Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Caenorhabditis elegans Mitokondriyal Hastalık Modellerinde Hayvan Aktivitesini Ölçmek için Deneysel Yöntemlerin Karşılaştırmalı Analizi

Published: April 4, 2021 doi: 10.3791/62244
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1,2
1Mitochondrial Medicine Frontier Program, Division of Human Genetics, Department of Pediatrics, The Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Bu çalışma, C. elegans complex I hastalığı gaz-1(fc21)solucanlarında, yani ZebraLab (orta verimli bir test) ve WormScan'da (yüksek verimli bir test) iki yarı otomatik lokomotor aktivite analizi yaklaşımı için protokoller sunar ve nematod davranışını ve entegre nöromüsküler işlevi ölçmek için çok çeşitli araştırma yöntemleri arasında karşılaştırmalı analiz sağlar.

Abstract

Caenorhabditis elegans, çeşitli insan hastalıklarının mekanizmalarını ve tedavilerini verimli bir şekilde sorgulamak için çevirisel bir hayvan modeli olarak merkezi faydası ile yaygın olarak tanınmaktadır. Solucanlar, hızlı gelişim döngüsü, büyük kuluçka boyutu, kısa ömür, mikroskobik şeffaflık, düşük bakım maliyetleri, sağlam genomik araçlar paketi, mutant depoları ve hem in vivo hem de eks vivo fizyolojisini sorgulamak için deneysel metodolojilerinden yararlanarak terapötik hedefler ve tedaviler hakkında daha derin içgörüler elde etmek için özellikle yüksek verimli genetik ve ilaç ekranları için uygundur. Solucan lokomotor aktivitesi, mitokondriyal hastalıkta sıklıkla bozulan, nedenleri ve tezahürleri oldukça heterojen olan ancak hücresel enerji üretme kapasitesinin bozulmasını toplu olarak paylaşan özellikle ilgili bir fenotipi temsil eder. Solucan davranışını sorgulamak için farklı metodolojilerden oluşan bir paket kullanılabilirken, bunlar genomik veya ilaç yüksek verimli ekranlar için deneysel maliyetler, karmaşıklık ve yardımcı programlarda büyük ölçüde değişir. Burada, C. eleganların farklı aşamalarda, yaşlarda ve deneysel sürelerde tek solucan veya solucan popülasyonlarında nematod hareketliliği, kırbaçlama, farengeal pompalama ve/veya kemotasisi ölçen 16 farklı aktivite analizi metodolojisinin göreli verimi, avantajları ve sınırlamaları karşılaştırıldı. ZebraLab (orta verimli bir yaklaşım) ve WormScan (yüksek verimli bir yaklaşım) olmak üzere mevcut yazılım araçlarının yeni uygulamalarını temsil eden nematod lokomotor etkinliğini ölçmek için iki yarı otomatik yöntem için ayrıntılı protokoller gösterilmiştir. Bu yöntemlerin uygulanmasından elde edilen veriler, L4 larva aşamasında benzer derecelerde hayvan aktivitesinin gerçekleştiğini ve mitokondriyal kompleks I hastalığında (gaz-1(fc21)) mutant solucanlarında vahşi tip (N2 Bristol) C. elegans'agöre1. Bu veriler, mitokondriyal hastalığın preklinik hayvan modellerinde solucan davranışı üzerinde yüksek verimli ilaç taramasını desteklemek için değişken kapasite ile solucan lokomotor aktivitesini verimli ve objektif bir şekilde ölçmek için ZebraLab veya WormScan yazılım araçlarını kullanmanın bu yeni uygulamalarının yardımcı programını doğrulamaz.

Introduction

Caenorhabiditis elegans, katı medyada çiftleşme, beslenme, yumurtlama, dışkılama, yüzme ve hareketlilik dahil olmak üzere tüm solucan davranışlarını koordine eden 302 nörona sahip olduğu için nörobilimde olağanüstü bir model olarak kabul edilmektedir1. Bu hermafroditik nematodlar, C. eleganlar ve insanlar arasındaki ~% 80 genlerin iyi karakterize edilmiş genomu ve yüksek homolojisi ile mümkün olan çok çeşitli insan hastalığı mekanizmalarını anlamak için de yaygın olarak kullanılmaktadır2,3,4. C. elegans uzun zamandır insan mitokondriyal hastalığı 5,6,7,8,9,10hücresel enerji üretme kapasitesini paylaşan ve genellikle klinik olarak önemli ölçüde bozulmuş nöromüsküler fonksiyon, egzersiz intoleransı ve yorgunluk ile mevcut olan kalıtsal metabolik bozuklukların son derece genetik ve fenotipik heterojen bir grubudur11 ,12,13,14. Bu amaçla, C. elegans modellerinin kullanımı, mitokondriyal hastalığın farklı genetik alt tiplerinde hayvan aktivitesinin ve nöromüsküler fonksiyonun nicel yönlerinin klinik öncesi modellemesinin yanı sıra nöromüsküler fonksiyonlarını ve genel aktivitelerini iyileştirebilecek aday tedavilere yanıtlarını sağlar.

C. elegans'taki nöromüsküler aktivite, katı veya sıvı ortamda fonksiyonel analizlere izin veren manuel ve yarı otomatik yaklaşımlar da dahil olmak üzere bir dizi deneysel metodoloji ile objektif olarak ölçülebilir (Tablo 1)1,15. C. elegans aktivitesinin doğru niceliği, kas ve sinir sisteminin fonksiyonu ve gelişimi ile ilgili keşifleri etkinleştirmek için önemli olduğu kanıtlanmıştır16,17,18. Bu çalışma, C. elegans hastalıkları modellerinde nöromüsküler fonksiyon ve aktiviteyi değerlendirmek için araştırma laboratuvarlarında gerçekleştirilebilecek 17 farklı testin deneysel gereksinimlerini, avantajlarını ve sınırlamalarını özetler ve karşılaştırır, hem gelişim evrelerinde ve yaşlarında hem de aday tedavilerine yanıt olarak temelde (Tablo 1 ). Nitekim, çalışma, kullanılan deneysel ve analitik metodolojiyi, her yöntemin avantajlarını ve sınırlamalarını, her testi gerçekleştirmek ve analiz etmek için gereken ekipman ve yazılımı, her durumda C. elegans thrashing (dakikada vücut virajları), lokomotor aktivitesi, farengeal pompalama ve kemotaksi oranlarını karakterize etmek için mevcut deneysel yaklaşımların aralığına ayrıntılı bir genel bakış sunmaktadır. ve her yöntemin yüksek verimli genetik veya ilaç tarama amaçları için kullanımını desteklemek için üretilen iş kapasitesi. Her bir analizin aktarım hızı kapasitesi, solucan bakımı, işlem süresi, tek veya çok kuyulu plakaların kullanımı ve/veya deneysel ayarı ve veri analizlerini tamamlamak için gereken deney zamanı da dahil olmak üzere deneysel protokol karmaşıklığına bağlı olarak düşük, orta veya yüksek olarak tanımlanır.

Thrashing19,lokomotor aktivite20,farengeal pompalama17,21ve kemotaksi22,23 manuel analizleri stereomikroskop gerektiren solucan aktivitesini değerlendirmek için iyi kurulmuş metodolojilerdir24. Solucanların hırpalama aktivitesinin ölçülmesi, dakikada vücut bükülme sıklığını belirlemek için sıvı ortamda analiz gerektirirken, solucan lokomotor aktivitesi katı ortamda veya sıvı ortamda ölçülebilir. Bununla birlikte, bireysel solucan aktivitesinin manuel analizleri doğası gereği zaman alıcıdır ve kaçınılmaz kullanıcı tarafından oluşturulan önyargıyı içerir. Solucan aktivite analizlerinin otomasyonu, kullanıcı tarafından oluşturulan önyargıyı en aza indirir ve deneysel aktarım hızını büyük ölçüde artırabilir25. Sıvı ortamda solucan kırbaçlama aktivitesinin video kayıtları wrMTrck, bir ImageJ eklentisi26kullanılarak analiz edilebilir. Bununla birlikte, wrMTrck için geliştirilen orijinal deneysel ayarlar yardımcı programını sınırladı, çünkü tek bir sıvı damlasında çok fazla solucan, doğru izlemeyi zorlaştıran solucanların üst üste binmasına yol açtı. Bu deneysel sınırlama çözülmüş olsa da27, wrMTrck yöntemi yüksek aktarım hızı taramasını destekleyemiyor.

C. elegans mitokondriyal hastalık modellerinde solucan lokomotor aktivitesini temelde ve aday tedavilerine yanıt olarak ölçmek için bir dizi yöntem mevcuttur. Bunlar arasında ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker28, geniş görüş alanı nematod izleme platformu (WF-NTP)29, WormMotel, WormWatcher30, WormLab31, Infinity Chip32ve WMicrotracker One33 (Tablo 1) bulunur. Bu yöntemler, genellikle çok kuyulu plakalarda, birden fazla solucan suşunda veya koşullarında eşzamanlı lokomotion analizine olanak tanır ve böylece daha yüksek verimli ilaç tarama uygulamalarını destekler. Bu yöntemlerden bazıları, pahalı ekipmana ve açık erişim yazılımına olan ihtiyaç ve deneysel protokolleri gerçekleştirme kolaylığı gibi genel yardımcı programlarını sınırlandırabilecek veya geliştirebilecek benzersiz hususlara sahiptir. Genel olarak, tek bir deneysel sistem veya protokol tüm C. elegans locomotor aktivite deneyleri için ideal değildir. Bunun yerine, belirli bir araştırmacının deneysel hedeflerine ve gereksinimlerine en uygun yöntemi dikkatlice seçmek önemlidir.

Farengeal pompalama, C. elegans'takinöromüsküler aktiviteyi değerlendirmek için başka bir önemli sonucu temsil eder. C. elegans farenks, solucanın beslenme sistemi34 , 35,36'nın ön ucundaki Escherichia coli'nin (E. coli)yutulmasını sağlayan 20 kashücresi,20 nöron ve20diğer hücreden oluşur. Farengeal pompalama oranlarını belirlemek için çeşitli manuel yöntemler oluşturulmuştur17,21,37,38. Çoğu yöntem, deneysel gözlemci tarafından doğrudan sayım ile farengeal pompalama frekansını görselleştirmek ve kaydetmek için stereomikroskop ve kamera kullanımına dayanmaktadır21. Otomatik farengeal pompalama hızı analizi, her pompanın süresi hakkında ek bilgi sağlayan hücre dışı elektrofiyerngeogram (EPG) kaydı yapılarakmümkündür 39. Farengeal pompalama hızı analizi, bireysel solucanların40 , 41odalarında hapsedildiği mikroakışkan bir sistem olan WormSpa'da da mümkündür. Farengeal pompa oranının analizini kolaylaştırmak için kullanılabilen ticari bir yöntem, özel bir çipte hareketsiz hale getirilen tek bir solucanda beslenme davranışının nöromüsküler yönlerini ölçen, görselleştiren ve analiz eden ScreenChip Sistemidir (InVivo Biosystems). Bu farengeal pompalama nicel yaklaşımı, ilaçlara, yaşlanmaya ve diğer faktörlere hem nöronal hem de fizyolojik yanıtları değerlendirmek için kullanılabilir42,43,44,45.

Kemotaxis, nematod büyüme ortamı (NGM) plakasının tanımlanmış bir alanında solucanlardan uzağa yerleştirilen bir kokuya yanıt olarak C. eleganların hareketini tanımlar. Kemotaksi yanıtının değerlendirilmesi, solucanların odoranta doğru kat ettiği fiziksel mesafeyi belirli bir zaman diliminde gözlemleyerek ve ölçerek ölçülebilen solucan nöronal ve nöromüsküler aktivitesinin entegre bir ölçüsünü sağlar46. Multi-Worm Tracker, solucanların bir çekiciye veya itici47'yedoğru kat ettiği mesafeyi ölçmenin deneysel verimliliğini artırmak için kullanılabilecek otomatik bir yöntemdir.

Burada, solucan aktivitesini ölçmek için oluşturulan iki yeni, yarı otomatik yöntem için ayrıntılı protokol açıklanmıştır. İlk yaklaşım ZebraLab'ı, C. eleganların sıvı ortamlarındaki genel lokomotor aktivitesini hareket sırasındaki piksel değişikliklerine dayanarak ölçmek için yeni bir orta verimli uygulama için Danio rerio'nun (zebra balığı) yüzme aktivitesini incelemek için geliştirilmiş ticari bir yazılım kullanır (Tablo 1, Şekil 1). Veri çıkışı, çok sayıda eşzamanlı koşuldan ve cam slaytta analiz edilen örneklerden hızlı bir şekilde elde edilir, ancak bu yöntem çok kuyulu bir plaka formatına uygun değildir. İkinci yaklaşım, WormScan metodolojisi48,49 ( Şekil2), doğurganlık ve sağkalım gibi entegre fizyolojik sonuçların yarı otomatik nicel analizini sağlamak için açık kaynaklı yazılımla değişken olarak kullanılabilecek iki sıralı taramanın diferansiyel görüntüsünü oluşturmak için düz yataklı bir tarayıcı kullanır. Burada, 96 kuyulu, düz tabanlı bir plakanın kuyusu başına on beş larva evre 4 (L4) solucan popülasyonlarında sıvı ortamda solucan lokomotor aktivitesini ölçmek için WormScan metodolojisinin yeni bir yüksek verimli adaptasyonu geliştirilmiştir. Bu yarı otomatik ve düşük maliyetli WormScan metodolojisi, yüksek verimli ilaç ekranlarına ve çeşitli hayvan evrelerinin ve48,49yaşlarının analizlerine kolayca uyarlanabilir.

Burada, hem ZebraLab hem de WormScan yarı otomatik yöntemlerini kullanarak C. elegans locomotor aktivitesini analiz etme protokolü ve etkinliği, mitokondriyal kompleks I hastalığı, gaz-1(fc21) için iyi kurulmuş bir C. elegans modelinde gösterilmiştir. gas-1 (K09A9.5 geni) insan NDUFS2'nin (NADH: ubiquinone oxidoreductase core (demir-kükürt proteini) alt birliği 2) ortologudur (Şekil 3). C. elegans gas-1(fc21) mutant suşu, NDUFS250'nin insan ortologunda homozigous p.R290K yanlış algı mutasyonu taşır, bu da doğurganlık ve yaşam süresinde önemli ölçüde azalmaya neden olur, bozulmuş solunum zinciri oksidatif fosforilasyon (OKSPHOS) kapasitesi51, ayrıca artan oksidatif stres ile azalmış mitokondriyal kütle ve membran potansiyeli5,8 . Son yirmi yılda mitokondriyal hastalığı incelemek için köklü kullanımına rağmen, gaz-1(fc21) mutantlarının lokomotor aktivitesi daha önce bildirilmedi. Burada ZebraLab ve WormScan yöntemleri, hem yöntemleri doğrulamanın hem de deneysel protokollerin ve bilişim analizlerinin karşılaştırmalı yararlarını ve verimliliğini göstermenin bir yolu olarak, vahşi tip (WT, N2 Bristol) solucanlara kıyasla gaz-1(fc21)lokomotor aktivitesini bağımsız olarak ölçmek için uygulanmıştır. ZebraLab yazılımı, C. elegans mitokondriyal hastalık modellerinde, hedeflenen ilaç taraması veya doğrulama çalışmaları için potansiyel uygulama ile birkaç eşzamanlı solucan lokomotor aktivitesinin hızlı bir şekilde nicelasyonuna izin verdi. Özellikle WormScan analizi, bileşik kütüphanelerin yüksek verimli ilaç ekranlarını kolayca etkinleştirmek ve birincil mitokondriyal hastalığın preklinik C. elegans modellerinde hayvan nöromüsküler fonksiyonunu ve lokomotor aktivitesini geliştiren müşteri adaylarını önceliklendirmek için uygundur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ZebraLab yazılımını kullanan cam slaytlarda sıvı ortamda solucan lokomotor aktivite analizi

  1. Nematod büyümesi ve elleçleme
    1. Nematod büyüme ortamı (NGM) içeren Petri plakalarında C. elegans yetiştirin ve besin kaynağı olarak Escherichia coli OP50 ile yayılır. Solucan kültürünü daha önce açıklandığı gibi 20 °C'de koruyun8.
    2. Zamanlanmış bir yumurta gerçekleştiren solucanları senkronize edinve solucanları istenen aşamada inceleyin. Bu protokolde L4 evre solucanları analiz edilmiştir.
    3. Ngm plakalarında kontrol ve mutant solucan suşlarını test edilecek veya tampon kontrolü yapılacak ilaç tedavileri ile ve olmadan büyütün. İlaç tedavisi etkilerini değerlendirmek için, S. bazal çözeltisinde istenen ilaç stok konsantrasyonunu hazırlayın; hesaplanan belirli hacmi NGM plakalarına yayın ve kurumasını sağlar. Solucanları belirli bir larva veya yetişkin aşamasında aktarın ve analizden önce istenen süre boyunca ilaç tedavi plakasını koruyun.
  2. Lokomotor aktivite video kaydı ve ZebraLab analizi için solucanların deneysel kurulumu
    1. Solucan çekme kullanarak gerinim ve durum başına 5 senkronize L4 solucanı seçin. Pipet bir kameraya bağlı stereomikroskop altında bulunan cam bir slayda tek bir 20 μL S. bazal çözelti damlası ve içine 5 solucan aktarın (Şekil 1A, B). NGM ve E. coli OP50 içeren Petri kabından 5 solucanı yalnızca kayıttan önceki anda sıvı damlasına aktarın.
      NOT: Önceki video kaydedilene kadar Petri kabındaki diğer solucanları korumaya devam edin. Bu, işlem sırasında 20 μl damlanın kuruması nedeniyle diğer solucanlarda oluşan hasarı önleyecektir (kuru zaman ~15-20 dk).
    2. Birden fazla teknik çoğaltma elde etmek için bir slaytta pipet birden fazla damla (Şekil 1A). Farklı NGM plakalarından solucanları seçin (biyolojik çoğaltma). Kapak fişi kullanmayın.
    3. Tek bir damlanın tüm alanını görselleştirmek için mikroskobun çalışma mesafesini ayarlayın. Dosyaları yazılıma yüklemek için düşük bir video çözünürlüğü (<1024 x 768) ayarlayın ve koruyun.
    4. Solucanların kayıt yapmadan önce 1 dakika boyunca oda sıcaklığında kaydırağa alışmasına izin verin.
    5. Solucan yüzme aktivitesini saniyede 15 karede (fps) 1 dakika boyunca 1 damla olarak kaydedin. Plakadaki her ek damla için görüntülemeyi tekrarlayın.
  3. C. ZebraLab yazılımında elegans lokomotor aktivite kayıt analizi
    1. Yazılıma video yüklemek için ZEBRALAB AVI seçeneğini kullanın. AVI Dosyaları ile Niceleme seçeneğine tıklayın (Şekil 1C).
    2. Yeni bir iletişim kuralı oluşturmak için, Dosya > Protokol Oluştur'u seçin ve analiz için seçilen alan sayısını ekleyin. Konum Sayısı: 1 'iseçin.
    3. Protokol Parametrelerini açın ve Deneme Süresi penceresinde 1 dakika'yı seçin. Farklı deneysel süreler için farklı bir deneysel süre seçin. İstenilen veri çıktısına bağlı olarak Zaman Deposu Yok penceresini seçin veya seçimini kaldırın ve Tümleştirme Dönemi'ni seçin. Bu çalışmada Zaman Kutusu seçilmedi ( Şekil1D).
      NOT: Zaman depo gözü, etkinliğin ortalamasının alacağı zamandır.
    4. Bir iletişim kuralı zaten oluşturulmuşsa, Protokolü Aç'ı seçin ve kaydedilen protokolü seçin (.vte biçiminde).
    5. Daha önce kaydedilmiş her bir video dosyasını karşıya yüklemek için Dosyala ve Film Aç'ı seçin.
    6. Tek bir algılama alanı oluşturmak ve solucanların bulunduğu tüm sıvı damlasının etrafında bir alan oluşturmak için Şekil 1E'de (siyah ok) belirtilen Alan simgesini seçin. Seç'e tıklayın, ardından İşaretleri > Oluştur > Alanlaraltındaki yeşil daire simgesine (gri ok) tıklayın.
      NOT: Tanımlanan damladaki tüm solucanların etkinliği seçilen alanda algılanacaktır (Şekil 1E,F).
    7. Kalibrasyon > Çizim ölçeğine (Şekil 1E) gidin ve video alanının solundan sağuna yatay bir çizgi çizin. Kalibre etmek için gerçek mesafeyi belirtin. Ardından Gruba Uygula 'yıseçin.
    8. Alanı oluşturmak için seçilen simgenin seçimini kaldırın (Şekil 1E'dekiok) ve Saydam'ı seçin veya seçimini kaldırın.
      NOT: Bu çalışmada Saydam seçilmiş ve daha iyi sonuçlar vermiştir.
    9. Analiz edilen tüm farklı C. elegans solucan suşlarının algılanmasına izin vermek için Algılama Duyarlılığını ve Etkinlik Eşiğini ayarlayın.
      NOT: Bu deneyde, Algılama Duyarlılığı sırasıyla 15 ve 2'lik Patlama ve Donma değerleriyle 8 olarak ayarlanmıştır (Şekil 1F).
    10. Aktivite analizi devam ederken hayvan tarafından yapılan parçayı görselleştirmek için Ekran Ölçeğini 70 olarak ayarlayın. Ardından Gruba Uygula 'yı (Şekil 1F) seçin.
    11. Farklı Kaydet > Yürüt > Deneme'yi ve ardından Başlat'ı tıklatın. Bir pencere açılır. Videoyu hızlı bir şekilde analiz etmek için video medyasını maksimum bilgisayar hızında işlemek istiyor musunuz?'u seçin (örneğin, ZebraLab yazılımı tarafından 1 dakikalık bir video kaydı 5 s olarak analiz edilir).
    12. Başka bir pencere açılır: Deneme Çalıştırma; denemeye devam etmek için Başlat'a tıklayın.
    13. Video kaydı tamamlandıktan sonra analiz durur. Deney > Durdur 'atıklayın. Bu, elektronik tablodaki tek bir düşüşten analiz edilen etkinliği kaydeder.
    14. Her bir damla videosu için analizi tekrarlayın. Her damla bir teknik kopyadır.
  4. ZebraLab verilerinin çıktısı ve analizi
    NOT: Denemeden sonra, her videodaki veriler seçilen klasöre ayrı elektronik tablolar olarak ayrı ayrı kaydedilir. Veri çıkış dosyasında, tek bir düşüşte hareket eden tüm solucanların tümleşik etkinlik düzeyi, actinteg altında piksel değiştikçe kaydedilir.
    1. Her videonun analizinden elde edilen her elektronik tabloyu açın. Bunları el ile tek bir dosyada derleyin.
      Mutant ve vahşi tür verilerini denetimin yüzdesine normalleştirin. Burada gruplar arasındaki ortalama aktivite düzeylerini karşılaştırmak için istatistiksel analizler yapıldı.

2. WormScan yazılım analizi ile sıvı ortamda 96 kuyu plakası formatında solucan lokomotor aktivite analizi

  1. Nematod büyümesi ve elleçleme
    1. Bölüm 1.1.1'de açıklandığı gibi C. elegans yetiştirin.
    2. Solucanları bölüm 1.1.2'de açıklandığı gibi eşitleyin.
    3. Bölüm 1.1.3'te açıklandığı gibi, L4 aşamasına veya 1.
  2. WormScan aktivite analizi için 96 kuyu plakasında solucanların deneysel kurulumu
    1. Daha önce açıklandığı gibi 96 kuyulu, net, düz tabanlı, mikro plakanın her kuyusuna S. bazal ortamda sıvı süspansiyonda E. coli OP50 hacmi başına% 2 ağırlıkta50μLekleyin.
    2. Stereomikroskop altında, L4 aşamasında veya 1. Solucanların taramadan önce 20 dakika boyunca sıvı ortama alışmasına izin verin.
      NOT: Diğer hayvan evreleri ve yaşları çalışma için kolayca değiştirilebilir.
  3. WormScan aktivite analizi 96 kuyu plakasında ve veri elektronik tabloya dışa aktarıyor.
    1. Her 96 kuyulu, net, düz tabanlı mikro plakayı, taramalar arasında 10 s'den az olacak şekilde standart bir düz yataklı tarayıcı kullanarak iki kez tarayın.
      NOT: Burada, jpeg görüntüleri üretmek için 1.200 nokta/in ve 16 bit gri tonlamalı fotoğraf tarayıcısı kullanıldı. Fotoğraf tarayıcısını kullanarak dört 96 kuyu plakasını taramak için gereken süre 10 dakikadan azdır.
    2. Açık kaynak yazılım49kullanarak iki sıralı taramayı hizalayın (Şekil 2A).
      NOT: Yazılım, ilgi çekici bir bölge için iki sıralı görüntü (Şekil 2B) ve göreli bir WormScan Puanıarasındaki piksel değişikliklerini değerlendirmek için bir fark görüntüsü oluşturur. Bu WormScan Skoru, tarayıcı tarafından 5 piksel eşiğine ayarlandığında üretilen ışık yoğunluğuna göre lokomotor tepkislerindeki değişikliklere eşdeğerdir (Şekil 2C).
    3. Verileri WormScan'dan elektronik tablo olarak verin. Verileri içeren elektronik tabloyu yerel bilgisayara kaydedin. Verileri kontrol yüzdesi (POC) olarak normalleştirin ve çeşitli mutant veya tedavi koşulları için biyolojik çoğaltma deneyleri arasında karşılaştırın. Mutant karşılaştırmak için istatistiksel analiz yapın ve kontrol öğrenci t-test kullanarak anlamına gelir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sıvı ortamdaki C. elegans locomotor aktivitesinin analizi, katı medyada kolayca ölçülemeyecek mitokondriyal hastalık solucan modellerinin entegre bir fenotipini kolayca yakalayabilir. ZebraLab, L4 larva aşamasında sıvı ortamda WTworms göre iyi kurulmuş mitokondriyal kompleks I hastalığı gaz-1(fc21) suşunun lokomotor aktivitesini ölçmek için kullanılmıştır. Tek bir sıvı damlasında 5 solucanın aktivitesi 1 dakika boyunca kaydedildi ve her suş için toplam 19 video (teknik çoğaltma) kaydedildi ve bu da suş başına toplam 95 solucanın analizine neden oldu. Suş başına dört biyolojik çoğalı deneyi elde edildi. Solucan etkinliği piksel değişimi (Şekil 3A) ve N2 Bristol WT kontrolüne normalleştirildiğinde denetimin yüzdesi (POC) olarak görüntülenir (Şekil 3B). Gaz-1(fc21) solucanları (%62 ± %16 piksel değişimi, ± SD anlamına gelir, n = 19), L4 aşamasındaki lokomotor aktivitelerinde WT solucanlarına kıyasla önemli bir%38 azalma (p < 0.001, t-test) vardı (%100 ± %11.35, ortalama ± SD, n = 4 biyolojik kopya üzerinde 19 teknik çoğaltmada durum başına 95 solucan).

Sıvı ortamda L4 evre gaz-1(fc21) ve WT solucanlarının lokomotor aktivitesini ölçmek için WormScan analizi de yapıldı. Veriler, her biyolojik çoğaltma plakasının standart bir düz yataklı tarayıcı kullanılarak taranan iki sıralı görüntü tarafından değerlendirildiği üç biyolojik çoğaltma deneyi için toplandı. Diferansiyel görüntülerin solucan aktivitesi piksel değişimi olarak karşılaştırıldı ve eşzamanlı N2 Bristol WT kontrolüne normalleştirildi. Benzer şekilde, Zebra balığı davranış tarama yönteminde görüldüğü gibi, WormScan tabanlı analiz gaz-1(fc21) solucanlarının (65.9 ± 6.1, ortalama ± SD, n = 13 kuyular) N2 Bristol vahşi tip solucanlara (%100 ± %4,8, ortalama ± SEM, n = 12 kuyu) kıyasla lokomotor aktivitesinde %34 (p < 0,001, t-test) önemli bir düşüş yaşadı (Şekil 3C). WormScan kullanarak 1. günde yetişkin gaz-1(fc21) solucanları (%50.1 ± %10.7, ortalama ± SD, n = 7 kuyular), WT solucanlarına kıyasla (%100 ± %16,2, ortalama ± SD, n = 6 kuyu) ile karşılaştırıldığında lokomotor aktivitesinde %49 (p < 0,001, t-test) azalma göstermiştir (Şekil 3D).

Tablo 1: C. elegans nöromüsküler aktivitesini değerlendirmek için mevcut deneysel tahlillere karşılaştırmalı genel bakış. C. elegans'ta thrashing, locomotion, farengeal pompalama ve/veya kemotatakinin fenotipik sonuçları üzerindeki solucan nöromüsküler aktivitesini ölçmek için kullanılabilecek 16 farklı deneysel teknikten oluşan geniş bir genel bakış sunulmaktadır. Okuma formatı, metodolojisi, deneysel üretim kapasitesi, yazılım ve/veya ekipman gereksinimlerinin yanı sıra her bir testin avantajları ve sınırlamaları ayrıntılı olarak verilmiştir. Her test ve yazılım aracı için referanslar ve ilgili web siteleri de sağlanmaktadır. Her bir analizin aktarım hızı kapasitesi, deneysel karmaşıklığa, tek veya çok kuyulu plakaların kullanımına ve/veya deneysel ayarı ve veri analizlerini tamamlamak için gereken deney zamanına bağlı olarak düşük, orta veya yüksek olarak tanımlanır. * Metodolojilerin lokomotion'un değerlendirilmesi için de kullanılabileceğini gösterir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Figure 1
Şekil 1: C. elegans ZebraLab yazılımı kullanılarak lokomotor aktivite analizi. (A,B) Solucan video kayıtları için deneysel protokol. Damla başına beş solucan (20 μL) S. bazal çözeltisi tanıtıldı ve stereomikroskop altında tek bir cam kaydırağına dört damla yerleştirildi. 5 solucanın her damlası teknik bir çoğaltma deneyini temsil ediyordu ve şarjlı bir cihaz (CCD) kamerası kullanılarak ayrı bir filmde 1 dakika kaydedildi. (C-F) ZebraLab'daki deneysel ayarlar, C. elegans'takilokomotor aktivitesinin değerlendirilmesine uyarlanmıştır. (C) Kaydedilen her videonun solucan locomotor aktivitesini ölçmek için AVI dosyaları ile Niceleme seçimi. (D) Protokol parametre ayarları, deneme süresi olarak 1 dakika seçilir. (E) İlgi alanını seçmek için alan oluşturun. Alan seçildi ve 5 solucanın yer aldığı yaklaşık 1 damla çözelti inşa edildi. (F) Algılama, her solucanın tüm vücudunu (kırmızı) tespit etmek için gri ölçekli eşiklere göre belirlendi. Eşik bölümünde, piksel değiştikçe solucan etkinliğini analiz etmek için patlama ve dondurma değerleri seçildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: C. elegans locomotor aktivite analizi WormScan metodolojisi kullanılarak. (A) Epson v800 düz yataklı tarayıcı kullanılarak, jpeg görüntüleri üretmek için 1.200 nokta/in ve 16 bit gri tonlama çözünürlükte 96 kuyu plakasının hemen sıralı iki taraması yakalandı. (B) 96 kuyu plakasının bu iki sıralı görüntüsü daha sonra WT solucanlarının ilgi çekici bir bölgesine (ROI) hizalandı. (C) Görüntü analizi, N2 Bristol için 15 solucan / kuyu ile her yatırım getirisi için hesaplanan bir fark görüntü puanına dayanmaktadır. Fark görüntüsü normalleştirildi ve denetim yüzdesi (POC) olarak raporlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: N2 Bristol vahşi tip solucanlarına göre gaz-1(fc21) mitokondriyal hastalık solucanlarında ZebraLab ve WormScan yazılım testlerinde lokomotor aktivitesinin karşılaştırmalı analizi. (A,B) WT ve gaz-1(fc21) sıvı damlalarındaki solucan aktivitesi (5 solucan / damla) 1 dakika boyunca video kaydedildi ve (A) piksel değişimi veya (B ) olarak ölçüldü ) ZebraLab yazılımını kullanarak vahşi tip kontrol yüzdesi. Genel olarak, ZebraLab tabanlı solucan aktivite analizi, gaz-1(fc21) L4 evre solucanlarında vahşi tip kontrollere kıyasla% 38 oranında önemli bir düşüş göstermiştir (*** p < 0.001). Grafik, her noktanın S. bazal damla başına beş solucanın genel etkinliğini ilettiği tüm verilerin ± SD'si anlamına gelir. Her damla, durum başına toplam dört biyolojik çoğaltma ile teknik bir kopyayı temsil eder. Durum başına çalışılan toplam 95 bireysel solucan boyunca toplam 19 video kaydedildi (5 solucanın her damlası için bir video). İstatistiksel analiz, Prism -GraphPad v6'daki öğrenci t-testi kullanılarak gerçekleştirildi. (C) L4 aşamasında WT ve gas-1(fc21) solucanları, WormScan yazılımında bir fark görüntüsü elde etmek için analiz edilen iki sıralı görüntü üretmek için düz yataklı tarama ile analiz edildi. 96 kuyu plakasında kuyu başına 15 solucanla üç biyolojik çoğalım deneyi yapıldı. WT solucanlarının aktivitesi, kontrol yüzdesini (POC) normalleştirmek için temel olarak kullanılmıştır. gas-1(fc21) aktivitesi vahşi tip kontrolüne kıyasla % 34 azaldı (*** p < 0.001). Çubuk grafikler, üç biyolojik çoğaltma deneyi boyunca ortalama ve standart sapmayı taşır. (D) N2 ve gas-1(fc21) yetişkin gün 1 evresinde solucanlar, 1. günde C. gas-1(fc21) aktivitesi için ayrıntılı olarak ayrıntılı olarak analiz edildi, vahşi tip kontrol solucanlarına göre% 49.1 azaldı (*** p < 0.001). Çubuk grafikler, N2 (n = 6 kuyu 15 solucan/kuyu) ve gaz-1 (fc21) (n = 7 kuyu 15solucan / kuyu) karşılaştıran bir biyolojik yinelemede piksel değişikliklerinin ortalama ve standart sapması taşır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, çalışma, C. elegans nöromüsküler aktivitesini solucan hırpalama, locomotion, farengeal pompalama ve kemotaksi de dahil olmak üzere çeşitli sonuçlar düzeyinde incelemek için ayrıntılı bilgileri ve gerekçeleri özetlemiştir. 16 farklı aktivite analizi metodolojisinin karşılaştırılması, farklı yaş ve deneysel sürelerde tek bir solucan veya solucan popülasyonunda nematod aktivitelerini ölçmenin göreli verimi, avantajları ve sınırlamaları açısından gerçek gerçekleştirildi. Bunlar arasında, L4 larva gelişim aşamasında larva evresi solucanlarında ve WT kontrollerine göre iyi kurulmuş bir mitokondriyal kompleks I hastalığının C. elegans suşunun 1 genç yetişkininde lokomotor aktivitesinde önemliazalma olduğunu gösteren iki yeni uyarlama ve yarı otomatik analiz uygulamaları vurgulandı.

Özellikle, C. elegans nöromüsküler fonksiyonu ve lokomotor aktivitesi, WT solucan hareketi sinüzoidal dalga modellerinde çok düzenli olduğundan, katı ortam üzerinde kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Düzenli hareket yollarının anormallikleri ve hızı, genellikle düşük verimli ve sıkıcı olan testlerde, deneysel gözlemci tarafından mikroskobik olarak tespit edilebilir ve manuel olarak puanlanabilir. Deneysel aktarım hızını artırmak için otomatik ve yüksek aktarım hızı yöntemleri seçilmelidir. Solucanların bozulmuş aktivitesi, cam slaytlardaki damlacıklardaki veya çok kuyulu plakalardaki solucanların genel lokomotor aktivitesinin farklı yazılım araçlarıyla yarı otomatik veya otomatik bir şekilde video kaydı ve ölçülebileceği sıvı medyada ölçülebilir. Gerçekten de, Verilerimiz, cam slaytlardaki sıvı damlalarındaki solucanların videolarındaki lokomotor aktivitesini ölçmek için zebralab yazılımının yeni bir uygulamasıyla nematod lokomotor aktivitesini objektif ve verimli bir şekilde ölçmenin yararını vurgulamaktadır (ortaput tarama kapasitesi yaklaşımı), ayrıca 96 kuyu plakalı sıvı ortam yaklaşımında solucanların diferansiyel düz yataklı tarama görüntülerinde solucan lokomotor aktivitesini ölçmek için WormScan yazılımını kullanarak54, 55,56 (yüksek verimli tarama kapasitesi yaklaşımı). ZebraLab yazılım yaklaşımı, çok kuyulu plaka formatları için mevcut geliştirilmiş protokol olmadan, çalışılan her koşul için tek plakaların kullanılmasını gerektirdiğinden orta verimli bir test olarak kabul edilir. ZebraLab yazılım yaklaşımını kullanmak, C. elegans aktivitesini birkaç koşulda analiz ederken minimum zaman gerektirirken, birden fazla duruma uygulandığında deneysel süre artar. Burada, solucanları sıvı damlacıklara aktarmak ve her durum için 18 teknik çoğaltma göz önünde bulundurularak aktivitelerinin videolarını kaydetmek için deneysel süre yaklaşık 2 saatti. ZebraLab yazılımını kullanarak bu videoların analizi için harcanan süre yaklaşık 1 saatti. Karşılaştırmak gerekirse, WormScan yöntemi yüksek aktarım hızına sahiptir, çünkü dört 96 kuyu plakasının 10 dakikadan daha kısa bir sürede eşzamanlı analizine izin veren çok kuyulu bir plaka formatı içerir ve COPAS Bisoter ile 96 kuyu plakası kurmak da 10 dakikadan azdır.

Her iki metodoloji de L4 larva evresi gaz-1(fc21) mitokondriyal hastalık mutant solucanlarında WT solucanlarına göre benzer şekilde azaltılmış bir aktivite gösterdi, böylece solucan davranışındaki farklılıkları ölçmek için her iki farklı yaklaşımı da doğruladı. Ayrıca, WormScan analizi, hayvan lokomotor aktivitesinde ilerleyici azalmanın, 1 yetişkin evresinde belirgin olduğu gibi gaz-1(fc21) solucanlarında yaşla birlikte meydana geldiğini kolayca göstermek için kullanılmıştır.

Zebra balığı yüzme analizi için geliştirilen ZebraLab yazılımını C. elegans aktivite analizine uyarlamamızın temel avantajları, zebralab yazılımına yüklenen film dosyalarında teknik çoğaltma başına sadece saniye gerektiren yarı otomatik nicel analiz ile videolardaki solucan hareketini objektif olarak yakalamanın deneysel olarak basit ve ucuz olmasıdır ve manuel nicellik metodolojilerinde bulunan araştırmacı tabanlı önyargıyı ortadan kaldırır. Ayrıca, bu yazılım aracının araştırma laboratuvarında olması, iki hayvan modeli türünde, yani zebra balığı ve C. elegans'talokomotor aktivitesini ölçmek için yararlıdır. Dezavantajı, bunun satın alma gerektiren ticari bir yazılım olması ve solucan videolarının yazılıma manuel olarak yüklenmesi gerektiğidir, ancak yükleme işlemi basittir ve yazılım analiz süresi nispeten hızlıdır. Genel olarak, C. elegans locomotor aktivitesini ölçmek için ZebraLab yazılımının kullanılmasıyla ilgili yeni uygulama, solucan davranışı üzerindeki ilaç etkilerini değerlendirmek için doğrudan potansiyele sahiptir, ancak yüksek çözünürlüklü gereksinimleri göz önüne alındığında, yüksek çözünürlüklü gereksinimleri göz önüne alındığında, filmlerin cam slaytlara yerleştirilen medya damlalarında hareket eden solucanların yakalanmasını zorunlu kılmaktadır.

Ayrıca WormScan yazılımını, 96 kuyulu bir plakada sıvı ortamda solucanların solucan lokomotor kapasitesini verimli bir şekilde ölçmek için uyarladık. Bu yaklaşım, hayvan doğurganlığını ve hayatta kalmasını objektif olarak ölçmek için standart bir düz yataklı tarayıcı kullanan ve daha önce C. elegans49'dayüksek verimli ekranlar için kullanılan yüksek verimli ve düşük maliyetli bir deneysel yöntem sunar. Bu tekniğin temel avantajları, herhangi bir aşamada veya yaşta çok sayıda koşulun paralel karşılaştırılmasını sağlayan, kullanım kolaylığı, düşük kurulum maliyeti ve ücretsiz ve herkese açık WormScan yazılımı tarafından objektif bir şekilde hızlı analiz sağlayan yüksek verimli taramaya çok uygun olmasıdır49. WormScan'ın dezavantajı, yalnızca sıralı taramalar arasında meydana gelen ve bazı mutasyonlarda veya koşullarda küçük derecelerde fenotipik değişimi tespit etmek için yeterince hassas olmayabileceği değişimi sorgulayabilmesidir. Buna ek olarak, hem ZebraLab hem de WormScan yöntemleri sadece hayvan aktivitesini test etmek için görüntü pikseli değişikliklerine dayandığından, hayvan hareketliliği aktivitesi üzerindeki mutasyon ve/veya tedavi etkilerinin daha spesifik olarak değerlendirilmesini ve karşılaştırılmasını sağlamak için solucan boyutunda suşlar arasında veya zaman içinde belirli bir tedaviye yanıt olarak oluşabilecek önemli farklılıkların düşünülmesi ve/veya her iki yöntem için de bir normalleşme faktörü olarak kullanılması gerekebilir.

Genel olarak, nematod nöromüsküler aktiviteyi thrashing, locomotion, farengeal pompalama ve/ veya kemotaxis'in entegre fenotipik sonuçları üzerinde değerlendirmek için çok çeşitli deneysel yöntemler kullanılabilir. Bu yöntemlerden 16'sını (Tablo 1), özel deneysel ve analitik gereksinimlerini, avantajlarını, sınırlamalarını ve aktarım hızı kapasitelerini vurgulayarak karşılaştırdık. Bunlar arasında, sıvı ortamda solucan hareketliliği aktivitesini yarı otomatik, objektif ve hızlı bir şekilde ölçmek için özellikle yararlı olan mevcut yazılım araçlarının iki yeni uygulaması olan ZebraLab (orta verimli bir yaklaşım) ve WormScan (yüksek verimli bir yaklaşım) için ayrıntılı deneysel protokoller sağladık. Her iki deneysel yaklaşım da L4 aşamasında WT C. elegans suşlarına göre mitokondriyal hastalıkta(gaz-1(fc21)) benzer derecede azalmış bir hareketlilik aktivitesi meydana geldiğini ve gas-1(fc21) solucanlarında genç yetişkin aşamasının lokomotor aktivitesinde ilerleyici bir düşüş olduğunu ortaya koydu. Bu veriler, dahili olarak tutarlı veriler sağlayan bu deneysel yaklaşımların geçerliliğini göstermektedir. Ayrıca, bu yöntem dizisi çok yönlüdür ve çeşitli hastalık etiyolojilerinde, hayvan aşamalarında ve yaşlarında ve insan hastalığı için kurşun hedeflerinin klinik öncesi değerlendirmesi için yararlı olan aday terapötik modelleme veya yüksek verimli ilaç ekranlarına yanıt olarak çok çeşitli solucan lokomotor aktivite ölçümleri sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M.L., N.D.M., N.S., ve E.N.-O. ilgili finansal açıklamaları yoktur. M.J.F., MitoCUREia, Inc.'in kurucu ortağı, RiboNova, Inc.'de özkaynak ilgisi olan bilimsel danışma kurulu üyesi ve Khondrion ve Larimar Therapeutics'te ücretli danışman olarak bilimsel yönetim kurulu üyesidir. M.J.F. daha önce mitokondriyal hastalık terapötik preklinik ve/veya klinik aşama geliştirme çalışmaları yapan çeşitli şirketlerle ücretli danışman olarak (Astellas [eski adıyla Mitobridge] Pharma Inc., Cyclerion Therapeutics, Epirium Bio, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics, NeuroVive, Reneo Therapeutics, Stealth BioTherapeutics, Zogenix, Inc.) ve/veya sponsorlu bir araştırma işbirlikçisi (AADI Therapeutics, Cardero Therapeutics, Cyclerion Therapeutics, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics Inc., Mission Therapeutics, NeuroVive, Raptor Therapeutics, REATA Inc., RiboNova Inc., Standigm Therapeutics ve Stealth BioTherapeutics).

Acknowledgments

Bu projenin erken hazırlanması için organizasyon desteğiyle doktoralı Anthony Rosner'a ve protokol analizine katkıda bulunan Erin Haus'a minnettarız. Bu çalışma Juliet's Cure FBXL4 Mitokondriyal Hastalık Araştırma Fonu, Jaxson Flynt C12ORF65 Araştırma Fonu ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 ve T32-NS007413) tarafından finanse edildi. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka fon sağlayıcıların veya Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmez.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild isolate  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Bristol
Camera Olympus DP73
gas-1(fc-21) CGC CW152
Microscope slides ThermoFisher 4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM) Research Products International Corp. N81800-1000.0
OP50 Escherichia coli CGC Uracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm)  VWR international 25373-085
S. Basal VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
Scanner EPSON V800
Stereomicroscope Olympus MVX10 microscope
96-well flat bottom  VWR international 29442-056
WormScan software Mathew et al. 45 S1 Standalone Java platform Software for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab software ViewPoint Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2013).
  2. Shaye, D. D., Greenwald, I. OrthoList: a compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).
  3. van Ham, T. J., et al. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genetics. 4 (3), 1000027 (2008).
  4. Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
  5. Dingley, S., et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10 (2), 125-136 (2010).
  6. Polyak, E., Zhang, Z., Falk, M. J. Molecular profiling of mitochondrial dysfunction in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 837, 241-255 (2012).
  7. McCormick, E., Place, E., Falk, M. J. Molecular genetic testing for mitochondrial disease: from one generation to the next. Neurotherapeutics. 10 (2), 251-261 (2013).
  8. McCormack, S., et al. Pharmacologic targeting of sirtuin and PPAR signaling improves longevity and mitochondrial physiology in respiratory chain complex I mutant Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 22, 45-59 (2015).
  9. Polyak, E., et al. N-acetylcysteine and vitamin E rescue animal longevity and cellular oxidative stress in pre-clinical models of mitochondrial complex I disease. Molecular Genetics and Metabolism. 123 (4), 449-462 (2018).
  10. Guha, S., et al. Pre-clinical evaluation of cysteamine bitartrate as a therapeutic agent for mitochondrial respiratory chain disease. Human Molecular Genetics. 28 (11), 1837-1852 (2019).
  11. Gorman, G. S., et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease. Annals of Neurology. 77 (5), 753-759 (2015).
  12. Mancuso, M., Orsucci, D., Filosto, M., Simoncini, C., Siciliano, G. Drugs and mitochondrial diseases: 40 queries and answers. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 13 (4), 527-543 (2012).
  13. Gai, X., et al. Mutations in FBXL4, encoding a mitochondrial protein, cause early-onset mitochondrial encephalomyopathy. American Journal of Human Genetics. 93 (3), 482-495 (2013).
  14. Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298 (5602), 2398-2401 (2002).
  15. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
  16. Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
  17. Avery, L., Horvitz, H. R. Effects of starvation and neuroactive drugs on feeding in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 253 (3), 263-270 (1990).
  18. Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
  19. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. Journal of Experimental Biology. 211 (23), 3703-3711 (2008).
  20. Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
  21. Avery, L. Motor neuron M3 controls pharyngeal muscle relaxation timing in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 175, 283-297 (1993).
  22. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  23. Bargmann, C. I., Thomas, J. H., Horvitz, H. R. Chemosensory cell function in the behavior and development of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 529-538 (1990).
  24. Anne, C. H. Behavior. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. 2005-2018, (2006).
  25. Biston, M. C., et al. An objective method to measure cell survival by computer-assisted image processing of numeric images of Petri dishes. Physics in Medicine & Biology. 48 (11), 1551-1563 (2003).
  26. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52321 (2015).
  27. Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab on a Chip. 8 (9), 1432-1435 (2008).
  28. Javer, A., et al. An open-source platform for analyzing and sharing worm-behavior data. Nature Methods. 15 (9), 645-646 (2018).
  29. Koopman, M., et al. Assessing motor-related phenotypes of Caenorhabditis elegans with the wide field-of-view nematode tracking platform. Nature Protocols. 15 (6), 2071-2106 (2020).
  30. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  31. Angstman, N. B., Kiessling, M. C., Frank, H. G., Schmitz, C. High interindividual variability in dose-dependent reduction in speed of movement after exposing C. elegans to shock waves. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 12 (2015).
  32. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  33. Bianchi, J. I., Stockert, J. C., Buzzi, L. I., Blazquez-Castro, A., Simonetta, S. H. Reliable screening of dye phototoxicity by using a Caenorhabditis elegans fast bioassay. PLoS One. 10 (6), 0128898 (2015).
  34. Albertson, D. G., Thomson, J. N. The pharynx of Caenorhabditis elegans. Philososophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 275 (938), 299-325 (1976).
  35. Raizen, D. M., Avery, L. Electrical activity and behavior in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Neuron. 12 (3), 483-495 (1994).
  36. Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook. , 1-23 (2012).
  37. Morck, C., Rauthan, M., Wagberg, F., Pilon, M. pha-2 encodes the C. elegans ortholog of the homeodomain protein HEX and is required for the formation of the pharyngeal isthmus. Developmental Biology. 272 (2), 403-418 (2004).
  38. Song, B. M., Avery, L. Serotonin activates overall feeding by activating two separate neural pathways in Caenorhabditis elegans. TheJournal of Neuroscience. 32 (6), 1920-1931 (2012).
  39. Avery, L., Raizen, D., Lockery, S. Electrophysiological methods. Methods in Cell Biology. 48, 251-269 (1995).
  40. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab in a Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  41. Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nature Communications. 8, 14221 (2017).
  42. Brinkmann, V., Ale-Agha, N., Haendeler, J., Ventura, N. The Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) in the aging process: Another puzzling role for this highly conserved transcription factor. Frontiers in Physiology. 10, 1561 (2019).
  43. Huang, C., et al. Intrinsically aggregation-prone proteins form amyloid-like aggregates and contribute to tissue aging in Caenorhabditis elegans. eLife. 8, 43059 (2019).
  44. Zhu, B., et al. Functional analysis of epilepsy-associated variants in STXBP1/Munc18-1 using humanized Caenorhabditis elegans. Epilepsia. 61 (4), 810-821 (2020).
  45. Weeks, J. C., Robinson, K. J., Lockery, S. R., Roberts, W. M. Anthelmintic drug actions in resistant and susceptible C. elegans revealed by electrophysiological recordings in a multichannel microfluidic device. International Journal of Parasitology. Drugs and Drug Resistance. 8 (3), 607-628 (2018).
  46. Haroon, S., et al. Multiple molecular mechanisms rescue mtDNA disease in C. elegans. Cell Reports. 22 (12), 3115-3125 (2018).
  47. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  48. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
  49. Mathew, M. D., et al. Using C. elegans forward and reverse genetics to identify new compounds with anthelmintic activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005058 (2016).
  50. Kayser, E. B., Morgan, P. G., Hoppel, C. L., Sedensky, M. M. Mitochondrial expression and function of GAS-1 in Caenorhabditis elegans. Journal Biological Chemistry. 276 (23), 20551-20558 (2001).
  51. Falk, M. J., Kayser, E. B., Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mitochondrial complex I function modulates volatile anesthetic sensitivity in C. elegans. Current Biology. 16 (16), 1641-1645 (2006).
  52. Kwon, Y. J., Guha, S., Tuluc, F., Falk, M. J. High-throughput BioSorter quantification of relative mitochondrial content and membrane potential in living Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 40, 42-50 (2018).
  53. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  54. Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental protocol for examining behavioral response profiles in larval fish: Application to the Neuro-stimulant caffeine. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57938 (2018).
  55. Carlsson, G., Blomberg, M., Pohl, J., Orn, S. Swimming activity in zebrafish larvae exposed to veterinary antiparasitic pharmaceuticals. Environmental Toxicology and Pharmacology. 63, 74-77 (2018).
  56. Yang, X., et al. High-throughput screening in larval zebrafish identifies novel potent sedative-hypnotics. Anesthesiology. 129 (3), 459-476 (2018).

Tags

Davranış Sayı 170 solucanlar C. elegans,lokomotor aktivite farengeal pompalama kemotaksi kırbaçlama ZebraLab WormScan yüksek verimli eleme kapasitesi gaz-1 (fc21)
<em>Caenorhabditis elegans</em> Mitokondriyal Hastalık Modellerinde Hayvan Aktivitesini Ölçmek için Deneysel Yöntemlerin Karşılaştırmalı Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah,… More

Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah, N., Nakamaru-Ogiso, E., Falk, M. J. Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease. J. Vis. Exp. (170), e62244, doi:10.3791/62244 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter