Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

تحليل مقارن للطرق التجريبية لقياس النشاط الحيواني في نماذج Elegans Caenorhabditis من مرض الميتوكوندريا

Published: April 4, 2021 doi: 10.3791/62244
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1,2
1Mitochondrial Medicine Frontier Program, Division of Human Genetics, Department of Pediatrics, The Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

تقدم هذه الدراسة بروتوكولات لنهجين شبه آليين لتحليل النشاط الحركي في C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms ، وهما ZebraLab (وهو مقايسة متوسطة الإنتاجية) وWormScan (وهو مقايسة عالية الإنتاجية) وتوفر تحليلا مقارنا بين مجموعة واسعة من طرق البحث لتحديد سلوك النيماتودا والوظيفة العصبية العضلية المتكاملة.

Abstract

ومن المسلم به على نطاق واسع Caenorhabditis elegans لمرفقه المركزي كنموذج حيواني ترجمي لاستجواب بكفاءة آليات وعلاجات الأمراض البشرية المتنوعة. الديدان هي مناسبة بشكل خاص للشاشات الوراثية والأدوية عالية الإنتاجية للحصول على نظرة أعمق في الأهداف والعلاجات العلاجية من خلال استغلال دورة التنمية السريعة ، وحجم الحضنة الكبيرة ، والعمر القصير ، والشفافية المجهرية ، وانخفاض تكاليف الصيانة ، ومجموعة قوية من الأدوات الجينية ، والمستودعات المتحولة ، والمنهجيات التجريبية لاستجواب كل من فيزيولوجيا الجسم الحي والفيفو السابق. يمثل النشاط الحركي للديدان النمط الظاهري ذي الصلة بشكل خاص والذي غالبا ما يضعف في مرض الميتوكوندريا ، وهو غير متجانس للغاية في الأسباب والمظاهر ولكنه يشترك بشكل جماعي في قدرة ضعيفة على إنتاج الطاقة الخلوية. في حين يمكن استخدام مجموعة من المنهجيات المختلفة لاستجواب سلوك الدودة ، فإن هذه تختلف اختلافا كبيرا في التكاليف التجريبية والتعقيد والفائدة للشاشات الجينومية أو الدوائية عالية الإنتاجية. هنا، تمت مقارنة الإنتاجية النسبية، والمزايا، والقيود المفروضة على 16 منهجية مختلفة لتحليل النشاط التي تحدد حركة النيماتودا، والضرب، والضخ البلعومي، و / أو chemotaxis في الديدان المفردة أو مجموعات الديدان من C. elegans في مراحل مختلفة، والأعمار، والمدد التجريبية. وقد تم عرض بروتوكولات مفصلة لطرق شبه آلية لقياس النشاط الحركي النيماتودا التي تمثل تطبيقات جديدة لأدوات البرمجيات المتاحة، وهما ZebraLab (نهج متوسط الإنتاجية) وWormScan (نهج عالي الإنتاجية). أظهرت البيانات من تطبيق هذه الطرق درجات مماثلة من انخفاض النشاط الحيواني وقعت في مرحلة L4 اليرقات، وتقدم في اليوم 1 البالغين، في الميتوكوندريا المعقدة I المرض (الغاز-1(fc21)) الديدان المتحولة بالنسبة إلى البرية من نوع (N2 بريستول) C. elegans. هذه البيانات تؤكد فائدة لهذه التطبيقات الجديدة من استخدام ZebraLab أو WormScan أدوات البرمجيات لقياس النشاط الحركي دودة بكفاءة وموضوعية، مع قدرة متغيرة لدعم فحص المخدرات عالية الإنتاجية على سلوك دودة في نماذج الحيوانات قبل السريرية من مرض الميتوكوندريا.

Introduction

ومن المسلم به على نطاق واسع Caenorhabiditis elegans كنموذج بارز في علم الأعصاب على أساس وجود 302 الخلايا العصبية التي تنسق جميع السلوكيات دودة, بما في ذلك التزاوج, تغذية, وضع البيض, التغوط, السباحة, والحركة على وسائل الإعلام الصلبة1. وتستخدم هذه الديدان الخيطية hermaphroditic أيضا على نطاق واسع لفهم مجموعة واسعة من آليات الأمراض البشرية، التي جعلت من الممكن من قبل الجينوم لها تتميز جيدا والهوولوجيا عالية من الجينات ~ 80٪ بين C. elegans والبشر2،3،4. وقد استخدمت منذ فترة طويلة C. elegans لاستجواب مرض الميتوكوندريا البشري5,6,7,8,9,10, وهو مجموعة غير متجانسة وراثيا للغاية و phenotypically من الاضطرابات الأيضية الموروثة التي تشترك في ضعف القدرة على توليد الطاقة الخلوية وغالبا ما تكون موجودة سريريا مع ضعف كبير في الوظائف العصبية والعضلية, ممارسة التعصب, والتعب11 ،12،13،14. وتحقيقا لهذه الغاية، فإن استخدام نماذج C. elegans يمكن النمذجة قبل السريرية للجوانب الكمية للنشاط الحيواني والوظيفة العصبية العضلية في أنواع فرعية وراثية مختلفة من مرض الميتوكوندريا، فضلا عن استجابتها للعلاجات المرشحة التي قد تحسن وظيفتها العصبية والعضلية والنشاط العام.

النشاط العصبي العضلي في C. elegans قابل للقياس موضوعيا من خلال مجموعة من المنهجيات التجريبية ، بما في ذلك النهج اليدوية وشبه الآلية التي تسمح بإجراء تحليلات وظيفية في الوسائط الصلبة أو السائلة (الجدول 1)1،15. وقد ثبت كمية دقيقة من النشاط C. elegans المهم لتمكين الاكتشافات المتعلقة وظيفة وتطوير الجهاز العضلي والعصبي16،17،18. تلخص هذه الدراسة وتقارن المتطلبات التجريبية والمزايا والقيود المفروضة على 17 مقايسة مختلفة يمكن إجراؤها في مختبرات الأبحاث لتقييم الوظيفة والنشاط العصبي العضلي على أربع نتائج رئيسية في نماذج أمراض C. elegans ، سواء عند خط الأساس في مجموعة من مراحل النمو والأعمار وكذلك استجابة للعلاجات المرشحة (الجدول 1 ). في الواقع ، تقدم الدراسة لمحة عامة مفصلة عن مجموعة من النهج التجريبية المتاحة لتوصيف معدلات سحق C. elegans (الانحناءات الجسم في الدقيقة الواحدة) ، والنشاط الحركي ، والضخ البلعومي ، وchemtaxis في كل حالة تحديد المنهجية التجريبية والتحليلية المستخدمة ، ومزايا وقيود كل طريقة ، والمعدات والبرمجيات اللازمة لأداء وتحليل كل المقايسة ، وقدرة الإنتاجية لكل طريقة لدعم استخدامها لأغراض فحص وراثية أو أدوية عالية الإنتاجية. توصف قدرة الإنتاجية لكل مقايسة بأنها منخفضة أو متوسطة أو عالية استنادا إلى تعقيد البروتوكول التجريبي ، بما في ذلك صيانة الدودة ، ووقت المعالجة ، واستخدام لوحات أحادية أو متعددة الآبار ، و / أو وقت المجرب اللازم لإكمال الإعداد التجريبي وتحليل البيانات.

التحليلات اليدوية لسحق19، النشاط الحركي20، ضخ البلعوم17،21، وchemocis22،23 هي منهجيات راسخة لتقييم نشاط الدودة التي تتطلب منظار مجسم24. في حين أن قياس نشاط سحق الديدان يتطلب تحليلا في الوسائط السائلة لتحديد وتيرة الانحناءات الجسم في الدقيقة الواحدة، يمكن قياس النشاط الحركي دودة إما على وسائل الإعلام الصلبة أو في وسائل الإعلام السائلة. ومع ذلك، فإن التحليلات اليدوية لنشاط الدودة الفردية تستغرق بطبيعتها وقتا طويلا وتنطوي على تحيز لا يمكن تجنبه من قبل المستخدم. أتمتة تحليلات نشاط الفيروس المتنقل يقلل من التحيز الذي يولده المستخدم ويمكن أن يزيد بشكل كبير من الإنتاجية التجريبية25. يمكن تحليل تسجيلات الفيديو لنشاط سحق دودة في وسائل الإعلام السائلة باستخدام wrMTrck ، وهو البرنامج المساعد ImageJ26. ومع ذلك ، فإن الإعدادات التجريبية الأصلية التي تم تطويرها لwrMTrck حدت من فائدتها ، لأن الكثير من الديدان في قطرة سائلة واحدة أدت إلى تداخل الديدان التي جعلت التتبع الدقيق صعبا. في حين تم حل هذا القيد التجريبي27، فإن طريقة wrMTrck غير قادرة على دعم الفحص عالي الإنتاجية.

توجد مجموعة من الطرق لقياس النشاط الحركي للديدان عند خط الأساس واستجابة للعلاجات المرشحة في نماذج مرض الميتوكوندريا C. elegans. وتشمل هذه ZebraLab (ViewPoint علوم الحياة), تيربسي تعقب28, واسعة مجال الرؤية منصة تتبع النيماتودا (WF-NTP)29, WormMotel, WormWatcher30, WormLab31, إنفينيتي تشيب32, وWMicrotracker واحد33 (الجدول 1). وتتيح هذه الأساليب التحليل المتزامن للحركة في سلالات أو حالات دودة متعددة، عادة على لوحات متعددة الآبار، مما يدعم تطبيقات فحص الأدوية ذات الإنتاجية العالية. وبعض هذه الأساليب لها اعتبارات فريدة قد تحد من فائدتها العامة أو تعززها، مثل الحاجة إلى معدات باهظة الثمن مقابل برمجيات الوصول المفتوح، وسهولة متفاوتة في تنفيذ البروتوكولات التجريبية. وعموما، لا يوجد نظام تجريبي واحد أو بروتوكول مناسب بشكل مثالي لجميع تجارب النشاط الحركي C. elegans. بل من المهم أن تختار بعناية الطريقة الأنسب للأهداف والمتطلبات التجريبية للمحقق المحدد.

يمثل ضخ البلعوم نتيجة هامة أخرى لتقييم النشاط العصبي العضلي في C. elegans. يتكون البلعوم C. elegans من 20 خلايا العضلات, 20 الخلايا العصبية, و 20 الخلايا الأخرى التي تمكن ابتلاع الإشريكية القولونية (E. coli) في الطرف الأمامي من الجهاز الهضمي للدودة34,35,36. وقد تم إنشاء عدة طرق يدوية لتحديد معدلات ضخ البلعوم17،21،37،38. وتستند معظم الأساليب على استخدام مجسم وكاميرا لتصور وتسجيل تردد ضخ البلعوم مع العد المباشر من قبل المراقب التجريبي21. تحليل معدل الضخ البلعومي الآلي ممكن من خلال إجراء تسجيل خارج الخلية يطلق عليه مخطط كهربية (EPG) ، والذي يوفر معلومات إضافية عن مدة كل مضخة39. تحليل معدل الضخ البلعومي ممكن أيضا في نظام microfluidic ، WormSpa ، حيث يتم احتجاز الديدان الفردية في الغرف40،41. وهناك طريقة تجارية متاحة لتسهيل تحليل معدل مضخة البلعوم هو نظام ScreenChip (InVivo Biosystems) ، الذي يقيس ويتصور ويحلل الجوانب العصبية والعضلية لسلوك التغذية في دودة واحدة معطلة في رقاقة مخصصة. ويمكن استخدام هذا النهج الكمية ضخ البلعوم لتقييم كل من الاستجابات العصبية والفسيولوجية للأدوية, الشيخوخة, وغيرها من العوامل42,43,44,45.

يصف Chemotaxis حركة C. elegans استجابة لرائحة وضعت بعيدا عن الديدان في منطقة محددة من وسائل الإعلام نمو النيماتودا (NGM) لوحة. تقييم الاستجابة chemotaxis يوفر مقياسا متكاملا للنشاط العصبي العصبي العصبي العصبي العضلي الدودة التي يمكن قياسها من خلال مراقبة وقياس المسافة المادية التي قطعتها الديدان نحو الرائحة في فترة زمنية محددة46. تعقب الديدان المتعددة هو طريقة تلقائية يمكن استخدامها لتحسين الكفاءة التجريبية لتحديد المسافة التي قطعتها الديدان نحو الجذاب أو منطارد 47.

هنا، يتم وصف البروتوكول التفصيلي ل طريقتين جديدتين شبه آليتين تم إنشاؤهما لقياس نشاط الدودة كميا. النهج الأول يستخدم ZebraLab البرمجيات التجارية التي وضعت أصلا لدراسة نشاط السباحة من دانيو rerio (حمار وحشي), لتطبيق رواية متوسطة الإنتاجية لتحديد النشاط الحركي العام في وسائل الإعلام السائلة من C. elegans على أساس التغيرات بكسل أثناء الحركة (الجدول 1, الشكل 1). يتم الحصول على إخراج البيانات بسرعة من عدد كبير من الشروط والعينات المتزامنة التي تم تحليلها على شريحة زجاجية ، على الرغم من أن هذه الطريقة ليست مناسبة لتنسيق لوحة متعددة الآبار. النهج الثاني هو التكيف رواية منهجية WormScan48،49 ( الشكل2) ، والذي يستخدم ماسح ضوئي مسطح لخلق صورة تفاضلية من اثنين من عمليات المسح المتتالية التي يمكن استخدامها بشكل متنوع مع البرمجيات مفتوحة المصدر لتمكين التحليل الكمي شبه الآلي للنتائج الفسيولوجية المتكاملة مثل البراز والبقاء على قيد الحياة. هنا ، تم تطوير تكييف جديد عالي الإنتاجية لمنهجية WormScan لتحديد النشاط الحركي للديدان في الوسائط السائلة في مجموعات من خمسة عشر دودة من المرحلة الرابعة (L4) من اليرقات لكل بئر من لوحة مسطحة القاع ذات 96 بئرا. يمكن تكييف هذه المنهجية WormScan شبه الآلية والمنخفضة التكلفة بسهولة مع شاشات الأدوية عالية الإنتاجية ، وكذلك لتحليل المراحل الحيوانية المختلفةوالأعمار 48،49.

هنا، بروتوكول وفعالية تحليل النشاط الحركي C. elegans باستخدام كل من ZebraLab وWormScan أساليب شبه الآلي هو موضح في نموذج C. elegans راسخة لمرض الميتوكوندريا المعقدة I، الغاز-1(fc21). gas-1 (K09A9.5 جين) هو تقويم العظام من NDUFS2 الإنسان (NADH: ubiquinone oxidoreductase الأساسية (بروتين الحديد والكبريت) وحدة فرعية 2) (الشكل 3). C. elegans gas-1(fc21) سلالة متحولة يحمل طفرة missense p.R290K homozygous في تقويم العظام البشري من NDUFS250, مما تسبب في انخفاض كبير في البراز والعمر, ضعف الفوسفور التأكسدي سلسلة الجهاز التنفسي (OXPHOS) قدرة51, فضلا عن انخفاض كتلة الميتوكوندريا وإمكانات الغشاء معزيادةالإجهاد التأكسدي 5,8 . على الرغم من استخدامه الراسخ على مدى العقدين الماضيين لدراسة مرض الميتوكوندريا ، لم يتم الإبلاغ عن النشاط الحركي للغاز -1(fc21)المسوخ من قبل. هنا، تم تطبيق ZebraLab وWormScan أساليب لتحديد النشاط الحركي بشكل مستقل من الغاز-1(fc21)بالمقارنة مع البرية نوع (WT، N2 بريستول) الديدان، سواء كوسيلة للتحقق من صحة الأساليب وكذلك لإثبات فائدتها المقارنة وكفاءة البروتوكولات التجريبية وتحليلات المعلوماتية. سمح برنامج ZebraLab بكمية سريعة للعديد من الحالات المتزامنة للنشاط الحركي للديدان في نماذج مرض الميتوكوندريا C. elegans ، مع إمكانية التطبيق لفحص الأدوية المستهدفة أو دراسات التحقق من الصحة. تحليل WormScan ، على وجه الخصوص ، مناسب تماما لتمكين شاشات الأدوية عالية الإنتاجية للمكتبات المركبة وتحديد أولويات الخيوط التي تحسن وظيفة الأعصاب العضلية الحيوانية والنشاط الحركي في نماذج C. elegans قبل السريرية لمرض الميتوكوندريا الأولي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. دودة تحليل النشاط الحركي في وسائل الإعلام السائلة على الشرائح الزجاجية باستخدام برنامج ZebraLab

  1. نمو النيماتودا والتعامل معها
    1. تنمو C. elegans على لوحات بيتري التي تحتوي على وسائل الإعلام نمو النيماتودا (NGM) وانتشرت مع Escherichia القولونية OP50 كمصدر للغذاء. الحفاظ على ثقافة الدودة عند 20 درجة مئوية، كما هو موضح سابقا8.
    2. مزامنة الديدان أداء بيضة توقيت وضع52 ودراسة الديدان في المرحلة المطلوبة. في هذا البروتوكول، تم تحليل الديدان المرحلة L4.
    3. زيادة السيطرة وسلالات دودة متحولة على لوحات NGM مع وبدون علاجات المخدرات ليتم اختبارها أو السيطرة العازلة. لتقييم آثار العلاج من المخدرات، وإعداد تركيز مخزون المخدرات المطلوب في محلول القاعدية S. نشر حجم معين محسوب على لوحات NGM والسماح لها لتجف. نقل الديدان في مرحلة محددة من اليرقات أو الكبار والحفاظ على لوحة العلاج من المخدرات لمدة المطلوب قبل التحليل.
  2. الإعداد التجريبي للديدان لتسجيل فيديو النشاط الحركي وتحليل ZebraLab
    1. اختر 5 ديدان L4 متزامنة لكل سلالة وحالة باستخدام معول دودة. ماصة قطرة واحدة 20 ميكرولتر من S. الحل القاعدي على شريحة زجاجية تقع تحت مجسم متصل بكاميرا ونقل 5 الديدان في ذلك (الشكل 1A, B). نقل الديدان 5 من طبق بيتري التي تحتوي على NGM وE. coli OP50 إلى انخفاض السائل فقط في اللحظة التي تسبق التسجيل.
      ملاحظة: استمر في الحفاظ على الديدان الأخرى على طبق بيتري حتى يتم تسجيل الفيديو السابق. وهذا سوف تجنب الضرر الناجم عن الديدان الأخرى بسبب جفاف قطرات 20 ميكرولتر أثناء الإجراء (وقت الجفاف ~ 15-20 دقيقة).
    2. ماصة قطرات متعددة على شريحة واحدة للحصول على تكرارات تقنية متعددة (الشكل 1A). حدد الديدان من لوحات NGM مختلفة (تكرار البيولوجية). لا تستخدم قسيمة الغطاء.
    3. ضبط مسافة عمل المجهر لتصور المنطقة الكاملة من قطرة واحدة. تعيين والحفاظ على دقة الفيديو منخفضة (<1024 × 768) لتحميل الملفات في البرنامج.
    4. السماح للديدان بالتأقلم على الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة قبل التسجيل.
    5. سجل نشاط السباحة الدودة في 1 قطرة لمدة 1 دقيقة في 15 لقطة في الثانية (FPS). كرر التصوير لكل قطرة إضافية على اللوحة.
  3. C. elegans تحليل تسجيل النشاط الحركي في برنامج ZebraLab
    1. استخدم خيار ZEBRALAB AVI لتحميل مقاطع الفيديو إلى البرنامج. انقر على الخيار التكميم مع ملفات AVI (الشكل 1C).
    2. لإنشاء بروتوكول جديد، حدد ملف > إنشاء بروتوكول،ثم أضف عدد المناطق المحددة للتحليل. اختر عدد المواقع: 1.
    3. افتح معلمات البروتوكول وحدد دقيقة واحدة في إطار مدة التجربة. حدد مدة تجريبية مختلفة لفترات تجريبية مختلفة. حدد أو قم بإلغاء تحديد الإطار بلا سلة زمنية واختر فترة التكامل،اعتمادا على إخراج البيانات المطلوب. في هذه الدراسة لم يتم اختيار بن الوقت (الشكل 1D).
      ملاحظة: سلة الوقت هو الوقت الذي سيتم متوسط النشاط.
    4. إذا تم إنشاء بروتوكول بالفعل، حدد فتح البروتوكول وحدد البروتوكول المحفوظ (بتنسيق .vte).
    5. حدد ملفا وافتح فيلما لتحميل كل ملف فيديو فردي تم تسجيله مسبقا.
    6. حدد رمز المنطقة المشار إليه في الشكل 1E (السهم الأسود) لبناء منطقة واحدة للكشف وإنشاء منطقة حول قطرة السائل بأكملها حيث توجد الديدان. انقر على حدد، ثم رمز الدائرة الخضراء (السهم الرمادي) تحت المناطق > بناء علامات مسح >.
      ملاحظة: سيتم الكشف عن نشاط كافة worms في إسقاط المعرفة في المنطقة المحددة (الشكل 1E, F).
    7. انتقل إلى المعايرة > Draw scale(الشكل 1E)وارسم خطا أفقيا من اليسار إلى يمين منطقة الفيديو. الإشارة إلى المسافة الحقيقية للمعايرة. ثم حدد تطبيق على المجموعة.
    8. إلغاء تحديد الرمز المحدد لإنشاء المنطقة (السهم في الشكل 1E)وتحديد أو إلغاء تحديد شفاف.
      ملاحظة: في هذه الدراسة، تم اختيار شفافة وأعطى نتائج أفضل.
    9. ضبط حساسية الكشف و عتبة النشاط للسماح للكشف عن جميع سلالات دودة C. elegans المختلفة التي تم تحليلها.
      ملاحظة: في هذه التجربة، تم تعيين حساسية الكشف في 8 مع قيم الاندفاع والتجميد من 15 و 2، على التوالي(الشكل 1F).
    10. تعيين مقياس العرض في 70 لتصور المسار الذي أدلى به الحيوان في حين يجري تحليل النشاط. ثم حدد تطبيق على المجموعة ( الشكل1F).
    11. انقر على التجربة > تنفيذ > حفظ ك، ثم على ابدأ. يتم فتح نافذة. اختر هل تريد معالجة وسائط الفيديو بأقصى سرعة كمبيوتر؟ لتحليل الفيديو بسرعة (على سبيل المثال، يتم تحليل تسجيل فيديو لمدة دقيقة واحدة من قبل برنامج ZebraLab في 5 s).
    12. نافذة أخرى يفتح: تشغيل التجربة; انقر على ابدأ للشروع في التجربة.
    13. بعد اكتمال تسجيل الفيديو، يتوقف التحليل. انقر على التجربة > إيقاف. وهذا يحفظ النشاط الذي تم تحليله من قطرة واحدة في جدول بيانات.
    14. كرر التحليل لكل فيديو من قطرة الفردية. كل قطرة هي نسخة تقنية متماثلة واحدة.
  4. إخراج وتحليل بيانات ZebraLab
    ملاحظة: بعد التجربة، يتم حفظ البيانات من كل فيديو بشكل فردي كجداول بيانات منفصلة في المجلد المختار. في ملف إخراج البيانات، يتم تسجيل مستوى النشاط المتكامل لكافة الديدان المتحركة في قطرة فردية كتغييرات بكسل تحت actinteg.
    1. افتح كل جدول بيانات تم الحصول عليه من تحليل كل فيديو. ترجمة لهم يدويا في ملف واحد.
      تطبيع البيانات متحولة والبرية من نوع إلى نسبة مئوية من السيطرة. وفي هذا الأثناء، أجريت تحليلات إحصائية لمقارنة متوسط مستويات النشاط بين المجموعات.

2. دودة تحليل النشاط الحركي في وسائل الإعلام السائلة في شكل لوحة 96 جيدا من قبل تحليل البرمجيات WormScan

  1. نمو النيماتودا والتعامل معها
    1. تنمو C. elegans كما هو موضح في القسم 1.1.1.
    2. مزامنة الديدان كما هو موضح في المقطع 1.1.2.
    3. تنمو الديدان على وسائل الإعلام محددة كما هو موضح في القسم 1.1.3 حتى المرحلة L4 أو اليوم 1 الكبار.
  2. الإعداد التجريبي للديدان في لوحة 96 جيدا لتحليل نشاط WormScan
    1. إضافة 50 ميكرولتر من وزن 2٪ لكل حجم من E. coli OP50 في تعليق السائل في المتوسط القاعدي S. إلى كل بئر من 96 جيدا، واضحة، مسطحة القاع، microplate، كما هو موضح سابقا49،53.
    2. تحت منظار مجسم، اختر يدويا 15 دودة متزامنة في مرحلة L4 أو اليوم الأول للبالغين من لوحات NGM الخاصة بهم إلى وسائط سائلة داخل كل بئر تجريبي من اللوحة الدقيقة ذات ال 96 بئرا. السماح للديدان بالتأقلم مع الوسائط السائلة لمدة 20 دقيقة قبل المسح الضوئي.
      ملاحظة: يمكن استبدال مراحل وأعمار الحيوانات الأخرى بسهولة للدراسة.
  3. تحليل نشاط WormScan في لوحة 96 جيدا وتصدير البيانات إلى جدول البيانات.
    1. مسح كل 96 جيدا، واضحة، مسطحة القاع، microplate مرتين بالتتابع باستخدام الماسح الضوئي المسطح القياسية، مع أقل من 10 ثانية بين الاشعة.
      ملاحظة: هنا، تم استخدام الماسح الضوئي للصور بدقة 1200 نقطة/بوصة وتدرج رمادي 16 بت لإنتاج صور JPEG. الوقت اللازم لمسح أربع لوحات 96 بئر باستخدام الماسح الضوئي للصورة أقل من 10 دقيقة.
    2. محاذاة مسحين متتالية (الشكل 2A) باستخدام البرمجيات مفتوحة المصدر49.
      ملاحظة: البرنامج بإنشاء صورة اختلاف لتقييم التغييرات بكسل بين الصورتين متسلسلة لمنطقة الفائدة (الشكل 2B) و نقاط WormScanنسبي . هذه النتيجة WormScan يعادل التغيرات في الاستجابة الحركية على أساس كثافة الضوء التي تنتجها الماسح الضوئي عند تعيينها إلى عتبة بكسل من 5 (الشكل 2C).
    3. تصدير البيانات من WormScan ك جدول بيانات. حفظ جدول البيانات الذي يحتوي على البيانات إلى الكمبيوتر المحلي. تطبيع البيانات كنسبة مئوية من السيطرة (POC) ومقارنة عبر التجارب البيولوجية تكرار لظروف متحولة متنوعة أو العلاج. إجراء تحليل إحصائي لمقارنة متحولة والتحكم يعني استخدام الطالب ر-اختبار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحليل النشاط الحركي C. elegans في وسائل الإعلام السائلة يمكن بسهولة التقاط النمط الظاهري المتكامل لنماذج دودة مرض الميتوكوندريا التي قد لا تكون قابلة للقياس الكمي بسهولة على وسائل الإعلام الصلبة. تم استخدام ZebraLab لقياس النشاط الحركي لمجمع الميتوكوندريا الراسخ I مرض الغاز-1(fc21)سلالة بالنسبة إلى ديدان WT في وسائل الإعلام السائلة في مرحلة اليرقات L4. وسجل نشاط 5 ديدان في قطرة سائلة واحدة على مدى دقيقة واحدة، مع تسجيل ما مجموعه 19 شريط فيديو (تكرارات تقنية) لكل سلالة، مما أدى إلى تحليل إجمالي ل 95 دودة لكل سلالة. وتم الحصول على أربع تجارب بيولوجية للتكرار لكل سلالة. يتم عرض نشاط الفيروس المتنقل كذلك كتغير بكسل(الشكل 3A)،وكنسبة مئوية من عنصر التحكم (POC) عند تسويتها إلى N2 Bristol WT control (الشكل 3B). الغاز -1(fc21) الديدان (62٪ ± 16٪ بكسل التغيير, متوسط ± SD، n = 19) كان له انخفاض كبير بنسبة 38٪ (p < 0.001، t-test)في نشاطه الحركي في مرحلة L4 مقارنة بالديدان WT (100٪ ± 11.35٪، يعني ± SD، n = 95 دودة لكل حالة في 19 تكرارا تقنيا لأكثر من 4 تكرارات بيولوجية).

كما تم إجراء تحليل WormScan لتحديد النشاط الحركي لمرحلة L4 الغاز-1(fc21)والديدان WT في وسائل الإعلام السائلة. وتم جمع البيانات لثلاث تجارب تكرار بيولوجية، حيث تم تقييم كل لوحة تكرار بيولوجية من خلال صورتين متسلسلتين تم مسحهما ضوئيا باستخدام ماسح ضوئي مسطح قياسي. تمت مقارنة نشاط الدودة للصور التفاضلية كتغير بكسل وتم تطبيعه إلى التحكم المتزامن N2 Bristol WT. وبالمثل ، كما رأينا من قبل طريقة فحص سلوك زيبرافيش ، أظهر التحليل القائم على WormScan أن الديدان الغازية -1(fc21)(65.9 ± 6.1 ، متوسط ± SD، n = 13 بئرا) كان له انخفاض كبير في النشاط الحركي بنسبة 34٪ (p < 0.001، t-test)مقارنة بالديدان البرية من نوع N2 Bristol (100٪ ± 4.8٪، متوسط ± SEM، n = 12 بئرا) ( الشكل3C). تحليل باستخدام WormScan في اليوم 1 الكبار الغاز-1(fc21) الديدان (50.1٪ ± 10.7٪, متوسط ± SD، n = 7 آبار) أظهر انخفاضا في النشاط الحركي بنسبة 49٪ (p < 0.001، t-test)مقارنة بالديدان WT (100٪ ± 16.2٪، متوسط ± SD، n = 6 آبار)(الشكل 3D).

الجدول 1: نظرة عامة مقارنة على المقايسات التجريبية المتاحة لتقييم النشاط العصبي العضلي C. elegans. يتم توفير نظرة عامة مفصلة على مجموعة واسعة من 16 تقنيات تجريبية مختلفة التي يمكن استخدامها لقياس النشاط العصبي العضلي دودة على النتائج الظاهرية للسحق، والحركة، والضخ البلعومي، و / أو chemotaxis في C. elegans. يتم تفصيل تنسيق القراءة والمنهجية والقدرة الإنتاجية التجريبية والبرمجيات و / أو متطلبات المعدات ، وكذلك مزايا وقيود كل مقايسة. كما يتم توفير المراجع والمواقع ذات الصلة لكل أداة من أدوات الفحص والبرامج. توصف قدرة الإنتاجية لكل مقايسة بأنها منخفضة أو متوسطة أو عالية ، استنادا إلى التعقيد التجريبي ، واستخدام لوحات أحادية أو متعددة الآبار ، و / أو وقت المجرب اللازم لإكمال الإعداد التجريبي وتحليل البيانات. * يشير إلى أن المنهجيات يمكن أن تستخدم أيضا لتقييم الحركة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Figure 1
الشكل 1: C. elegans تحليل النشاط الحركي باستخدام برنامج ZebraLab. (أ, ب) بروتوكول تجريبي لتسجيلات الفيديو دودة. تم إدخال خمس ديدان لكل قطرة (20 ميكرولتر) من محلول S. القاعدي ، مع وضع أربع قطرات على شريحة زجاجية واحدة تحت منظار مجسم. كل قطرة من 5 ديدان تمثل تجربة تكرار تقنية وتم تسجيلها لمدة دقيقة واحدة في فيلم منفصل باستخدام كاميرا جهاز مشحون (CCD). (C-F) إعدادات تجريبية في ZebraLab كما تتكيف مع تقييم النشاط الحركي في C. elegans. (ج) اختيار التكميم مع ملفات AVI لتحديد النشاط الحركي للدودة لكل فيديو مسجل. (D) إعدادات المعلمة البروتوكول، مع 1 دقيقة المحددة كمدة التجربة. (ه) منطقة البناء لتحديد منطقة الاهتمام. تم اختيار المنطقة وبناؤها حوالي قطرة واحدة من الحل الذي تم فيه وضع 5 ديدان. (F)تم تحديد الكشف على أساس عتبة النطاق الرمادي للكشف عن الجسم كله من كل دودة (أحمر). في المقطع عتبة، تم تحديد قيم الاندفاع والتجمد لتحليل نشاط الفيروس المتنقل كتغييرات بكسل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: C. elegans تحليل النشاط الحركي باستخدام منهجية WormScan. (A)باستخدام الماسح الضوئي إبسون v800 مسطحة، تم التقاط مسحين متتالية على الفور من لوحة 96 جيدا مع قرار من 1200 نقطة / في و 16 بت الرمادي لإنتاج صور JPEG. (ب)ثم تم محاذاة هاتين الصورتين المتتابعتين للوحة من 96 بئرا إلى منطقة مرجعية ذات أهمية (ROI) لديدان WT. (ج)ويستند تحليل الصورة على درجة صورة الفرق محسوبة لكل عائد الاستثمار مع 15 الديدان / جيدا لبريستول N2. تم تطبيع صورة الفرق والإبلاغ عنها كنسبة مئوية من عنصر التحكم (POC). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التحليل المقارن للنشاط الحركي من قبل ZebraLab وWwscan برامج المقايسات في الغاز -1(fc21) الديدان مرض الميتوكوندريا بالنسبة إلى N2 بريستول البرية من نوع الديدان. (A, B) WT والغاز-1(fc21) نشاط دودة في قطرات السائل (5 الديدان / قطرة) تم تسجيل الفيديو لمدة 1 دقيقة وكميا كما(A)بكسل تغيير أو (B ) ) النسبة المئوية للسيطرة البرية باستخدام برنامج ZebraLab. وبشكل عام، أظهر تحليل نشاط الدودة القائم على ZebraLab انخفاضا كبيرا بنسبة 38٪ في ديدان المرحلة من الغاز-1(fc21)L4 بالمقارنة مع الضوابط البرية (*** p < 0.001). يعرض الرسم البياني يعني ± SD من جميع البيانات، حيث ينقل كل نقطة النشاط العام من خمسة ديدان لكل قطرة القاعدية S. ويمثل كل قطرة تكرارا تقنيا، مع دراسة ما مجموعه أربع نسخ بيولوجية لكل حالة. تم تسجيل ما مجموعه 19 مقطع فيديو (فيديو واحد لكل قطرة من 5 ديدان) ، عبر ما مجموعه 95 دودة فردية تمت دراستها لكل حالة. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام الطالب راختبار في بريزم -GraphPad v6. (C) WT والغاز-1(fc21) تم تحليل الديدان في مرحلة L4 عن طريق المسح المسطح لإنتاج صورتين متتالية التي تم تحليلها في برنامج WormScan لإنتاج صورة الفرق. وأجريت ثلاث تجارب بيولوجية لتكرار الديدان مع 15 دودة لكل بئر في 96 لوحة جيدة. تم استخدام نشاط الديدان WT كخط أساس لتطبيع النسبة المئوية للسيطرة (POC). انخفض نشاط الغاز-1(fc21)بنسبة 34٪ مقارنة بالتحكم البري (*** p < 0.001). تنقل الرسوم البيانية الشريطية الانحراف المتوسط والمعياري عبر ثلاث تجارب تكرار بيولوجية. (د)تم تحليل N2 والغاز-1(fc21) الديدان في مرحلة اليوم 1 الكبار على نحو مماثل كما هو مفصل للوحة C. الغاز-1(fc21) النشاط في اليوم 1 انخفض البالغين بنسبة 49.1٪ بالنسبة للديدان السيطرة البرية من نوع (*** ع < 0.001). تنقل الرسوم البيانية الشريطية متوسط الانحراف المعياري لتغيرات البكسل في تكرار بيولوجي واحد يقارن N2 (n = 6 آبار من 15 دودة / بئر) والغاز-1(fc21)(n = 7 آبار من 15 دودة / بئر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، لخصت الدراسة معلومات مفصلة والأساس المنطقي لدراسة النشاط العصبي العضلي C. elegans على مستوى النتائج المتنوعة، بما في ذلك سحق الديدان، والحركة، وضخ البلعوم، وchemocis. أجريت مقارنة 16 منهجية مختلفة لتحليل النشاط من حيث الإنتاجية النسبية والمزايا والقيود المفروضة على أنشطة النيماتودا الكمي في دودة واحدة أو مجموعات دودة واحدة في أعمار مختلفة ومدد تجريبية. من بين هذه ، تم تسليط الضوء على اثنين من التعديلات الجديدة وتطبيقات التحليلات شبه الآلية لإظهار انخفاض كبير في النشاط الحركي في الديدان في مرحلة اليرقات في مرحلة نمو يرقات L4 وفي اليوم 1 الشباب البالغين من مركب الميتوكوندريا الراسخ I disease C. elegans سلالة ، الغاز -1(fc21) نسبة إلى ضوابط WT.

على وجه الخصوص ، تمت دراسة وظيفة C. elegans العصبية والعضلية والنشاط الحركي على نطاق واسع على الوسائط الصلبة منذ حركة دودة WT منتظمة جدا في أنماط الموجات الجيبية. يمكن الكشف عن تشوهات مسار حركتهم المنتظمة وسرعتها بشكل مجهري وسجلها المراقب التجريبي يدويا ، في المقايسات التي غالبا ما تكون منخفضة الإنتاجية ومملة. لزيادة الإنتاجية التجريبية، يجب تحديد الطرق الآلية وعالية الإنتاجية. يمكن أن يكون ضعف نشاط الديدان قابلا للقياس الكمي في الوسائط السائلة ، حيث يمكن تسجيل النشاط الحركي العام للديدان في قطرات على الشرائح الزجاجية أو في لوحات متعددة الآبار وقياسه كميا بطريقة شبه آلية أو آلية باستخدام أدوات برامج مختلفة. في الواقع ، تسلط بياناتنا الضوء على فائدة قياس النشاط الحركي الخيطي بموضوعية وكفاءة سواء من خلال تطبيق جديد لبرنامج ZebraLab لتحديد النشاط الحركي في مقاطع الفيديو للديدان في قطرات سائلة على الشرائح الزجاجية (نهج قدرة فحص متوسطة الإنتاجية) ، وكذلك من خلال استخدام برنامج WormScan لقياس النشاط الحركي للديدان في صور المسح المسطح التفاضلية للديدان فينهجالوسائط السائلة 96-well 55،56 (نهج قدرة الفحص عالية الإنتاجية). يعتبر نهج برنامج ZebraLab بمثابة اختبار متوسط الإنتاجية لأنه يتطلب استخدام لوحات واحدة لكل حالة تمت دراستها ، دون بروتوكول مطور حاليا لتنسيقات اللوحات متعددة الآبار. أثناء استخدام نهج برنامج ZebraLab يتطلب الحد الأدنى من الوقت عند تحليل نشاط C. elegans في بعض الحالات ، يزيد الوقت التجريبي عند تطبيقه على شروط متعددة. هنا ، كان الوقت التجريبي حوالي 2 ساعة لنقل الديدان إلى قطرات سائلة وتسجيل مقاطع فيديو لنشاطها ، مع الأخذ في الاعتبار 18 تكرارا تقنيا لكل حالة. وكان الوقت الذي يقضيه لتحليل أشرطة الفيديو هذه باستخدام برنامج ZebraLab حوالي 1 ساعة. وعلى سبيل المقارنة، فإن طريقة WormScan عالية الإنتاجية لأنها تتضمن تنسيق لوحة متعددة الآبار التي تسمح بالتحليل المتزامن لأربع لوحات من 96 بئرا في أقل من 10 دقائق وإعداد لوحة من 96 بئرا مع COPAS Bisoter هي أيضا أقل من 10 دقائق.

وأظهرت كلتا المنهجيتين نشاطا مخفضا بالمثل في المرحلة L4 اليرقات الغاز-1(fc21) الديدان المتحولة مرض الميتوكوندريا بالنسبة للديدان WT, وبالتالي التحقق من صحة كلا النهجين متميزة لتحديد الاختلافات في سلوك دودة. علاوة على ذلك ، تم استخدام تحليل WormScan لإثبات أن الانخفاض التدريجي في النشاط الحركي الحيواني حدث مع التقدم في العمر في الديدان الغازية -1(fc21)كما كان واضحا في مرحلة البلوغ في اليوم الأول.

المزايا الرئيسية لدينا تكييف البرمجيات ZebraLab التي تم تطويرها لتحليل السباحة حمار وحشي لتحليل النشاط C. elegans هو أنه من السهل تجريبيا وغير مكلفة لالتقاط موضوعيا حركة دودة في أشرطة الفيديو، مع تحليل كمي شبه الآلي في ملفات الأفلام التي تم تحميلها على برنامج ZebraLab تتطلب ثوان فقط لكل تكرار التقنية ويزيل التحيز القائم على المحقق الذي هو موجود في منهجيات الكمية اليدوية. علاوة على ذلك ، وجود هذه الأداة البرمجية واحدة في مختبر البحوث مفيد لقياس النشاط الحركي في نوعين نموذج الحيوان ، وهي حمار وحشي وC. elegans. العيب هو أن هذا هو البرنامج التجاري الذي يتطلب شراء ومقاطع الفيديو دودة تحتاج إلى تحميلها يدويا في البرنامج، على الرغم من أن عملية التحميل واضحة ووقت تحليل البرمجيات سريعة نسبيا. بشكل عام ، فإن التطبيق الجديد الموصوف هنا باستخدام برنامج ZebraLab لتحديد النشاط الحركي C. elegans يحمل إمكانات مباشرة لتقييم آثار المخدرات على سلوك الدودة ، على الرغم من أن إنتاجيته لا تزال منخفضة إلى متوسطة نظرا لمتطلباتها عالية الدقة التي تتطلب التقاط الأفلام من الديدان تتحرك في قطرات الوسائط الموضوعة على الشرائح الزجاجية.

كما قمنا بتكييف برنامج WormScan لقياس القدرة الحركية للديدان بكفاءة في الوسائط السائلة في لوحة من 96 بئرا. يقدم هذا النهج طريقة تجريبية عالية الإنتاجية ومنخفضة التكلفة تستخدم ماسحا ضوئيا مسطحا قياسيا لتحديد براز الحيوان وبقائه بشكل موضوعي ، وقد تم استخدامه سابقا للشاشات عالية الإنتاجية في C. elegans49. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قابلة جدا لفحص عالي الإنتاجية ، مما يتيح مقارنات متوازية لعدد كبير من الشروط في أي مرحلة أو عمر ، مع سهولة الاستخدام ، وانخفاض تكلفة الإعداد ، والتحليل السريع بطريقة موضوعية من قبل برنامج WormScan المجاني والمتاح للجمهور49. عيب WormScan هو أنه يمكن فقط استجواب التغيير الذي يحدث بين الاشعة المتتابعة ، والتي في بعض الطفرات أو الظروف قد لا تكون حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن درجات صغيرة من التغيير phenotypic. بالإضافة إلى ذلك ، حيث تعتمد كل من ZebraLab و WormScan حصريا على تغييرات بكسل الصورة لتقييم النشاط الحيواني ، فقد تحتاج الاختلافات الكبيرة في حجم الدودة التي قد تحدث بين السلالات أو استجابة لعلاج محدد بمرور الوقت إلى النظر فيها و / أو استخدامها كعامل تطبيع لكلا الطريقتين ، لتمكين تقييم ومقارنة آثار الطفرات و / أو العلاج على النشاط الحركي الحيواني بشكل أكثر تحديدا.

عموما، يمكن استخدام مجموعة واسعة من الطرق التجريبية لتقييم النشاط العصبي العضلي الخيطي على النتائج الظاهرية المتكاملة للسحق، والحركة، والضخ البلعومي، و / أو chemotaxis. قارنا 16 من هذه الأساليب(الجدول 1)، وتسليط الضوء على متطلباتها التجريبية والتحليلية المحددة ، والمزايا ، والقيود ، والقدرة الإنتاجية. من بين هذه ، قدمنا بروتوكولات تجريبية مفصلة للتطبيقين الجديدين لأدوات البرامج الموجودة ، ZebraLab (نهج متوسط الإنتاجية) وWormScan (نهج عالي الإنتاجية) ، والتي هي مفيدة بشكل خاص لنشاط حركة الدودة شبه التلقائي والموضوعي والسريع في الوسائط السائلة. وكشف كلا النهجين التجريبية على نحو مماثل انخفاض درجة نشاط الحركة وقعت في مرض الميتوكوندريا(الغاز-1(fc21)) بالنسبة لسلالات elegans WT C. في المرحلة L4، مع الانخفاض التدريجي في النشاط الحركي من قبل مرحلة الشباب الكبار في الغاز-1(fc21) الديدان. وتبين هذه البيانات صحة هذه النهج التجريبية التي تسفر عن بيانات متسقة داخليا. وعلاوة على ذلك، فإن هذه المجموعة من الأساليب متعددة الاستخدامات للغاية، مما يتيح مجموعة واسعة من مقاييس النشاط الحركي للديدان في مختلف أصول الأمراض والمراحل والأعمار الحيوانية، واستجابة للنمذجة العلاجية المرشحة أو شاشات الأدوية عالية الإنتاجية المفيدة للتقييم قبل السريري للأهداف الرئيسية للأمراض البشرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

م.ل.، ن.د.M، ن.س.، و إي.إن.أو. ليس لديهم إفصاحات مالية ذات صلة. M.J.F. هو المؤسس المشارك لشركة MitoCUREia، وعضو المجلس الاستشاري العلمي مع حصة الأسهم في RiboNova، وشركة، وعضو المجلس العلمي كمستشار مدفوع الأجر مع Khondrion، واريمار العلاجية. وقد سبق أن M.J.F. أو تشارك حاليا مع العديد من الشركات العاملة في مرض الميتوكوندريا العلاجية قبل السريرية و / أو تطوير المرحلة السريرية كمستشار مدفوع الأجر (أستيلاس [سابقا ميتوبريدج] فارما شركة, Cyclerion العلاجية، Epirium الحيوي، ايميل العلاجية، Minovia العلاجية، NeuroVive، رينيو العلاجية، الشبح BioTherapeutics، Zogenix، وشركة) و / أو متعاون البحوث برعاية (AADI العلاجية، كارديرو العلاجية، Cyclerion العلاجية، ايميل العلاجية، شركة مينوفيا العلاجية، بعثة العلاجية، NeuroVive، رابتور العلاجية، REATA شركة، RiboNova شركة، Standigm العلاجية، والشبح BioTherapeutics).

Acknowledgments

ونحن ممتنون لأنتوني روزنر، دكتوراه، بدعمه التنظيمي للتحضير المبكر لهذا المشروع، وإيرين هاوس للمساهمة في تحليل البروتوكول. تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق جولييت لأبحاث أمراض الميتوكوندريا علاج FBXL4، وصندوق أبحاث جاكسون فلينت C12ORF65، والمعاهد الوطنية للصحة (R01-GM120762، R01-GM120762-08S1، R35-GM134863، و T32-NS007413). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للممولين أو المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild isolate  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Bristol
Camera Olympus DP73
gas-1(fc-21) CGC CW152
Microscope slides ThermoFisher 4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM) Research Products International Corp. N81800-1000.0
OP50 Escherichia coli CGC Uracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm)  VWR international 25373-085
S. Basal VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
Scanner EPSON V800
Stereomicroscope Olympus MVX10 microscope
96-well flat bottom  VWR international 29442-056
WormScan software Mathew et al. 45 S1 Standalone Java platform Software for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab software ViewPoint Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2013).
  2. Shaye, D. D., Greenwald, I. OrthoList: a compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).
  3. van Ham, T. J., et al. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genetics. 4 (3), 1000027 (2008).
  4. Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
  5. Dingley, S., et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10 (2), 125-136 (2010).
  6. Polyak, E., Zhang, Z., Falk, M. J. Molecular profiling of mitochondrial dysfunction in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 837, 241-255 (2012).
  7. McCormick, E., Place, E., Falk, M. J. Molecular genetic testing for mitochondrial disease: from one generation to the next. Neurotherapeutics. 10 (2), 251-261 (2013).
  8. McCormack, S., et al. Pharmacologic targeting of sirtuin and PPAR signaling improves longevity and mitochondrial physiology in respiratory chain complex I mutant Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 22, 45-59 (2015).
  9. Polyak, E., et al. N-acetylcysteine and vitamin E rescue animal longevity and cellular oxidative stress in pre-clinical models of mitochondrial complex I disease. Molecular Genetics and Metabolism. 123 (4), 449-462 (2018).
  10. Guha, S., et al. Pre-clinical evaluation of cysteamine bitartrate as a therapeutic agent for mitochondrial respiratory chain disease. Human Molecular Genetics. 28 (11), 1837-1852 (2019).
  11. Gorman, G. S., et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease. Annals of Neurology. 77 (5), 753-759 (2015).
  12. Mancuso, M., Orsucci, D., Filosto, M., Simoncini, C., Siciliano, G. Drugs and mitochondrial diseases: 40 queries and answers. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 13 (4), 527-543 (2012).
  13. Gai, X., et al. Mutations in FBXL4, encoding a mitochondrial protein, cause early-onset mitochondrial encephalomyopathy. American Journal of Human Genetics. 93 (3), 482-495 (2013).
  14. Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298 (5602), 2398-2401 (2002).
  15. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
  16. Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
  17. Avery, L., Horvitz, H. R. Effects of starvation and neuroactive drugs on feeding in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 253 (3), 263-270 (1990).
  18. Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
  19. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. Journal of Experimental Biology. 211 (23), 3703-3711 (2008).
  20. Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
  21. Avery, L. Motor neuron M3 controls pharyngeal muscle relaxation timing in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 175, 283-297 (1993).
  22. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  23. Bargmann, C. I., Thomas, J. H., Horvitz, H. R. Chemosensory cell function in the behavior and development of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 529-538 (1990).
  24. Anne, C. H. Behavior. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. 2005-2018, (2006).
  25. Biston, M. C., et al. An objective method to measure cell survival by computer-assisted image processing of numeric images of Petri dishes. Physics in Medicine & Biology. 48 (11), 1551-1563 (2003).
  26. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52321 (2015).
  27. Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab on a Chip. 8 (9), 1432-1435 (2008).
  28. Javer, A., et al. An open-source platform for analyzing and sharing worm-behavior data. Nature Methods. 15 (9), 645-646 (2018).
  29. Koopman, M., et al. Assessing motor-related phenotypes of Caenorhabditis elegans with the wide field-of-view nematode tracking platform. Nature Protocols. 15 (6), 2071-2106 (2020).
  30. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  31. Angstman, N. B., Kiessling, M. C., Frank, H. G., Schmitz, C. High interindividual variability in dose-dependent reduction in speed of movement after exposing C. elegans to shock waves. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 12 (2015).
  32. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  33. Bianchi, J. I., Stockert, J. C., Buzzi, L. I., Blazquez-Castro, A., Simonetta, S. H. Reliable screening of dye phototoxicity by using a Caenorhabditis elegans fast bioassay. PLoS One. 10 (6), 0128898 (2015).
  34. Albertson, D. G., Thomson, J. N. The pharynx of Caenorhabditis elegans. Philososophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 275 (938), 299-325 (1976).
  35. Raizen, D. M., Avery, L. Electrical activity and behavior in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Neuron. 12 (3), 483-495 (1994).
  36. Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook. , 1-23 (2012).
  37. Morck, C., Rauthan, M., Wagberg, F., Pilon, M. pha-2 encodes the C. elegans ortholog of the homeodomain protein HEX and is required for the formation of the pharyngeal isthmus. Developmental Biology. 272 (2), 403-418 (2004).
  38. Song, B. M., Avery, L. Serotonin activates overall feeding by activating two separate neural pathways in Caenorhabditis elegans. TheJournal of Neuroscience. 32 (6), 1920-1931 (2012).
  39. Avery, L., Raizen, D., Lockery, S. Electrophysiological methods. Methods in Cell Biology. 48, 251-269 (1995).
  40. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab in a Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  41. Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nature Communications. 8, 14221 (2017).
  42. Brinkmann, V., Ale-Agha, N., Haendeler, J., Ventura, N. The Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) in the aging process: Another puzzling role for this highly conserved transcription factor. Frontiers in Physiology. 10, 1561 (2019).
  43. Huang, C., et al. Intrinsically aggregation-prone proteins form amyloid-like aggregates and contribute to tissue aging in Caenorhabditis elegans. eLife. 8, 43059 (2019).
  44. Zhu, B., et al. Functional analysis of epilepsy-associated variants in STXBP1/Munc18-1 using humanized Caenorhabditis elegans. Epilepsia. 61 (4), 810-821 (2020).
  45. Weeks, J. C., Robinson, K. J., Lockery, S. R., Roberts, W. M. Anthelmintic drug actions in resistant and susceptible C. elegans revealed by electrophysiological recordings in a multichannel microfluidic device. International Journal of Parasitology. Drugs and Drug Resistance. 8 (3), 607-628 (2018).
  46. Haroon, S., et al. Multiple molecular mechanisms rescue mtDNA disease in C. elegans. Cell Reports. 22 (12), 3115-3125 (2018).
  47. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  48. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
  49. Mathew, M. D., et al. Using C. elegans forward and reverse genetics to identify new compounds with anthelmintic activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005058 (2016).
  50. Kayser, E. B., Morgan, P. G., Hoppel, C. L., Sedensky, M. M. Mitochondrial expression and function of GAS-1 in Caenorhabditis elegans. Journal Biological Chemistry. 276 (23), 20551-20558 (2001).
  51. Falk, M. J., Kayser, E. B., Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mitochondrial complex I function modulates volatile anesthetic sensitivity in C. elegans. Current Biology. 16 (16), 1641-1645 (2006).
  52. Kwon, Y. J., Guha, S., Tuluc, F., Falk, M. J. High-throughput BioSorter quantification of relative mitochondrial content and membrane potential in living Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 40, 42-50 (2018).
  53. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  54. Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental protocol for examining behavioral response profiles in larval fish: Application to the Neuro-stimulant caffeine. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57938 (2018).
  55. Carlsson, G., Blomberg, M., Pohl, J., Orn, S. Swimming activity in zebrafish larvae exposed to veterinary antiparasitic pharmaceuticals. Environmental Toxicology and Pharmacology. 63, 74-77 (2018).
  56. Yang, X., et al. High-throughput screening in larval zebrafish identifies novel potent sedative-hypnotics. Anesthesiology. 129 (3), 459-476 (2018).

Tags

السلوك، العدد 170، الديدان، C. elegans،النشاط الحركي، ضخ البلعوم، chemotaxis، سحق، ZebraLab، WormScan، قدرة فحص عالية الإنتاجية، الغاز-1 (fc21)
تحليل مقارن للطرق التجريبية لقياس النشاط الحيواني في <em>نماذج Elegans Caenorhabditis</em> من مرض الميتوكوندريا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah,… More

Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah, N., Nakamaru-Ogiso, E., Falk, M. J. Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease. J. Vis. Exp. (170), e62244, doi:10.3791/62244 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter