Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Análisis comparativo de métodos experimentales para cuantificar la actividad animal en modelos de enfermedad mitocondrial de Caenorhabditis elegans

Published: April 4, 2021 doi: 10.3791/62244
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1,2
1Mitochondrial Medicine Frontier Program, Division of Human Genetics, Department of Pediatrics, The Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Este estudio presenta protocolos para dos enfoques semiautomatizado de análisis de actividad locomotora en gusanos gas-1(fc21)de la enfermedad de C. elegans complejo I, a saber, ZebraLab (un ensayo de rendimiento medio) y WormScan (un ensayo de alto rendimiento) y proporcionan un análisis comparativo entre una amplia gama de métodos de investigación para cuantificar el comportamiento de los nematodos y la función neuromuscular integrada.

Abstract

Caenorhabditis elegans es ampliamente reconocido por su utilidad central como modelo animal traslacional para interrogar eficientemente los mecanismos y terapias de diversas enfermedades humanas. Los gusanos son particularmente adecuados para pantallas genéticas y farmacológicas de alto rendimiento para obtener una visión más profunda de las dianas terapéuticas y las terapias al explotar su rápido ciclo de desarrollo, gran tamaño de cría, corta vida útil, transparencia microscópica, bajos costos de mantenimiento, conjunto robusto de herramientas genómicas, repositorios de mutantes y metodologías experimentales para interrogar la fisiología in vivo y ex vivo. La actividad locomotora del gusano representa un fenotipo particularmente relevante que con frecuencia se ve afectado en la enfermedad mitocondrial, que es altamente heterogénea en causas y manifestaciones, pero colectivamente comparte una capacidad deteriorada para producir energía celular. Si bien se puede usar un conjunto de metodologías diferentes para interrogar el comportamiento de los gusanos, estas varían mucho en costos experimentales, complejidad y utilidad para las pantallas genómicas o de alto rendimiento de medicamentos. Aquí, se compararon el rendimiento relativo, las ventajas y las limitaciones de 16 metodologías diferentes de análisis de actividad que cuantifican la locomoción de nematodos, la golpiza, el bombeo faríngeo y / o la quimiotaxis en gusanos individuales o poblaciones de gusanos de C. elegans en diferentes etapas, edades y duraciones experimentales. Se demostraron protocolos detallados para dos métodos semiautomatizados para cuantificar la actividad locomotora de los nematodos que representan nuevas aplicaciones de las herramientas de software disponibles, a saber, ZebraLab (un enfoque de rendimiento medio) y WormScan (un enfoque de alto rendimiento). Los datos de la aplicación de estos métodos demostraron grados similares de actividad animal reducida que ocurrieron en la etapa larvaria L4, y progresaron en adultos del día 1, en la enfermedad mitocondrial del complejo I (gas-1(fc21) )gusanos mutantes en relación con el tipo salvaje (N2 Bristol) C. elegans. Estos datos validan la utilidad para estas nuevas aplicaciones del uso de las herramientas de software ZebraLab o WormScan para cuantificar la actividad locomotora del gusano de manera eficiente y objetiva, con capacidad variable para apoyar la detección de fármacos de alto rendimiento en el comportamiento de los gusanos en modelos animales preclínicos de enfermedad mitocondrial.

Introduction

Caenorhabiditis elegans es ampliamente reconocido como un modelo sobresaliente en neurociencia basado en que tiene 302 neuronas que coordinan todos los comportamientos de los gusanos, incluido el apareamiento, la alimentación, la puesta de huevos, la defecación, la natación y la locomoción en medios sólidos1. Estos nematodos hermafroditas también se utilizan ampliamente para comprender una amplia gama de mecanismos de enfermedades humanas, lo que es posible gracias a su genoma bien caracterizado y su alta homología de ~ 80% de genes entre C. elegans y humanos2,3,4. C. elegans se ha utilizado durante mucho tiempo para interrogar la enfermedad mitocondrial humana5,6,7,8,9,10,que es un grupo altamente heterogéneo genética y fenotípicamente heterogéneo de trastornos metabólicos hereditarios que comparten una capacidad deteriorada para generar energía celular y, a menudo, clínicamente presentes con una función neuromuscular sustancialmente deteriorada, intolerancia al ejercicio y fatiga11 ,12,13,14. Con este fin, el uso de modelos de C. elegans permite el modelado preclínico de aspectos cuantitativos de la actividad animal y la función neuromuscular en diferentes subtipos genéticos de enfermedad mitocondrial, así como su respuesta a terapias candidatas que pueden mejorar su función neuromuscular y actividad general.

La actividad neuromuscular en C. elegans es objetivamente medible por una serie de metodologías experimentales, incluyendo enfoques manuales y semiautomatizados que permiten análisis funcionales en medios sólidos o líquidos(Tabla 1)1,15. La cuantificación precisa de la actividad de C. elegans ha demostrado ser importante para permitir descubrimientos relacionados con la función y el desarrollo del sistema muscular y nervioso16,17,18. Este estudio resume y compara los requisitos experimentales, las ventajas y las limitaciones de 17 ensayos diferentes que se pueden realizar en laboratorios de investigación para evaluar la función y la actividad neuromuscular en cuatro resultados clave en modelos de enfermedades por C. elegans, tanto al inicio en un rango de etapas y edades de desarrollo como en respuesta a terapias candidatas (Tabla 1 ). De hecho, el estudio proporciona una visión detallada de la gama de enfoques experimentales disponibles para caracterizar las tasas de golpeo de C. elegans (curvas corporales por minuto), la actividad locomotora, el bombeo faríngeo y la quimiotaxis, en cada caso especificando la metodología experimental y analítica utilizada, las ventajas y limitaciones de cada método, el equipo y el software necesarios para realizar y analizar cada ensayo, y la capacidad de rendimiento de cada método para apoyar su uso con fines de detección genética o de drogas de alto rendimiento. La capacidad de rendimiento de cada ensayo se describe como baja, media o alta en función de la complejidad del protocolo experimental, incluido el mantenimiento del gusano, el tiempo de procesamiento, el uso de placas de uno o varios pozos y / o el tiempo del experimentador necesario para completar el entorno experimental y los análisis de datos.

Los análisis manuales de thrashing19,actividad locomotora20,bombeo faríngeo17,21y quimiotaxis22, 23 son metodologías bien establecidas para evaluar la actividad de los gusanos que requieren un estereomicroscopio24. Mientras que la medición de la actividad de los gusanos requiere un análisis en medios líquidos para determinar la frecuencia de las curvas del cuerpo por minuto, la actividad locomotora del gusano se puede medir en medios sólidos o en medios líquidos. Sin embargo, los análisis manuales de la actividad individual del gusano son intrínsecamente lentos e implican un sesgo inevitable generado por el usuario. La automatización de los análisis de actividad de gusanos minimiza el sesgo generado por el usuario y puede aumentar en gran medida el rendimiento experimental25. Las grabaciones de video de la actividad de golpeo de gusanos en medios líquidos se pueden analizar utilizando wrMTrck, un complemento de ImageJ26. Sin embargo, la configuración experimental original que se desarrolló para wrMTrck limitó su utilidad, ya que demasiados gusanos en una sola gota líquida llevaron a la superposición de gusanos que dificultaron el seguimiento preciso. Si bien esta limitación experimental se ha resuelto27, el método wrMTrck no es capaz de soportar la detección de alto rendimiento.

Existe una variedad de métodos para cuantificar la actividad locomotora del gusano al inicio y en respuesta a las terapias candidatas en modelos de enfermedad mitocondrial de C. elegans. Estos incluyen ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker28,amplia plataforma de seguimiento de nematodos de campo de visión (WF-NTP)29,WormMotel, WormWatcher30,WormLab31,Infinity Chip32y WMicrotracker One33 (Tabla 1). Estos métodos permiten el análisis simultáneo de la locomoción en múltiples cepas o condiciones de gusanos, generalmente en placas de múltiples pozos, lo que respalda aplicaciones de detección de fármacos de mayor rendimiento. Algunos de estos métodos tienen consideraciones únicas que pueden limitar o mejorar su utilidad general, como la necesidad de equipos costosos en comparación con el software de acceso abierto, y la facilidad variable de realizar protocolos experimentales. En general, ningún sistema o protocolo experimental es ideal para todos los experimentos de actividad locomotora de C. elegans. Más bien, es importante elegir cuidadosamente qué método se adapta mejor a los objetivos y requisitos experimentales del investigador específico.

El bombeo faríngeo representa otro resultado importante para evaluar la actividad neuromuscular en C. elegans. La faringe de C. elegans está compuesta por 20 células musculares, 20 neuronas y otras 20 células que permiten la ingestión de Escherichia coli (E. coli)en el extremo anterior del tracto alimentario del gusano34,35,36. Se han establecido varios métodos manuales para determinar las tasas de bombeo faríngeo17,21,37,38. La mayoría de los métodos se basan en el uso de un estereomicroscopio y una cámara para visualizar y registrar la frecuencia de bombeo faríngeo con conteo directo por el observador experimental21. El análisis automatizado de la velocidad de bombeo faríngeo es posible mediante la realización de un registro extracelular denominado electrofaringigograma (EPG), que proporciona información adicional sobre la duración de cada bomba39. El análisis de la velocidad de bombeo faríngeo también es posible en un sistema microfluídico, WormSpa, donde los gusanos individuales están confinados en cámaras40,41. Un método comercial disponible para facilitar el análisis de la tasa de bombeo faríngeo es el sistema ScreenChip (InVivo Biosystems), que mide, visualiza y analiza los aspectos neuromusculares del comportamiento de alimentación en un solo gusano que se inmoviliza en un chip personalizado. Este enfoque de cuantificación del bombeo faríngeo se puede utilizar para evaluar las respuestas neuronales y fisiológicas a los fármacos, el envejecimiento y otros factores42,43,44,45.

La quimiotaxis describe el movimiento de C. elegans en respuesta a un odorante colocado lejos de los gusanos en un área definida de la placa de medios de crecimiento de nematodos (NGM). La evaluación de la respuesta de quimiotaxis proporciona una medida integrada de la actividad neuronal y neuromuscular del gusano que es cuantificable al observar y medir la distancia física recorrida por los gusanos hacia el odorante en un período de tiempo definido46. El Multi-Worm Tracker es un método automático que se puede utilizar para mejorar la eficiencia experimental de cuantificar la distancia recorrida por los gusanos hacia un atrayente o desde un repelente47.

Aquí, se describe el protocolo detallado para dos métodos novedosos y semiautomatizados establecidos para cuantificar la actividad del gusano. El primer enfoque utiliza ZebraLab, un software comercial que se desarrolló originalmente para estudiar la actividad de natación de Danio rerio (pez cebra), para una nueva aplicación de rendimiento medio para cuantificar la actividad locomotora general en medios líquidos de C. elegans en función de los cambios de píxeles durante el movimiento(Tabla 1, Figura 1). La salida de datos se obtiene rápidamente de un gran número de condiciones concurrentes y muestras analizadas en un portaobjetos de vidrio, aunque este método no es adecuado para un formato de placa de múltiples pozos. El segundo enfoque es una adaptación novedosa de la metodología WormScan48,49 (Figura 2), que utiliza un escáner de cama plana para crear una imagen diferencial de dos escaneos secuenciales que se pueden usar de manera variable con software de código abierto para permitir el análisis cuantitativo semiautomatizado de resultados fisiológicos integrados como la fecundidad y la supervivencia. Aquí, se desarrolló una nueva adaptación de alto rendimiento de la metodología WormScan para cuantificar la actividad locomotora del gusano en medios líquidos en poblaciones de quince gusanos larvales en etapa 4 (L4) por pozo de una placa de fondo plano de 96 pozos. Esta metodología WormScan semiautomatizada y de bajo costo se puede adaptar fácilmente a las pruebas de detección de medicamentos de alto rendimiento, así como a los análisis de varias etapas animales y edadesde 48,49.

Aquí, el protocolo y la eficacia del análisis de la actividad locomotora de C. elegans utilizando los métodos semiautomatizados ZebraLab y WormScan se demuestran en un modelo bien establecido de C. elegans para la enfermedad mitocondrial del complejo I, gas-1(fc21). gas-1 (gen K09A9.5) es un ortólogo del NDUFS2 humano (NADH: núcleo de ubiquinona oxidorreductasa (proteína hierro-azufre) subunidad 2)(Figura 3). La cepa mutante C. elegans gas-1(fc21)porta una mutación homocigota p.R290K sin sentido en el ortólogo humano de NDUFS250,causando una disminución significativa de la fecundidad y la vida útil, deterioro de la capacidad de fosforilación oxidativa de la cadena respiratoria (OXPHOS)51,así como disminución de la masa mitocondrial y el potencial de membrana con aumento del estrés oxidativo5,8 . A pesar de su uso bien establecido en las últimas dos décadas para estudiar la enfermedad mitocondrial, la actividad locomotora de los mutantes gas-1(fc21)no se informó previamente. Aquí, los métodos ZebraLab y WormScan se aplicaron para cuantificar de forma independiente la actividad locomotora del gas-1(fc21)en comparación con los gusanos de tipo salvaje (WT, N2 Bristol), tanto como una forma de validar los métodos como para demostrar su utilidad comparativa y eficiencia de los protocolos experimentales y los análisis informáticos. El software ZebraLab permitió la cuantificación rápida de varias condiciones concurrentes de actividad locomotora del gusano en modelos de enfermedad mitocondrial de C. elegans, con aplicación potencial para estudios dirigidos de detección o validación de fármacos. El análisis de WormScan, en particular, es adecuado para permitir fácilmente cribado farmacológico de alto rendimiento de bibliotecas de compuestos y priorizar los cables que mejoran la función neuromuscular animal y la actividad locomotora en modelos preclínicos de C. elegans de enfermedad mitocondrial primaria.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Análisis de la actividad locomotora del gusano en medios líquidos en portaobjetos de vidrio utilizando el software ZebraLab

  1. Crecimiento y manipulación de nematodos
    1. Cultive C. elegans en placas de Petri que contengan medios de crecimiento de nematodos (NGM) y difunda con Escherichia coli OP50 como fuente de alimento. Mantener el cultivo de gusanos a 20 °C, como se describió anteriormente8.
    2. Sincronice los gusanos realizando una puesta de huevo cronometrada52 y estudie los gusanos en la etapa deseada. En este protocolo, se analizaron los gusanos en etapa L4.
    3. Control de cultivo y cepas de gusanos mutantes en placas NGM con y sin tratamientos farmacológicos para ser probados o control tampón. Para evaluar los efectos del tratamiento farmacológico, prepare la concentración deseada de existencias de fármacos en S. solución basal; extienda el volumen específico calculado sobre las placas NGM y deje que se seque. Transfiera los gusanos en una etapa larvaria o adulta específica y manténgalos en la placa de tratamiento del medicamento durante la duración deseada antes del análisis.
  2. Configuración experimental de gusanos para la grabación de vídeo de la actividad locomotora y el análisis de ZebraLab
    1. Elija 5 gusanos L4 sincronizados por cepa y condición usando un gusano pick. Pipetear una sola gota de 20 μL de solución basal de S. en un portaobjetos de vidrio ubicado debajo de un estereomicroscópica conectado a una cámara y transferir 5 gusanos a ella(Figura 1A,B). Transfiera los 5 gusanos de la placa de Petri que contiene NGM y E. coli OP50 a la gota líquida solo en el momento anterior a la grabación.
      NOTA: Continúe manteniendo los otros gusanos en la placa de Petri hasta que se grabe el video anterior. Esto evitará el daño causado en los otros gusanos debido al secado de las gotas de 20 μl durante el procedimiento (tiempo de secado ~ 15-20 min).
    2. Pipetear múltiples gotas en una diapositiva para obtener múltiples réplicas técnicas (Figura 1A). Seleccione gusanos de diferentes placas NGM (replicación biológica). No utilice la funda deslizante.
    3. Ajuste la distancia de trabajo del microscopio para visualizar el área completa de una sola gota. Configure y mantenga una resolución de video baja (<1024 x 768) para cargar los archivos en el software.
    4. Permita que los gusanos se aclimaten en el portaobjetos a temperatura ambiente durante 1 minuto antes de grabar.
    5. Registre la actividad de natación del gusano en 1 gota durante 1 minuto a 15 cuadros por segundo (fps). Repita la imagen para cada gota adicional en la placa.
  3. Análisis de registro de la actividad locomotora de C. elegans en el software ZebraLab
    1. Utilice la opción ZEBRALAB AVI para subir vídeos al software. Haga clic en la opción Cuantización con archivos AVI (Figura 1C).
    2. Para crear un nuevo protocolo, seleccione Archivo > Generar protocoloy, a continuación, agregue el número de áreas seleccionadas para el análisis. Elija Recuento de ubicaciones: 1.
    3. Abra Parámetros de protocolo y seleccione 1 minuto en la ventana Duración del experimento. Seleccione una duración experimental diferente para diferentes duraciones experimentales. Seleccione o anule la selección de la ventana Sin papelera de tiempo y elija Período de integración,dependiendo de la salida de datos deseada. En este estudio no se seleccionó ningún contenedor de tiempo(Figura 1D).
      NOTA: El contenedor de tiempo es el tiempo durante el cual se promediará la actividad.
    4. Si ya se ha creado un protocolo, seleccione Abrir protocolo y seleccione el protocolo guardado (en formato .vte).
    5. Seleccione Archivo y Abrir una película para cargar cada archivo de video individual que se grabó anteriormente.
    6. Seleccione el icono Área indicado en la Figura 1E (flecha negra) para construir una sola área de detección y crear un área alrededor de toda la gota líquida donde se encuentran los gusanos. Haga clic en Seleccionar, luego en el icono de círculo verde (flecha gris) debajo de Áreas > Construir > Marcas claras.
      NOTA: La actividad de todos los gusanos en la gota definida se detectará en el área seleccionada (Figura 1E, F).
    7. Vaya a Calibración > Escala de dibujo (Figura 1E) y dibuje una línea horizontal de izquierda a derecha del área de video. Indique la distancia real a calibrar. A continuación, seleccione Aplicar al grupo.
    8. Anule la selección del icono seleccionado para crear el área (flecha en la figura 1E)y seleccione o anule la selección de Transparente.
      NOTA: En este estudio, Transparent fue seleccionado y dio mejores resultados.
    9. Ajuste la sensibilidad de detección y el umbral de actividad para permitir la detección de todas las diferentes cepas de gusanos C. elegans analizadas.
      NOTA: En este experimento, la sensibilidad de detección se estableció en 8 con valores de ráfaga y congelación de 15 y 2, respectivamente (Figura 1F).
    10. Establezca la escala de visualización en 70 para visualizar la pista realizada por el animal mientras se realiza el análisis de la actividad. A continuación, seleccione Aplicar al grupo ( Figura1F).
    11. Haga clic en Experimento > Ejecutar > Guardar comoy, a continuación, en Inicio. Se abre una ventana. Elija ¿Desea procesar los medios de vídeo a la máxima velocidad de la computadora? para analizar el vídeo rápidamente (por ejemplo, una grabación de vídeo de 1 minuto es analizada por el software en ZebraLab en 5 s).
    12. Se abre otra ventana: Running Experiment; haga clic en Iniciar para continuar con el experimento.
    13. Una vez completada la grabación de vídeo, el análisis se detiene. Haga clic en Experimento > Detener. Esto guarda la actividad analizada de una sola gota en una hoja de cálculo.
    14. Repita el análisis para cada video de caída individual. Cada gota es una réplica técnica.
  4. Salida y análisis de datos de ZebraLab
    NOTA: Después del experimento, los datos de cada video se guardan individualmente como hojas de cálculo separadas en la carpeta elegida. En el archivo de salida de datos, el nivel de actividad integrado de todos los gusanos que se mueven en una caída individual se registra como cambios de píxeles bajo actinteg.
    1. Abre cada hoja de cálculo obtenida del análisis de cada vídeo. Compilarlos manualmente en un solo archivo.
      Normalice los datos mutantes y de tipo salvaje a un porcentaje de control. Aquí, se realizaron análisis estadísticos para comparar los niveles medios de actividad entre los grupos.

2. Análisis de la actividad locomotora del gusano en medios líquidos en formato de placa de 96 pozos mediante el análisis de software WormScan

  1. Crecimiento y manipulación de nematodos
    1. Cultivar C. elegans como se describe en la sección 1.1.1.
    2. Sincronice los gusanos como se describe en la sección 1.1.2.
    3. Cultivar gusanos en medios específicos como se describe en la sección 1.1.3 hasta la etapa L4 o el día 1 adulto.
  2. Configuración experimental de gusanos en placa de 96 pozos para el análisis de la actividad de WormScan
    1. Añadir 50 μL de 2% de peso por volumen de E. coli OP50 en suspensión líquida en medio basal S. a cada pozo de una microplaca de 96 pomos, transparente, de fondo plano, como se describió anteriormente49,53.
    2. Bajo un estereomicroscopio, elija manualmente 15 gusanos sincronizados en la etapa L4 o el día 1 adulto de sus placas NGM en medios líquidos dentro de cada pozo experimental de la microplaca de 96 pozos. Permita que los gusanos se aclimaten al medio líquido durante 20 minutos antes de escanear.
      NOTA: Otras etapas y edades de los animales pueden ser fácilmente sustituidas por el estudio.
  3. Análisis de actividad de WormScan en placa de 96 pozos y exportación de datos a hoja de cálculo.
    1. Escanee cada microplaca de 96 pozos, transparente y de fondo plano dos veces secuencialmente utilizando un escáner de cama plana estándar, con menos de 10 s entre escaneos.
      NOTA: Aquí, el escáner fotográfico con resolución de 1.200 puntos / entrada y escala de grises de 16 bits se utilizó para producir imágenes jpeg. El tiempo requerido para escanear cuatro placas de 96 pozos con el escáner fotográfico es inferior a 10 minutos.
    2. Alinear los dos escaneos secuenciales(Figura 2A)utilizando software de código abierto49.
      NOTA: El software genera una imagen de diferencia para evaluar los cambios de píxeles entre las dos imágenes secuenciales para una región de interés(Figura 2B)y una puntuación de WormScanrelativa. Esta puntuación de WormScan es equivalente a los cambios en la respuesta locomotora en función de la intensidad de la luz producida por el escáner cuando se establece en un umbral de píxeles de 5(Figura 2C).
    3. Exporte los datos de WormScan como una hoja de cálculo. Guarde la hoja de cálculo que contiene los datos en el equipo local. Normalice los datos como porcentaje de control (POC) y compare entre experimentos de réplica biológica para diversas condiciones mutantes o de tratamiento. Realizar análisis estadísticos para comparar medios mutantes y de control utilizando la prueba tde Student.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

El análisis de la actividad locomotora de C. elegans en el medio líquido podría capturar fácilmente un fenotipo integrado de modelos de gusanos de enfermedades mitocondriales que pueden no ser fácilmente cuantificables en medios sólidos. ZebraLab se utilizó para cuantificar la actividad locomotora de la cepa gas-1(fc21)de la enfermedad del complejo I mitocondrial bien establecida en relación con los gusanos WT en medios líquidos en la etapa larvaria L4. La actividad de 5 gusanos en una sola gota líquida se registró durante 1 min, con un total de 19 videos (réplicas técnicas) grabados para cada cepa, resultando en total el análisis de 95 gusanos por cepa. Se obtuvieron cuatro experimentos de réplica biológica por cepa. La actividad del gusano se muestra como cambio de píxel(Figura 3A)y como porcentaje de control (POC) cuando se normaliza al control N2 Bristol WT(Figura 3B). Los gusanos gas-1(fc21)(62% ± 16% de cambio de píxeles, media ± SD, n = 19) tuvieron una disminución significativa del 38% (p < 0.001, t-test) en su actividad locomotora en la etapa L4 en comparación con los gusanos WT (100% ± 11.35%, ± media SD, n = 95 gusanos por condición en 19 réplicas técnicas sobre 4 réplicas biológicas).

También se realizó un análisis de WormScan para cuantificar la actividad locomotora de los gusanos L4 stage gas-1(fc21)y WT en medios líquidos. Los datos se recopilaron para tres experimentos de réplica biológica, donde cada placa de réplica biológica se evaluó mediante dos imágenes secuenciales escaneadas utilizando un escáner de cama plana estándar. La actividad del gusano de las imágenes diferenciales se comparó como cambio de píxeles y se normalizó con el control concurrente N2 Bristol WT. De manera similar, como se observó en el método de detección del comportamiento del pez cebra, el análisis basado en WormScan demostró que los gusanos gas-1(fc21)(65,9 ± 6,1, media ± SD, n = 13 pozos) tuvieron una disminución significativa en la actividad locomotora en un 34% (p < 0,001, t-test)en comparación con los gusanos de tipo salvaje N2 Bristol (100% ± 4,8%, media ± SEM, n = 12 pozos) ( Figura3C). El análisis utilizando WormScan en el día 1 de gusanos adultos gas-1(fc21)(50,1% ± 10,7%, media ± SD, n = 7 pozos) demostró una disminución de la actividad locomotora en un 49% (p < 0,001, t-test) en comparación con los gusanos WT (100% ± 16,2%, media ± SD, n = 6 pozos) (Figura 3D).

Tabla 1: Visión general comparativa de los ensayos experimentales disponibles para evaluar la actividad neuromuscular de C. elegans. Se proporciona una descripción detallada de una amplia gama de 16 técnicas experimentales diferentes que se pueden utilizar para cuantificar la actividad neuromuscular del gusano en los resultados fenotípicos de la golpiza, la locomoción, el bombeo faríngeo y / o quimiotaxis en C. elegans. Se detallan el formato de lectura, la metodología, la capacidad de rendimiento experimental, los requisitos de software y / o equipo, así como las ventajas y limitaciones de cada ensayo. También se proporcionan referencias y sitios web relevantes para cada ensayo y herramienta de software. La capacidad de rendimiento de cada ensayo se describe como baja, media o alta, según la complejidad experimental, el uso de placas de uno o varios pozos y / o el tiempo del experimentador necesario para completar el entorno experimental y los análisis de datos. * Indica que las metodologías también se pueden utilizar para la evaluación de la locomoción. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figure 1
Figura 1: Análisis de la actividad locomotora de C. elegans utilizando el software ZebraLab. (A,B) Protocolo experimental para grabaciones de vídeo de gusanos. Se introdujeron cinco gusanos por gota (20 μL) de solución basal de S., con cuatro gotas colocadas en un solo portaobjetos de vidrio bajo un estereomitroscopio. Cada gota de 5 gusanos representó un experimento de réplica técnica y se grabó durante 1 minuto en una película separada utilizando una cámara de dispositivo de acoplamiento cargado (CCD). (C-F) Ajustes experimentales en ZebraLab adaptados a la evaluación de la actividad locomotora en C. elegans. (C) Selección de Cuantización con archivos AVI para cuantificar la actividad locomotora del gusano de cada video grabado. (D) Configuración del parámetro de protocolo, con 1 minuto seleccionado como duración del experimento. (E) Construir área para seleccionar el área de interés. El área fue seleccionada y construida alrededor de 1 gota de solución en la que se colocaron 5 gusanos. (F) La detección se determinó en función de los umbrales de escala de grises para detectar todo el cuerpo de cada gusano (rojo). En la sección de umbral, se seleccionaron valores de ráfaga y congelación para analizar la actividad del gusano a medida que cambian los píxeles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Análisis de la actividad locomotora de C. elegans utilizando la metodología WormScan. (A) Utilizando un escáner plano Epson v800, se capturaron dos escaneos secuenciales inmediatos de una placa de 96 pozos con una resolución de 1.200 puntos / in y escala de grises de 16 bits para producir imágenes jpeg. (B) Estas dos imágenes secuenciales de una placa de 96 pozos se alinearon con una región de referencia de interés (ROI), de gusanos WT. (C) El análisis de imágenes se basa en una puntuación de imagen de diferencia calculada para cada ROI con 15 gusanos/pozo para N2 Bristol. La imagen de diferencia se normalizó y se informó como porcentaje de control (POC). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis comparativo de la actividad locomotora mediante ensayos de software ZebraLab y WormScan en gusanos de enfermedad mitocondrial gas-1(fc21) en relación con gusanos de tipo salvaje N2 Bristol. (A, B) WT y gas-1(fc21) actividad del gusano en gotas líquidas (5 gusanos / gota) se grabó en video durante 1 minuto y se cuantificó como (A) los píxeles cambian o (B ) porcentaje de control de tipo salvaje mediante el software ZebraLab. En general, el análisis de actividad de gusanos basado en ZebraLab demostró una disminución significativa del 38% en los gusanos de la etapa L4 de gas-1(fc21)en comparación con los controles de tipo salvaje (*** p < 0.001). El gráfico muestra la media ± SD de todos los datos, donde cada punto transmite la actividad general de cinco gusanos por S. gota basal. Cada gota representa una réplica técnica, con un total de cuatro réplicas biológicas estudiadas por condición. Se grabaron un total de 19 videos (un video por cada gota de 5 gusanos), en un total de 95 gusanos individuales estudiados por condición. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba tde Student en Prism -GraphPad v6. (C) Los gusanos WT y gas-1(fc21)en la etapa L4 se analizaron mediante escaneo plano para producir dos imágenes secuenciales que se analizaron en el software WormScan para obtener una imagen diferente. Se realizaron tres experimentos de réplica biológica con 15 gusanos por pozo en una placa de 96 pozos. La actividad de los gusanos WT se utilizó como línea de base para normalizar el porcentaje de control (POC). la actividad de gas-1(fc21)se redujo en un 34% en comparación con el control de tipo salvaje (*** p < 0,001). Los gráficos de barras transmiten la media y la desviación estándar a través de tres experimentos de réplica biológica. (D) Los gusanos N2 y gas-1(fc21) en la etapa adulta del día 1 se analizaron de manera similar como se detalla para el panel C. La actividad del gas-1(fc21) en adultos del día 1 se redujo en un 49,1% en relación con los gusanos de control de tipo salvaje (*** p < 0,001). Los gráficos de barras transmiten la media y la desviación estándar de los cambios de píxeles en una réplica biológica comparando N2 (n = 6 pozos de 15 gusanos / pozo) y gas-1(fc21) (n = 7 pozos de 15 gusanos / pozo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aquí, el estudio resumió información detallada y fundamentos para estudiar la actividad neuromuscular de C. elegans a nivel de diversos resultados, incluyendo golpes de gusanos, locomoción, bombeo faríngeo y quimiotaxis. La comparación de 16 metodologías diferentes de análisis de actividad se realizó en términos del rendimiento relativo, las ventajas y las limitaciones de cuantificar las actividades de los nematodos en un solo gusano o poblaciones de gusanos a diferentes edades y duraciones experimentales. Entre estos, se destacaron dos nuevas adaptaciones y aplicaciones de análisis semiautomatizados para demostrar una reducción significativa de la actividad locomotora en gusanos en etapa larvaria en la etapa de desarrollo larvario L4 y en adultos jóvenes del día 1 de una enfermedad mitocondrial bien establecida de la enfermedad de C. elegans, gas-1(fc21) en relación con los controles WT.

En particular, la función neuromuscular y la actividad locomotora de C. elegans se han estudiado ampliamente en medios sólidos, ya que el movimiento del gusano WT es muy regular en los patrones de ondas sinusoidales. Las anomalías de su trayectoria de movimiento regular y la velocidad pueden ser detectadas microscópicamente y puntuadas manualmente por el observador experimental, en ensayos que a menudo son de bajo rendimiento y tediosos. Para aumentar el rendimiento experimental, se deben seleccionar métodos automatizados y de alto rendimiento. La actividad deteriorada de los gusanos puede ser cuantificable en medios líquidos, donde la actividad locomotora general de los gusanos en gotas en portaobjetos de vidrio o en placas de múltiples pozos se puede grabar y cuantificar en video de manera semiautomatizada o automatizada con diferentes herramientas de software. De hecho, nuestros datos destacan la utilidad de medir de manera objetiva y eficiente la actividad locomotora de los nematodos tanto mediante una nueva aplicación del software ZebraLab para cuantificar la actividad locomotora en videos de gusanos en gotas líquidas en portaobjetos de vidrio (un enfoque de capacidad de detección de rendimiento medio), como mediante la utilización del software WormScan para cuantificar la actividad locomotora del gusano en imágenes diferenciales de escaneo de lecho plano de gusanos en un enfoque de medios líquidos de placa de 96 pozos54, 55,56 (un enfoque de capacidad de cribado de alto rendimiento). El enfoque de software de ZebraLab se considera un ensayo de rendimiento medio, ya que requiere que se utilicen placas individuales para cada condición estudiada, sin el protocolo desarrollado actualmente para formatos de placas de múltiples pozos. Si bien el uso del enfoque de software ZebraLab requiere un tiempo mínimo al analizar la actividad de C. elegans en unas pocas condiciones, el tiempo experimental aumenta cuando se aplica a múltiples condiciones. Aquí, el tiempo experimental fue de aproximadamente 2 h para transferir gusanos a gotas líquidas y grabar videos de su actividad, considerando 18 réplicas técnicas para cada condición. El tiempo empleado para el análisis de estos vídeos utilizando el software ZebraLab fue de aproximadamente 1 h. En comparación, el método WormScan es de alto rendimiento porque incorpora un formato de placa de múltiples pozos que permite el análisis simultáneo de cuatro placas de 96 pozos en menos de 10 minutos y la configuración de una placa de 96 pozos con un COPAS Bisoter también es inferior a 10 minutos.

Ambas metodologías mostraron una actividad igualmente reducida en los gusanos mutantes de la enfermedad mitocondrial L4 en etapa larvaria gas-1(fc21)en relación con los gusanos WT, validando así ambos enfoques distintos para cuantificar las diferencias en el comportamiento del gusano. Además, el análisis de WormScan se utilizó para demostrar fácilmente que la reducción progresiva de la actividad locomotora animal ocurrió con la edad en los gusanos gas-1(fc21),como fue evidente en la etapa adulta del día 1.

Las principales ventajas de adaptar el software ZebraLab que se desarrolló para el análisis de natación de peces cebra al análisis de actividad de C. elegans es que es experimentalmente simple y económico capturar objetivamente el movimiento del gusano en videos, con un análisis cuantitativo semiautomatizado en archivos de película cargados en el software ZebraLab que requiere solo segundos por réplica técnica y elimina el sesgo basado en investigadores que está presente en las metodologías de cuantificación manual. Además, tener esta herramienta de software en el laboratorio de investigación es útil para cuantificar la actividad locomotora en dos especies de modelos animales, a saber, el pez cebra y C. elegans. La desventaja es que este es un software comercial que requiere compra y los videos de gusanos deben cargarse manualmente en el software, aunque el proceso de carga es sencillo y el tiempo de análisis del software es relativamente rápido. En general, la novedosa aplicación descrita aquí del uso del software ZebraLab para cuantificar la actividad locomotora de C. elegans tiene un potencial directo para evaluar los efectos de los medicamentos en el comportamiento de los gusanos, aunque su rendimiento sigue siendo de bajo a medio dado que sus requisitos de alta resolución requieren que se capturen películas de gusanos que se mueven en gotas de medios colocadas en portaobjetos de vidrio.

También adaptamos el software WormScan para cuantificar de manera eficiente la capacidad locomotora de los gusanos en medios líquidos en una placa de 96 pozos. Este enfoque ofrece un método experimental de alto rendimiento y bajo costo que utiliza un escáner de cama plana estándar para cuantificar objetivamente la fecundidad y supervivencia de los animales y se ha utilizado previamente para pantallas de alto rendimiento en C. elegans49. Las principales ventajas de esta técnica son que es muy susceptible de cribado de alto rendimiento, permitiendo comparaciones paralelas de un gran número de condiciones en cualquier etapa o edad, con facilidad de uso, bajo costo de configuración y análisis rápido de manera objetiva por el software WormScan que es gratuito y disponible públicamente49. La desventaja del WormScan es que solo puede interrogar el cambio que ocurre entre las exploraciones secuenciales, que en algunas mutaciones o condiciones pueden no ser lo suficientemente sensibles como para detectar pequeños grados de cambio fenotípico. Además, dado que los métodos ZebraLab y WormScan se basan exclusivamente en los cambios de píxeles de imagen para evaluar la actividad animal, es posible que sea necesario considerar y/o utilizar como factor de normalización para ambos métodos, las diferencias sustanciales en el tamaño del gusano que pueden ocurrir entre cepas o en respuesta a una terapia específica a lo largo del tiempo, para permitir más específicamente la evaluación y comparación de los efectos de la mutación y/o el tratamiento en la actividad locomotora animal.

En general, se puede utilizar una amplia gama de métodos experimentales para evaluar la actividad neuromuscular de los nematodos en los resultados fenotípicos integrados de golpes, locomoción, bombeo faríngeo y / o quimiotaxis. Comparamos 16 de estos métodos(Tabla 1),destacando sus requisitos experimentales y analíticos específicos, ventajas, limitaciones y capacidad de rendimiento. Entre estos, proporcionamos protocolos experimentales detallados para dos aplicaciones novedosas de herramientas de software existentes, ZebraLab (un enfoque de rendimiento medio) y WormScan (un enfoque de alto rendimiento), que son particularmente útiles para cuantificar de forma semiautomática, objetiva y rápida la actividad de locomoción del gusano en medios líquidos. Ambos enfoques experimentales revelaron un grado igualmente reducido de actividad de la locomoción ocurrida en la enfermedad mitocondrial (gas-1(fc21)) en relación con las cepas wt C. elegans en la etapa L4, con una disminución progresiva de la actividad locomotora por la etapa adulta joven en gusanos gas-1(fc21). Estos datos demuestran la validez de estos enfoques experimentales que producen datos internamente consistentes. Además, esta gama de métodos es altamente versátil, lo que permite una amplia gama de métricas de actividad locomotora del gusano en diversas etiologías de enfermedades, etapas y edades de los animales, y en respuesta a modelos terapéuticos candidatos o pruebas de detección de medicamentos de alto rendimiento que son útiles para la evaluación preclínica de objetivos principales para enfermedades humanas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M.L., N.D.M., N.S. y E.N.-O. no tienen divulgaciones financieras relevantes. M.J.F. es cofundador de MitoCUREia, Inc., miembro de la junta asesora científica con participación accionaria en RiboNova, Inc., y miembro de la junta científica como consultor remunerado con Khondrion y Larimar Therapeutics. M.J.F. ha estado o está actualmente comprometido con varias compañías involucradas en el desarrollo de etapas preclínicas y / o clínicas terapéuticas de enfermedades mitocondriales como consultor pagado (Astellas [anteriormente Mitobridge] Pharma Inc., Cyclerion Therapeutics, Epirium Bio, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics, NeuroVive, Reneo Therapeutics, Stealth BioTherapeutics, Zogenix, Inc.) y / o un colaborador de investigación patrocinado (AADI Therapeutics, Cardero Therapeutics, Cyclerion Therapeutics, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics Inc., Mission Therapeutics, NeuroVive, Raptor Therapeutics, REATA Inc., RiboNova Inc., Standigm Therapeutics y Stealth BioTherapeutics).

Acknowledgments

Estamos agradecidos a Anthony Rosner, PhD., con su apoyo organizativo para la preparación temprana de este proyecto, y a Erin Haus por contribuir al análisis de protocolos. Este trabajo fue financiado por el Fondo de Investigación de Enfermedades Mitocondriales FBXL4 de Juliet's Cure, el Fondo de Investigación Jaxson Flynt C12ORF65 y los Institutos Nacionales de Salud (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 y T32-NS007413). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los financiadores o de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild isolate  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Bristol
Camera Olympus DP73
gas-1(fc-21) CGC CW152
Microscope slides ThermoFisher 4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM) Research Products International Corp. N81800-1000.0
OP50 Escherichia coli CGC Uracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm)  VWR international 25373-085
S. Basal VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
Scanner EPSON V800
Stereomicroscope Olympus MVX10 microscope
96-well flat bottom  VWR international 29442-056
WormScan software Mathew et al. 45 S1 Standalone Java platform Software for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab software ViewPoint Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2013).
  2. Shaye, D. D., Greenwald, I. OrthoList: a compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).
  3. van Ham, T. J., et al. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genetics. 4 (3), 1000027 (2008).
  4. Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
  5. Dingley, S., et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10 (2), 125-136 (2010).
  6. Polyak, E., Zhang, Z., Falk, M. J. Molecular profiling of mitochondrial dysfunction in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 837, 241-255 (2012).
  7. McCormick, E., Place, E., Falk, M. J. Molecular genetic testing for mitochondrial disease: from one generation to the next. Neurotherapeutics. 10 (2), 251-261 (2013).
  8. McCormack, S., et al. Pharmacologic targeting of sirtuin and PPAR signaling improves longevity and mitochondrial physiology in respiratory chain complex I mutant Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 22, 45-59 (2015).
  9. Polyak, E., et al. N-acetylcysteine and vitamin E rescue animal longevity and cellular oxidative stress in pre-clinical models of mitochondrial complex I disease. Molecular Genetics and Metabolism. 123 (4), 449-462 (2018).
  10. Guha, S., et al. Pre-clinical evaluation of cysteamine bitartrate as a therapeutic agent for mitochondrial respiratory chain disease. Human Molecular Genetics. 28 (11), 1837-1852 (2019).
  11. Gorman, G. S., et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease. Annals of Neurology. 77 (5), 753-759 (2015).
  12. Mancuso, M., Orsucci, D., Filosto, M., Simoncini, C., Siciliano, G. Drugs and mitochondrial diseases: 40 queries and answers. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 13 (4), 527-543 (2012).
  13. Gai, X., et al. Mutations in FBXL4, encoding a mitochondrial protein, cause early-onset mitochondrial encephalomyopathy. American Journal of Human Genetics. 93 (3), 482-495 (2013).
  14. Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298 (5602), 2398-2401 (2002).
  15. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
  16. Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
  17. Avery, L., Horvitz, H. R. Effects of starvation and neuroactive drugs on feeding in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 253 (3), 263-270 (1990).
  18. Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
  19. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. Journal of Experimental Biology. 211 (23), 3703-3711 (2008).
  20. Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
  21. Avery, L. Motor neuron M3 controls pharyngeal muscle relaxation timing in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 175, 283-297 (1993).
  22. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  23. Bargmann, C. I., Thomas, J. H., Horvitz, H. R. Chemosensory cell function in the behavior and development of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 529-538 (1990).
  24. Anne, C. H. Behavior. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. 2005-2018, (2006).
  25. Biston, M. C., et al. An objective method to measure cell survival by computer-assisted image processing of numeric images of Petri dishes. Physics in Medicine & Biology. 48 (11), 1551-1563 (2003).
  26. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52321 (2015).
  27. Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab on a Chip. 8 (9), 1432-1435 (2008).
  28. Javer, A., et al. An open-source platform for analyzing and sharing worm-behavior data. Nature Methods. 15 (9), 645-646 (2018).
  29. Koopman, M., et al. Assessing motor-related phenotypes of Caenorhabditis elegans with the wide field-of-view nematode tracking platform. Nature Protocols. 15 (6), 2071-2106 (2020).
  30. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  31. Angstman, N. B., Kiessling, M. C., Frank, H. G., Schmitz, C. High interindividual variability in dose-dependent reduction in speed of movement after exposing C. elegans to shock waves. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 12 (2015).
  32. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  33. Bianchi, J. I., Stockert, J. C., Buzzi, L. I., Blazquez-Castro, A., Simonetta, S. H. Reliable screening of dye phototoxicity by using a Caenorhabditis elegans fast bioassay. PLoS One. 10 (6), 0128898 (2015).
  34. Albertson, D. G., Thomson, J. N. The pharynx of Caenorhabditis elegans. Philososophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 275 (938), 299-325 (1976).
  35. Raizen, D. M., Avery, L. Electrical activity and behavior in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Neuron. 12 (3), 483-495 (1994).
  36. Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook. , 1-23 (2012).
  37. Morck, C., Rauthan, M., Wagberg, F., Pilon, M. pha-2 encodes the C. elegans ortholog of the homeodomain protein HEX and is required for the formation of the pharyngeal isthmus. Developmental Biology. 272 (2), 403-418 (2004).
  38. Song, B. M., Avery, L. Serotonin activates overall feeding by activating two separate neural pathways in Caenorhabditis elegans. TheJournal of Neuroscience. 32 (6), 1920-1931 (2012).
  39. Avery, L., Raizen, D., Lockery, S. Electrophysiological methods. Methods in Cell Biology. 48, 251-269 (1995).
  40. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab in a Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  41. Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nature Communications. 8, 14221 (2017).
  42. Brinkmann, V., Ale-Agha, N., Haendeler, J., Ventura, N. The Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) in the aging process: Another puzzling role for this highly conserved transcription factor. Frontiers in Physiology. 10, 1561 (2019).
  43. Huang, C., et al. Intrinsically aggregation-prone proteins form amyloid-like aggregates and contribute to tissue aging in Caenorhabditis elegans. eLife. 8, 43059 (2019).
  44. Zhu, B., et al. Functional analysis of epilepsy-associated variants in STXBP1/Munc18-1 using humanized Caenorhabditis elegans. Epilepsia. 61 (4), 810-821 (2020).
  45. Weeks, J. C., Robinson, K. J., Lockery, S. R., Roberts, W. M. Anthelmintic drug actions in resistant and susceptible C. elegans revealed by electrophysiological recordings in a multichannel microfluidic device. International Journal of Parasitology. Drugs and Drug Resistance. 8 (3), 607-628 (2018).
  46. Haroon, S., et al. Multiple molecular mechanisms rescue mtDNA disease in C. elegans. Cell Reports. 22 (12), 3115-3125 (2018).
  47. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  48. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
  49. Mathew, M. D., et al. Using C. elegans forward and reverse genetics to identify new compounds with anthelmintic activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005058 (2016).
  50. Kayser, E. B., Morgan, P. G., Hoppel, C. L., Sedensky, M. M. Mitochondrial expression and function of GAS-1 in Caenorhabditis elegans. Journal Biological Chemistry. 276 (23), 20551-20558 (2001).
  51. Falk, M. J., Kayser, E. B., Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mitochondrial complex I function modulates volatile anesthetic sensitivity in C. elegans. Current Biology. 16 (16), 1641-1645 (2006).
  52. Kwon, Y. J., Guha, S., Tuluc, F., Falk, M. J. High-throughput BioSorter quantification of relative mitochondrial content and membrane potential in living Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 40, 42-50 (2018).
  53. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  54. Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental protocol for examining behavioral response profiles in larval fish: Application to the Neuro-stimulant caffeine. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57938 (2018).
  55. Carlsson, G., Blomberg, M., Pohl, J., Orn, S. Swimming activity in zebrafish larvae exposed to veterinary antiparasitic pharmaceuticals. Environmental Toxicology and Pharmacology. 63, 74-77 (2018).
  56. Yang, X., et al. High-throughput screening in larval zebrafish identifies novel potent sedative-hypnotics. Anesthesiology. 129 (3), 459-476 (2018).

Tags

Comportamiento Número 170 gusanos C. elegans,actividad locomotora bombeo faríngeo quimiotaxis thrashing ZebraLab WormScan capacidad de cribado de alto rendimiento gas-1(fc21)
Análisis comparativo de métodos experimentales para cuantificar la actividad animal en modelos de enfermedad mitocondrial de <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah,… More

Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah, N., Nakamaru-Ogiso, E., Falk, M. J. Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease. J. Vis. Exp. (170), e62244, doi:10.3791/62244 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter