Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Vergelijkende analyse van experimentele methoden om dierlijke activiteit in Caenorhabditis elegans-modellen van mitochondriale ziekte te kwantificeren

Published: April 4, 2021 doi: 10.3791/62244
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1,2
1Mitochondrial Medicine Frontier Program, Division of Human Genetics, Department of Pediatrics, The Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Deze studie presenteert protocollen voor twee semi-geautomatiseerde locomotorische activiteitsanalysebenaderingen in C. elegans complex I ziekte gas-1(fc21) wormen, namelijk ZebraLab (een medium-throughput assay) en WormScan (een high-throughput assay) en biedt vergelijkende analyse tussen een breed scala aan onderzoeksmethoden om het gedrag van nematoden en de geïntegreerde neuromusculaire functie te kwantificeren.

Abstract

Caenorhabditis elegans wordt algemeen erkend voor zijn centrale nut als een translationeel diermodel om mechanismen en therapieën van verschillende menselijke ziekten efficiënt te ondervragen. Wormen zijn bijzonder geschikt voor genetische en medicijnscreenings met hoge doorvoer om dieper inzicht te krijgen in therapeutische doelen en therapieën door gebruik te maken van hun snelle ontwikkelingscyclus, grote broedgrootte, korte levensduur, microscopische transparantie, lage onderhoudskosten, robuuste reeks genomische hulpmiddelen, mutantenrepository's en experimentele methodologieën om zowel in vivo als ex vivo fysiologie te ondervragen. Worm locomotorische activiteit vertegenwoordigt een bijzonder relevant fenotype dat vaak wordt aangetast bij mitochondriale ziekten, die zeer heterogeen is in oorzaken en manifestaties, maar gezamenlijk een verminderd vermogen deelt om cellulaire energie te produceren. Hoewel een reeks verschillende methodologieën kan worden gebruikt om het gedrag van wormen te ondervragen, variëren deze sterk in experimentele kosten, complexiteit en nut voor genomische of medicijnschermen met hoge doorvoer. Hier werden de relatieve doorvoer, voordelen en beperkingen van 16 verschillende activiteitsanalysemethoden vergeleken die de voortbeweging van nematoden, thrashing, faryngeaal pompen en / of chemotaxis kwantificeren in enkele wormen of wormpopulaties van C. elegans in verschillende stadia, leeftijden en experimentele duur. Gedetailleerde protocollen werden gedemonstreerd voor twee semi-geautomatiseerde methoden om de locomotorische activiteit van nematoden te kwantificeren die nieuwe toepassingen van beschikbare softwaretools vertegenwoordigen, namelijk ZebraLab (een benadering met gemiddelde doorvoer) en WormScan (een benadering met hoge doorvoer). Gegevens van de toepassing van deze methoden toonden aan dat vergelijkbare graden van verminderde dierlijke activiteit optraden in het L4-larvale stadium en vorderden bij volwassenen op dag 1, bij mitochondriale complexI-ziekte ( gas-1(fc21)mutante wormen ten opzichte van wild-type (N2 Bristol) C. elegans. Deze gegevens valideren het nut voor deze nieuwe toepassingen van het gebruik van de ZebraLab- of WormScan-softwaretools om de locomotorische activiteit van wormen efficiënt en objectief te kwantificeren, met variabele capaciteit om high-throughput medicijnscreening op wormgedrag in preklinische diermodellen van mitochondriale ziekte te ondersteunen.

Introduction

Caenorhabiditis elegans wordt algemeen erkend als een uitstekend model in de neurowetenschappen op basis van het hebben van 302 neuronen die alle wormgedrag coördineren, inclusief paring, voeding, eieren leggen, ontlasting, zwemmen en voortbeweging op vaste media1. Deze hermafrodiete nematoden worden ook veel gebruikt om een breed scala aan menselijke ziektemechanismen te begrijpen, mogelijk gemaakt door het goed gekarakteriseerde genoom en de hoge homologie van ~ 80% genen tussen C. elegans en mensen2,3,4. C. elegans worden al lang gebruikt om de menselijke mitochondriale ziekte5,6,7,8,9,10te ondervragen, wat een zeer genetisch en fenotypisch heterogene groep van erfelijke metabole stoornissen is die een verminderd vermogen delen om cellulaire energie te genereren en vaak klinisch aanwezig zijn met een aanzienlijk verminderde neuromusculaire functie, inspanningsintolerantie en vermoeidheid11 ,12,13,14. Hiertoe maakt het gebruik van C. elegans-modellen preklinische modellering mogelijk van kwantitatieve aspecten van dierlijke activiteit en neuromusculaire functie in verschillende genetische subtypen van mitochondriale ziekte, evenals hun reactie op kandidaat-therapieën die hun neuromusculaire functie en algehele activiteit kunnen verbeteren.

Neuromusculaire activiteit in C. elegans is objectief meetbaar door een reeks experimentele methodologieën, waaronder zowel handmatige als semi-geautomatiseerde benaderingen die functionele analyses in vaste of vloeibare media mogelijk maken (Tabel 1)1,15. Nauwkeurige kwantificering van C. elegans-activiteit is belangrijk gebleken om ontdekkingen mogelijk te maken met betrekking tot de functie en ontwikkeling van het spier- en zenuwstelsel16,17,18. Deze studie vat de experimentele vereisten, voordelen en beperkingen van 17 verschillende assays samen die kunnen worden uitgevoerd in onderzoekslaboratoria om de neuromusculaire functie en activiteit te evalueren op vier belangrijke uitkomsten in C. elegans-ziektemodellen, zowel bij de baseline in een reeks ontwikkelingsstadia en leeftijden als als reactie op kandidaattherapieën (tabel 1 ). Inderdaad, de studie biedt een gedetailleerd overzicht van het scala aan beschikbare experimentele benaderingen om de snelheid van C. elegans thrashing (lichaamsbuigingen per minuut), locomotorische activiteit, faryngeaal pompen en chemotaxis te karakteriseren - in elk geval met vermelding van de gebruikte experimentele en analytische methodologie, de voordelen en beperkingen van elke methode, de apparatuur en software die nodig is om elke test uit te voeren en te analyseren, en de doorvoercapaciteit van elke methode ter ondersteuning van het gebruik ervan voor genetische of drugsscreening met hoge doorvoer. De doorvoercapaciteit van elke test wordt beschreven als laag, gemiddeld of hoog op basis van de complexiteit van het experimentele protocol, inclusief wormonderhoud, verwerkingstijd, het gebruik van enkele of multi-well platen en / of experimenteertijd die nodig is om de experimentele setting en gegevensanalyses te voltooien.

Handmatige analyses van thrashing19, locomotorische activiteit20, faryngealepompen 17,21en chemotaxis22,23 zijn gevestigde methodologieën om wormactiviteit te evalueren die een stereomicroscoop vereisen24. Terwijl het meten van de thrashing-activiteit van wormen analyse in vloeibare media vereist om de frequentie van lichaamsbuigingen per minuut te bepalen, kan de locomotorische activiteit van de worm worden gemeten op vaste media of in vloeibare media. Handmatige analyses van individuele wormactiviteit zijn echter inherent tijdrovend en brengen onvermijdelijke door de gebruiker gegenereerde vooringenomenheid met zich mee. Automatisering van wormactiviteitsanalyses minimaliseert door gebruikers gegenereerde bias en kan de experimentele doorvoer aanzienlijk verhogen25. Video-opnames van worm thrashing activiteit in vloeibare media kunnen worden geanalyseerd met behulp van wrMTrck, een ImageJ plugin26. De oorspronkelijke experimentele instellingen die voor wrMTrck werden ontwikkeld, beperkten echter het nut ervan, omdat te veel wormen in een enkele vloeistofdruppel leidden tot overlapping van wormen die nauwkeurige tracking moeilijk maakten. Hoewel deze experimentele beperking is opgelost27, is de wrMTrck-methode niet in staat om screening met hoge doorvoer te ondersteunen.

Er bestaat een reeks methoden om de locomotorische activiteit van wormen bij baseline en als reactie op kandidaat-therapieën in C. elegans mitochondriale ziektemodellen te kwantificeren. Deze omvatten ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker28,wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP)29,WormMotel, WormWatcher30,WormLab31,Infinity Chip32en WMicrotracker One33 (Tabel 1). Deze methoden maken gelijktijdige analyse van voortbeweging in meerdere wormstammen of -omstandigheden mogelijk, meestal op platen met meerdere putten, waardoor screeningstoepassingen voor geneesmiddelen met een hogere doorvoer worden ondersteund. Sommige van deze methoden hebben unieke overwegingen die hun algemene nut kunnen beperken of verbeteren, zoals de behoefte aan dure apparatuur versus open-access software en het variërende gemak van het uitvoeren van experimentele protocollen. Over het algemeen is geen enkel experimenteel systeem of protocol bij uitstek geschikt voor alle experimenten met locomotorische activiteit van C. elegans. Het is eerder belangrijk om zorgvuldig te kiezen welke methode het meest geschikt is voor de experimentele doelen en vereisten van de specifieke onderzoeker.

Faryngeaal pompen vertegenwoordigt een andere belangrijke uitkomst om neuromusculaire activiteit bij C. eleganste beoordelen . De C. elegans farynx bestaat uit 20 spiercellen, 20 neuronen en 20 andere cellen die inname van Escherichia coli (E. coli) aan het voorste uiteinde van het spijsverteringskanaal van de worm mogelijk maken34,35,36. Er zijn verschillende handmatige methoden vastgesteld om faryngeale pompsnelheden17,21,37,38te bepalen. De meeste methoden zijn gebaseerd op het gebruik van een stereomicroscoop en camera om de faryngeale pompfrequentie te visualiseren en vast te leggen met directe telling door de experimentele waarnemer21. Geautomatiseerde faryngeale pompsnelheidsanalyse is mogelijk door een extracellulaire registratie uit te voeren die elektrofaryngeogram (EPG) wordt genoemd, die aanvullende informatie biedt over de duur van elke pomp39. Faryngeale pompsnelheidsanalyse is ook mogelijk in een microfluïdisch systeem, WormSpa, waar individuele wormen worden opgesloten in kamers40,41. Een commerciële methode die beschikbaar is om de analyse van de faryngeale pompsnelheid te vergemakkelijken, is het ScreenChip System (InVivo Biosystems), dat de neuromusculaire aspecten van voedingsgedrag meet, visualiseert en analyseert in een enkele worm die is geïmmobiliseerd in een aangepaste chip. Deze faryngeale pompkwantificeringsbenadering kan worden gebruikt om zowel neuronale als fysiologische reacties op geneesmiddelen, veroudering en andere factoren te beoordelen42,43,44,45.

Chemotaxis beschrijft de beweging van C. elegans als reactie op een geurstof die weg van de wormen wordt geplaatst in een bepaald gebied van de nematode groeimedia (NGM) plaat. Het beoordelen van de chemotaxisrespons biedt een geïntegreerde maat voor neuronale en neuromusculaire activiteit van de worm die kwantificeerbaar is door het observeren en meten van de fysieke afstand die wormen in een bepaalde periode tot de odorant afleggen46. De Multi-Worm Tracker is een automatische methode die kan worden gebruikt om de experimentele efficiëntie te verbeteren van het kwantificeren van de afstand die wormen afleggen tot een lokstof of van een afweermiddel47.

Hier wordt het gedetailleerde protocol beschreven voor twee nieuwe, semi-geautomatiseerde methoden die zijn vastgesteld voor het kwantificeren van wormactiviteit. De eerste benadering maakt gebruik van ZebraLab, een commerciële software die oorspronkelijk werd ontwikkeld om de zwemactiviteit van Danio rerio (zebravis) te bestuderen, voor een nieuwe toepassing met gemiddelde doorvoer om de totale locomotorische activiteit in vloeibare media van C. elegans te kwantificeren op basis van pixelveranderingen tijdens beweging(tabel 1, figuur 1). Gegevensuitvoer wordt snel verkregen uit een groot aantal gelijktijdige omstandigheden en monsters geanalyseerd op een glasplaat, hoewel deze methode niet geschikt is voor een plaatformaat met meerdere putten. De tweede benadering is een nieuwe aanpassing van de WormScan-methodologie48,49 ( Figuur2), die een flatbedscanner gebruikt om een differentieel beeld te maken van twee sequentiële scans die variabel kunnen worden gebruikt met open-source software om semi-geautomatiseerde kwantitatieve analyse van geïntegreerde fysiologische uitkomsten zoals vruchtbaarheid en overleving mogelijk te maken. Hier werd een nieuwe high-throughput aanpassing van de WormScan-methodologie ontwikkeld om de locomotorische activiteit van wormen in vloeibare media te kwantificeren in populaties van vijftien larvale stadium 4 (L4) wormen per put van een 96-well, platbodemplaat. Deze semi-geautomatiseerde en goedkope WormScan-methodologie kan gemakkelijk worden aangepast aan geneesmiddelenschermen met een hoge doorvoer, evenals aan analyses van verschillende dierstadia en leeftijdenvan 48,49jaar.

Hier wordt het protocol en de werkzaamheid van het analyseren van C. elegans locomotorische activiteit met behulp van zowel ZebraLab als WormScan semi-geautomatiseerde methoden aangetoond in een gevestigde C. elegans-model voor mitochondriale complex I-ziekte, gas-1(fc21). gas-1 (gen K09A9.5) is een ortholoog van humane NDUFS2 (NADH: ubiquinon oxidoreductase core (ijzer-zwavel eiwit) subeenheid 2) (Figuur 3). De C. elegans gas-1(fc21) mutante stam draagt een homozygote p.R290K missense mutatie in de menselijke ortholoog van NDUFS250, waardoor de vruchtbaarheid en levensduur aanzienlijk afnemen, verminderde respiratoire keten oxidatieve fosforylering (OXPHOS) capaciteit51, evenals verminderde mitochondriale massa en membraan potentieel met verhoogde oxidatieve stress5,8 . Ondanks het gevestigde gebruik in de afgelopen twee decennia om mitochondriale ziekten te bestuderen, werd locomotorische activiteit van gas-1(fc21) mutanten niet eerder gemeld. Hier werden ZebraLab- en WormScan-methoden toegepast om de locomotorische activiteit van gas-1(fc21) onafhankelijk te kwantificeren in vergelijking met wild-type (WT, N2 Bristol) wormen, zowel als een manier om de methoden te valideren als om hun vergelijkende nut en efficiëntie van de experimentele protocollen en informatica-analyses aan te tonen. ZebraLab-software maakte een snelle kwantificering mogelijk van verschillende gelijktijdige omstandigheden van wormlocomotorische activiteit in C. elegans mitochondriale ziektemodellen, met mogelijke toepassing voor gerichte screening of validatiestudies van geneesmiddelen. WormScan-analyse, in het bijzonder, is zeer geschikt om gemakkelijk high-throughput medicijnscreenings van samengestelde bibliotheken mogelijk te maken en prioriteit te geven aan leads die de neuromusculaire functie van dieren en de locomotorische activiteit in preklinische C. elegans-modellen van primaire mitochondriale ziekte verbeteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Worm locomotorische activiteit analyse in vloeibare media op glazen dia's met behulp van ZebraLab software

  1. Groei en behandeling van nematoden
    1. Kweek C. elegans op petriplaten met nematodengroeimedia (NGM) en verspreid met Escherichia coli OP50 als voedselbron. Houd de wormcultuur op 20 °C, zoals eerder beschreven8.
    2. Synchroniseer wormen die een getimede eier leggen52 uitvoeren en bestudeer wormen in het gewenste stadium. In dit protocol werden L4-stadiumwormen geanalyseerd.
    3. Kweekbestrijding en gemuteerde wormstammen op NGM-platen met en zonder te testen medicamenteuze behandelingen of buffercontrole. Om de effecten van de medicamenteuze behandeling te evalueren, bereidt u de gewenste concentratie van de medicijnvoorraad in S. basale oplossing voor; verdeel het berekende specifieke volume over de NGM-platen en laat het drogen. Breng de wormen over in een specifiek larvaal of volwassen stadium en onderhoud op de medicijnbehandelingsplaat voor de gewenste duur vóór de analyse.
  2. Experimentele opstelling van wormen voor bewegingsactiviteit video-opname en ZebraLab-analyse
    1. Kies 5 gesynchroniseerde L4-wormen per stam en conditie met behulp van een wormenplectrum. Pipetteer een enkele druppel S. basale oplossing van 20 μL op een glazen dia onder een stereomicroscoop die op een camera is aangesloten en breng er 5 wormen in over(Figuur 1A,B). Breng de 5 wormen van de petrischaal met NGM en E. coli OP50 pas over op de vloeistofdruppel op het moment voorafgaand aan de registratie.
      OPMERKING: Blijf de andere wormen op de petrischaal onderhouden totdat de vorige video is opgenomen. Dit voorkomt de schade aan de andere wormen als gevolg van het opdrogen van de 20 μl druppels tijdens de procedure (droogtijd ~ 15-20 min).
    2. Pipetteer meerdere druppels op één dia om meerdere technische replicaties te verkrijgen(figuur 1A). Selecteer wormen uit verschillende NGM-platen (biologische replicatie). Gebruik geen afdekslip.
    3. Pas de werkafstand van de microscoop aan om het volledige gebied van een enkele druppel te visualiseren. Stel een lage videoresolutie in en behoud deze (<1024 x 768) om de bestanden in de software te uploaden.
    4. Laat wormen 1 minuut op kamertemperatuur acclimatiseren op de dia voordat u opneemt.
    5. Registreer de zwemactiviteit van de worm in 1 druppel gedurende 1 minuut met 15 frames per seconde (fps). Herhaal de beeldvorming voor elke extra druppel op de plaat.
  3. C. elegans locomotorische activiteit registratie analyse in ZebraLab software
    1. Gebruik de optie ZEBRALAB AVI om video's naar de software te uploaden. Klik op de optie Kwantisatie met AVI-bestanden (Figuur 1C).
    2. Als u een nieuw protocol wilt maken, selecteert u Bestand > Protocol genererenen voegt u het aantal gebieden toe dat voor de analyse is geselecteerd. Kies locatie aantal: 1.
    3. Open Protocolparameters en selecteer 1 min in het venster Experimentduur. Selecteer een andere experimentele duur voor verschillende experimentele duur. Selecteer of deselecteer het venster No Time Bin en kies Integratieperiode, afhankelijk van de gewenste gegevensuitvoer. In dit onderzoek is geen Time Bin geselecteerd(figuur 1D).
      OPMERKING: Tijdbak is de tijd waarover de activiteit wordt gemiddeld.
    4. Als er al een protocol is gemaakt, selecteert u Open Protocol en selecteert u het opgeslagen protocol (in .vte-indeling).
    5. Selecteer Bestand en Open een film om elk afzonderlijk videobestand te uploaden dat eerder is opgenomen.
    6. Selecteer het gebiedspictogram dat wordt aangegeven in figuur 1E (zwarte pijl) om een enkel detectiegebied te bouwen en een gebied rond de hele vloeistofdruppel te maken waar wormen zich bevinden. Klik op Selecterenen vervolgens op het groene cirkelpictogram (grijze pijl) onder Gebieden > Build > Duidelijke markeringen.
      OPMERKING: De activiteit van alle wormen in de gedefinieerde druppel wordt gedetecteerd in het geselecteerde gebied(Figuur 1E,F).
    7. Ga naar Kalibratie > Tekenschaal (Figuur 1E) en teken een horizontale lijn van links naar rechts van het videogebied. Geef de werkelijke afstand aan die moet worden gekalibreerd. Selecteer vervolgens Toepassen op groep.
    8. Hef de selectie van het pictogram op dat is geselecteerd om het gebied te bouwen (pijl in figuur 1E)en selecteer of deselecteer Transparant.
      OPMERKING: In dit onderzoek werd Transparant geselecteerd en gaf betere resultaten.
    9. Pas de detectiegevoeligheid en activiteitsdrempel aan om de detectie van alle verschillende geanalyseerde C. elegans-wormstammen mogelijk te maken.
      OPMERKING: In dit experiment werd de detectiegevoeligheid ingesteld op 8 met burst- en bevriezingswaarden van respectievelijk 15 en 2(figuur 1F).
    10. Stel de displayschaal in op 70 om het spoor te visualiseren dat door het dier is gemaakt terwijl de activiteitsanalyse aan de gang is. Selecteer vervolgens Toepassen op groep ( Figuur1F).
    11. Klik op Experimenteren > Uitvoeren > Opslaan alsen vervolgens op Starten. Er wordt een venster geopend. Kies Wilt u de videomedia op maximale computersnelheid verwerken? om de video snel te analyseren (bijv. een video-opname van 1 minuut wordt geanalyseerd door de in ZebraLab-software in 5 s).
    12. Er wordt nog een ander venster geopend: Experiment uitvoeren; klik op Start om door te gaan met het experiment.
    13. Nadat de video-opname is voltooid, stopt de analyse. Klik op Experiment > Stop. Dit slaat de geanalyseerde activiteit op vanaf een enkele druppel in een spreadsheet.
    14. Herhaal de analyse voor elke video van individuele druppel. Elke druppel is een technische replicatie.
  4. Output en analyse van ZebraLab-gegevens
    OPMERKING: Na het experiment worden gegevens van elke video afzonderlijk opgeslagen als afzonderlijke spreadsheets in de gekozen map. In het gegevensuitvoerbestand wordt het geïntegreerde activiteitsniveau van alle wormen die in een individuele druppel bewegen geregistreerd als pixelveranderingen onder actinteg.
    1. Open elke spreadsheet die is verkregen uit de analyse van elke video. Compileer ze handmatig in één bestand.
      Normaliseer de mutant- en wildtypegegevens tot een percentage van de controle. Hier werden statistische analyses uitgevoerd om de gemiddelde activiteitsniveaus tussen groepen te vergelijken.

2. Worm locomotorische activiteit analyse in vloeibare media in 96-well plaat formaat door WormScan software analyse

  1. Groei en behandeling van nematoden
    1. Kweek C. elegans zoals beschreven in rubriek 1.1.1.
    2. Synchroniseer wormen zoals beschreven in paragraaf 1.1.2.
    3. Kweek wormen op specifieke media zoals beschreven in rubriek 1.1.3 tot L4 stadium of dag 1 volwassene.
  2. Experimentele opstelling van wormen in 96-well plaat voor WormScan activiteitsanalyse
    1. Voeg 50 μL van 2% gewicht per volume E. coli OP50 in vloeibare suspensie in S. basaal medium toe aan elke put van een 96-well, clear, flat-bottom, microplaat, zoals eerder beschreven49,53.
    2. Kies onder een stereomicroscoop handmatig 15 gesynchroniseerde wormen in het L4-stadium of dag 1 volwassen uit hun NGM-platen in vloeibare media in elke experimentele put van de 96-well microplaat. Laat de wormen 20 minuten wennen aan de vloeibare media voordat u gaat scannen.
      OPMERKING: Andere dierstadia en -leeftijden kunnen gemakkelijk worden vervangen door studie.
  3. WormScan-activiteitsanalyse in 96-well plaat en gegevensexport naar spreadsheet.
    1. Scan elke microplaat met 96 plaatsen, een vlakke bodem en twee keer achter elkaar met behulp van een standaard flatbedscanner, met minder dan 10 s tussen de scans.
      OPMERKING: Hier werd de fotoscanner met een resolutie van 1.200 dots /in en 16-bit grijswaarden gebruikt om jpeg-afbeeldingen te produceren. De tijd die nodig is om vier 96-well platen te scannen met behulp van de fotoscanner is minder dan 10 minuten.
    2. Lijn de twee opeenvolgende scans(Figuur 2A)uit met behulp van open source software49.
      OPMERKING: De software genereert een verschilafbeelding om pixelveranderingen tussen de twee opeenvolgende afbeeldingen voor een interessegebied(figuur 2B)en een relatieve WormScan-scorete evalueren. Deze WormScan Score is gelijk aan veranderingen in locomotorische respons op basis van de lichtintensiteit geproduceerd door de scanner wanneer ingesteld op een pixeldrempel van 5(Figuur 2C).
    3. Exporteer de gegevens uit WormScan als een spreadsheet. Sla de spreadsheet met de gegevens op de lokale computer op. Normaliseer de gegevens als percentage van de controle (POC) en vergelijk biologische replicatie-experimenten voor diverse mutant- of behandelingsomstandigheden. Voer statistische analyse uit om mutant- en controlemiddelen te vergelijken met behulp van de student t-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analyse van C. elegans locomotorische activiteit in de vloeibare media zou gemakkelijk een geïntegreerd fenotype van mitochondriale ziektewormmodellen kunnen vastleggen die mogelijk niet gemakkelijk kwantificeerbaar zijn op vaste media. ZebraLab werd gebruikt om de locomotorische activiteit van de gevestigde mitochondriale complex I ziekte gas-1(fc21) stam ten opzichte van WTwormen in vloeibare media in het L4 larvale stadium te kwantificeren. De activiteit van 5 wormen in een enkele vloeistofdruppel werd gedurende 1 minuut geregistreerd, met een totaal van 19 video's (technische replicaties) opgenomen voor elke stam, wat resulteerde in een totale analyse van 95 wormen per stam. Per stam werden vier biologische replicatie-experimenten verkregen. Wormactiviteit wordt weergegeven als pixelverandering(figuur 3A)en als percentage controle (POC) wanneer genormaliseerd naar N2 Bristol WT-controle(figuur 3B). De gas-1(fc21) wormen (62% ± 16% pixelverandering, gemiddelde ± SD, n = 19) hadden een significante afname van 38% (p < 0,001, t-test) in hun locomotorische activiteit in L4-stadium in vergelijking met WT-wormen (100% ± 11,35%, gemiddelde ± SD, n = 95 wormen per conditie in 19 technische replicaties over 4 biologische replicaties).

WormScan-analyse werd ook uitgevoerd om de locomotorische activiteit van L4-traps gas-1(fc21) en WT-wormen in vloeibare media te kwantificeren. Gegevens werden verzameld voor drie biologische replicatie-experimenten, waarbij elke biologische replicatieplaat werd geëvalueerd door twee opeenvolgende afbeeldingen die werden gescand met behulp van een standaard flatbedscanner. Wormactiviteit van de differentiële beelden werd vergeleken als pixelverandering en genormaliseerd naar gelijktijdige N2 Bristol WT-controle. Evenzo, zoals werd gezien door de zebravisgedragsscreeningsmethode, toonde op WormScan gebaseerde analyse aan dat de gas-1(fc21)wormen (65,9 ± 6,1, gemiddelde ± SD, n = 13 putten) een significante afname van de locomotorische activiteit hadden met 34% (p < 0,001, t-test) in vergelijking met N2 Bristol wild-type wormen (100% ± 4,8%, gemiddelde ± SEM, n = 12 putten) (Figuur 3C). Analyse met behulp van WormScan op dag 1 volwassen gas-1(fc21) wormen (50,1% ± 10,7%, gemiddelde ± SD, n = 7 putten) toonde een afname van de locomotorische activiteit met 49% (p < 0,001, t-test) in vergelijking met WT-wormen (100% ± 16,2%, gemiddelde ± SD, n = 6 putten) (Figuur 3D).

Tabel 1: Vergelijkend overzicht van experimentele assays die beschikbaar zijn om de neuromusculaire activiteit van C. elegans te evalueren. Een gedetailleerd overzicht wordt gegeven van een breed scala aan 16 verschillende experimentele technieken die kunnen worden gebruikt om de neuromusculaire activiteit van de worm te kwantificeren op de fenotypische uitkomsten van thrashing, locomotion, faryngeaal pompen en / of chemotaxis in C. elegans. Leesformaat, methodologie, experimentele doorvoercapaciteit, software- en /of apparatuurvereisten, evenals voordelen en beperkingen van elke test worden gedetailleerd beschreven. Referenties en relevante websites voor elke test en softwaretool worden ook verstrekt. De doorvoercapaciteit van elke test wordt beschreven als laag, gemiddeld of hoog, op basis van de experimentele complexiteit, het gebruik van enkele of multi-well platen en / of experimenteertijd die nodig is om de experimentele setting en gegevensanalyses te voltooien. * Geeft aan dat de methodologieën ook kunnen worden gebruikt voor de evaluatie van de voortbeweging. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Figure 1
Figuur 1: C. elegans locomotorische activiteit analyse met behulp van ZebraLab software. (A,B) Experimenteel protocol voor wormvideo-opnames. Vijf wormen werden geïntroduceerd per druppel (20 μL) S. basale oplossing, waarbij vier druppels op een enkele glazen dia onder een stereomicroscoop werden geplaatst. Elke druppel van 5 wormen vertegenwoordigde een technisch replicatie-experiment en werd gedurende 1 minuut opgenomen in een afzonderlijke film met behulp van een CCD-camera (charged-coupled device). (C-F) Experimentele instellingen in ZebraLab zoals aangepast aan de evaluatie van locomotorische activiteit in C. elegans. (C) Selectie van kwantisatie met AVI-bestanden om de locomotorische activiteit van elke opgenomen video te kwantificeren. (D) Protocol parameterinstellingen, met 1 min geselecteerd als experimentduur. (E) Bouw een gebied om het interessegebied te selecteren. Het gebied werd geselecteerd en gebouwd rond 1 druppel oplossing waarin 5 wormen werden geplaatst. (F) Detectie werd bepaald op basis van grijsschaaldrempels om het hele lichaam van elke worm (rood) te detecteren. In het drempelgedeelte zijn burst- en bevriezingswaarden geselecteerd om de wormactiviteit te analyseren als pixelveranderingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: C. elegans locomotorische activiteitsanalyse met behulp van WormScan-methodologie. (A) Met behulp van een Epson v800-flatbedscanner werden twee onmiddellijk opeenvolgende scans van een 96-well-plaat vastgelegd met een resolutie van 1.200 dots / in en 16-bit grijswaarden om jpeg-afbeeldingen te produceren. (B) Deze twee opeenvolgende afbeeldingen van een 96-well plaat werden vervolgens uitgelijnd op een referentiegebied van belang (ROI), van WT-wormen. (C) Beeldanalyse is gebaseerd op een verschilbeeldscore berekend voor elke ROI met 15 wormen /put voor N2 Bristol. Het verschilbeeld werd genormaliseerd en gerapporteerd als percentage van controle (POC). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Vergelijkende analyse van locomotorische activiteit door ZebraLab en WormScan software assays in gas-1(fc21) mitochondriale ziekte wormen ten opzichte van N2 Bristol wild-type wormen. (A, B) WT en gas-1(fc21) wormactiviteit in vloeibare druppels (5 wormen / druppel) werd gedurende 1 minuut op video opgenomen en gekwantificeerd als (A) pixels verandering of (B ) ) percentage wild-type controle met behulp van de ZebraLab-software. Over het algemeen toonde de op ZebraLab gebaseerde wormactiviteitsanalyse een significante afname met 38% in gas-1(fc21)L4-stadiumwormen in vergelijking met wildtypecontroles (*** p < 0,001). De grafiek toont gemiddelde ± SD van alle gegevens, waarbij elke stip de totale activiteit van vijf wormen per S. basale druppel weergeeft. Elke druppel vertegenwoordigt een technische replicatie, met in totaal vier biologische replicaties bestudeerd per aandoening. In totaal werden 19 video's opgenomen (één video voor elke druppel van 5 wormen), verdeeld over een totaal van 95 individuele wormen die per aandoening werden bestudeerd. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de student t-testin Prism -GraphPad v6. (C) WT en gas-1(fc21) wormen in L4 stadium werden geanalyseerd door flatbed scanning om twee opeenvolgende beelden te produceren die werden geanalyseerd in WormScan software om een verschilbeeld te produceren. Drie biologische replicatie-experimenten werden uitgevoerd met 15 wormen per put in een putplaat van 96. De activiteit van WT-wormen werd gebruikt als basislijn om het controlepercentage (POC) te normaliseren. gas-1(fc21) activiteit was verminderd met 34% in vergelijking met wild-type controle (*** p < 0,001). Staafdiagrammen geven het gemiddelde en de standaarddeviatie weer over drie biologische replicatie-experimenten. (D) N2 en gas-1(fc21) wormen in volwassen dag 1 stadium werden op dezelfde manier geanalyseerd als gedetailleerd voor panel C. gas-1(fc21) activiteit in dag 1 volwassenen was verminderd met 49,1% ten opzichte van wild-type controlewormen (*** p < 0,001). Staafdiagrammen geven het gemiddelde en de standaarddeviatie van pixelveranderingen in één biologische replicatie weer, waarbij N2 (n = 6 putten van 15 wormen / put) en gas-1(fc21) (n = 7 putten van 15 wormen / put) worden vergeleken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier vatte de studie gedetailleerde informatie en redenen samen voor het bestuderen van C. elegans neuromusculaire activiteit op het niveau van diverse uitkomsten, waaronder wormthrashing, voortbeweging, faryngeaal pompen en chemotaxis. De vergelijking van 16 verschillende activiteitsanalysemethoden werd uitgevoerd in termen van de relatieve doorvoer, voordelen en beperkingen van het kwantificeren van nematodenactiviteiten in een enkele worm of wormpopulaties op verschillende leeftijden en experimentele duur. Onder deze werden twee nieuwe aanpassingen en toepassingen van semi-geautomatiseerde analyses benadrukt om significante vermindering van locomotorische activiteit aan te tonen in larvale stadiumwormen in het L4 larvale ontwikkelingsstadium en in dag 1 jonge volwassenen van een gevestigde mitochondriale complex I ziekte C. elegans stam, gas-1(fc21) ten opzichte van WT-controles.

In het bijzonder is de neuromusculaire functie en locomotorische activiteit van C. elegans uitgebreid bestudeerd op vaste media, omdat de beweging van de WT-worm zeer regelmatig is in sinusoïdale golfpatronen. Afwijkingen van hun normale bewegingspad en de snelheid kunnen microscopisch worden gedetecteerd en handmatig worden gescoord door de experimentele waarnemer, in testen die vaak een lage doorvoer en vervelend zijn. Om de experimentele doorvoer te verhogen, moeten geautomatiseerde methoden en methoden met hoge doorvoer worden geselecteerd. Verminderde activiteit van wormen kan kwantificeerbaar zijn in vloeibare media, waar de totale locomotorische activiteit van wormen in druppels op glazen dia's of in platen met meerdere putten kan worden opgenomen en gekwantificeerd op semi-geautomatiseerde of geautomatiseerde wijze met verschillende softwaretools. Inderdaad, onze gegevens benadrukken het nut van het objectief en efficiënt meten van de locomotorische activiteit van nematoden, zowel door een nieuwe toepassing van ZebraLab-software om locomotorische activiteit te kwantificeren in video's van wormen in vloeibare druppels op glazen dia's (een screeningscapaciteitsbenadering met gemiddelde doorvoer), als door gebruik te maken van WormScan-software om wormenmotoractiviteit te kwantificeren in differentiële flatbedscanbeelden van wormen in een 96-well plate liquid media-benadering54, 55,56 (een high-throughput screening capaciteitsbenadering). De ZebraLab-softwarebenadering wordt beschouwd als een gemiddelde doorvoertest, omdat het vereist dat voor elke bestudeerde toestand afzonderlijke platen worden gebruikt, zonder het huidige ontwikkelde protocol voor plaatformaten met meerdere putten. Terwijl het gebruik van de ZebraLab-softwarebenadering minimale tijd vereist bij het analyseren van C. elegans-activiteit in een paar omstandigheden, neemt de experimentele tijd toe wanneer deze op meerdere omstandigheden wordt toegepast. Hier was de experimentele tijd ongeveer 2 uur om wormen in vloeistofdruppels over te brengen en video's van hun activiteit op te nemen, rekening houdend met 18 technische replicaties voor elke aandoening. De tijd besteed aan de analyse van deze video's met behulp van de ZebraLab-software was ongeveer 1 uur. Ter vergelijking: de WormScan-methode heeft een hoge doorvoer omdat deze een multi-well plaatformaat bevat dat gelijktijdige analyse van vier 96-well platen in minder dan 10 minuten mogelijk maakt en het opzetten van een 96-well plaat met een COPAS Bisoter is ook minder dan 10 min.

Beide methodologieën toonden een vergelijkbare verminderde activiteit in L4 larvale stadium gas-1(fc21) mitochondriale ziekte mutante wormen ten opzichte van WT-wormen, waardoor beide verschillende benaderingen voor het kwantificeren van verschillen in wormgedrag werden valideerde. Verder werd WormScan-analyse gebruikt om gemakkelijk aan te tonen dat progressieve vermindering van dierlijke locomotorische activiteit optrad met de leeftijd in de gas-1(fc21) wormen, zoals duidelijk was in het volwassen stadium van dag 1.

De belangrijkste voordelen van het aanpassen van de ZebraLab-software die is ontwikkeld voor zebraviszwemanalyse aan C. elegans-activiteitsanalyse is dat het experimenteel eenvoudig en goedkoop is om wormbewegingen objectief vast te leggen in video's, met semi-geautomatiseerde kwantitatieve analyse in filmbestanden die zijn geüpload naar ZebraLab-software die slechts seconden per technische replicatie vereist en op onderzoekers gebaseerde vooroordelen verwijdert die aanwezig zijn in handmatige kwantificeringsmethodologieën. Verder is het hebben van deze ene softwaretool in het onderzoekslaboratorium nuttig om locomotorische activiteit te kwantificeren in twee diersoorten, namelijk zebravissen en C. elegans. Het nadeel is dat dit een commerciële software is die aankoop vereist en wormvideo's handmatig in de software moeten worden geüpload, hoewel het uploadproces eenvoudig is en de software-analysetijd relatief snel is. Over het algemeen heeft de hier beschreven nieuwe toepassing van het gebruik van ZebraLab-software om de locomotorische activiteit van C. elegans te kwantificeren direct potentieel om medicijneffecten op wormgedrag te evalueren, hoewel de doorvoer laag tot gemiddeld blijft, gezien de vereisten met hoge resolutie vereisen dat films worden vastgelegd van wormen die bewegen in mediadruppels die op glazen dia's worden geplaatst.

We hebben ook de WormScan-software aangepast om de locomotorische capaciteit van wormen in vloeibare media in een 96-well plaat efficiënt te kwantificeren. Deze aanpak biedt een high-throughput en goedkope experimentele methode die een standaard flatbed scanner gebruikt om de vruchtbaarheid en overleving van dieren objectief te kwantificeren en is eerder gebruikt voor schermen met een hoge doorvoer in C. elegans49. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het zeer vatbaar is voor screening met hoge doorvoer, waardoor parallelle vergelijkingen van een groot aantal omstandigheden in elk stadium of op elke leeftijd mogelijk zijn, met gebruiksgemak, lage installatiekosten en snelle analyse op een objectieve manier door de WormScan-software die gratis en openbaar beschikbaar is49. Het nadeel van de WormScan is dat het alleen de verandering kan ondervragen die optreedt tussen de sequentiële scans, die in sommige mutaties of omstandigheden mogelijk niet gevoelig genoeg zijn om kleine graden van fenotypische verandering te detecteren. Aangezien zowel ZebraLab- als WormScan-methoden uitsluitend afhankelijk zijn van beeldpixelveranderingen om de dierlijke activiteit te testen, moeten bovendien aanzienlijke verschillen in wormgrootte die kunnen optreden tussen stammen of als reactie op een specifieke therapie in de loop van de tijd mogelijk worden overwogen en / of gebruikt als een normalisatiefactor voor beide methoden, om meer specifiek evaluatie en vergelijking van mutatie- en / of behandelingseffecten op dierlijke locomotorische activiteit mogelijk te maken.

Over het algemeen kan een breed scala aan experimentele methoden worden gebruikt om de neuromusculaire activiteit van nematoden te beoordelen op geïntegreerde fenotypische uitkomsten van thrashing, locomotion, faryngeaal pompen en / of chemotaxis. We vergeleken 16 van deze methoden(tabel 1),met de nadruk op hun specifieke experimentele en analytische vereisten, voordelen, beperkingen en doorvoercapaciteit. Onder deze hebben we gedetailleerde experimentele protocollen geleverd voor twee nieuwe toepassingen van bestaande softwaretools, ZebraLab (een benadering met gemiddelde doorvoer) en WormScan (een benadering met hoge doorvoer), die bijzonder nuttig zijn om semi-automatisch, objectief en snel de voortbewegingsactiviteit van wormen in vloeibare media te kwantificeren. Beide experimentele benaderingen toonden een vergelijkbare verminderde mate van voortbewegingsactiviteit op bij mitochondriale ziekte (gas-1(fc21)) ten opzichte van WT C. elegans-stammen in het L4-stadium, met progressieve afname van locomotorische activiteit door het jongvolwassen stadium in gas-1(fc21) wormen. Deze gegevens tonen de validiteit aan van deze experimentele benaderingen die intern consistente gegevens opleveren. Bovendien is deze reeks methoden zeer veelzijdig, waardoor een breed scala aan wormmotorische activiteitsstatistieken mogelijk is in diverse ziekte-etiologieën, dierstadia en leeftijden, en als reactie op kandidaat-therapeutische modellering of high-throughput medicijnscreening die nuttig zijn voor preklinische evaluatie van looddoelen voor menselijke ziekten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M.L., N.D.M., N.S., en E.N.-O. geen relevante financiële informatie hebben. M.J.F. is mede-oprichter van MitoCUREia, Inc., lid van de wetenschappelijke adviesraad met aandelenbelang in RiboNova, Inc., en wetenschappelijk bestuurslid als betaald consultant bij Khondrion en Larimar Therapeutics. M.J.F. is eerder of momenteel betrokken geweest bij verschillende bedrijven die betrokken zijn bij mitochondriale ziekte therapeutische preklinische en / of klinische fase ontwikkeling als een betaalde consultant (Astellas [voorheen Mitobridge] Pharma Inc., Cyclerion Therapeutics, Epirium Bio, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics, NeuroVive, Reneo Therapeutics, Stealth BioTherapeutics, Zogenix, Inc.) en / of een gesponsorde onderzoeksmedewerker (AADI Therapeutics, Cardero Therapeutics, Cyclerion Therapeutics, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics Inc., Mission Therapeutics, NeuroVive, Raptor Therapeutics, REATA Inc., RiboNova Inc., Standigm Therapeutics en Stealth BioTherapeutics).

Acknowledgments

We zijn Anthony Rosner, PhD., dankbaar met zijn organisatorische steun voor de vroege voorbereiding van dit project, en Erin Haus voor het bijdragen aan protocolanalyse. Dit werk werd gefinancierd door het Juliet's Cure FBXL4 Mitochondrial Disease Research Fund, het Jaxson Flynt C12ORF65 Research Fund en de National Institutes of Health (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 en T32-NS007413). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de financiers of de National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild isolate  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Bristol
Camera Olympus DP73
gas-1(fc-21) CGC CW152
Microscope slides ThermoFisher 4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM) Research Products International Corp. N81800-1000.0
OP50 Escherichia coli CGC Uracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm)  VWR international 25373-085
S. Basal VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
Scanner EPSON V800
Stereomicroscope Olympus MVX10 microscope
96-well flat bottom  VWR international 29442-056
WormScan software Mathew et al. 45 S1 Standalone Java platform Software for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab software ViewPoint Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2013).
  2. Shaye, D. D., Greenwald, I. OrthoList: a compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).
  3. van Ham, T. J., et al. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genetics. 4 (3), 1000027 (2008).
  4. Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
  5. Dingley, S., et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10 (2), 125-136 (2010).
  6. Polyak, E., Zhang, Z., Falk, M. J. Molecular profiling of mitochondrial dysfunction in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 837, 241-255 (2012).
  7. McCormick, E., Place, E., Falk, M. J. Molecular genetic testing for mitochondrial disease: from one generation to the next. Neurotherapeutics. 10 (2), 251-261 (2013).
  8. McCormack, S., et al. Pharmacologic targeting of sirtuin and PPAR signaling improves longevity and mitochondrial physiology in respiratory chain complex I mutant Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 22, 45-59 (2015).
  9. Polyak, E., et al. N-acetylcysteine and vitamin E rescue animal longevity and cellular oxidative stress in pre-clinical models of mitochondrial complex I disease. Molecular Genetics and Metabolism. 123 (4), 449-462 (2018).
  10. Guha, S., et al. Pre-clinical evaluation of cysteamine bitartrate as a therapeutic agent for mitochondrial respiratory chain disease. Human Molecular Genetics. 28 (11), 1837-1852 (2019).
  11. Gorman, G. S., et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease. Annals of Neurology. 77 (5), 753-759 (2015).
  12. Mancuso, M., Orsucci, D., Filosto, M., Simoncini, C., Siciliano, G. Drugs and mitochondrial diseases: 40 queries and answers. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 13 (4), 527-543 (2012).
  13. Gai, X., et al. Mutations in FBXL4, encoding a mitochondrial protein, cause early-onset mitochondrial encephalomyopathy. American Journal of Human Genetics. 93 (3), 482-495 (2013).
  14. Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298 (5602), 2398-2401 (2002).
  15. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
  16. Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
  17. Avery, L., Horvitz, H. R. Effects of starvation and neuroactive drugs on feeding in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 253 (3), 263-270 (1990).
  18. Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
  19. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. Journal of Experimental Biology. 211 (23), 3703-3711 (2008).
  20. Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
  21. Avery, L. Motor neuron M3 controls pharyngeal muscle relaxation timing in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 175, 283-297 (1993).
  22. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  23. Bargmann, C. I., Thomas, J. H., Horvitz, H. R. Chemosensory cell function in the behavior and development of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 529-538 (1990).
  24. Anne, C. H. Behavior. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. 2005-2018, (2006).
  25. Biston, M. C., et al. An objective method to measure cell survival by computer-assisted image processing of numeric images of Petri dishes. Physics in Medicine & Biology. 48 (11), 1551-1563 (2003).
  26. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52321 (2015).
  27. Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab on a Chip. 8 (9), 1432-1435 (2008).
  28. Javer, A., et al. An open-source platform for analyzing and sharing worm-behavior data. Nature Methods. 15 (9), 645-646 (2018).
  29. Koopman, M., et al. Assessing motor-related phenotypes of Caenorhabditis elegans with the wide field-of-view nematode tracking platform. Nature Protocols. 15 (6), 2071-2106 (2020).
  30. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  31. Angstman, N. B., Kiessling, M. C., Frank, H. G., Schmitz, C. High interindividual variability in dose-dependent reduction in speed of movement after exposing C. elegans to shock waves. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 12 (2015).
  32. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  33. Bianchi, J. I., Stockert, J. C., Buzzi, L. I., Blazquez-Castro, A., Simonetta, S. H. Reliable screening of dye phototoxicity by using a Caenorhabditis elegans fast bioassay. PLoS One. 10 (6), 0128898 (2015).
  34. Albertson, D. G., Thomson, J. N. The pharynx of Caenorhabditis elegans. Philososophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 275 (938), 299-325 (1976).
  35. Raizen, D. M., Avery, L. Electrical activity and behavior in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Neuron. 12 (3), 483-495 (1994).
  36. Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook. , 1-23 (2012).
  37. Morck, C., Rauthan, M., Wagberg, F., Pilon, M. pha-2 encodes the C. elegans ortholog of the homeodomain protein HEX and is required for the formation of the pharyngeal isthmus. Developmental Biology. 272 (2), 403-418 (2004).
  38. Song, B. M., Avery, L. Serotonin activates overall feeding by activating two separate neural pathways in Caenorhabditis elegans. TheJournal of Neuroscience. 32 (6), 1920-1931 (2012).
  39. Avery, L., Raizen, D., Lockery, S. Electrophysiological methods. Methods in Cell Biology. 48, 251-269 (1995).
  40. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab in a Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  41. Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nature Communications. 8, 14221 (2017).
  42. Brinkmann, V., Ale-Agha, N., Haendeler, J., Ventura, N. The Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) in the aging process: Another puzzling role for this highly conserved transcription factor. Frontiers in Physiology. 10, 1561 (2019).
  43. Huang, C., et al. Intrinsically aggregation-prone proteins form amyloid-like aggregates and contribute to tissue aging in Caenorhabditis elegans. eLife. 8, 43059 (2019).
  44. Zhu, B., et al. Functional analysis of epilepsy-associated variants in STXBP1/Munc18-1 using humanized Caenorhabditis elegans. Epilepsia. 61 (4), 810-821 (2020).
  45. Weeks, J. C., Robinson, K. J., Lockery, S. R., Roberts, W. M. Anthelmintic drug actions in resistant and susceptible C. elegans revealed by electrophysiological recordings in a multichannel microfluidic device. International Journal of Parasitology. Drugs and Drug Resistance. 8 (3), 607-628 (2018).
  46. Haroon, S., et al. Multiple molecular mechanisms rescue mtDNA disease in C. elegans. Cell Reports. 22 (12), 3115-3125 (2018).
  47. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  48. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
  49. Mathew, M. D., et al. Using C. elegans forward and reverse genetics to identify new compounds with anthelmintic activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005058 (2016).
  50. Kayser, E. B., Morgan, P. G., Hoppel, C. L., Sedensky, M. M. Mitochondrial expression and function of GAS-1 in Caenorhabditis elegans. Journal Biological Chemistry. 276 (23), 20551-20558 (2001).
  51. Falk, M. J., Kayser, E. B., Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mitochondrial complex I function modulates volatile anesthetic sensitivity in C. elegans. Current Biology. 16 (16), 1641-1645 (2006).
  52. Kwon, Y. J., Guha, S., Tuluc, F., Falk, M. J. High-throughput BioSorter quantification of relative mitochondrial content and membrane potential in living Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 40, 42-50 (2018).
  53. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  54. Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental protocol for examining behavioral response profiles in larval fish: Application to the Neuro-stimulant caffeine. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57938 (2018).
  55. Carlsson, G., Blomberg, M., Pohl, J., Orn, S. Swimming activity in zebrafish larvae exposed to veterinary antiparasitic pharmaceuticals. Environmental Toxicology and Pharmacology. 63, 74-77 (2018).
  56. Yang, X., et al. High-throughput screening in larval zebrafish identifies novel potent sedative-hypnotics. Anesthesiology. 129 (3), 459-476 (2018).

Tags

Gedrag wormen C. elegans locomotorische activiteit faryngeaal pompen chemotaxis thrashing ZebraLab WormScan high-throughput screening capaciteit gas-1 (fc21)
Vergelijkende analyse van experimentele methoden om dierlijke activiteit in <em>Caenorhabditis elegans-modellen</em> van mitochondriale ziekte te kwantificeren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah,… More

Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah, N., Nakamaru-Ogiso, E., Falk, M. J. Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease. J. Vis. Exp. (170), e62244, doi:10.3791/62244 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter