Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Komparativ analyse av eksperimentelle metoder for å kvantifisere dyreaktivitet i Caenorhabditis elegans Modeller av mitokondriesykdom

Published: April 4, 2021 doi: 10.3791/62244
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1,2
1Mitochondrial Medicine Frontier Program, Division of Human Genetics, Department of Pediatrics, The Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Denne studien presenterer protokoller for to halvautomatiske lokomotoriske aktivitetsanalyser i C. elegans kompleks I sykdom gass-1(fc21) ormer, nemlig ZebraLab (en middels gjennomstrømningsanalyse) og WormScan (en høy gjennomstrømningsanalyse) og gir komparativ analyse blant et bredt spekter av forskningsmetoder for å kvantifisere nematodeadferd og integrert nevromuskulær funksjon.

Abstract

Caenorhabditis elegans er allment anerkjent for sin sentrale nytte som en translasjonell dyremodell for effektivt å forhøre mekanismer og terapier av ulike menneskelige sykdommer. Ormer er spesielt godt egnet for genetiske skjermer og legemiddelskjermer med høy gjennomstrømning for å få dypere innsikt i terapeutiske mål og terapier ved å utnytte deres raske utviklingssyklus, stor brødstørrelse, kort levetid, mikroskopisk transparens, lave vedlikeholdskostnader, robust pakke med genomiske verktøy, mutante depoter og eksperimentelle metoder for å forhøre både in vivo og ex vivo fysiologi. Orm lokomotorisk aktivitet representerer en spesielt relevant fenotype som ofte svekkes ved mitokondriesykdom, som er svært heterogen i årsaker og manifestasjoner, men som samlet deler en svekket kapasitet til å produsere cellulær energi. Mens en pakke med forskjellige metoder kan brukes til å forhøre ormadferd, varierer disse sterkt i eksperimentelle kostnader, kompleksitet og verktøy for genomiske eller narkotika high-throughput skjermer. Her ble den relative gjennomstrømningen, fordelene og begrensningene til 16 forskjellige aktivitetsanalysemetoder sammenlignet som kvantifiserer nematode-bevegelse, thrashing, faryngeal pumping og / eller chemotaxis i enkelt ormer eller ormpopulasjoner av C. elegans på forskjellige stadier, aldre og eksperimentelle varigheter. Detaljerte protokoller ble demonstrert for to halvautomatiske metoder for å kvantifisere nematode lokomotorisk aktivitet som representerer nye anvendelser av tilgjengelige programvareverktøy, nemlig ZebraLab (en middels gjennomstrømningstilnærming) og WormScan (en tilnærming med høy gjennomstrømning). Data fra å anvende disse metodene viste lignende grader av redusert dyreaktivitet på L4 larvalstadiet, og utviklet seg på dag 1 voksne, i mitokondriekompleks I sykdom (gass-1(fc21)mutante ormer i forhold til wild-type (N2 Bristol) C. elegans. Disse dataene validerer verktøyet for disse nye applikasjonene ved bruk av ZebraLab- eller WormScan-programvareverktøy for å kvantifisere orm lokomotorisk aktivitet effektivt og objektivt, med variabel kapasitet til å støtte høygjennomstrømningsmedisin screening på ormadferd i prekliniske dyremodeller av mitokondriesykdom.

Introduction

Caenorhabiditis elegans er allment anerkjent som en fremragende modell innen nevrovitenskap basert på at den har 302 nevroner som koordinerer all ormadferd, inkludert parring, fôring, egglegging, avføring, svømming og bevegelse på faste medier1. Disse hermafrodittiske nematodene er også mye brukt til å forstå et bredt spekter av menneskelige sykdomsmekanismer, muliggjort av sitt godt karakteriserte genom og høye homologi av ~ 80% gener mellom C. elegans og mennesker2,3,4. C. elegans har lenge vært brukt til å forhøre menneskelig mitokondriesykdom5,6,7,8,9,10, som er en svært genetisk og fenotypisk heterogen gruppe arvelige metabolske forstyrrelser som deler nedsatt kapasitet til å generere cellulær energi og ofte klinisk tilstede med betydelig nedsatt nevromuskulær funksjon, treningsintoleranse og tretthet11 ,12,13,14. For dette formål muliggjør bruk av C. elegans-modeller preklinisk modellering av kvantitative aspekter av dyreaktivitet og nevromuskulær funksjon i forskjellige genetiske undertyper av mitokondriesykdom, samt deres respons på kandidatterapier som kan forbedre deres nevromuskulære funksjon og generell aktivitet.

Nevromuskulær aktivitet i C. elegans er objektivt målbar ved en rekke eksperimentelle metoder, inkludert både manuelle og halvautomatiske tilnærminger som tillater funksjonelle analyser i enten faste eller flytende medier (Tabell 1)1,15. Nøyaktig kvantitet av C. elegans aktivitet har vist seg viktig for å muliggjøre funn knyttet til funksjon og utvikling av muskel- og nervesystemet16,17,18. Denne studien oppsummerer og sammenligner eksperimentelle krav, fordeler og begrensninger ved 17 ulike analyser som kan utføres i forskningslaboratorier for å evaluere nevromuskulær funksjon og aktivitet på fire nøkkelutfall i C. elegans sykdomsmodeller, både ved baseline ved en rekke utviklingsstadier og aldre, samt som svar på kandidatterapier ( Tabell 1 elegans sykdomsmodeller, både ved baseline i en rekke utviklingsstadier og aldre, samt som svar på kandidatterapier (Tabell 1 ). Faktisk gir studien en detaljert oversikt over utvalget av tilgjengelige eksperimentelle tilnærminger for å karakterisere rater av C. elegans thrashing (kroppsbøyninger per minutt), lokomotorisk aktivitet, faryngeal pumping og chemotaxis-i hvert tilfelle som spesifiserer eksperimentell og analytisk metodikk som brukes, fordelene og begrensningene ved hver metode, utstyret og programvaren som trengs for å utføre og analysere hver analyse, og gjennomstrømningskapasiteten til hver metode for å støtte bruken til genetiske eller narkotikascreeningsformål med høy gjennomstrømning. Gjennomstrømningskapasiteten til hver analyse beskrives som lav, middels eller høy basert på den eksperimentelle protokollkompleksiteten, inkludert ormvedlikehold, behandlingstid, bruk av enkeltplater eller flerbrønnplater og/eller eksperimenteringstid som trengs for å fullføre eksperimentelle innstillings- og dataanalyser.

Manuelle analyser av thrashing19, lokomotorisk aktivitet20, farynngeal pumping17,21og chemotaxis22,23 er veletablerte metoder for å evaluere ormaktivitet som krever et stereomikroskop24. Mens måling av thrashing aktivitet av ormer krever analyse i flytende medier for å bestemme frekvensen av kroppsbøyninger per minutt, orm locomotor aktivitet kan måles enten på faste medier eller i flytende medier. Manuelle analyser av individuell ormaktivitet er imidlertid iboende tidkrevende og innebærer uunngåelig brukergenerert skjevhet. Automatisering av ormaktivitetsanalyser minimerer brukergenererte skjevheter og kan i stor grad øke eksperimentell gjennomstrømning25. Videoopptak av orm thrashing aktivitet i flytende medier kan analyseres ved hjelp av wrMTrck, en ImageJ plugin26. Imidlertid begrenset de opprinnelige eksperimentelle innstillingene som ble utviklet for wrMTrck sitt verktøy, siden for mange ormer i en enkelt væskedråpe førte til overlapping av ormer som gjorde nøyaktig sporing vanskelig. Selv om denne eksperimentelle begrensningen er løst27, kan ikke wrMTrck -metoden støtte screening med høy gjennomstrømning.

Det finnes en rekke metoder for å kvantifisere orm lokomotorisk aktivitet ved baseline og som svar på kandidatbehandlinger i C. elegans mitokondrie sykdomsmodeller. Disse inkluderer ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker28, wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP)29, WormMotel, WormWatcher30, WormLab31, Infinity Chip32og WMicrotracker One33 (Tabell 1). Disse metodene muliggjør samtidig analyse av bevegelse i flere ormstammer eller forhold, vanligvis på multi-brønnplater, og støtter dermed applikasjoner for narkotikascreening med høyere gjennomstrømning. Noen av disse metodene har unike hensyn som kan begrense eller forbedre deres generelle verktøy, for eksempel behovet for dyrt utstyr kontra programvare med åpen tilgang, og varierende enkel utførelse av eksperimentelle protokoller. Totalt sett er ingen enkelt eksperimentelt system eller protokoll ideelt egnet for alle C. elegans lokomotoriske aktivitetseksperimenter. Snarere er det viktig å nøye velge hvilken metode som passer best til den spesifikke undersøkerens eksperimentelle mål og krav.

Pharyngeal pumping representerer et annet viktig resultat for å vurdere nevromuskulær aktivitet i C. elegans. C. elegans pharynx består av 20 muskelceller, 20 nevroner og 20 andre celler som muliggjør inntak av Escherichia coli (E. coli) i den fremre enden av ormens fordøyelseskanal34,35,36. Det er etablert flere manuelle metoder for å bestemme pharyngeal pumpehastigheter17,21,37,38. De fleste metoder er basert på bruk av et stereomikroskop og kamera for å visualisere og registrere faryngeal pumpefrekvens med direkte telling av den eksperimentelle observatøren21. Automatisert pharyngeal pumpehastighetsanalyse er mulig ved å utføre en ekstracellulær registrering kalt elektropharyngeogram (EPG), som gir ytterligere informasjon om varigheten av hver pumpe39. Pharyngeal pumpehastighetsanalyse er også mulig i et mikrofluidisk system, WormSpa, hvor individuelle ormer er begrenset i kamre40,41. En kommersiell metode tilgjengelig for å lette analysen av pharyngeal pumpehastigheten er ScreenChip System (InVivo Biosystems), som måler, visualiserer og analyserer de nevromuskulære aspektene ved fôringsadferd i en enkelt orm som er immobilisert i en tilpasset brikke. Denne pharyngeal pumpende kvantumstilnærmingsmetoden kan brukes til å vurdere både nevronale og fysiologiske responser på narkotika, aldring og andre faktorer42,43,44,45.

Chemotaxis beskriver bevegelsen av C. elegans som svar på en luktstoff plassert vekk fra ormene i et definert område av nematode vekstmediene (NGM) plate. Vurdering av chemotaxis-responsen gir et integrert mål på orm nevronal og nevromuskulær aktivitet som kan kvantifiseres ved å observere og måle den fysiske avstanden som er reist av ormer mot luktstoffet i en definert tidsperiode46. Multi-Worm Tracker er en automatisk metode som kan brukes til å forbedre den eksperimentelle effektiviteten ved å kvantifisere avstanden som er reist av ormer mot en tiltrekningskraft eller fra en avstøtende47.

Her beskrives den detaljerte protokollen for to nye, halvautomatiske metoder etablert for kvantifisering av ormaktivitet. Den første tilnærmingen benytter ZebraLab en kommersiell programvare som opprinnelig ble utviklet for å studere svømmeaktivitet av Danio rerio (sebrafisk), for en ny medium-gjennomstrømningsapplikasjon for å kvantifisere generell lokomotorisk aktivitet i flytende medier av C. elegans basert på pikselendringer under bevegelse (Tabell 1, figur 1). Datautgang hentes raskt fra et stort antall samtidige forhold og prøver analysert på et glasssklie, selv om denne metoden ikke er egnet for et multi-brønns plateformat. Den andre tilnærmingen er en ny tilpasning av WormScan-metoden48,49 ( figur2), som bruker en planskanner til å lage et differensialbilde av to sekvensielle skanninger som kan brukes med åpen kildekode-programvare for å muliggjøre halvautomatisk kvantitativ analyse av integrerte fysiologiske resultater som fecundity og overlevelse. Her ble det utviklet en ny høygjennomstrømningstilpasning av WormScan-metoden for å kvantifisere orm lokomotorisk aktivitet i flytende medier i populasjoner av femten larvaltrinn 4 (L4) ormer per brønn av en 96-brønns, flatbunnplate. Denne halvautomatiske og rimelige WormScan-metodikken kan lett tilpasses høygjennomstrømningsmedisinske skjermer, samt til analyser av ulike dyrestadier og alder48,49.

Her demonstreres protokollen og effekten av å analysere C. elegans lokomotorisk aktivitet ved hjelp av både ZebraLab og WormScan halvautomatiske metoder i en veletablert C. elegans-modell for mitokondriekompleks I sykdom, gass-1(fc21). gas-1 (K09A9,5 gen) er en ortolog av humant NDUFS2 (NADH: ubiquinone oxidoreductase core (jern-svovelprotein) subenhet 2) (Figur 3). C. elegans gas-1(fc21) mutantstamme bærer en homozygot p.R290K missense mutasjon i den menneskelige ortologen av NDUFS250, forårsaker betydelig redusert fecundity og levetid, nedsatt respiratorisk kjede oksidativ fosforylering (OXPHOS) kapasitet51, samt redusert mitokondriemasse og membranpotensial med økt oksidativ stress5,8 , . Til tross for sin veletablerte bruk de siste to tiårene for å studere mitokondriesykdom, ble lokomotorisk aktivitet av gass-1(fc21) mutanter ikke tidligere rapportert. Her ble ZebraLab- og WormScan-metoder brukt til uavhengig kvantifisere den lokomotoriske aktiviteten til gass-1(fc21) sammenlignet med wild-type (WT, N2 Bristol) ormer, både som en måte å validere metodene på, samt å demonstrere deres komparative nytte og effektivitet av eksperimentelle protokoller og informatikkanalyser. ZebraLab programvare tillot rask kvantitet av flere samtidige forhold av orm locomotorisk aktivitet i C. elegans mitokondrie sykdom modeller, med potensiell anvendelse for målrettet narkotika screening eller validering studier. Spesielt WormScan-analyse er godt egnet til å enkelt muliggjøre høygjennomstrømningsmedisinske skjermer av sammensatte biblioteker og prioritere ledninger som forbedrer dyrets nevromuskulære funksjon og lokomotorisk aktivitet i prekliniske C. elegans-modeller av primær mitokondriesykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Orm lokomotorisk aktivitetsanalyse i flytende medier på glasssklier ved hjelp av ZebraLab programvare

  1. Nematode vekst og håndtering
    1. Vokse C. elegans på Petri plater som inneholder nematode vekstmedier (NGM) og spred med Escherichia coli OP50 som matkilde. Opprettholde ormekultur ved 20 °C, som tidligere beskrevet8.
    2. Synkroniser ormer som utfører et tidsbelagt egg lå52 og studerer ormer på ønsket stadium. I denne protokollen ble L4-stadium ormer analysert.
    3. Få kontroll og mutant ormstammer på NGM-plater med og uten legemiddelbehandlinger som skal testes eller bufferkontroll. For å evaluere legemiddelbehandlingseffektene, forberede ønsket legemiddelbestandskonsentrasjon i S. basal løsning; det beregnede spesifikke volumet på NGM-platene og la det tørke. Overfør ormene på et bestemt larv- eller voksenstadium og vedlikehold på legemiddelbehandlingsplaten i ønsket varighet før analyse.
  2. Eksperimentelt oppsett av ormer for lokomotorisk aktivitetsvideoopptak og ZebraLab-analyse
    1. Velg 5 synkroniserte L4-ormer per belastning og betingelse ved hjelp av en ormplukking. Pipette en enkelt 20 μL dråpe S. basalløsning på en glasssklie som er plassert under et stereomikroskop koblet til et kamera og overfør 5 ormer inn i det (Figur 1A, B). Overfør de 5 ormene fra Petri-parabolen som inneholder NGM og E. coli OP50 til væskedråpen bare for øyeblikket før innspillingen.
      MERK: Fortsett å vedlikeholde de andre ormene på Petri-parabolen til den forrige videoen er spilt inn. Dette vil unngå skaden forårsaket på de andre ormene på grunn av tørking av de 20 μl dråpene under prosedyren (tørrtid ~ 15-20 min).
    2. Pipette flere dråper på ett lysbilde for å få flere tekniske replikeringer (Figur 1A). Velg ormer fra forskjellige NGM-plater (biologisk replikering). Ikke bruk dekselslipp.
    3. Juster mikroskopets arbeidsavstand for å visualisere hele området for en enkelt dråpe. Angi og oppretthold en lav videooppløsning (<1024 x 768) for å laste opp filene i programvaren.
    4. La ormer akklimatisere seg på lysbildet ved romtemperatur i 1 min før opptak.
    5. Registrer ormsvømmingsaktiviteten i 1 slipp i 1 min ved 15 bilder per sekund (fps). Gjenta bildet for hver ekstra dråpe på platen.
  3. C. elegans locomotor aktivitetsopptak analyse i ZebraLab programvare
    1. Bruk alternativet ZEBRALAB AVI for å laste opp videoer til programvaren. Klikk på alternativet Kvantisering med AVI-filer (Figur 1C).
    2. Hvis du vil opprette en ny protokoll, velger du Fil > Generer protokoll, og deretter legger du til antall områder som er valgt for analysen. Velg Plasseringsantall: 1.
    3. Åpne Protokollparametere, og velg 1 min i Eksperimenteringsvarighet-vinduet. Velg en annen eksperimentell varighet for ulike eksperimentelle varigheter. Merk av for eller fjern merket for vinduet Ingen tidshylle , og velg Integrasjonsperiode, avhengig av ønsket datautdata. I denne studien ble No Time Bin valgt ( Figur1D).
      MERK: Tidshylle er tiden aktiviteten vil bli gjennomsnittet over.
    4. Hvis en protokoll allerede er opprettet, velger du Åpne protokoll og velger den lagrede protokollen (i VTE-format).
    5. Velg Fil og åpne en film for å laste opp hver enkelt videofil som tidligere ble spilt inn.
    6. Velg Område-ikonet som er angitt i figur 1E (svart pil) for å bygge ett enkelt deteksjonsområde og opprette et område rundt hele væskedråpen der ormer er plassert. Klikk Velg, og klikk deretter det grønne sirkelikonet (grå pil) under Områder > Bygg > Fjern merker.
      MERK: Aktiviteten til alle ormer i den definerte dråpen vil bli oppdaget i det valgte området (Figur 1E,F).
    7. Gå til Kalibrering > Tegn skala (Figur 1E) og tegn en vannrett linje fra venstre til høyre for videoområdet. Angi den reelle avstanden som skal kalibreres. Velg deretter Bruk på gruppe.
    8. Fjern merket for ikonet som er valgt for å bygge området (pil i figur 1E), og merk av for eller fjern merket for Gjennomsiktig.
      MERK: I denne studien ble Transparent valgt ut og ga bedre resultater.
    9. Juster deteksjonsfølsomhet og aktivitetsterskel for å tillate deteksjon av alle de forskjellige C. elegans-ormstammene som analyseres.
      MERK: I dette eksperimentet ble deteksjonsfølsomheten satt til 8 med burst- og fryseverdier på henholdsvis 15 og 2 (figur 1F).
    10. Sett Display Scale på 70 for å visualisere sporet laget av dyret mens aktivitetsanalyse er i gang. Velg deretter Bruk på gruppe ( Figur1F).
    11. Klikk Eksperimenter > Utfør > Lagre som, og klikk deretter Start . Det åpnes et vindu. Velg Vil du behandle videomediet med maksimal datahastighet? for å analysere videoen raskt (f.eks. et videoopptak på 1 min analyseres av i ZebraLab-programvaren i 5 s).
    12. Et annet vindu åpnes: Kjøre eksperiment; klikk på Start for å fortsette med eksperimentet.
    13. Etter at videoopptaket er fullført, stopper analysen. Klikk Eksperimenter > Stopp. Dette lagrer aktiviteten som analyseres fra én enkelt dråpe i et regneark.
    14. Gjenta analysen for hver video av individuell slipp. Hver dråpe er en teknisk replikering.
  4. Produksjon og analyse av ZebraLab-data
    MERK: Etter eksperimentet lagres data fra hver video individuelt som separate regneark i den valgte mappen. I utdatafilen registreres det integrerte aktivitetsnivået for alle ormer som beveger seg i en individuell slipp, ettersom pikselendringer under actinteg.
    1. Åpne hvert regneark hentet fra analysen av hver video. Kompiler dem manuelt i en enkelt fil.
      Normaliser mutant- og wild-type-dataene til en prosent av kontrollen. Her ble det utført statistiske analyser for å sammenligne gjennomsnittlig aktivitetsnivå mellom grupper.

2. Orm lokomotorisk aktivitetsanalyse i flytende medier i 96-brønns plateformat ved WormScan programvareanalyse

  1. Nematode vekst og håndtering
    1. Vokse C. elegans som beskrevet i avsnitt 1.1.1.
    2. Synkroniser ormer som beskrevet i del 1.1.2.
    3. Voks ormer på bestemte medier som beskrevet i avsnitt 1.1.3 til L4 stadium eller dag 1 voksen.
  2. Eksperimentelt oppsett av ormer i 96-brønnsplate for WormScan aktivitetsanalyse
    1. Tilsett 50 μL 2% vekt per volum av E. coli OP50 i flytende suspensjon i S. basal medium til hver brønn av en 96-brønn, klar, flatbunn, mikroplate, som tidligere beskrevet49,53.
    2. Under et stereomikroskop velger du manuelt 15 synkroniserte ormer på L4-trinn eller dag 1 voksen fra NGM-platene til flytende medier i hver eksperimentelle brønn på 96-brønnsmikroplaten. La ormene akklimatisere seg til det flytende mediet i 20 minutter før skanning.
      MERK: Andre dyrestadier og aldre kan lett erstattes med studier.
  3. WormScan aktivitetsanalyse i 96-brønns plate og dataeksport til regneark.
    1. Skann hver 96-brønns, klar, flatbunnet mikroplate to ganger sekvensielt ved hjelp av en standard planskanner, med mindre enn 10 s mellom skanninger.
      MERK: Her ble fotoskanneren med en oppløsning på 1200 prikker/inn og 16-biters gråtoner brukt til å produsere jpeg-bilder. Tiden det tar å skanne fire plater med 96 brønner ved hjelp av fotoskanneren, er mindre enn 10 minutter.
    2. Juster de to sekvensielle skanningene (figur 2A) ved hjelp av åpen kildekode-programvare49.
      MERK: Programvaren genererer et forskjellsbilde for å evaluere pikselendringer mellom de to sekvensielle bildene for et interesseområde (figur 2B) og en relativ WormScan Score. Denne WormScan-poengsummen tilsvarer endringer i lokomotorisk respons basert på lysintensiteten som produseres av skanneren når den settes til en pikselterskel på 5 (figur 2C).
    3. Eksporter dataene fra WormScan som et regneark. Lagre regnearket som inneholder dataene, på den lokale datamaskinen. Normaliser dataene som prosentandel av kontroll (POC) og sammenlign på tvers av biologiske replikeringsforsøk for ulike mutant- eller behandlingstilstander. Utfør statistisk analyse for å sammenligne mutant- og kontrollmidler ved hjelp av student t-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analyse av C. elegans lokomotorisk aktivitet i flytende medier kan lett fange en integrert fenotype av mitokondriesykdom ormmodeller som kanskje ikke er lett kvantifiserbare på faste medier. ZebraLab ble brukt til å kvantifisere lokomotorisk aktivitet av det veletablerte mitokondriekomplekset I sykdom gass-1(fc21) stamme i forhold til WTworms i flytende medier på L4 larvalstadiet. Aktiviteten til 5 ormer i en enkelt væskedråpe ble registrert over 1 min, med totalt 19 videoer (tekniske replikeringer) registrert for hver stamme, noe som resulterte i total analyse av 95 ormer per stamme. Fire biologiske replikeringsforsøk ble oppnådd per stamme. Ormaktivitet vises som pikselendring (figur 3A), og som prosent av kontrollen (POC) når den normaliseres til N2 Bristol WT-kontroll (Figur 3B). Gass-1(fc21) ormer (62% ± 16% pikselendring, gjennomsnittlig ± SD, n = 19) hadde en signifikant 38% reduksjon (p < 0,001, t-test) i sin lokomotoriske aktivitet på L4 stadium sammenlignet med WT ormer (100% ± 11,35%, gjennomsnittlig ± SD, n = 95 ormer per tilstand i 19 tekniske replikeringer over 4 biologiske kopier).

WormScan-analyse ble også utført for å kvantifisere den lokomotoriske aktiviteten til L4-trinns gass-1(fc21) og WT-ormer i flytende medier. Data ble samlet inn for tre biologiske replikeringsforsøk, der hver biologiske replikeringsplate ble evaluert av to sekvensielle bilder skannet ved hjelp av en standard planskanner. Ormaktiviteten til differensialbildene ble sammenlignet som pikselendring og normalisert til samtidig N2 Bristol WT-kontroll. På samme måte, som det ble sett av Sebrafish behavior screening-metoden, viste WormScan-basert analyse at gass-1(fc21) ormer (65,9 ± 6,1, gjennomsnittlig ± SD, n = 13 brønner) hadde en signifikant reduksjon i lokomotorisk aktivitet med 34 % (p < 0,001, t-test) sammenlignet med N2 Bristol wild-type ormer (100 % ± 4,8 %, gjennomsnittlig ± SEM, n = 12 brønner) (Figur 3C). Analyse ved bruk av WormScan på dag 1 voksen gass-1(fc21) ormer (50,1% ± 10,7%, gjennomsnittlig ± SD, n = 7 brønner) viste en reduksjon i lokomotorisk aktivitet med 49 % (p < 0,001, t-test) sammenlignet med WT-ormer (100 % ± 16,2 %, gjennomsnittlig ± SD, n = 6 brønner) (Figur 3D).

Tabell 1: Komparativ oversikt over eksperimentelle analyser tilgjengelig for å evaluere C. elegans nevromuskulær aktivitet. En detaljert oversikt er gitt av et bredt spekter av 16 forskjellige eksperimentelle teknikker som kan brukes til å kvantifisere orm neuromuskulær aktivitet på fenotypiske resultater av thrashing, bevegelse, pharyngeal pumping, og / eller chemotaxis i C. elegans. Leseformat, metodikk, eksperimentell gjennomstrømningskapasitet, programvare- og/eller utstyrskrav, samt fordeler og begrensninger ved hver analyse er detaljerte. Referanser og relevante nettsteder for hvert analyse- og programvareverktøy er også gitt. Gjennomstrømningskapasiteten til hver analyse beskrives som lav, middels eller høy, basert på eksperimentell kompleksitet, bruk av enkelt- eller multibrønnplater og/eller eksperimenteringstid som trengs for å fullføre eksperimentell innstilling og dataanalyser. * Indikerer at metodene også kan brukes til evaluering av bevegelse. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Figure 1
Figur 1: C. elegans lokomotoriske aktivitetsanalyser ved hjelp av ZebraLab-programvare. (A,B) Eksperimentell protokoll for videoopptak av ormer. Fem ormer ble introdusert per dråpe (20 μL) av S. basal løsning, med fire dråper plassert på en enkelt glasssklie under et stereomikroskop. Hver dråpe med 5 ormer representerte et eksperiment for teknisk replikering og ble spilt inn i 1 min i en egen film ved hjelp av et ccd-kamera (ladet enhet). (C-F) Eksperimentelle innstillinger i ZebraLab som tilpasset evaluering av lokomotorisk aktivitet i C. elegans. (C) Valg av kvantisering med AVI-filer for å kvantifisere ormen lokomotorisk aktivitet for hver innspilte video. (D) Protokollparameterinnstillinger, der 1 min er valgt som eksperimentvarighet. (E) Bygg område for å velge interesseområde. Området ble valgt og bygget rundt 1 dråpe løsning der 5 ormer ble plassert. (F) Deteksjon ble bestemt basert på gråskala tersklering for å oppdage hele kroppen av hver orm (rød). I terskeldelen ble burst- og frysingsverdier valgt for å analysere ormeaktivitet etter hvert som pikselen endres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: C. elegans lokomotorisk aktivitetsanalyse ved hjelp av WormScan-metodikk. (A) Ved hjelp av en Epson v800 planskanner ble to umiddelbart sekvensielle skanninger av en 96-brønnsplate tatt med en oppløsning på 1200 prikker/inn og 16-biters gråtoner for å produsere jpeg-bilder. (B) Disse to sekvensielle bildene av en 96-brønns plate ble deretter justert etter et referanseområde av interesse (ROI), av WT-ormer. (C) Bildeanalyse er basert på en forskjell bildescore beregnet for hver avkastning med 15 ormer / brønn for N2 Bristol. Differansebildet ble normalisert og rapportert som prosentandel av kontroll (POC). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Komparativ analyse av lokomotorisk aktivitet av ZebraLab og WormScan programvareanalyser i gass-1(fc21) mitokondriesykdom ormer i forhold til N2 Bristol wild-type ormer. (A, B) WT og gass-1(fc21) ormaktivitet i flytende dråper (5 ormer / slipp) ble video registrert i 1 min og kvantifisert som (A) piksler eller endrepiksler ( ) prosentandel av wild-type kontroll ved hjelp av ZebraLab-programvaren. Samlet sett viste ZebraLab-basert ormaktivitetsanalyse en signifikant reduksjon med 38% i gass-1(fc21) L4-stadium ormer sammenlignet med wild-type kontroller (*** p < 0,001). Grafen viser gjennomsnittlig ± SD for alle data, der hver prikk formidler den totale aktiviteten til fem ormer per S. basalfall. Hver dråpe representerer en teknisk replikering, med totalt fire biologiske repliker studert per tilstand. Totalt 19 videoer ble spilt inn (en video for hver dråpe på 5 ormer), over totalt 95 individuelle ormer studert per tilstand. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av student t-testeni Prism -GraphPad v6. (C) WT og gass-1(fc21) ormer på L4 stadium ble analysert av flatbed skanning for å produsere to sekvensielle bilder som ble analysert i WormScan programvare for å gi en forskjell bilde. Tre biologiske replikeringsforsøk ble utført med 15 ormer per brønn i en 96 brønnplate. Aktiviteten til WT-ormer ble brukt som grunnlinje for å normalisere prosentandelen av kontroll (POC). gass-1(fc21) aktiviteten ble redusert med 34% sammenlignet med wild-type kontroll (*** p < 0,001). Stolpediagrammer formidler gjennomsnitts- og standardavvik på tvers av tre biologiske replikeringsforsøk. (D) N2 og gass-1(fc21)ormer på voksen dag 1 stadium ble analysert på samme måte som beskrevet for panel C. gass-1(fc21) aktivitet på dag 1 voksne ble redusert med 49,1% i forhold til wild-type kontroll ormer (*** p < 0,001). Stolpediagrammer formidler gjennomsnitts- og standardavvik for pikselendringer i én biologisk replikering som sammenligner N2 (n = 6 brønner på 15 ormer/brønn) og gass-1(fc21) (n = 7 brønner på 15 ormer/brønn). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her oppsummerte studien detaljert informasjon og begrunnelser for å studere C. elegans nevromuskulær aktivitet på nivået av forskjellige resultater, inkludert orm thrashing, bevegelse, faryngeal pumping og chemotaxis. Sammenligningen av 16 forskjellige aktivitetsanalysemetoder ble utført når det gjelder relativ gjennomstrømning, fordeler og begrensninger ved kvantifisere nematodeaktiviteter i en enkelt orm- eller ormpopulasjoner i forskjellige aldre og eksperimentelle varigheter. Blant disse ble to nye tilpasninger og anvendelser av halvautomatiske analyser fremhevet for å demonstrere betydelig reduksjon i lokomotorisk aktivitet i larval-stage ormer på L4 larval utviklingsstadium og i dag 1 unge voksne av et veletablert mitokondriekompleks I sykdom C. elegans stamme, gass-1(fc21) i forhold til WT-kontroller.

Spesielt har C. elegans nevromuskulær funksjon og lokomotorisk aktivitet blitt grundig studert på faste medier siden WT ormbevegelse er svært vanlig i sinusformede bølgemønstre. Abnormiteter i deres vanlige bevegelsesbane og hastigheten kan mikroskopisk oppdages og manuelt scores av den eksperimentelle observatøren, i analyser som ofte er lav gjennomstrømning og kjedelig. For å øke eksperimentell gjennomstrømning bør automatiserte og høygjennomstrømningsmetoder velges. Nedsatt aktivitet av ormer kan kvantifiseres i flytende medier, hvor generell lokomotorisk aktivitet av ormer i dråper på glasssklier eller i flerbrønnplater kan filmes og kvantifiseres på halvautomatisk eller automatisert måte med forskjellige programvareverktøy. Faktisk, våre data fremhever nytten av objektivt og effektivt måling av nematode lokomotorisk aktivitet både ved en ny anvendelse av ZebraLab programvare for å kvantifisere locomotorisk aktivitet i videoer av ormer i flytende dråper på glass lysbilder (en middels gjennomstrømning screening kapasitet tilnærming), samt ved å bruke WormScan programvare for å kvantifisere orm locomotor aktivitet i differensial flatbed skanning bilder av ormer i en 96-brønns plate flytende mediatilnærming, 55,56 (en høy gjennomstrømning screening kapasitet tilnærming). ZebraLab-programvaretilnærmingen betraktes som en middels gjennomstrømningsanalyse siden den krever at enkeltplater brukes til hver tilstand som studeres, uten nåværende utviklet protokoll for flerbrønns plateformater. Mens du bruker ZebraLab-programvaretilnærmingen krever minimal tid når du analyserer C. elegans-aktivitet under noen få forhold, øker den eksperimentelle tiden når den brukes på flere forhold. Her var den eksperimentelle tiden omtrent 2 timer for å overføre ormer til flytende dråper og spille inn videoer av deres aktivitet, med tanke på 18 tekniske repliker for hver tilstand. Tiden som ble brukt til analysen av disse videoene ved hjelp av ZebraLab-programvaren var omtrent 1 time. Til sammenligning er WormScan-metoden høy gjennomstrømning fordi den inneholder et flerbrønns plateformat som tillater samtidig analyse av fire 96-brønnsplater på mindre enn 10 minutter og sette opp en 96-brønns plate med en COPAS Bisoter er også mindre enn 10 min.

Begge metodene viste en tilsvarende redusert aktivitet i L4 larval stadium gas-1(fc21) mitokondriesykdom mutant ormer i forhold til WT ormer, og dermed validere begge distinkte tilnærminger for kvantifisere forskjeller i orm atferd. Videre ble WormScan-analysen brukt til lett å demonstrere at progressiv reduksjon i dyr lokomotorisk aktivitet skjedde med alderen i gass-1(fc21) ormer som det fremgår av dag 1 voksenstadiet.

De viktigste fordelene ved vår tilpasning av ZebraLab-programvaren som ble utviklet for sebrafisksvømmingsanalyse til C. elegans aktivitetsanalyse er at det er eksperimentelt enkelt og billig å objektivt fange ormbevegelse i videoer, med halvautomatisk kvantitativ analyse i filmfiler lastet opp til ZebraLab-programvare som krever bare sekunder per teknisk replikering og fjerner undersøkerbaserte skjevheter som er til stede i manuelle kvantitetsmetoder. Videre er det nyttig å ha dette ene programvareverktøyet i forskningslaboratoriet for å kvantifisere lokomotorisk aktivitet i to dyremodellarter, nemlig sebrafisk og C. elegans. Ulempen er at dette er en kommersiell programvare som krever kjøp og ormevideoer må lastes opp manuelt til programvaren, selv om opplastingsprosessen er grei og programvareanalysetiden er relativt rask. Totalt sett har den nye applikasjonen beskrevet her å bruke ZebraLab-programvare for å kvantifisere C. elegans lokomotorisk aktivitet direkte potensial til å evaluere narkotikaeffekter på ormadferd, selv om gjennomstrømningen forblir lav-til-medium gitt sine høyoppløselige krav som krever at filmer fanges opp av ormer som beveger seg i mediedråper plassert på glasssklier.

Vi tilpasset også WormScan programvare for effektivt kvantifisere orm lokomotorisk kapasitet av ormer i flytende medier i en 96-brønns plate. Denne tilnærmingen tilbyr en høy gjennomstrømning og rimelig eksperimentell metode som bruker en standard planskanner for objektivt å kvantifisere dyr fecundity og overlevelse og har tidligere blitt brukt til skjermer med høy gjennomstrømning i C. elegans49. De viktigste fordelene med denne teknikken er at den er svært mottagelig for screening med høy gjennomstrømning, noe som muliggjør parallelle sammenligninger av et stort antall forhold når som helst eller alder, med brukervennlighet, lave installasjonskostnader og rask analyse på en objektiv måte av WormScan-programvaren som er gratis og offentlig tilgjengelig49. Ulempen med WormScan er at den bare kan forhøre endringen som skjer mellom sekvensielle skanninger, som i noen mutasjoner eller forhold kanskje ikke er tilstrekkelig følsomme til å oppdage små grader av fenotypisk endring. I tillegg, ettersom både ZebraLab- og WormScan-metoder utelukkende er avhengige av bildepikselendringer for å analysee dyreaktivitet, kan det hende at betydelige forskjeller i ormstørrelse som kan oppstå mellom stammer eller som svar på en bestemt terapi over tid, må vurderes og/eller brukes som en normaliseringsfaktor for begge metodene, for mer spesifikt å muliggjøre evaluering og sammenligning av mutasjons- og/eller behandlingseffekter på dyrs lokomotoriske aktivitet.

Totalt sett kan et bredt spekter av eksperimentelle metoder brukes til å vurdere nematode nevromuskulær aktivitet på integrerte fenotypiske resultater av thrashing, bevegelse, faryngitteal pumping og / eller chemotaxis. Vi sammenlignet 16 av disse metodene (tabell 1), og fremhevet deres spesifikke eksperimentelle og analytiske krav, fordeler, begrensninger og gjennomstrømningskapasitet. Blant disse ga vi detaljerte eksperimentelle protokoller for to nye applikasjoner av eksisterende programvareverktøy, ZebraLab (en middels gjennomstrømningstilnærming) og WormScan (en høygjennomstrømningstilnærming), som er spesielt nyttige for semi-automatisk, objektivt og raskt kvantifisere ormeaktivitet i flytende medier. Begge eksperimentelle tilnærminger avdekket en tilsvarende redusert grad av bevegelsesaktivitet forekom i mitokondriesykdom (gass-1(fc21)) i forhold til WT C. elegans stammer på L4-stadiet, med progressiv nedgang i lokomotorisk aktivitet av den unge voksne scenen i gass-1(fc21) ormer. Disse dataene viser gyldigheten av disse eksperimentelle tilnærmingene som gir internt konsistente data. Videre er dette utvalget av metoder svært allsidig, noe som muliggjør et bredt spekter av orm lokomotoriske aktivitetsmålinger i forskjellige sykdomsetiologier, dyrestadier og aldre, og som svar på kandidatterapeutisk modellering eller høygjennomstrømningsmedisinske skjermer som er nyttige for preklinisk evaluering av blymål for menneskelig sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M.L., N.D.M., N.S. og E.N.-O. har ingen relevante finansielle opplysninger. M.J.F. er medgrunnlegger av MitoCUREia, Inc., vitenskapelig rådgivende styremedlem med eierandel i RiboNova, Inc., og vitenskapelig styremedlem som betalt konsulent med Khondrion, og Larimar Therapeutics. M.J.F. har tidligere vært eller er for tiden engasjert i flere selskaper involvert i mitokondriesykdom terapeutisk preklinisk og / eller klinisk stadium utvikling som en betalt konsulent (Astellas [tidligere Mitobridge] Pharma Inc., Cyclerion Therapeutics, Epirium Bio, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics, NeuroVive, Reneo Therapeutics, Stealth BioTherapeutics, Zogenix, Inc.) og/eller en sponset forskningspartner (AADI Therapeutics, Cardero Therapeutics, Cyclerion Therapeutics, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics Inc., Mission Therapeutics, NeuroVive, Raptor Therapeutics, REATA Inc., RiboNova Inc., Standigm Therapeutics og Stealth BioTherapeutics).

Acknowledgments

Vi er takknemlige til Anthony Rosner, PhD., med hans organisatoriske støtte til den tidlige utarbeidelsen av dette prosjektet, og til Erin Haus for å bidra til protokollanalyse. Dette arbeidet ble finansiert av Juliet's Cure FBXL4 Mitochondrial Disease Research Fund, Jaxson Flynt C12ORF65 Research Fund og National Institutes of Health (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 og T32-NS007413). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til funderne eller National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild isolate  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Bristol
Camera Olympus DP73
gas-1(fc-21) CGC CW152
Microscope slides ThermoFisher 4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM) Research Products International Corp. N81800-1000.0
OP50 Escherichia coli CGC Uracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm)  VWR international 25373-085
S. Basal VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
Scanner EPSON V800
Stereomicroscope Olympus MVX10 microscope
96-well flat bottom  VWR international 29442-056
WormScan software Mathew et al. 45 S1 Standalone Java platform Software for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab software ViewPoint Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2013).
  2. Shaye, D. D., Greenwald, I. OrthoList: a compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).
  3. van Ham, T. J., et al. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genetics. 4 (3), 1000027 (2008).
  4. Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
  5. Dingley, S., et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10 (2), 125-136 (2010).
  6. Polyak, E., Zhang, Z., Falk, M. J. Molecular profiling of mitochondrial dysfunction in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 837, 241-255 (2012).
  7. McCormick, E., Place, E., Falk, M. J. Molecular genetic testing for mitochondrial disease: from one generation to the next. Neurotherapeutics. 10 (2), 251-261 (2013).
  8. McCormack, S., et al. Pharmacologic targeting of sirtuin and PPAR signaling improves longevity and mitochondrial physiology in respiratory chain complex I mutant Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 22, 45-59 (2015).
  9. Polyak, E., et al. N-acetylcysteine and vitamin E rescue animal longevity and cellular oxidative stress in pre-clinical models of mitochondrial complex I disease. Molecular Genetics and Metabolism. 123 (4), 449-462 (2018).
  10. Guha, S., et al. Pre-clinical evaluation of cysteamine bitartrate as a therapeutic agent for mitochondrial respiratory chain disease. Human Molecular Genetics. 28 (11), 1837-1852 (2019).
  11. Gorman, G. S., et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease. Annals of Neurology. 77 (5), 753-759 (2015).
  12. Mancuso, M., Orsucci, D., Filosto, M., Simoncini, C., Siciliano, G. Drugs and mitochondrial diseases: 40 queries and answers. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 13 (4), 527-543 (2012).
  13. Gai, X., et al. Mutations in FBXL4, encoding a mitochondrial protein, cause early-onset mitochondrial encephalomyopathy. American Journal of Human Genetics. 93 (3), 482-495 (2013).
  14. Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298 (5602), 2398-2401 (2002).
  15. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
  16. Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
  17. Avery, L., Horvitz, H. R. Effects of starvation and neuroactive drugs on feeding in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 253 (3), 263-270 (1990).
  18. Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
  19. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. Journal of Experimental Biology. 211 (23), 3703-3711 (2008).
  20. Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
  21. Avery, L. Motor neuron M3 controls pharyngeal muscle relaxation timing in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 175, 283-297 (1993).
  22. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  23. Bargmann, C. I., Thomas, J. H., Horvitz, H. R. Chemosensory cell function in the behavior and development of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 529-538 (1990).
  24. Anne, C. H. Behavior. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. 2005-2018, (2006).
  25. Biston, M. C., et al. An objective method to measure cell survival by computer-assisted image processing of numeric images of Petri dishes. Physics in Medicine & Biology. 48 (11), 1551-1563 (2003).
  26. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52321 (2015).
  27. Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab on a Chip. 8 (9), 1432-1435 (2008).
  28. Javer, A., et al. An open-source platform for analyzing and sharing worm-behavior data. Nature Methods. 15 (9), 645-646 (2018).
  29. Koopman, M., et al. Assessing motor-related phenotypes of Caenorhabditis elegans with the wide field-of-view nematode tracking platform. Nature Protocols. 15 (6), 2071-2106 (2020).
  30. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  31. Angstman, N. B., Kiessling, M. C., Frank, H. G., Schmitz, C. High interindividual variability in dose-dependent reduction in speed of movement after exposing C. elegans to shock waves. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 12 (2015).
  32. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  33. Bianchi, J. I., Stockert, J. C., Buzzi, L. I., Blazquez-Castro, A., Simonetta, S. H. Reliable screening of dye phototoxicity by using a Caenorhabditis elegans fast bioassay. PLoS One. 10 (6), 0128898 (2015).
  34. Albertson, D. G., Thomson, J. N. The pharynx of Caenorhabditis elegans. Philososophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 275 (938), 299-325 (1976).
  35. Raizen, D. M., Avery, L. Electrical activity and behavior in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Neuron. 12 (3), 483-495 (1994).
  36. Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook. , 1-23 (2012).
  37. Morck, C., Rauthan, M., Wagberg, F., Pilon, M. pha-2 encodes the C. elegans ortholog of the homeodomain protein HEX and is required for the formation of the pharyngeal isthmus. Developmental Biology. 272 (2), 403-418 (2004).
  38. Song, B. M., Avery, L. Serotonin activates overall feeding by activating two separate neural pathways in Caenorhabditis elegans. TheJournal of Neuroscience. 32 (6), 1920-1931 (2012).
  39. Avery, L., Raizen, D., Lockery, S. Electrophysiological methods. Methods in Cell Biology. 48, 251-269 (1995).
  40. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab in a Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  41. Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nature Communications. 8, 14221 (2017).
  42. Brinkmann, V., Ale-Agha, N., Haendeler, J., Ventura, N. The Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) in the aging process: Another puzzling role for this highly conserved transcription factor. Frontiers in Physiology. 10, 1561 (2019).
  43. Huang, C., et al. Intrinsically aggregation-prone proteins form amyloid-like aggregates and contribute to tissue aging in Caenorhabditis elegans. eLife. 8, 43059 (2019).
  44. Zhu, B., et al. Functional analysis of epilepsy-associated variants in STXBP1/Munc18-1 using humanized Caenorhabditis elegans. Epilepsia. 61 (4), 810-821 (2020).
  45. Weeks, J. C., Robinson, K. J., Lockery, S. R., Roberts, W. M. Anthelmintic drug actions in resistant and susceptible C. elegans revealed by electrophysiological recordings in a multichannel microfluidic device. International Journal of Parasitology. Drugs and Drug Resistance. 8 (3), 607-628 (2018).
  46. Haroon, S., et al. Multiple molecular mechanisms rescue mtDNA disease in C. elegans. Cell Reports. 22 (12), 3115-3125 (2018).
  47. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  48. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
  49. Mathew, M. D., et al. Using C. elegans forward and reverse genetics to identify new compounds with anthelmintic activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005058 (2016).
  50. Kayser, E. B., Morgan, P. G., Hoppel, C. L., Sedensky, M. M. Mitochondrial expression and function of GAS-1 in Caenorhabditis elegans. Journal Biological Chemistry. 276 (23), 20551-20558 (2001).
  51. Falk, M. J., Kayser, E. B., Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mitochondrial complex I function modulates volatile anesthetic sensitivity in C. elegans. Current Biology. 16 (16), 1641-1645 (2006).
  52. Kwon, Y. J., Guha, S., Tuluc, F., Falk, M. J. High-throughput BioSorter quantification of relative mitochondrial content and membrane potential in living Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 40, 42-50 (2018).
  53. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  54. Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental protocol for examining behavioral response profiles in larval fish: Application to the Neuro-stimulant caffeine. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57938 (2018).
  55. Carlsson, G., Blomberg, M., Pohl, J., Orn, S. Swimming activity in zebrafish larvae exposed to veterinary antiparasitic pharmaceuticals. Environmental Toxicology and Pharmacology. 63, 74-77 (2018).
  56. Yang, X., et al. High-throughput screening in larval zebrafish identifies novel potent sedative-hypnotics. Anesthesiology. 129 (3), 459-476 (2018).

Tags

Oppførsel utgave 170 ormer C. elegans lokomotorisk aktivitet pharyngeal pumping chemotaxis thrashing ZebraLab WormScan høy gjennomstrømning screening kapasitet gass-1 (fc21)
Komparativ analyse av eksperimentelle metoder for å kvantifisere dyreaktivitet i <em>Caenorhabditis elegans</em> Modeller av mitokondriesykdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah,… More

Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah, N., Nakamaru-Ogiso, E., Falk, M. J. Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease. J. Vis. Exp. (170), e62244, doi:10.3791/62244 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter