieren, München, Duitsland. C57BL6/J muizen werden commercieel verkregen.
1. Voorbereidingen
- Bereid celsorteerbuffer voor (tabel 1) en bewaar bij 4 °C.
OPMERKING: Tijdens de hele experimentele procedure moet de celsorteerbuffer altijd op ijs staan. - Bereid de digestiebuffer (tabel 1) kort voor de spijsvertering voor, omdat de activiteit van collagenase slechts enkele uren bij kamertemperatuur kon worden gedetecteerd.
- Raadpleeg het eerder gepubliceerde protocol voor de bereiding van dissectieschotel10. Kortom, voeg 30 ml agarosegel (3%-4%) toe aan een petrischaal met een diameter van 100 mm en koel af bij kamertemperatuur.
2. Dierenoffers en hartuitsnijding
- Verdoof de muis met isofluraan door hem in een incubatiekamer te plaatsen die verbonden is met een isofluraanverdamper en gespoeld met 5% isofluraan/95% zuurstof.
- Na de injectie van fentanyl voor analgesie, open de ribbenkast en perfuseer het hart door 5-10 ml ijskoude 1x PBS rechtstreeks in de linker ventrikel (LV) te injecteren. Haal het muizenhart eruit en leg het op de dissectieschaal. Experimentele details zijn eerder in detail beschreven10.
3. Microdissectie van SAN en AVN
- Na het isoleren van het hart, voert u de volgende microdissectieprocedures uit in de dissectieschaal met ijskoude 1x PBS onder de ontleedmicroscoop.
- Gebruik de cardiale anatomische oriëntatiepunten, d.w.z. aorta, longslagader, coronaire sinus, linker / rechter ventrikel, enz. om links/rechts (links: LV; rechts: RV) en anterieur/posterior (anterior: aorta; posterior: coronaire sinus) van het hart te bepalen. Nadat de oriëntatie is bepaald, draait u het hart rond met de voorkant ervan aan de onderkant van de schaal (om de grote aderen bloot te leggen die zich achteraan bevinden).
- Microdissectie van SAN
OPMERKING: Microdissectie van het SAN is eerder beschreven10. Het proces wordt hieronder in het kort beschreven.- Stel het inter-cavaleriegebied bloot door de rechter atriale aanhangsels (RAA) en het weefsel naast superieure vena cava (SVC) en inferieure vena cava (IVC) op de microdissectieschaal te pinnen met behulp van insectenpennen.
- Snijd het hart langs het interatriale septum parallel aan de crista terminalis (CT) om het inter-cavalgebied te scheiden en het SAN-monster te verkrijgen (figuur 1A, figuur 2A). Doe het monster in een lege microcentrifugebuis van 1,5 ml op ijs.
- Microdissectie van AVN
- Zorg er na het verzamelen van het SAN-monster voor dat de RAA en delen van het rechteratrium (RA) al zijn weggesneden, waardoor alleen het interatriale septum (IAS) en het interventriculaire septum (IVS) overblijven.
- Pin de resterende delen van het hart door het weefsel naast de IAS en IVS met behulp van insectenpennen om de rechter atriale kant van IAS naar boven te maken.
- Kijk naar het rechter atrium op het endocardiale oppervlak voor de driehoek van Koch. Het zal vooraan worden begrensd door de scharnierlijn van de septumfolder van de tricuspidalisklep (TV) en achteraan door de pees van Todaro. De opening van de coronaire sinus wordt waargenomen aan de basis. (Figuur 1B, figuur 2B).
- Snijd de driehoek van Koch, die de AVN bevat, en plaats deze direct in een lege 1,5 ml microcentrifugebuis op ijs.
4. Spijsvertering
- Bereid de digestiebuffer (tabel 1) kort voor gebruik voor.
- Gehakt het SAN- en AVN-weefsel goed met scalpels.
OPMERKING: Het goed hakken van het weefsel zal de spijsvertering verhogen en helpen om een goede celsuspensie te krijgen voor het sorteren. Omdat de SAN- en AVN-monsters vrij klein zijn, wordt aanbevolen om het weefsel direct in de 1,5 ml microcentrifugebuis te hakken om het verlies van het monster te verminderen. - Voeg 500 μL digestiebuffer per monster toe en spoel al het gehakte weefsel uit de wand van de 1,5 ml microcentrifugebuis. Zacht pipetteren helpt bij het verteren van het monster.
- Homogeniseer de buis op een vortexmachine (instellingen: 37 °C, 750 tpm gedurende 1 uur).
- Breng na de vertering de weefselsuspensie over naar een verse centrifugebuis van 15 ml door een celzeef van 40 μm te gaan. Spoel de celzeef af met een extra 5 ml celsorteerbuffer om de spijsvertering te stoppen.
- Centrifugeer de buis van 15 ml bij 350 x g gedurende 7 minuten bij 4 °C. Verwijder vervolgens het supernatant volledig met behulp van de pipet. Resuspendeer de celpellet met een celsorteerbuffer van 90 μL.
OPMERKING: Pipetteer vóór magnetische scheiding de celsuspensie voorzichtig een paar keer of ga door een celzeef van 30 μm om celklonters indien nodig te verwijderen, om een eencellige suspensie te verkrijgen voor optimale prestaties van magnetische verrijking van interessante celpopulaties.
5. Magnetische verrijking van CD45 en monsterkleuring
OPMERKING: Om de hartmacrofagen met een hoge sorteerefficiëntie te isoleren, werd uitsluiting van ongewenste cellen, waaronder lymfocyten, uitgevoerd met CD45-microbeads volgens het protocol van de fabrikant. Op basis van het sorteerpanel werden cardiale resident macrofagen geïdentificeerd als CD45hoogCD11bhoogCD64hoog Ly6Claag/ int F4/80hoog.
- Voeg 10 μL CD45 microbeads per 107 totale cellen toe aan de celsuspensie in de centrifugebuis van 15 ml. Meng de monsters goed en incubeer ze gedurende 15 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: Het tellen van cellen met behulp van een hemocytometer moet kort worden gedaan om ervoor te zorgen dat elke buis niet meer dan 107 totale cellen bevat. Bij het werken met hogere celaantallen moet het volume magnetische kralen worden opgeschaald. - Bereid het antilichaammengsel door de volgende antilichamen in celsorteerbuffer te verdunnen (1:100 verdunning voor elk antilichaam): CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI zal later worden toegevoegd aan de kleuring voor levend / dood discriminatie.
- Voeg na 15 minuten magnetische kraalincubatie 100 μL antilichaammengsel rechtstreeks toe aan de celsuspensie in de buis van 15 ml (dan is de uiteindelijke concentratie van alle antilichamen 1:200) en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C.
- Was na 20 minuten antilichaamincubatie de celsuspensie door 1-2 ml celsorteerbuffer per 107 cellen toe te voegen en centrifugeer op 350 x g gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant volledig door te pipetteren.
- Resuspendeer tot 108 cellen in 500 μL celsorteerbuffer.
OPMERKING: Het maximale celnummer voor magnetische scheiding moet worden bepaald volgens het protocol van de fabrikant. - Bereid de magnetische scheidingsset voor.
- Bevestig de magnetische kolom aan een geschikte magnetische afscheider en plaats een opvangbuis onder de magnetische kolom.
- Bereid de magnetische kolommen voor door te spoelen met celsorteerbuffer: voeg 500 μL celsorteerbuffer toe aan de bovenkant van de kolom en laat de buffer passeren.
- Breng de celsuspensie onmiddellijk aan op de kolom terwijl de celsorteerbuffer passeert.
OPMERKING: Vermijd de vorming van luchtbellen in de kolom. Volgens het protocol van de fabrikant, hoewel de vultijd van de kolom kan veranderen ten opzichte van de opslagomstandigheden, heeft dit geen invloed op de kwaliteit van de scheiding. - Was de kolom met een celsorteerbuffer van 3 x 500 μL. De doorstroom in stap 5.7 en stap 5.8 bevat niet-gelabelde cellen, die kunnen worden weggegooid als er geen verder experiment nodig is.
OPMERKING: Voeg de celsorteerbuffer onmiddellijk toe wanneer het kolomreservoir bijna leeg is. - Verwijder de kolom uit de magnetische afscheider en plaats deze op een nieuwe opvangbuis.
- Voeg 1 ml celsorteerbuffer toe aan de kolom. Spoel de kolom onmiddellijk door de bij de kolom geleverde zuiger stevig aan te brengen. De doorstroom bevat de magnetisch gelabelde cellen.
- Voeg DAPI-oplossing toe aan alle verzamelde magnetisch gelabelde celsuspensies kort voordat u ze op de celsorteerder uitvoert. Stel de eindconcentratie DAPI in op 0,3-0,5 μg/ml.
- Voer FACS-analyse uit.
6. Monsters ter compensatie
- Bereid 6 bruine microcentrifugebuizen van 1,5 ml met het label "PE", "APC-Cy7", "APC", "PE-Cy7", "FITC" en "DAPI" om antilichamen tegen licht te beschermen. Bereid nog een microcentrifugebuis van 1,5 ml met het label "niet-gekleurd".
OPMERKING: Dit kan worden gedaan op hetzelfde moment als het incuberen van de celsuspensie met de microbeads en antilichamen. Het niet-gekleurde monster kan het cardiomyocytenweefsel zijn dat willekeurig wordt verzameld uit het gespaarde hartweefsel en ook wordt behandeld volgens stap 4. - Verdun elk afzonderlijk fluorescentie-geconjugeerd antilichaam met celsorteerbuffer tot 1:50 in de bruine microcentrifugebuizen van 1,5 ml die dienovereenkomstig zijn gemarkeerd.
- Voeg een druppel compensatieparels toe en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C.
- Voeg 2 ml celsorteerbuffer toe aan elke bruine microcentrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g . Gooi het supernatant volledig weg en resuspendeer de kraal met pellet met 300 μL celsorteerbuffer en breng ze over in celsorteerders die ook dienovereenkomstig zijn gemarkeerd.
7. Draaien op de celsorteerder en gating strategie
- Breng eerst de niet-gekleurde monster- en compensatiebuizen aan en pas de spanningen van elk kanaal aan om zowel de positieve als de negatieve piek uit te lijnen met de juiste positie van de as. Sla de compensatie-instellingen op en pas deze toe op de volgende voorbeelden.
- Pas de monsters toe op de celsorteerder. Stel de gatingstrategie in zoals beschreven in figuur 4. Cardiale resident macrofagen worden geïdentificeerd als CD45hoogCD11bhoogCD64hoogLy6Claag / int F4/80hoog. DAPI wordt gebruikt als een cel levensvatbaarheid marker.
- Controleer de flowcytometriegrafieken om te bevestigen dat de interessante celpopulatie correct wordt weergegeven op de grafieken. Als dit niet het geval is, past u de spanning van elk kanaal aan de middelste weergave van elke grafiek aan.
- Als de spanningsinstellingen bevredigend zijn, start u de sorteerprocedure. Verzamel de gesorteerde celpopulatie in kweekmedium dat bestaat uit DMEM met 10% foetaal runderserum, aangevuld met 100 μg/ml streptomycine en 100 U/ml penicilline.
8. Resident macrofagen cultuur
- Breng na het verzamelen van de gesorteerde macrofagen de cellen onmiddellijk over naar 35 mm weefselkweekschalen of 24 putplaten, of gebruik ze direct voor volgende experimenten.
- Om gesorteerde macrofagen te kweken, incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO2-incubator .
- Verander het kweekmedium elke 48-72 uur. Zwevende dode cellen kunnen gemakkelijk worden verwijderd door mediumverandering. Gebruik levende macrofagen die aan de onderkant van de kweekschaal zijn bevestigd voor volgend experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We beschrijven een praktische procedure voor de isolatie van cardiale resident macrofagen specifiek uit de SAN- en AVN-regio. Om een juiste dissectie te bevestigen, wordt Masson's Trichrome-kleuring en immunofluorescente HCN4-kleuring uitgevoerd (figuur 3)12. Met dit protocol konden we ongeveer 60.000 macrofagen uit één heel hart verzamelen. Figuur 4 toont de gatingstrategie voor het sorteren van hartmacrofagen. Levende residente cardiale macrofagen werden geïdentificeerd als CD45+CD11b+F4/80+CD64+Ly6C-. Figuur 5 toont vers gesorteerde hartmacrofagen die werden geïdentificeerd door hun oppervlakteantigenen CD45, F4/80 en CD11b. Vers gesorteerde cellen werden waargenomen onder brightfield-zicht van de microscoop (figuur 5A). De gesorteerde cellen waren positief voor CD45 (CD45+) wanneer ze werden waargenomen onder het fluorofoor-PE-kanaal (figuur 5B). Hetzelfde beeld van de gesorteerde cellen wanneer waargenomen onder fluorofoor-APC-Cy7 kanaal toonde CD11b + fenotype (figuur 5C). Hetzelfde beeld van de gesorteerde cellen wanneer waargenomen onder fluorofoor-PE-Cy7 kanaal toonde F4/80+ fenotype (figuur 5D). Figuur 5E is het samengevoegde beeld dat is verkregen met de fluorescerende microscoop voor de gesorteerde cellen. Deze drievoudig positieve cellen werden geïdentificeerd als cardiale resident macrofagen. Figuur 6 toont geïsoleerde cardiale macrofagen gekweekt in medium tot 6 dagen. Witte pijlen geven macrofagen aan, zwarte pijlen geven zwevende ronde dode cellen aan.
Figuur 1: Anatomie van het SAN en AVN onder de dissectiemicroscoop. (A) Anatomie van het SAN onder de dissectiemicroscoop. De locatie van het SAN wordt aangegeven door een rode stippellijn binnen het inter-cavalgebied (zwarte stippellijnen). (B) Anatomie van de AVN onder de dissectiemicroscoop. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van eerder gepubliceerd artikel10. De AVN (rode stippelcirkel) bevindt zich aan de top van de driehoek van Koch (witte stippelvormige driehoek) aan de onderkant van het vliezige septum. De driehoek van Koch wordt gevormd door de pees van Todaro (TT, groene stippellijn), tricuspidalisklep (TV, blauwe stippellijn) en de opening van de coronaire sinus (CS, gele stippellijn). SVC, superieure vena cava; IVC, inferieure vena cava; IAS, interatrieel septum; RA, rechter atrium; RAA, rechter atriumaanhangsel; RV, rechter ventrikel; CT, Crista terminalis; IVS, interventriculair septum; VAN, ovale fossa. PA, longslagader; RV, rechter ventrikel; LV, linker ventrikel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematische illustratie van SAN- en AVN-lokalisatie. (A) schematische illustratie van SAN-lokalisatie. SAN wordt aangegeven door een rode stippelcirkel binnen het inter-cavalgebied naast de CT (zwarte stippellijn). (B) schematische illustratie van AVN-lokalisatie. AVN wordt aangegeven door een rode stippelcirkel binnen de Koch-driehoek (grijze stippeldriehoek) bestaande uit tv en de opening van CS. SVC, superieure vena cava; IVC, inferieure vena cava; IAS, interatrieel septum; RA, rechter atrium; RAA, rechter atriumaanhangsel; CT, Crista terminalis; IVS, interventriculair septum; VAN, ovale fossa; IVS, interventriculair septum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Identificatie van het SAN en AVN met histologische kleuring. Identificatie van het SAN (A,B) en AVN (C,D). Immunofluorescente kleuring van HCN4-cellen van het positieve geleidingssysteem in SAN (A) en AVN (C) evenals Masson's trichrome kleuring van SAN (B) en AVN (D). Rode pijlen geven sinusknoopslagader (SNA, B) aan, zwarte pijl en zwarte stippellijn geven compacte AVN aan, blauwe pijl geeft het centrale vezelige lichaam (CFB) aan. CT, crista terminalis; CFB, centraal vezelig lichaam; CN, compacte AVN; RA, rechter atrium; RV, rechter ventrikel; IAS, interatrieel septum; IVS, interventriculair septum; TV, tricuspidalisklep; MV, mitralisklep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Gating strategie voor celsortering van residente cardiale macrofagen. Mononucleaire cellen worden geïdentificeerd, doubletten worden uitgesloten door FSC-W versus FSC-A en dode cellen worden uitgesloten door DAPI (A-D). Levende cellen worden afgesloten op CD45+ leukocyten (E) en vervolgens op CD11b+ myeloïde cellen (F). Cardiale macrofagen werden geïdentificeerd door de expressie van zowel F4/80 als CD64 (G), en uiteindelijk gestratificeerd door Ly6C-expressie (H). Levende residente cardiale macrofagen worden geïdentificeerd als CD45+CD11b+F4/80+CD64+Ly6C-. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Vers gesorteerde hartmacrofagen en immunofluorescente kleuring. (A) Vers gesorteerde hartmacrofagen. Immunofluorescente kleuring van specifieke oppervlakteantigenen zoals CD45 (B), CD11b (C) of F4/80 (D). Volgens de gatingstrategie worden hartmacrofagen geïdentificeerd als triple positive cells (E). Schaalbalk vertegenwoordigt 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Cultuur van gesorteerde macrofagen. Kweek van gesorteerde macrofagen in kweekmedium gedurende respectievelijk 48 uur (A, B), 96 uur (C, D) en 6 dagen (E, F). Er worden twee afzonderlijke cultuurgerechten per tijdstip getoond (schotel 1: A, C, E; schotel 2: B, D, F). Witte pijlen geven levende macrofagen aan met een spindelachtige vorm en typische uitsteeksels3. Zwarte pijlen geven zwevende ronde dode cellen aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Verbinding | Eindconcentratie | g of ml vereist |
| FACS-buffer | ||
| BSA | 0.50% | |
| EDTA | 2mM | |
| Pbs (1x) | 500 ml | |
| Digestiebuffer | ||
| Collagenase I | 450 U/ml | |
| Collagenase XI | 125 U/ml | |
| DNase I | 60 U/ml | |
| Hyaluronidase | 60 U/ml | |
| HEPES-buffer | 20 μl per 1 ml | |
| Pbs (1x) | Voeg tot 1 ml toe voor 2 monsters | |
| Cultuurmedium | ||
| Dmem | 79 ml | |
| Penicilline/streptomycine | 1% | 1 ml |
| FBS | 20% | 20 ml |
| Tae (50x) | ||
| Tris-basis | 24.20% | 24,2 g |
| 100 % azijnzuur | 5.71% | 5,71 ml |
| 0,5 M EDTA | 0,05 m | 10 ml |
| dH2O | Voeg tot 100ml toe | |
Tabel 1: Samenstelling van de benodigde oplossingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit manuscript beschrijven we een protocol voor de verrijking van cardiale macrofagen specifiek uit de SAN- en AVN-regio's met een hoge zuiverheidsgraad.
Macrofagen zijn onderverdeeld in subpopulaties op basis van hun anatomische locatie en functioneel fenotype. Ze kunnen ook overschakelen van het ene functionele fenotype naar het andere als reactie op variabele micro-omgevingssignalen13. In vergelijking met andere organen zoals beenmerg en lever bevat hartweefsel een lager percentage immuuncellen en lagere absolute aantallen van elke cellulaire subpopulatie14. Daarom zijn celsorterings-, verrijkings- en zuiveringsmethoden noodzakelijke hulpmiddelen om voldoende hoeveelheden van de relevante celpopulatie te verkrijgen. Fluorescentie-geactiveerde celsortering en MACS maken het mogelijk om zuivere, gesorteerde celpopulaties te verkrijgen, omdat het gelijktijdige meting van verschillende eigenschappen van de cellen mogelijk maakt.
Verschillende flowcytometriepanelen zijn beschreven voor de identificatie van subpopulaties van cardiale macrofagen 3,6,15. De functie van macrofagen in steady state en ziekte hangt niet alleen af van hun ontwikkelingsoorsprong, maar ook van de weefselomgeving. Over het algemeen bevat het volwassen hart twee belangrijke subgroepen van Ly6Clage / CCR2-residente macrofagen die verschillende niveaus van MHC-II tot expressie brengen en die zichzelf via lokale proliferatie in steady state kunnen handhaven, terwijl tijdens ziekte klassieke Ly6Choge monocyten worden gerekruteerd naar plaatsen van ontsteking, waar ze differentiëren in macrofagen16 . Tijdens de ontwikkeling bezetten verschillende subpopulaties van macrofagen verschillende hartlocaties geassocieerd met verschillende functies17. We wilden de residente macrofagen specifiek bestuderen vanuit het hartgeleidingssysteem, met name de residente macrofagen uit de SAN- en AVN-regio's. Volgens Hulsmans et al. worden cardiale resident macrofagen geïdentificeerd als CD45hoog CD11bhoogCD64hoogF4/80hoogLy6Claag/int.
De oogst van cardiale macrofagen van één volwassen muis voor celsortering duurt ongeveer 3 uur. Het is belangrijk om de experimentele procedures logisch te regelen en incubatie parallel toe te staan om tijd te besparen en de behandeling van de mogelijk fragiele macrofagen in de suspensie te minimaliseren. Omdat de sorteerprocedure druk kon uitoefenen op de gesorteerde cellen, adviseerden we om de sorteertijd te verkorten door magnetische kralen te gebruiken die de sorteerefficiëntie enorm konden verhogen en ook een hogere zuiverheid van residente macrofagen mogelijk maakten.
De toepassing van dit protocol omvat, maar is niet beperkt tot, zuivering van macrofagen en/of andere niet-cardiomyocytenceltypen uit het hartweefsel en andere muizenstammen. De gesorteerde macrofagen kunnen worden gebruikt voor volgende experimenten, bijvoorbeeld celmotiliteitstests, gen- of eiwitexpressiestudies, enz. Single-cell RNA sequencing is ook mogelijk door cellen één voor één rechtstreeks uit de verzamelbuis van de celsorteerder te verzamelen.
Flowcytometrie-gebaseerde celsortering heeft echter zijn beperkingen. Een nauwkeurig ontworpen antilichaampaneel is belangrijk en moet rekening houden met de expressie van antigenen op de celpopulatie van belang en de fluorofoor die aan de antilichamen is geconjugeerd. De functie en levensvatbaarheid van cellen kunnen worden veranderd door de bindende antilichamen, wat de uitkomsten van latere experimenten kan beïnvloeden. Bovendien zijn de complexe celsorteerinstrumenten duur, geavanceerd en ook gevoelig voor problemen met fluidics-systeemblokkades en laserkalibratie. Daarom zijn onderhoud door hoogopgeleide specialisten en een goede werking door een ervaren professionele technicus vereist. Hoewel celsortering een zuivere celpopulatie van belang zou kunnen opleveren, is de algehele efficiëntie nog steeds relatief laag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er is geen potentieel belangenconflict gemeld dat relevant is voor dit artikel.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de China Scholarship Council (CSC, aan R. Xia), het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK; 81X2600255 aan S. Clauss, 81Z0600206 aan S. Kääb, 81Z0600204 aan C.S.), de Corona Foundation (S199/10079/2019 aan S. Clauss), de SFB 914 (project Z01 aan S. Massberg), het ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 aan S. Clauss) en de Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (aan S. Clauss). De financiers hadden geen rol in de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories |
References
- Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R.
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Pinto, A. R., et al.
- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
Tags
Geneeskunde Nummer 171 hartgeleidingssysteem sinoatriale knoop atrioventriculaire knoop residente cardiale macrofagen flowcytometrie magnetische geactiveerde celsortering MACS fluorescentie-geactiveerde celsortering microdissectie primaire celkweekErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU)
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU)
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU)
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
