Summary
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र मेटास्टेसिस पीडीएक्स मॉडल मानव मेटास्टेसिस के फेनोटाइपिक और आणविक विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिससे उन्हें प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए उत्कृष्ट मॉडल बनाया जाता है। यहां वर्णित है कि पीडीएक्स मॉडल और टीकाकरण मार्गों को कैसे स्थापित किया जाए जो प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए सबसे अच्छा उपयोग किया जाता है।
Abstract
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) मेटास्टेसिस के लिए नए उपचारों के विकास को प्रीक्लिनिकल मॉडल की कमी से बाधित किया गया है जो रोग का सटीक प्रतिनिधित्व करते हैं। सीएनएस मेटास्टेसिस के रोगी व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) मॉडल को मानव रोग के फेनोटाइपिक और आणविक विशेषताओं का बेहतर प्रतिनिधित्व करने के लिए दिखाया गया है, साथ ही ऐतिहासिक सेल लाइन मॉडल की तुलना में मानव रोगी ट्यूमर की विषमता और क्लोनल गतिशीलता को बेहतर ढंग से प्रतिबिंबित किया गया है। कई साइटें हैं जिनका उपयोग प्रीक्लिनिकल परीक्षणों की स्थापना करते समय रोगी-व्युत्पन्न ऊतक को प्रत्यारोपित करने के लिए किया जा सकता है, प्रत्येक के अपने फायदे और नुकसान हैं, और प्रत्येक मेटास्टैटिक कैस्केड के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है। यहां, प्रोटोकॉल बताता है कि पीडीएक्स मॉडल कैसे स्थापित करें और पूर्व-नैदानिक अध्ययनों में सीएनएस मेटास्टेसिस पीडीएक्स मॉडल का उपयोग करने के लिए तीन अलग-अलग दृष्टिकोण प्रस्तुत करें, उनके प्रत्येक अनुप्रयोगों और सीमाओं पर चर्चा करें। इनमें फ्लैंक आरोपण, मस्तिष्क में ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन और इंट्राकार्डियक इंजेक्शन शामिल हैं। चमड़े के नीचे फ्लैंक आरोपण निगरानी करना सबसे आसान है और इसलिए, पूर्व-नैदानिक अध्ययनों के लिए सबसे सुविधाजनक है। इसके अलावा, फ्लैंक आरोपण से मस्तिष्क और अन्य ऊतकों में मेटास्टेस देखा गया था, यह दर्शाता है कि ट्यूमर मेटास्टेसिस के कई चरणों से गुजरा है, जिसमें इंट्रावासेशन, एक्स्ट्रावेसन और उपनिवेशीकरण शामिल हैं। मस्तिष्क में ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन मस्तिष्क ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को पुन: उत्पन्न करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प है और रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) को पार करने के लिए जीवविज्ञान की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए उपयोगी है लेकिन मेटास्टैटिक कैस्केड के अधिकांश चरणों को बाईपास करता है। इंट्राकार्डियक इंजेक्शन मस्तिष्क को मेटास्टेसिस की सुविधा देता है और अंग ट्रोपिज्म का अध्ययन करने के लिए भी उपयोगी है। जबकि यह विधि मेटास्टैटिक कैस्केड के पहले चरणों को छोड़ देती है, इन कोशिकाओं को अभी भी परिसंचरण, अतिरिक्त और उपनिवेश से बचना होगा। पीडीएक्स मॉडल की उपयोगिता, इसलिए, ट्यूमर टीकाकरण के मार्ग से प्रभावित होती है और किसका उपयोग करना है, इसका विकल्प वैज्ञानिक प्रश्न और प्रयोग के समग्र लक्ष्यों द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए।
Introduction
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में मेटास्टेसिस की घटना हाल के वर्षों में 1,2,3 में बढ़ी है। सीएनएस मेटास्टेसिस के लिए पारंपरिक उपचार, जैसे कि ट्यूमर रिसेक्शन, पूरे मस्तिष्क रेडियोथेरेपी और स्टीरियोटैक्टिक रेडियोसर्जरी, काफी हद तक उपशामक और शायद ही कभी उपचारात्मक रहे हैं, और इससे दुर्बल दुष्प्रभाव हो सकते हैं, जैसे कि संज्ञानात्मक गिरावट1। हाल ही में, सीएनएस मेटास्टेसिस के उपचार के लिए कई नए लक्षित और प्रतिरक्षात्मक उपचार विकसित किए जा रहे हैं जो कम दुष्प्रभाव होने के साथ-साथ अधिक प्रभावी उपचार होने का वादा दिखातेहैं।
प्रीक्लिनिकल परिणामों को सार्थक नैदानिक समापन बिंदुओं में अनुवाद करने के लिए अक्सर प्रभावी और पूर्वानुमानित मॉडलिंग रणनीतियों की आवश्यकता होती है। ऐतिहासिक रूप से, सेल लाइन जेनोग्राफ्ट मॉडल सीएनएस मेटास्टेसिस अनुसंधान में प्रीक्लिनिकल अनुसंधान के लिए मानक थे। हालांकि, ये सेल लाइन मॉडल मेजबान ट्यूमर के सच्चे ट्यूमर व्यवहार को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं या रोग के हिस्टोलॉजिकल या आणविक विषमता का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा, सेल लाइन मॉडल इन विट्रो विकास स्थितियों के अनुकूल होने में सक्षम हैं और इसलिए, मेजबान ट्यूमर के मूल गुणों को खो देते हैं। रोगी व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स), जो एक रोगी के ट्यूमर को एक इम्यूनोडेफिशिएंट या मानवकृत माउस में संलग्न करते हैं, ट्रांसलेशनल कैंसर अनुसंधान में तेजी से उपयोग किए जाते हैं। शोधकर्ताओं ने दिखाया है कि पीडीएक्स मॉडल आमतौर पर ट्यूमर के विकास, हिस्टोलॉजिकल विशेषताओं को ईमानदारी से पुन: उत्पन्न कर सकते हैं, ट्यूमर विषमता, मेटास्टैटिक क्षमता और आणविक आनुवंशिक विशेषताओं को बनाए रख सकते हैं। इसके अलावा, पीडीएक्स मॉडल रोगसूचक हैं जिससे पीडीएक्स ट्यूमर विलंबता अवधि रोगी के समग्र अस्तित्व के साथ संबंधित है और उन्हें रोगी परीक्षणों में चिकित्सीय प्रतिक्रिया की सटीक भविष्यवाणी करने के लिए भी दिखाया गया है 5,6.
ज्यादातर, ये एक ही मूल से उत्पन्न ट्यूमर का प्रतिनिधित्व करने वाले विकसित किए गए हैं, जैसे कि गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी)7, स्तन कैंसर 8,9, और मेलेनोमा 10,11। हाल ही में, पीडीएक्स मॉडल का एक बड़ा और विविध संग्रह विकसित और विशेषता है, जो आठ अलग-अलग हिस्टोलॉजिकल उपप्रकारोंका प्रतिनिधित्व करता है। यह प्रदर्शित किया गया है कि सीएनएस मेटास्टेसिस के लिए पीडीएक्स मॉडल उनके मूल रोगी ट्यूमर से निकटता से मिलते जुलते हैं, दोनों हिस्टोलॉजिकल और आणविक रूप से और हिस्टोलॉजिकल अद्वितीय अंतर और समानताएं10,12 भी प्रदर्शित की हैं। इसके अलावा, जबकि अधिकांश सीएनएस मेटास्टेसिस पीडीएक्स मॉडल मानव ट्यूमर की क्लोनल विषमता को बनाए रखते हैं, कुछ ने क्लोनल उत्तराधिकार12 के सबूत प्रदर्शित किए, जिससे उन्हें उपचार के बाद क्लोनल परिवर्तनों की निगरानी करके उपचारों के प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिए भी आदर्श बनाया गया।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल पीडीएक्स स्थापना के तरीकों और सीएनएस मेटास्टेसिस के प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले टीकाकरण के विभिन्न मार्गों को रेखांकित करते हैं (चित्रा 1)। ये आरोपण विधियां विकास और मेटास्टेसिस की नकल करने की उनकी क्षमता में भिन्न होती हैं। यहां, प्रोटोकॉल आरोपण के प्रत्येक मार्ग के लिए अनुप्रयोगों पर प्रकाश डालता है और दर्शाता है कि सीएनएस मेटास्टेसिस के अध्ययन के लिए उनका उपयोग कैसे किया जा सकता है।
Protocol
निम्नलिखित चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला है जिसका उपयोग चमड़े के नीचे फ्लैंक आरोपण द्वारा पीडीएक्स मॉडल स्थापित करने और प्रीक्लिनिकल अध्ययनों की स्थापना के लिए किया जाता है जो उपचार के परीक्षण को सक्षम करते हैं, जो जैविक परिवर्तनों और मेटास्टैटिक कैस्केड के विभिन्न चरणों का आकलन करने में सहायता कर सकते हैं। सभी अध्ययनों और मॉडलों ने 3-8 सप्ताह की महिला एनओजी चूहों का उपयोग किया। सभी ऊतक ों के नमूने संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार सूचित सहमति के तहत एकत्र किए गए थे। सभी पशु प्रयोग एक संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किए गए थे।
1. फ्लैंक आरोपण द्वारा पीडीएक्स मॉडल की स्थापना और प्रसार
- पीडीएक्स मॉडल की स्थापना
- ऑपरेटिंग रूम में रोगी से ट्यूमर के सर्जिकल रिसेक्शन के बाद, ताजा ट्यूमर ऊतकों को एक उपयुक्त समाधान (जैसे डीएमईएम) में स्टोर करें और तुरंत इसे बर्फ पर रखें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि ऊतक पूरी तरह से जलमग्न है, भंडारण समाधान (>10 एमएल) की अधिकता का उपयोग करें।
- ऊतक को ऊतक संवर्धन डिश में स्थानांतरित करें और 5 एमएल डीपीबीएस के साथ कुल्ला करें।
नोट: यह कदम सड़न रोकनेवाली तकनीकों का उपयोग करके जैव सुरक्षा कैबिनेट में आयोजित किया जाना चाहिए। संभावित मानव संक्रामक एजेंटों से बचाव के लिए उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनकर सावधानी बरतनी चाहिए। - ट्यूमर से नेक्रोटिक क्षेत्रों को हटा दें।
नोट: इसे ऊतक के केंद्र की ओर एक सफेद मुशी क्षेत्र के रूप में पहचाना जा सकता है। - शेष ऊतक को लगभग 2 x 2 x 2 मिमी टुकड़ों में काटें।
- ऊतकों को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें विकास कारक कम तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स होता है और उन्हें बर्फ पर स्टोर करता है। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक ऊतक टुकड़े को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए पर्याप्त तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (>200 μL) का उपयोग किया जाता है।
- क्रायोसंरक्षित शेष ऊतकों को चरण 1.3 में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रत्यारोपित नहीं किया जाएगा।
- 2-5% आइसोफ्लुरेन और ऑक्सीजन के साथ एक प्रेरण कक्ष में जानवर को एनेस्थेटाइज करें। एक बार एनेस्थेटाइज्ड होने के बाद, निरंतर ऑक्सीजन की आपूर्ति के साथ 1.5-2.5% आइसोफ्लुरेन पर संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए जानवर को नाक शंकु में स्थानांतरित करें। पेडल रिफ्लेक्स की कमी के माध्यम से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें। सर्जरी के दौरान आंखों की सूखापन को रोकने के लिए पशु चिकित्सा नेत्र मरहम लागू करें। जब तक जानवर ठीक नहीं हो जाता तब तक प्रक्रिया के दौरान जानवर के लिए थर्मल समर्थन प्रदान करें।
- माउस पर आरोपण साइट की पहचान करें।
नोट: यह माउस के दाएं या बाएं किनारे पर होना चाहिए, आमतौर पर पेट के क्षेत्र के किनारे पार्श्व रूप से लैंडमार्क किया जाना चाहिए, जो रिबकेज के बगल में होता है। - सर्जिकल क्षेत्र तैयार करने के लिए, फर को शेव करें और पोविडोन आयोडीन और 70% इथेनॉल के तीन वैकल्पिक स्क्रब के साथ कीटाणुरहित करें।
- फोर्सप्स का उपयोग करके, माउस की त्वचा को उठाएं और त्वचा पर 0.5-1 सेमी चीरा लगाएं।
- चमड़े के नीचे की जगह में एक जेब (0.5-1 सेमी गहरी) बनाने के लिए चीरा स्थल पर त्वचा के नीचे धीरे-धीरे सर्जिकल कैंची की एक जोड़ी डालें।
- सावधानी से जेब में एक ट्यूमर का टुकड़ा रखें और ट्यूमर को बाहर फिसलने से रोकने के लिए इसे जेब के नीचे धक्का दें।
- 4-0 नायलॉन सर्जिकल सीवन का उपयोग करके चीरा बंद करें।
नोट: अन्य घाव बंद करने के तरीके जैसे गैर-अवशोषक या अवशोषक सीवन और घाव क्लिप का भी उपयोग किया जा सकता है। - माउस को वापस पिंजरे में स्थानांतरित करें और संज्ञाहरण से जानवर की वसूली की निगरानी करें, जब तक कि यह एम्बुलेटरी न हो।
नोट: एनाल्जेसिक की आवश्यकता नहीं होती है, लेकिन चूहों में दर्द देखा जाता है तो प्रशासित किया जा सकता है। - साप्ताहिक ट्यूमर के विकास की निगरानी करें। प्रति माउस एक ट्यूमर की उम्मीद है।
नोट: प्रत्यारोपण में ट्यूमर की मात्रा शुरू में कम हो जाएगी लेकिन यह चिंता का कारण नहीं है। एक ट्यूमर को एक बार लिया गया माना जाता है जब यह स्पष्ट हो जाता है और एक लघुगणकीय विकास चरण में प्रवेश करता है। यह पहला मार्ग F0 पीढ़ी का प्रतिनिधित्व करता है। - एक बार जब ट्यूमर बढ़ने लगते हैं, तो प्रति सप्ताह तीन बार ट्यूमर को मापें। कैलिपर के साथ ट्यूमर की लंबाई और चौड़ाई को मापें। ट्यूमर की मात्रा की गणना करने के लिए, सूत्र का उपयोग करें: लंबाई x चौड़ाई x चौड़ाई /
- पीडीएक्स ट्यूमर के साथ प्रत्यारोपित चूहों को इच्छामृत्यु दें जब ट्यूमर के सबसे लंबे हिस्से का उपयोग करके ट्यूमर व्यास में 15 मिमी से अधिक होता है। सीओ2 प्रेरण कक्ष में सीओ2 इनहेलेशन द्वारा इच्छामृत्यु करें, इसके बाद एक माध्यमिक विधि के रूप में ग्रीवा अव्यवस्था।
- चीरा लगाकर जानवर के फ्लैंक से ट्यूमर को निकाल दें। एक्साइज ट्यूमर को कुंद कैंची और बल के साथ धीरे से विच्छेदित करें। ऐसा करने के लिए, पहले ट्यूमर के ऊपर की त्वचा को काट दें, फिर ट्यूमर को उसके नीचे की मांसपेशियों की परत से दूर काट दें।
- ट्यूमर ऊतक को एक उपयुक्त भंडारण समाधान (जैसे डीएमईएम) के >10 एमएल में स्थानांतरित करें। तुरंत इसे बर्फ पर रखें। इस ट्यूमर को क्रायोसंरक्षित किया जा सकता है या चूहों के दूसरे सेट में पारित किया जा सकता है। इस परिच्छेद को F1 के रूप में देखें।
नोट: फिर से पासिंग ट्यूमर मार्ग एफ 2 और इसी तरह प्रस्तुत करेगा।
- पीडीएक्स मॉडल का प्रसार
- चरण 1.1.19 से भंडारण समाधान में रखे गए कटे हुए ट्यूमर से शुरू करें।
- ऊतक को एक ऊतक संस्कृति डिश में स्थानांतरित करें और 5 एमएल डीपीबीएस के साथ कुल्ला करें।
- ट्यूमर से नेक्रोटिक क्षेत्रों को हटा दें।
- ऊतक को लगभग 2 x 2 x 2 मिमी टुकड़ों में काटें।
- ऊतकों को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें विकास कारक कम तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (>200 μL) होता है और बर्फ पर स्टोर होता है।
- क्रायोसंरक्षित शेष ऊतक जो चरण 1.3 में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रसार के लिए उपयोग नहीं किया जाता है।
- 2-5% आइसोफ्लुरेन और ऑक्सीजन के साथ एक प्रेरण कक्ष में जानवर को एनेस्थेटाइज करें। एक बार एनेस्थेटाइज्ड होने के बाद, निरंतर ऑक्सीजन की आपूर्ति के साथ 1.5-2.5% आइसोफ्लुरेन पर संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए जानवर को नाक शंकु में स्थानांतरित करें। पेडल रिफ्लेक्स की कमी के माध्यम से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें। सर्जरी के दौरान आंखों की सूखापन को रोकने के लिए पशु चिकित्सा नेत्र मरहम लागू करें। जब तक जानवर ठीक नहीं हो जाता तब तक प्रक्रिया के दौरान जानवर के लिए थर्मल समर्थन प्रदान करें।
- माउस पर आरोपण साइट की पहचान करें।
नोट: यह माउस के दाएं या बाएं किनारे पर होना चाहिए, आमतौर पर पेट के क्षेत्र में, रिबकेज के पुच्छल पर। - सर्जिकल क्षेत्र तैयार करने के लिए, फर को शेव करें और पोविडोन आयोडीन और 70% इथेनॉल के तीन वैकल्पिक स्क्रब के साथ कीटाणुरहित करें।
- माउस के एक फ्लैंक पर 0.5-1 सेमी चीरा लगाएं।
- चमड़े के नीचे की जगह में एक जेब (0.5-1 सेमी गहरी) बनाने के लिए चीरा पर त्वचा के नीचे धीरे-धीरे सर्जिकल कैंची की एक जोड़ी डालें।
- सावधानी से जेब में एक ट्यूमर का टुकड़ा रखें और ट्यूमर को बाहर फिसलने से रोकने के लिए इसे जेब के नीचे धक्का दें।
- 4-0 नायलॉन सर्जिकल सीवन या अन्य घाव बंद करने के तरीकों का उपयोग करके चीरा बंद करें।
- माउस को पिंजरे में वापस स्थानांतरित करें और संज्ञाहरण से इसकी वसूली की निगरानी करें, जब तक कि यह एम्बुलेटरी न हो।
नोट: एनाल्जेसिक की आवश्यकता नहीं होती है, लेकिन चूहों में दर्द देखा जाता है तो प्रशासित किया जा सकता है। - विलंबता (गैर-विकास चरण) के दौरान, साप्ताहिक रूप से ट्यूमर के विकास की निगरानी करें। प्रति माउस एक ट्यूमर की उम्मीद है।
नोट: प्रत्यारोपण में ट्यूमर की मात्रा शुरू में कम हो जाएगी लेकिन यह चिंता का कारण नहीं है। एक ट्यूमर को एक बार लिया जाना माना जाता है जब यह स्पष्ट हो जाता है और लगातार बढ़ने लगता है। - एक बार जब ट्यूमर बढ़ने लगते हैं, तो प्रति सप्ताह तीन बार ट्यूमर को मापें। कैलिपर के साथ ट्यूमर की लंबाई और चौड़ाई को मापें। सूत्र का उपयोग करके ट्यूमर की मात्रा की गणना करें: लंबाई x चौड़ाई x चौड़ाई /
- पीडीएक्स ट्यूमर के साथ प्रत्यारोपित चूहों को इच्छामृत्यु दें जब ट्यूमर के सबसे लंबे हिस्से का उपयोग करके ट्यूमर व्यास में 15 मिमी से अधिक होता है। सीओ 2 प्रेरण कक्ष में सीओ 2 साँस लेना द्वारा इच्छामृत्यु करें, इसके बाद एक माध्यमिक विधि के रूप में ग्रीवा अव्यवस्था।
- एक चीरा लगाकर और कुंद कैंची और बल के साथ ट्यूमर को धीरे से विच्छेदित करके जानवर के फ्लैंक से ट्यूमर को बाहर निकालें।
- ट्यूमर ऊतक को एक उपयुक्त भंडारण समाधान (जैसे डीएमईएम) के >10 एमएल में स्थानांतरित करें और फिर तुरंत बर्फ पर रखें।
- पीडीएक्स ट्यूमर का क्रायोप्रिजर्वेशन।
- पीडीएक्स ट्यूमर के साथ प्रत्यारोपित चूहों को इच्छामृत्यु दें जब ट्यूमर के सबसे लंबे हिस्से का उपयोग करके ट्यूमर व्यास में 15 मिमी से अधिक होता है। सीओ2 प्रेरण कक्ष में सीओ2 इनहेलेशन द्वारा इच्छामृत्यु करें, इसके बाद एक माध्यमिक विधि के रूप में ग्रीवा अव्यवस्था।
- एक चीरा लगाकर और कुंद कैंची और बल के साथ ट्यूमर को धीरे से विच्छेदित करके जानवर के फ्लैंक से ट्यूमर को बाहर निकालें।
- ट्यूमर ऊतक को एक उपयुक्त भंडारण समाधान (जैसे डीएमईएम) के >10 एमएल में स्थानांतरित करें और फिर तुरंत बर्फ पर रखें।
- ऊतक को एक ऊतक संस्कृति डिश में स्थानांतरित करें और 5 एमएल डीपीबीएस के साथ कुल्ला करें।
- ट्यूमर से नेक्रोटिक क्षेत्रों को हटा दें।
- ऊतक को लगभग 2 x 2 x 2 मिमी टुकड़ों में काटें।
- ऊतक को क्रायोट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 20% डीएमईएम, 70% एफबीएस और 10% डीएमएसओ शामिल हैं।
- क्रायोट्यूब को क्रायोप्रिजर्वेशन कंटेनर में स्थानांतरित करें और -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
- जब क्रायोट्यूब -80 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो जाता है, तो उन्हें तरल नाइट्रोजन भंडारण में स्थानांतरित करें।
2. प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए टीकाकरण मार्ग।
- चमड़े के नीचे फ्लैंक आरोपण।
नोट: चमड़े के नीचे फ्लैंक आरोपण का उपयोग आसानी से किया जा सकता है और मेटास्टैटिक कैस्केड के सभी चरणों का अध्ययन करने के लिए सहायक हो सकता है।- प्रारंभिक फ्लैंक आरोपण के लिए बढ़ते पीडीएक्स ट्यूमर या क्रायोप्रिजर्व्ड पीडीएक्स ट्यूमर का उपयोग करें।
- बढ़ते पीडीएक्स ट्यूमर के लिए, आईएसीयूसी-अनुमोदित विधि का उपयोग करके चूहों को इच्छामृत्यु दें जब ट्यूमर लंबाई में 15 मिमी से अधिक हो; ट्यूमर को बचाएं और ट्यूमर ऊतक को एक उपयुक्त भंडारण समाधान (जैसे डीएमईएम) में स्थानांतरित करें और तुरंत बर्फ पर रखें।
- क्रायोप्रिजर्व्ड पीडीएक्स ट्यूमर के लिए, क्रायोप्रिजर्व्ड पीडीएक्स ऊतक को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में डुबोकर जल्दी से पिघलाएं।
- चरण 1.2.2-1.2.19 का पालन करें।
- मस्तिष्क में इंट्राक्रैनील इंजेक्शन द्वारा ऑर्थोटोपिक आरोपण।
नोट: इस मॉडल का उपयोग बीबीबी को पार करने और ट्यूमर उपनिवेशीकरण का अध्ययन करने के लिए दवाओं की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। यह खंड मुख्य रूप से ट्यूमर पृथक्करण किट के उपयोग का संदर्भ देता है (देखें सामग्री की तालिका). विभिन्न ऊतक प्रकारों को अलग-अलग पृथक्करण प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। यह अनुशंसा की जाती है कि उपयोगकर्ता पृथक्करण दक्षता को अधिकतम करने के लिए प्रोटोकॉल का परीक्षण और अनुकूलन करें।- आईएसीयूसी-अनुमोदित विधि का उपयोग करके पीडीएक्स ट्यूमर के साथ प्रत्यारोपित चूहों को इच्छामृत्यु दें जब ट्यूमर लंबाई में 15 मिमी से अधिक हो।
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ परिस्थितियों में, शल्य चिकित्सा से पीडीएक्स ट्यूमर को बचाएं और बर्फ पर डीएमईएम में स्टोर करें।
- निर्माता के प्रोटोकॉल द्वारा इंगित डीएमईएम में एंजाइम मिश्रण जोड़कर उपयुक्त ट्यूब में पृथक्करण समाधान तैयार करें।
- एक ऊतक संवर्धन डिश में 5 एमएल डीपीबीएस में ट्यूमर धोएं।
- ट्यूमर से नेक्रोटिक क्षेत्रों को हटा दें।
- ट्यूमर को लंबाई में 2-4 मिमी के छोटे टुकड़ों में काटें।
- ट्यूमर के टुकड़ों को एंजाइम मिश्रण युक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- ट्यूब को ऊतक विघटनकर्ता से संलग्न करें और ऊतक प्रकार के लिए उपयुक्त कार्यक्रम चलाएं। उपयुक्त प्रोग्राम चलाने के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल से परामर्श करें, और आवश्यक पृथक्करण समय।
- कार्यक्रम के पूरा होने के बाद, 70 μm सेल छन्नी के माध्यम से कोशिकाओं को तनाव दें।
- डीएमईएम के 20 एमएल के साथ सेल छन्नी धो लें।
- विघटित कोशिकाओं को 7 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और डीपीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
- कोशिकाओं की गिनती करें और आवश्यक एकाग्रता को पतला करें।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम सेट करें और चूहों के लिए एक हीटिंग पैड तैयार करें। 70% इथेनॉल के साथ सभी क्षेत्रों को साफ करें।
- 2-5% आइसोफ्लुरेन और ऑक्सीजन के साथ एक प्रेरण कक्ष में जानवर को एनेस्थेटाइज करें। एक बार एनेस्थेटाइज्ड होने के बाद, निरंतर ऑक्सीजन की आपूर्ति के साथ 1.5-2.5% आइसोफ्लुरेन पर संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए जानवर को नाक शंकु में स्थानांतरित करें। पेडल रिफ्लेक्स की कमी के माध्यम से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें। सर्जरी के दौरान आंखों की सूखापन को रोकने के लिए पशु चिकित्सा नेत्र मरहम लागू करें। जब तक जानवर ठीक नहीं हो जाता तब तक प्रक्रिया के दौरान जानवर के लिए थर्मल समर्थन प्रदान करें।
- खोपड़ी को उजागर करने के लिए माउस के सिर पर फर को शेव करके सर्जिकल क्षेत्र तैयार करें।
- माउस को उपयुक्त एनाल्जेसिक प्रदान करें, जैसे कि चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा प्रशासित 1 मिलीग्राम / किग्रा ब्यूप्रेनोर्फिन निरंतर रिलीज (एसआर) की एक खुराक।
- माउस को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि माउस बाइट-ब्लॉक पर काट रहा है। माउस के सिर को मजबूती से सुरक्षित करने के लिए कान की सलाखों का उपयोग करें।
नोट: माउस ठीक से सुरक्षित है यदि बल के साथ धीरे से धक्का देने पर सिर नहीं हिलता है। - पोविडोन-आयोडीन और 70% इथेनॉल के तीन वैकल्पिक स्क्रब के साथ मुंडा क्षेत्र को कीटाणुरहित करें।
- खोपड़ी को उजागर करने और खोपड़ी को वापस लेने के लिए खोपड़ी पर 5-7 मिमी अनुदैर्ध्य चीरा लगाएं।
- पेरीओस्टेम को एक कुंद सर्जिकल उपकरण जैसे कि फोर्सप्स के साथ खुरचदें।
- खोपड़ी पर ब्रेग्मा का पता लगाएं।
- ब्रेग्मा के शीर्ष पर स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम की सुई रखें और निर्देशांक को 0 पर रीसेट करें या हाथ पर निर्देशांक को नोट करें।
- हाथ को 1 मिमी पीछे (पुच्छल) और 1 मिमी पार्श्व, मध्य रेखा के दाईं ओर ले जाएं।
- इस स्थान को स्थायी मार्कर से चिह्नित करें. यदि हाथ में सिरिंज के लिए एक स्लॉट है, तो स्थान को चिह्नित करने के लिए सिरिंज स्लॉट में एक मार्कर संलग्न करें।
- इस स्थान पर खोपड़ी में एक छोटा सा छेद ड्रिल करें। मस्तिष्क में ड्रिलिंग को रोकने के लिए बहुत अधिक दबाव लागू न करें।
- 1-2 μL की मात्रा में 5-10 x 104 कोशिकाओं के साथ 5 μL, 26 G हैमिल्टन सिरिंज लोड करें, और स्टीरियोटैक्सिक आर्म से संलग्न करें।
- धीरे-धीरे हैमिल्टन सिरिंज सुई को मस्तिष्क में 2 मिमी डालें।
- वांछित दर पर कोशिकाओं को इंजेक्ट करना शुरू करें, आमतौर पर 0.2-0.5 μL / min।
- इंजेक्शन पूरा होने के बाद, धीरे-धीरे मस्तिष्क से सुई को वापस ले लें।
- हड्डी के मोम के साथ बर्र छेद भरें।
- सर्जिकल सीवन या सर्जिकल गोंद के साथ चीरा बंद करें।
- माउस को वापस पिंजरे में स्थानांतरित करें और संज्ञाहरण से इसकी वसूली की निगरानी करें।
- जानवरों की स्थिति की नियमित रूप से निगरानी करें और अनुमोदित प्रोटोकॉल में मानवीय समापन बिंदु मानदंड तक पहुंचने पर उन्हें इच्छामृत्यु दें।
नोट: मस्तिष्क में सफल ट्यूमर वृद्धि के परिणामस्वरूप जानवर की बिगड़ती स्थिति होती है, जो अक्सर सिर झुकाव, खुरदरे बालों के कोट, झुके हुए शरीर, भेंगापन वाली आंखें, कम गतिविधि और कम शरीर की स्थिति स्कोर (बीसीएस < 2) के साथ प्रकट होती है। - इच्छामृत्यु वाले जानवरों पर एक नेक्रोपसी करें, इसके बाद मस्तिष्क में ट्यूमर की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण करें। इम्प्लांटेशन से लेकर इच्छामृत्यु तक लगने वाले समय की लंबाई रिकॉर्ड करें।
- इंट्राकार्डियक इंजेक्शन द्वारा पीडीएक्स मॉडल का आरोपण।
नोट: ट्यूमर कोशिकाओं के परिसंचरण में होने के बाद इस मॉडल का उपयोग अंग ट्रोपिज्म का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यह खंड ट्यूमर पृथक्करण किट का भी उपयोग करता है और ऊतक प्रकार द्वारा अनुकूलन की आवश्यकता होती है।- चरण 2.2.1-2.2.13 का पालन करें।
- 2-5% आइसोफ्लुरेन और ऑक्सीजन के साथ एक प्रेरण कक्ष में जानवर को एनेस्थेटाइज करें। एक बार एनेस्थेटाइज्ड होने के बाद, निरंतर ऑक्सीजन की आपूर्ति के साथ 1.5-2.5% आइसोफ्लुरेन पर संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए जानवर को नाक शंकु में स्थानांतरित करें। पेडल रिफ्लेक्स की कमी के माध्यम से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें। सर्जरी के दौरान आंखों की सूखापन को रोकने के लिए पशु चिकित्सा नेत्र मरहम लागू करें। जब तक जानवर ठीक नहीं हो जाता तब तक प्रक्रिया के दौरान जानवर के लिए थर्मल समर्थन प्रदान करें।
- फिर, माउस को लापरवाह स्थिति में रखें।
- छाती पर सर्जिकल क्षेत्र तैयार करने के लिए, फर को शेव करें और इसे पोविडोन-आयोडीन और 70% इथेनॉल के तीन वैकल्पिक स्क्रब के साथ कीटाणुरहित करें।
- 28 ग्राम सुई पर एक सिरिंज में 0.5-10 x 105 कोशिकाओं को 100 μL की मात्रा तक खींचें।
नोट: आवश्यक कोशिकाओं की संख्या मॉडल की आक्रामकता के आधार पर भिन्न होती है और प्रत्येक मॉडल के लिए कोशिकाओं की इष्टतम संख्या अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जानी चाहिए। - इंजेक्शन साइट का पता लगाएं (माउस के उरोस्थि के थोड़ा बाएं और स्टर्नल नॉच और ज़ाइफॉइड प्रक्रिया के बीच आधा रास्ता)।
- इंजेक्शन साइट पर माउस में लंबवत रूप से सुई डालें।
- सिरिंज में प्रवेश करने वाले रक्त के बैकफ्लो के माध्यम से बाएं वेंट्रिकल में सफल प्रवेश का निरीक्षण करें। धीरे-धीरे सुई को हिलाए बिना कोशिकाओं को बाएं वेंट्रिकल में वितरित करें।
- धीरे-धीरे सुई को माउस से लंबवत रूप से बाहर खींचें।
- इंजेक्शन साइट पर बाँझ धुंध का एक टुकड़ा लागू करें और रक्तस्राव बंद होने तक लगभग 1 मिनट के लिए दबाव लागू करें, जबकि अभी भी श्वसन के लिए छाती की गति की अनुमति दें।
- माउस को संज्ञाहरण से निकालें और इसे गर्म पैड पर ठीक होने दें।
नोट: सफल ट्यूमर विकास के परिणामस्वरूप जानवर की बिगड़ती स्थिति होती है, जो अक्सर उखड़े हुए बालों के कोट, झुके हुए शरीर, तिरछी आंखें, कम गतिविधि और कम शरीर की स्थिति स्कोर (बीसीएस < 2) के साथ प्रकट होती है। - जानवरों की स्थिति की नियमित रूप से निगरानी करें और अनुमोदित प्रोटोकॉल में मानवीय समापन बिंदु मानदंड तक पहुंचने पर उन्हें इच्छामृत्यु दें।
- इच्छामृत्यु वाले जानवरों पर मेटास्टेस की पहचान करने के लिए एक नेक्रोपसी करें, इसके बाद लक्ष्य अंग में ट्यूमर की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण करें। इंट्राकार्डियक इंजेक्शन से लेकर इच्छामृत्यु तक लगने वाले समय की लंबाई रिकॉर्ड करें।
Representative Results
फ्लैंक-प्रचारित पीडीएक्स ट्यूमर प्रत्यारोपण, निगरानी और बचाव के लिए सबसे आसान हैं, और आमतौर पर पीडीएक्स ट्यूमर की प्रारंभिक स्थापना और प्रसार के लिए अनुशंसित है (चित्रा 1)। पीडीएक्स ट्यूमर की स्थापना या प्रसार करते समय, कई जानवरों में ट्यूमर को प्रत्यारोपित करना समझदारी है, क्योंकि ट्यूमर लेने की दर अलग-अलग हो सकती है और ट्यूमर का हर टुकड़ा हमेशा चूहों में नहीं लेगा। मस्तिष्क13 में सीधे सीएनएस मेटास्टेसिस पीडीएक्स की स्थापना और प्रसार के लिए तरीके विकसित किए गए हैं। हालांकि, ये विधियां अभी भी कम टेक रेट के साथ अधिक चुनौतीपूर्ण हैं और ट्यूमर फ्लैंक आरोपण की तुलना में प्रचार और निगरानी करने के लिए काफी अधिक कठिन हैं।
यदि रोगी ट्यूमर आसानी से उपलब्ध नहीं हैं, तो सीएनएस मेटास्टेसिस पीडीएक्स ट्यूमर को विभिन्न स्रोतों से भी प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें अकादमिक प्रयोगशालाओं या वाणिज्यिक कंपनियों के भंडार शामिल हैं। ट्यूमर प्राप्त करने के बाद, पहली प्राथमिकता जितना संभव हो उतना सामग्री का प्रचार और क्रायोप्रिजर्व करना होगा, यह सुनिश्चित करना कि बड़ी संख्या में कम मार्ग ट्यूमर संरक्षित हैं। यह सुनिश्चित करता है कि पीडीएक्स मॉडल के साथ बाद के अध्ययनों की अनिश्चित संख्या के लिए पर्याप्त सामग्री उपलब्ध है। अमर सेल लाइनों की तरह, पीडीएक्स ट्यूमर को क्रायोसंरक्षित किया जाना चाहिए और कम मार्ग संख्या पर उपयोग किया जाना चाहिए, क्योंकि आनुवंशिक बहाव के परिणामस्वरूप समय12,14,15 के साथ पीडीएक्स के फेनोटाइप और जीनोटाइप में परिवर्तन होता है। पीडीएक्स ट्यूमर के स्रोत के बावजूद, मानव और माउस दोनों रोगजनकों के लिए पीडीएक्स और माउस कॉलोनियों की लगातार जांच करना महत्वपूर्ण है, जैसे कि मनुष्यों के लिए एचआईवी और हेपेटाइटिस और चूहों के लिए कोरिनेबैक्टीरियम बोविस। यह पीडीएक्स से अवांछित रोगजनकों के प्रसार को सीमित कर देगा, दोनों उन्हें संभालने वाले व्यक्ति और अध्ययन और विवेरियम में अन्य चूहों तक।
यहां वर्णित आरोपण विधियों का उपयोग ट्यूमर जीव विज्ञान का अध्ययन करने, मेटास्टैटिक कैस्केड के कई पहलुओं का मूल्यांकन करने और प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए किया जा सकता है। फ्लैंक आरोपण का मुख्य लाभ समय के साथ ट्यूमर की निगरानी में आसानी है, क्योंकि ट्यूमर दिखाई देते हैं, और इसकी वृद्धि को कैलिपर का उपयोग करके आसानी से मापा जा सकता है। यह विधि एक दवा लक्ष्य की व्यवहार्यता स्थापित करने के लिए शुरू करने के लिए एक अच्छी जगह हो सकती है। इंट्राक्रैनील आरोपण को प्राथमिकता दी जाती है यदि मस्तिष्क माइक्रोएन्वायरमेंट की उपस्थिति महत्वपूर्ण है और ट्यूमर के विकास या आणविक प्रोफ़ाइल को बदल सकती है। इसके अलावा, इंट्राक्रैनील आरोपण ट्यूमर को रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) के पीछे रखता है, जिससे बीबीबी को पार करने के लिए आवश्यक दवाओं की प्रभावकारिता की जांच करने वाले प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए यह आवश्यक हो जाता है। हालांकि, पीडीएक्स ट्यूमर के विकास की निगरानी करना मुश्किल है और कोशिकाओं को लेबल किए जाने पर रेडियोलॉजिकल इमेजिंग या बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग की आवश्यकता होती है। यह जानना कि दवा उपचार प्रीक्लिनिकल रूप से कब शुरू करना है, एक विशेष पीडीएक्स ट्यूमर वाले चूहों के विकास या औसत अस्तित्व के ज्ञान की निगरानी के लिए या तो इमेजिंग डेटा की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, इंट्राक्रैनील आरोपण मेटास्टैटिक कैस्केड के सभी आवश्यक चरणों को बाईपास करता है, जिससे यह केवल मस्तिष्क के भीतर दवा प्रभावकारिता और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है। ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में अंतर के बावजूद, पीडीएक्स ट्यूमर की आकृति विज्ञान आरोपण की साइट की परवाह किए बिना समान है जैसा कि मस्तिष्क मेटास्टेसिस से प्राप्त इस पीडीएक्स ट्यूमर (सीएम 04) में देखा जा सकता है जो एक छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर प्राथमिक ट्यूमर (चित्रा 2) से उत्पन्न हुआ है। छोटे नाभिक और अल्प साइटोप्लाज्म के साथ ट्यूमर कोशिकाओं की छोटी सेल फेफड़ों के कैंसर आकृति विज्ञान को फ्लैंक ट्यूमर, इंट्राक्रैनील ट्यूमर और पेट के मेटास्टेसिस में देखा जा सकता है जो इंट्राकार्डियक इंजेक्शन के परिणामस्वरूप होता है। इसके अलावा, फ्लैंक में प्रत्यारोपित ट्यूमर से सहज मेटास्टेसिस को पहले12 बार देखा गया है, यह सुझाव देते हुए कि मेटास्टैटिक प्रक्रियाओं जैसे कि इंट्रावेसन, एक्स्ट्रावेसन और कॉलोनाइजेशन को फ्लैंक ट्यूमर में पुन: व्यवस्थित और अध्ययन किया जा सकता है जो अन्यथा मस्तिष्क में ऑर्थोटोपिक ट्यूमर के साथ संभव नहीं होगा। सामान्य तौर पर, यह देखा गया है कि फ्लैंक आरोपण सीएनएस मेटास्टेसिस जीव विज्ञान का अध्ययन करने और प्रीक्लिनिकल अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त तरीका है।
इंट्राकार्डियक इंजेक्शन का उपयोग अक्सर अंग ट्रोपिज्म और ट्यूमर की मेटास्टैटिक क्षमता का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। इंजेक्शन ट्यूमर कोशिकाओं को मेटास्टैटिक कैस्केड के कई चरणों से गुजरना होगा, जिसमें जीवित परिसंचरण, बहिर्वाह और मेटास्टैटिक साइट का उपनिवेशीकरण शामिल है। मस्तिष्क में ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन की तरह, रेडियोलॉजिकल इमेजिंग या सेल लेबलिंग के बिना ट्यूमर मेटास्टेसिस की प्रगति को ट्रैक करना मुश्किल हो सकता है। हालांकि, ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के साथ, सफल टीकाकरण के परिणामस्वरूप समय के साथ जानवरों की स्थिति बिगड़ जाती है क्योंकि ट्यूमर फैलता है। चित्रा 3 ए सीएनएस मेटास्टेसिस पीडीएक्स मॉडल, एम 2 में इंट्राकार्डियक इंजेक्शन के बाद मस्तिष्क को मेटास्टेसिस प्रदर्शित करता है, जो मेलेनोमा से उत्पन्न हुआ है। पीडीएक्स ट्यूमर (सीएम 04) के इंट्राकार्डियक इंजेक्शन के परिणामस्वरूप पेट की गुहा और यकृत में मेटास्टेसिस हुआ (चित्रा 3 बी)। मूल्यांकन किए गए अन्य अंगों, जैसे फेफड़े, गुर्दे और अंडाशय में कोई दृश्य मेटास्टेस नहीं था।
चित्रा 1: प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए पीडीएक्स की स्थापना, प्रचार और उपयोग के सामान्य वर्कफ़्लो को दिखाने वाला फ्लो चार्ट। प्रत्येक टीकाकरण विधि के लिए, इसमें शामिल मेटास्टैटिक कैस्केड के चरण प्रत्येक विधि के नीचे सूचीबद्ध हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: विभिन्न टीकाकरण विधियों के बाद पीडीएक्स ट्यूमर की हिस्टोलॉजी। हेमटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) एक सीएनएस मेटास्टेसिस पीडीएक्स ट्यूमर का धुंधला होना जो छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (सीएम04) से उत्पन्न होता है, जो तीन तरीकों से इम्युनोकॉम्प्रोमाइज्ड चूहों में प्रत्यारोपित किया जाता है, छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर की समान ट्यूमर पैथोहिस्टोलॉजिकल और रूपात्मक विशेषताएं होती हैं, जिसमें छोटे नाभिक और अल्प साइटोप्लाज्म होते हैं। इंट्राकार्डियक इंजेक्शन पैनल पेट मेटास्टेसिस दिखाता है। छोटे आकार की कोशिकाओं और उच्च परमाणु से साइटोप्लाज्मिक अनुपात के घोंसले सभी तीन छवियों में स्पष्ट हैं। छवियों को स्लाइड स्कैनर पर लिया गया था और 10x तक बढ़ाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: इंट्राकार्डियक इंजेक्शन के बाद मेटास्टेस देखा गया। (ए) एम 2 और (बी) सीएम 04 के इंट्राकार्डियक इंजेक्शन के बाद नेक्रोपसी द्वारा मूल्यांकन के दौरान दिखाई देने वाले मेटास्टेसिस वाले ऊतकों का एच एंड ई धुंधलाहोना। छवियों को स्लाइड स्कैनर पर (ए) लिया गया था और 10 x आवर्धन पर एक नियमित माइक्रोस्कोप पर 1x (बाएं) या 20x (दाएं) या (B) तक बढ़ाया गया था। यह आंकड़ा हमारे पिछले प्रकाशन12 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
वर्तमान पांडुलिपि में, पीडीएक्स स्थापना और प्रसार के तरीकों का विस्तृत विवरण दिया गया है। सीएनएस मेटास्टेसिस का मूल्यांकन करते समय प्रीक्लिनिकल अध्ययन स्थापित करने के लिए उपयोग किए जा सकने वाले तीन अलग-अलग टीकाकरण विधियों का भी प्रदर्शन किया गया है। पसंद की विधि प्रयोग के लक्ष्यों पर निर्भर होनी चाहिए। कुछ मामलों में, एक से अधिक टीकाकरण मार्ग का उपयोग करना फायदेमंद होगा। उदाहरण के लिए, चमड़े के नीचे फ्लैंक आरोपण ट्यूमर के विकास पर दवा की प्रभावशीलता का अध्ययन करने और अपने लक्ष्य पर दवा का आकलन करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण प्रदान करता है और यह ट्यूमर के आकार के लिए एक दृश्य भी प्रदान करता है जिसे आसानी से निगरानी और मापा जाता है। हालांकि, एक बार लक्ष्य व्यवहार्यता और एंटी-ट्यूमर विकास गुण स्थापित हो जाने के बाद, बीबीबी को पार करने और मस्तिष्क ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर इसके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए जीवविज्ञान की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए एक ऑर्थोटोपिक अध्ययन स्थापित किया जा सकता है। इसके अलावा, ऑर्थोटोपिक और इंट्राकार्डियक इंजेक्शन अध्ययनों में उत्तरजीविता का बेहतर मूल्यांकन किया जाता है।
मस्तिष्क मेटास्टेसिस पीडीएक्स मॉडल का इंट्राक्रैनील इंजेक्शन अक्सर मस्तिष्क माइक्रोएन्वायरमेंट और बीबीबी की उपस्थिति के कारण पसंद का प्रीक्लिनिकल मॉडल होता है। हालांकि, अध्ययनों से पता चला है कि मस्तिष्क मेटास्टेस में बीबीबी को संशोधित करने की क्षमता होती है, जो ट्यूमर16 के अणुओं की पारगम्यता को प्रभावित करती है। बीबीबी में ये परिवर्तन इंट्राक्रैनील रूप से प्रत्यारोपित ट्यूमर द्वारा परिलक्षित नहीं होंगे, और इस वजह से प्रीक्लिनिकल दवा अध्ययन रोगी ट्यूमर की प्रतिक्रिया को पूरी तरह से प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं। इस चेतावनी के साथ भी, इंट्राक्रैनील इंजेक्शन प्रीक्लिनिकल मॉडल में बीबीबी को पार करने के लिए दवाओं की पारगम्यता और प्रभावकारिता का परीक्षण करने का सबसे अच्छा तरीका बना हुआ है। इंट्राक्रैनील मॉडल के साथ एक और चुनौती यह है कि वे ट्यूमर के विकास की निगरानी के लिए मुश्किल हैं और इमेजिंग तकनीकों के उपयोग की आवश्यकता होती है। फ्लोरोसेंट या बायोल्यूमिनेसेंट मार्करों के साथ पीडीएक्स का वायरल ट्रांसडक्शन पारंपरिक रूप से उपयोग किया जाता है लेकिन प्रदर्शन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। हालांकि, चूहों में उपयोग के लिए कई इमेजिंग तकनीकविकसित की जा रही हैं जिन्हें मार्करों की शुरूआत की आवश्यकता नहीं है, जो प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए इन ऑर्थोटोपिक ब्रेन ट्यूमर की निगरानी में आसानी में सुधार कर सकते हैं। इनमें चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) और पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) इमेजिंग और माइक्रो कंप्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रो-सीटी) जैसी इमेजिंग प्रौद्योगिकियां शामिल हैं। अंत में, इंट्राक्रैनील इंजेक्शन मस्तिष्क के बाहर सीएनएस मेटास्टेस के माइक्रोएन्वायरमेंट को सटीक रूप से प्रतिबिंबित नहीं कर सकता है, जैसे कि लेप्टोमेनिंगल मेटास्टेसिस में। इस मामले में, सिस्टर्ना मैग्ना में इंजेक्शन लेप्टोमेनिंगियल मेटास्टेस17 का अधिक सटीक प्रतिनिधित्व करने के लिए किया जा सकता है।
पीडीएक्स मॉडल के फेनोटाइपिक और आणविक विशेषताओं दोनों का लक्षण वर्णन प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए सर्वोत्तम मॉडल का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। ट्यूमर विलंबता 7-140 दिनों तक हो सकती है और लेने की दर भी अत्यधिक परिवर्तनशीलहो सकती है। प्रत्यारोपण के लिए जानवरों की इष्टतम संख्या और उपचार शुरू करने का समय प्रत्येक पीडीएक्स मॉडल की विशेषताओं पर आधारित होना चाहिए और इसे अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, पीडीएक्स ट्यूमर की आणविक प्रोफ़ाइल प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए सबसे अधिक प्रतिनिधि पीडीएक्स मॉडल के चयन के लिए भी महत्वपूर्ण है। मॉडल आणविक रूप से दाता ऊतक का प्रतिनिधित्व करता है, नैदानिक प्रतिक्रिया का अधिक पूर्वानुमान होने की संभावना है। इसके अलावा, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि मानव डेटा से चुने गए लक्ष्य अध्ययन के लिए चुने जा रहे पीडीएक्स में मौजूद हैं और कुछ पीढ़ियों के माध्यम से बनाए रखे जाते हैं, जैसा कि दिखाया गया है कि क्लोनल उत्तराधिकार मौजूदा प्रमुख क्लोन के एक अलग जीनोमिक प्रोफाइल से जुड़ा हुआ है। इसके प्रकाश में, सीएनएस मेटास्टेसिस पीडीएक्स ट्यूमर के फेनोटाइपिक और आणविक प्रोफाइल को कई पीढ़ियों में बड़े पैमाने परचित्रित किया गया है।
सीएनएस मेटास्टेसिस पीडीएक्स मॉडल का उपयोग करने के कई फायदों के बावजूद, उनके उपयोग से संबंधित कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, एक वैकल्पिक ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट और विशेष रूप से प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी पीडीएक्स मॉडल18 की अच्छी तरह से प्रलेखित सीमाएं हैं। चूहों में मानव ट्यूमर के जेनोग्राफ्ट के परिणामस्वरूप प्रत्येक बाद के मार्ग के साथ माउस स्ट्रोमा के साथ मानव स्ट्रोमा का प्रतिस्थापन होता है और मानव स्ट्रोमा को आम तौर पर कईमार्गों के बाद पूरी तरह से बदल दिया जाता है। हालांकि, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में अंतर के परिणामस्वरूप मूल रोगी ट्यूमर12 की तुलना में फ्लैंक-प्रत्यारोपित पीडीएक्स ट्यूमर के आणविक प्रोफ़ाइल में बड़े अंतर नहीं होते हैं, यह सुझाव देते हुए कि फ्लैंक मॉडल अभी भी सीएनएस मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए अच्छे प्रयोगात्मक मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं। दूसरा, इम्युनोकॉम्प्रोमाइज्ड जानवरों के उपयोग के परिणामस्वरूप ट्यूमर में प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ की कमी होती है और मेजबान द्वारा एक सामान्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया होती है, जिससे एक मौलिक तरीका सीमित हो जाता है जिसमें मेजबान कैंसरके विकास का मुकाबला करने का प्रयास करता है। जबकि मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ जुड़े मानवकृत चूहे ट्यूमर के साथ विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं की बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध हैं, फिर भीउन परिणामों के दृष्टिकोण, विधियों और व्याख्या के बारे में कई प्रश्न और विवाद हैं।
जबकि अधिकांश पीडीएक्स को आनुवंशिक रूप से स्थिर दिखाया गया है, हमने और अन्य लोगों ने दिखाया है कि दुर्लभ मामलों में, उपचार या अन्य बाहरी चयनात्मक दबावों की अनुपस्थिति में भी, ट्यूमर के क्लोन में परिवर्तन हो सकते हैं, जैसे कि मामूली क्लोन अधिग्रहण12,14,15। इसके परिणामस्वरूप आणविक प्रोफ़ाइल में नाटकीय परिवर्तन हो सकते हैं, जो अंततः ट्यूमर को रोगी ट्यूमर12 में प्रमुख क्लोन को प्रतिबिंबित नहीं करेगा। जबकि क्लोनल उत्तराधिकार प्रदर्शित करने वाले पीडीएक्स का उपयोग प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में किया जा सकता है, लक्ष्यीकरण के लिए अभिप्रेत कई जीन (जैसे, हर 2) क्लोनल उत्तराधिकार के साथ खो सकते हैं। इसलिए, यह निर्धारित करने के लिए पीडीएक्स मॉडल की लगातार स्क्रीनिंग को प्रोत्साहित किया जाता है कि क्या वे अभी भी वांछित क्लोन के आणविक प्रोफ़ाइल को बनाए रखते हैं।
सारांश में, पीडीएक्स मॉडल न केवल सीएनएस मेटास्टेसिस बल्कि अन्य ट्यूमर प्रकारों के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन मॉडलों को विकसित करने से पता चला है कि वे बड़े पैमाने पर मानव सीएनएस मेटास्टेसिस 8,9,10,12 के फेनोटाइपिक, आणविक प्रोफ़ाइल और विषमता को दर्शाते हैं। वे सीएनएस मेटास्टेसिस जीव विज्ञान दोनों का अध्ययन करने के लिए प्रभावी मॉडल के रूप में काम करते हैं और शारीरिक रूप से प्रासंगिक प्रीक्लिनिकल मॉडल के रूप में भी अच्छी तरह से काम करते हैं, जो ऐतिहासिक रूप से सीएनएस मेटास्टेसिस के विवो अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले अतिप्रयुक्त सेल लाइन मॉडल की जगह लेते हैं। निस्संदेह, पीडीएक्स और दाता रोगी ट्यूमर के बीच अंतर12,18 मौजूद है। यह जानना कि ये अंतर क्या हैं, प्रीक्लिनिकल अध्ययनों की उचित योजना और निष्पादन के लिए महत्वपूर्ण है। अंत में, कई टीकाकरण मार्गों के बीच चयन करके, पीडीएक्स मॉडल उनके उपयोग में बहुमुखी हैं जो रोग के कई पहलुओं के अध्ययन की अनुमति देते हैं। पीडीएक्स मॉडल निस्संदेह सीएनएस मेटास्टेसिस और उपन्यास चिकित्सा के विकास की हमारी समझ को आगे बढ़ाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाएंगे।
Disclosures
लेखकों के पास कोई खुलासा नहीं है।
Acknowledgments
चित्रा 3 ए हमारे पिछले प्रकाशन12 से लिया गया था और मेयो क्लिनिक में डॉ जेन सरकारिया की प्रयोगशाला में उत्पन्न किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25G needle | VWR | BD305122 | |
| 70 µm Cell strainer | VWR | 21008-952 | |
| 70% ethanol wipes | VWR | 470106-486 | |
| Bone wax | MedVet | W31G-RL | |
| CIEA NOG mouse | Taconic | NOG-F | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | |
| Ethiqa XR (buprenorphine SR) | MWI | 072117 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| gentleMACS C Tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi | 130-095-937 | |
| Hamilton syringe | Sigma | 20919 | |
| Matrigel growth factor reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Ophthalmic ointment | MedVet | PH-PURALUBE-VET | |
| PBS/DPBS | ThermoFisher | 14040133 | |
| Povidone iodine swabs | VWR | 15648-906 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical drill | Stoelting | 58610 | |
| Surgical glue | MedVet | VG3 | |
| Surgical sutures | MedVet | MMV-661-V | |
| Syringe | VWR | 53548-001 | |
| Tumor dissociation kit | Miltenyi | 130-095-929 |
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