Summary
Los modelos PDX de metástasis del sistema nervioso central representan las características fenotípicas y moleculares de la metástasis humana, lo que los convierte en excelentes modelos para estudios preclínicos. Aquí se describe cómo establecer modelos PDX y las rutas de inoculación que se utilizan mejor para estudios preclínicos.
Abstract
El desarrollo de nuevas terapias para la metástasis del sistema nervioso central (SNC) se ha visto obstaculizado por la falta de modelos preclínicos que representen con precisión la enfermedad. Se ha demostrado que los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) de metástasis del SNC representan mejor las características fenotípicas y moleculares de la enfermedad humana, así como reflejan mejor la heterogeneidad y la dinámica clonal de los tumores de pacientes humanos en comparación con los modelos históricos de líneas celulares. Existen múltiples sitios que se pueden utilizar para implantar tejido derivado del paciente al establecer ensayos preclínicos, cada uno con sus propias ventajas y desventajas, y cada uno adecuado para estudiar diferentes aspectos de la cascada metastásica. Aquí, el protocolo describe cómo establecer modelos PDX y presenta tres enfoques diferentes para utilizar modelos PDX de metástasis del SNC en estudios preclínicos, discutiendo cada una de sus aplicaciones y limitaciones. Estos incluyen implantación de flanco, inyección ortotópica en el cerebro e inyección intracardíaca. La implantación de flanco subcutáneo es la más fácil de controlar y, por lo tanto, la más conveniente para estudios preclínicos. Además, se observaron metástasis en el cerebro y otros tejidos de la implantación del flanco, lo que indica que el tumor ha sufrido múltiples pasos de metástasis, incluyendo intravasación, extravasación y colonización. La inyección ortotópica en el cerebro es la mejor opción para recapitular el microambiente del tumor cerebral y es útil para determinar la eficacia de los productos biológicos para cruzar la barrera hematoencefálica (BHE), pero evita la mayoría de los pasos de la cascada metastásica. La inyección intracardíaca facilita la metástasis en el cerebro y también es útil para estudiar el tropismo de órganos. Si bien este método renuncia a los pasos anteriores de la cascada metastásica, estas células aún tendrán que sobrevivir a la circulación, extravasarse y colonizar. La utilidad de un modelo PDX, por lo tanto, se ve afectada por la ruta de inoculación tumoral y la elección de cuál utilizar debe ser dictada por la cuestión científica y los objetivos generales del experimento.
Introduction
La incidencia de metástasis al sistema nervioso central (SNC) ha aumentado en los últimos años 1,2,3. Las terapias tradicionales para la metástasis del SNC, como la resección tumoral, la radioterapia cerebral completa y la radiocirugía estereotáctica, han sido en gran medida paliativas y rara vez curativas, y pueden provocar efectos secundarios debilitantes, como el deterioro cognitivo1. Recientemente, se están desarrollando muchas terapias nuevas dirigidas e inmunológicas para el tratamiento de la metástasis del SNC que se muestran prometedoras por ser tratamientos más efectivos, mientras que tienen menos efectos secundarios4.
Traducir los resultados preclínicos en criterios de valoración clínicos significativos a menudo requiere estrategias de modelado efectivas y predictivas. Históricamente, los modelos de xenoinjertos de línea celular fueron el estándar para la investigación preclínica en la investigación de metástasis del SNC. Sin embargo, estos modelos de líneas celulares no reflejan el verdadero comportamiento tumoral del tumor huésped ni representan la heterogeneidad histológica o molecular de la enfermedad. Además, los modelos de líneas celulares son capaces de adaptarse a las condiciones de crecimiento in vitro y, por lo tanto, pierden las propiedades originales del tumor huésped. Los xenoinjertos derivados del paciente (PDX), que injertan el tumor de un paciente en un ratón inmunodeficiente o humanizado, se utilizan cada vez más en la investigación traslacional del cáncer. Los investigadores han demostrado que los modelos PDX generalmente pueden recapitular fielmente el crecimiento tumoral, las características histológicas, mantener la heterogeneidad tumoral, el potencial metastásico y las características genéticas moleculares. Además, los modelos PDX son pronósticos, por lo que el período de latencia tumoral PDX se correlaciona con la supervivencia global del paciente y también se ha demostrado que predicen con precisión la respuesta terapéutica en ensayos con pacientes 5,6.
Ha habido una aparición de PDX de metástasis en el SNC. En su mayoría, estos se han desarrollado representando tumores originados en un solo origen, como el cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP)7, el cáncer de mama 8,9 y el melanoma 10,11. Más recientemente, se ha desarrollado y caracterizado una colección grande y diversa de modelos PDX, que representan ocho subtipos histológicos diferentes12. Se ha demostrado que los modelos PDX para metástasis del SNC se parecen mucho a su tumor original del paciente, tanto histológica como molecularmente y también han demostrado diferencias y similitudes histológicas únicas10,12. Además, aunque la mayoría de los modelos PDX de metástasis del SNC mantienen la heterogeneidad clonal de los tumores humanos, algunos mostraron evidencia de sucesión clonal12, lo que los hace también ideales para estudiar la resistencia a las terapias mediante el monitoreo de los cambios clonales después del tratamiento.
Los protocolos descritos aquí describen los métodos de establecimiento de PDX y varias vías de inoculación utilizadas en estudios preclínicos de metástasis del SNC (Figura 1). Estos métodos de implantación varían en su capacidad para imitar el crecimiento y la metástasis. Aquí, el protocolo destaca las aplicaciones para cada vía de implantación y demuestra cómo podrían usarse para el estudio de la metástasis del SNC.
Protocol
Los siguientes son una serie de protocolos paso a paso utilizados tanto para establecer modelos PDX mediante implantación de flanco subcutáneo como para establecer estudios preclínicos que permitan probar tratamientos, que pueden ayudar a evaluar los cambios biológicos y varios pasos de la cascada metastásica. Todos los estudios y modelos utilizaron ratones NOG hembra de 3-8 semanas de edad. Todas las muestras de tejido se recogieron bajo consentimiento informado de acuerdo con un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).
1. Establecimiento y propagación de modelos PDX por implantación de flancos
- Establecimiento de modelos PDX
- Después de la resección quirúrgica del tumor del paciente en la sala de operaciones, almacene los tejidos tumorales frescos en una solución adecuada (como DMEM) y colóquelos inmediatamente en hielo. Use un exceso de solución de almacenamiento (>10 ml) para asegurarse de que el tejido esté completamente sumergido.
- Transfiera el tejido a la placa de cultivo de tejidos y enjuague con 5 ml de DPBS.
NOTA: Este paso debe realizarse en un gabinete de bioseguridad utilizando técnicas asépticas. Se deben tomar precauciones usando equipo de protección personal (EPP) adecuado para protegerse contra posibles agentes infecciosos humanos. - Extirpar regiones necróticas del tumor.
NOTA: Esto se puede reconocer como una región blanda blanca hacia el centro del tejido. - Corte el tejido restante en trozos de aproximadamente 2 x 2 x 2 mm.
- Transfiera los tejidos a un tubo de microcentrífuga que contenga la matriz de membrana basal reducida del factor de crecimiento y almacénelos en hielo. Asegúrese de que se utiliza suficiente matriz de membrana basal (>200 μL) para sumergir completamente cada pieza de tejido.
- Criotpreservar los tejidos restantes que no se implantarán de acuerdo con el protocolo descrito en el paso 1.3.
- Anestesiar al animal en una cámara de inducción con 2-5% de isoflurano y oxígeno. Una vez anestesiado, transfiera el animal a un cono nasal para mantener la anestesia al 1,5-2,5% de isoflurano con un suministro continuo de oxígeno. Confirme la profundidad de la anestesia por falta de reflejo pedal. Aplique el ungüento oftálmico veterinario para prevenir la sequedad ocular durante la cirugía. Proporcionar soporte térmico al animal durante todo el procedimiento hasta que el animal se recupere.
- Identificar el sitio de implantación en el ratón.
NOTA: Esto debe estar en el flanco derecho o izquierdo del ratón, generalmente marcado lateralmente en el lado de la región abdominal, caudal a la caja torácica. - Para preparar el área quirúrgica, afeite el pelaje y desinfecte con tres exfoliantes alternados de povidona yodada y etanol al 70%.
- Usando fórceps, levante la piel del ratón y haga una incisión de 0.5-1 cm en la piel.
- Inserte un par de tijeras quirúrgicas lentamente debajo de la piel en el sitio de la incisión para crear un bolsillo (0.5-1 cm de profundidad) en el espacio subcutáneo.
- Coloque con cuidado una pieza tumoral en el bolsillo y empújela hacia el fondo del bolsillo para evitar que el tumor se salga.
- Cierre la incisión con suturas quirúrgicas de nylon 4-0.
NOTA: También se pueden utilizar otros métodos de cierre de heridas, como suturas no absorbibles o absorbibles y clips para heridas. - Transfiera el ratón de nuevo a la jaula y controle la recuperación del animal de la anestesia, hasta que sea ambulatorio.
NOTA: No se requieren analgésicos, pero se pueden administrar si se observa dolor en los ratones. - Controle el crecimiento del tumor semanalmente. Se espera un tumor por ratón.
NOTA: El volumen del tumor en el momento del trasplante parecerá disminuir inicialmente, pero esto no es motivo de preocupación. Se considera que un tumor se ha tomado una vez que se vuelve palpable y entra en una fase de crecimiento logarítmico. Este primer pasaje representa la generación F0. - Una vez que los tumores comiencen a crecer, mida los tumores tres veces por semana. Medir la longitud y anchura de los tumores con un calibrador. Para calcular el volumen del tumor, use la fórmula: largo x ancho x ancho / 2.
- Eutanasia a los ratones implantados con tumores PDX cuando los tumores tienen más de 15 mm de diámetro utilizando el lado más largo del tumor. Realizar la eutanasia por inhalación deCO2 en una cámara de inducción de CO2 , seguida de luxación cervical como método secundario.
- Reseque el tumor desde el flanco del animal haciendo una incisión. Diseccionar el tumor extirpado suavemente con tijeras romas y fórceps. Para hacer esto, primero corte la piel en la parte superior del tumor, luego corte el tumor lejos de la capa muscular debajo de él.
- Transfiera el tejido tumoral a >10 ml de una solución de almacenamiento adecuada (como DMEM). Colóquelo inmediatamente en hielo. Este tumor puede ser criopreservado o pasado a otro grupo de ratones. Considere este pasaje como F1.
NOTA: El paso de nuevo representaría el paso tumoral F2 y así sucesivamente.
- Propagación de modelos PDX
- Comience con el tumor resecado que se mantiene en solución de almacenamiento desde el paso 1.1.19.
- Transfiera el tejido a una placa de cultivo de tejidos y enjuague con 5 ml de DPBS.
- Extirpar las regiones necróticas del tumor.
- Corte el tejido en trozos de aproximadamente 2 x 2 x 2 mm.
- Transfiera los tejidos a un tubo de microcentrífuga que contenga la matriz de membrana basal reducida del factor de crecimiento (>200 μL) y guárdelos en hielo.
- Criotpreservar el tejido restante que no se utiliza para la propagación de acuerdo con el protocolo descrito en el paso 1.3.
- Anestesiar al animal en una cámara de inducción con 2-5% de isoflurano y oxígeno. Una vez anestesiado, transfiera el animal a un cono nasal para mantener la anestesia al 1,5-2,5% de isoflurano con un suministro continuo de oxígeno. Confirme la profundidad de la anestesia por falta de reflejo pedal. Aplique el ungüento oftálmico veterinario para prevenir la sequedad ocular durante la cirugía. Proporcionar soporte térmico al animal durante todo el procedimiento hasta que el animal se recupere.
- Identificar el sitio de implantación en el ratón.
NOTA: Este debe estar en el flanco derecho o izquierdo del ratón, generalmente en la región abdominal, caudal a la caja torácica. - Para preparar el área quirúrgica, afeite el pelaje y desinfecte con tres exfoliantes alternados de povidona yodada y etanol al 70%.
- Haga una incisión de 0.5-1 cm en un flanco del ratón.
- Inserte un par de tijeras quirúrgicas lentamente debajo de la piel en la incisión para crear un bolsillo (0.5-1 cm de profundidad) en el espacio subcutáneo.
- Coloque con cuidado una pieza tumoral en el bolsillo y empújela hacia el fondo del bolsillo para evitar que el tumor se salga.
- Cierre la incisión con suturas quirúrgicas de nylon 4-0 u otros métodos de cierre de heridas.
- Transfiera el ratón de nuevo a la jaula y controle su recuperación de la anestesia, hasta que sea ambulatorio.
NOTA: No se requieren analgésicos, pero se pueden administrar si se observa dolor en los ratones. - Durante la latencia (fase sin crecimiento), monitoree el crecimiento del tumor semanalmente. Se espera un tumor por ratón.
NOTA: El volumen del tumor en el momento del trasplante parecerá disminuir inicialmente, pero esto no es motivo de preocupación. Se considera que un tumor se toma una vez que se vuelve palpable y comienza a crecer continuamente. - Una vez que los tumores comiencen a crecer, mida los tumores tres veces por semana. Medir la longitud y anchura de los tumores con un calibrador. Calcule el volumen del tumor utilizando la fórmula: largo x ancho x ancho / 2.
- Eutanasia a los ratones implantados con tumores PDX cuando los tumores tienen más de 15 mm de diámetro utilizando el lado más largo del tumor. Realizar eutanasia por inhalación de CO2 en una cámara de inducción de CO2, seguida de luxación cervical como método secundario.
- Reseque el tumor desde el flanco del animal haciendo una incisión y diseccionando el tumor suavemente con tijeras romas y fórceps.
- Transfiera el tejido tumoral a >10 ml de una solución de almacenamiento adecuada (como DMEM) y luego colóquelo inmediatamente en hielo.
- Criopreservación de tumores PDX
- Eutanasia a los ratones implantados con tumores PDX cuando los tumores tienen más de 15 mm de diámetro utilizando el lado más largo del tumor. Realizar eutanasia por inhalación deCO2 en una cámara de inducción de CO2 , seguida de luxación cervical como método secundario.
- Reseque el tumor desde el flanco del animal haciendo una incisión y diseccionando el tumor suavemente con tijeras romas y fórceps.
- Transfiera el tejido tumoral a >10 ml de una solución de almacenamiento adecuada (como DMEM) y luego colóquelo inmediatamente en hielo.
- Transfiera el tejido a una placa de cultivo de tejidos y enjuague con 5 ml de DPBS.
- Extirpar regiones necróticas del tumor.
- Corte el tejido en trozos de aproximadamente 2 x 2 x 2 mm.
- Transfiera el tejido a criotubos que contengan 20% de DMEM, 70% de FBS y 10% de DMSO.
- Transfiera los criotubos a un recipiente de criopreservación y colóquelos en un congelador a -80 °C.
- Cuando los criotubos se enfríen a -80 °C, transfiéralos al almacenamiento de nitrógeno líquido.
2. Vías de inoculación para estudios preclínicos
- Implantación subcutánea del flanco.
NOTA: La implantación del flanco subcutáneo se puede utilizar para facilitar y puede ser útil para estudiar todos los pasos de la cascada metastásica.- Usar tumores PDX en crecimiento o tumores PDX criopreservados para la implantación inicial del flanco.
- Para el crecimiento de tumores PDX, eutanasia a los ratones utilizando un método aprobado por IACUC cuando los tumores tienen más de 15 mm de longitud; resecar el tumor y transferir el tejido tumoral a una solución de almacenamiento adecuada (como DMEM) e inmediatamente colocarlo en hielo.
- Para los tumores PDX criopreservados, descongele rápidamente el tejido PDX criopreservado sumergiéndolo en un baño maría a 37 °C.
- Siga los pasos 1.2.2-1.2.19.
- Implantación ortotópica por inyección intracraneal en el cerebro.
NOTA: Este modelo se puede utilizar para probar la eficacia de los fármacos para cruzar la barrera hematoencefálica y para estudiar la colonización tumoral. Esta sección hace referencia principalmente al uso del kit de disociación tumoral (consulte Tabla de materiales). Diferentes tipos de tejidos requieren diferentes protocolos de disociación. Se recomienda que el usuario pruebe y optimice el protocolo para maximizar la eficiencia de la disociación.- Eutanasia a los ratones implantados con tumores PDX utilizando un método aprobado por IACUC cuando los tumores tienen más de 15 mm de longitud.
- En condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad, reseque quirúrgicamente los tumores PDX y guárdelos en DMEM en hielo.
- Prepare la solución de disociación en el tubo apropiado agregando la mezcla de enzimas en DMEM como lo indica el protocolo del fabricante.
- Lave el tumor en 5 ml de DPBS en una placa de cultivo de tejidos.
- Extirpar las regiones necróticas del tumor.
- Corte el tumor en trozos pequeños de 2-4 mm de longitud.
- Transfiera las piezas tumorales al tubo que contiene la mezcla enzimática.
- Conecte el tubo al disociador de tejido y ejecute el programa adecuado para el tipo de tejido. Consulte el protocolo del fabricante para conocer el programa adecuado para ejecutarse y el tiempo de disociación requerido.
- Después de completar el programa, colar las células a través de un filtro de células de 70 μm.
- Lave el colador celular con 20 ml de DMEM.
- Centrifugar las células disociadas a 300 x g durante 7 min.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en DPBS.
- Contar las células y diluir a la concentración requerida.
- Configure el marco estereotáxico de acuerdo con las instrucciones del fabricante y prepare una almohadilla térmica para los ratones. Desinfecte todas las áreas con etanol al 70%.
- Anestesiar al animal en una cámara de inducción con 2-5% de isoflurano y oxígeno. Una vez anestesiado, transfiera el animal a un cono nasal para mantener la anestesia al 1,5-2,5% de isoflurano con un suministro continuo de oxígeno. Confirme la profundidad de la anestesia por falta de reflejo pedal. Aplique el ungüento oftálmico veterinario para prevenir la sequedad ocular durante la cirugía. Proporcionar soporte térmico al animal durante todo el procedimiento hasta que el animal se recupere.
- Prepare el área quirúrgica afeitando el pelaje en la cabeza del ratón para exponer el cuero cabelludo.
- Proporcionar al ratón el analgésico adecuado, como una dosis de 1 mg/kg de buprenorfina de liberación sostenida (RS) administrada por inyección subcutánea.
- Transfiera el ratón al marco estereotáxico. Asegúrese de que el ratón está mordiendo el bloque de mordida. Use las barras para los oídos para asegurar firmemente la cabeza del mouse.
NOTA: El ratón está bien asegurado si la cabeza no se mueve cuando se empuja suavemente con fórceps. - Desinfecte el área afeitada con tres exfoliantes alternos de povidona yodada y etanol al 70%.
- Haga una incisión longitudinal de 5-7 mm en el cuero cabelludo para exponer el cráneo y retraer el cuero cabelludo.
- Raspa el periostio con un instrumento quirúrgico contundente como fórceps.
- Localiza el bregma en el cráneo.
- Coloque la aguja del marco estereotáctico en la parte superior del bregma y restablezca las coordenadas a 0 o observe la coordenada en el brazo.
- Mueva el brazo 1 mm posterior (caudalmente) y 1 mm lateral, a la derecha de la línea media.
- Marque esta ubicación con un marcador permanente. Si el brazo contiene una ranura para la jeringa, coloque un marcador en la ranura de la jeringa para marcar la ubicación.
- Perfore un pequeño orificio de rebaba en el cráneo en este lugar. No aplique demasiada presión para evitar la perforación en el cerebro.
- Cargue una jeringa Hamilton de 5 μL y 26 g con 5-10 x 104 células , en un volumen de 1-2 μL, y conéctela al brazo estereotáxico.
- Inserte lentamente la aguja de la jeringa Hamilton 2 mm en el cerebro.
- Comience a inyectar células a la velocidad deseada, generalmente 0.2-0.5 μL / min.
- Después de completar la inyección, retraiga lentamente la aguja del cerebro.
- Llene el orificio de rebabas con cera ósea.
- Cierre la incisión con suturas quirúrgicas o pegamento quirúrgico.
- Transfiera el ratón de nuevo a la jaula y controle su recuperación de la anestesia.
- Monitorear la condición de los animales regularmente y sacrificarlos cuando se alcancen los criterios de criterio de valoración humanitario en el protocolo aprobado.
NOTA: El crecimiento exitoso del tumor en el cerebro resulta en el deterioro de la condición del animal, que a menudo se manifiesta con inclinación de la cabeza, pelaje áspero, cuerpo encorvado, ojos entrecerrados, actividad reducida y baja puntuación de condición corporal (BCS < 2). - Realizar una necropsia en los animales sacrificados, seguida de un análisis histológico para confirmar la presencia de tumores en el cerebro. Registre el tiempo que lleva desde la implantación hasta la eutanasia.
- Implantación de modelos PDX por inyección intracardíaca
NOTA: Este modelo se puede utilizar para estudiar el tropismo de órganos una vez que las células tumorales están en circulación. Esta sección también utiliza el kit de disociación tumoral y requiere optimización por tipo de tejido.- Siga los pasos 2.2.1-2.2.13.
- Anestesiar al animal en una cámara de inducción con 2-5% de isoflurano y oxígeno. Una vez anestesiado, transfiera el animal a un cono nasal para mantener la anestesia al 1,5-2,5% de isoflurano con un suministro continuo de oxígeno. Confirme la profundidad de la anestesia por falta de reflejo pedal. Aplique el ungüento oftálmico veterinario para prevenir la sequedad ocular durante la cirugía. Proporcionar soporte térmico al animal durante todo el procedimiento hasta que el animal se recupere.
- Luego, coloque el mouse en posición supina.
- Para preparar el área quirúrgica en el pecho, afeite el pelaje y desinfectarlo con tres exfoliantes alternos de povidona yodada y etanol al 70%.
- Extraiga 0,5-10 x 105 células en una jeringa con una aguja de 28 G, hasta un volumen de 100 μL.
NOTA: El número de celdas requeridas varía dependiendo de la agresividad del modelo y el número óptimo de celdas debe determinarse empíricamente para cada modelo. - Localice el lugar de inyección (ligeramente a la izquierda del esternón del ratón y a medio camino entre la muesca esternal y el proceso xifoide).
- Inserte la aguja verticalmente en el ratón en el lugar de la inyección.
- Observe la entrada exitosa en el ventrículo izquierdo a través de un reflujo de sangre que ingresa a la jeringa. Dispense lentamente las células en el ventrículo izquierdo sin mover la aguja.
- Tire lentamente de la aguja verticalmente del ratón.
- Aplique un trozo de gasa estéril sobre el lugar de la inyección y aplique presión durante aproximadamente 1 minuto hasta que el sangrado se detenga, mientras permite el movimiento del pecho para respirar.
- Retire el ratón de la anestesia y permita que se recupere en una almohadilla caliente.
NOTA: El crecimiento exitoso del tumor resulta en el deterioro de la condición del animal, que a menudo se manifiesta con pelaje erizado, cuerpo encorvado, ojos entrecerrados, actividad reducida y baja puntuación de condición corporal (BCS < 2). - Monitorear la condición de los animales regularmente y sacrificarlos cuando se alcancen los criterios de criterio de valoración humanitario en el protocolo aprobado.
- Realizar una necropsia para identificar metástasis en los animales sacrificados, seguida de un análisis histológico para confirmar la presencia de tumores en el órgano diana. Registre el tiempo que transcurre desde la inyección intracardíaca hasta la eutanasia.
Representative Results
Los tumores PDX propagados por el flanco son los más fáciles de implantar, monitorear y resecar, y generalmente se recomiendan para el establecimiento inicial y la propagación de los tumores PDX (Figura 1). Al establecer o propagar tumores PDX, es prudente implantar tumores en varios animales, ya que la tasa de toma de tumores puede variar y no todas las piezas del tumor siempre se tomarán en ratones. Se han desarrollado métodos para el establecimiento y propagación de PDX de metástasis del SNC directamente en el cerebro13. Sin embargo, estos métodos son aún más desafiantes con tasas de toma más bajas y los tumores son significativamente más difíciles de propagar y monitorear que la implantación de flancos.
Si los tumores de los pacientes no están fácilmente disponibles, los tumores PDX de metástasis del SNC también se pueden obtener de una variedad de fuentes, incluidos repositorios de laboratorios académicos o compañías comerciales. Después de adquirir los tumores, la primera prioridad sería propagar y criopreservar la mayor cantidad de material posible, asegurando que se conserve un gran número de tumores de paso bajo. Esto asegura que haya suficiente material disponible para un número indefinido de estudios posteriores con los modelos PDX. Al igual que las líneas celulares inmortalizadas, los tumores PDX deben ser criopreservados y utilizados en números de paso bajos, ya que la deriva genética resulta en cambios en el fenotipo y genotipo de las PDX a lo largo del tiempo12,14,15. Independientemente de la fuente de los tumores PDX, es importante realizar exámenes frecuentes de PDX y colonias de ratones para detectar patógenos humanos y de ratón, como el VIH y la hepatitis para humanos y Corynebacterium bovis para ratones. Esto limitará la propagación de patógenos no deseados desde el PDX tanto al individuo que los maneja como a otros ratones en el estudio y el vivero.
Los métodos de implantación descritos aquí se pueden utilizar para estudiar la biología del tumor, evaluar múltiples aspectos de la cascada metastásica y para estudios preclínicos. La principal ventaja de la implantación de flancos es la facilidad de monitoreo del tumor a lo largo del tiempo, ya que los tumores son visibles y su crecimiento se puede medir fácilmente con un calibrador. Este método puede ser un buen lugar para comenzar a establecer la viabilidad de un objetivo farmacológico. Se prefiere la implantación intracraneal si la presencia del microambiente cerebral es importante y podría alterar el crecimiento o el perfil molecular del tumor. Además, la implantación intracraneal coloca el tumor detrás de la barrera hematoencefálica (BHE), por lo que es esencial para los estudios preclínicos que examinan la eficacia de los fármacos necesarios para atravesar la BHE. Sin embargo, es difícil monitorear el crecimiento de los tumores PDX y requiere imágenes radiológicas o bioluminiscentes si las células están marcadas. Saber cuándo comenzar el tratamiento farmacológico preclínicamente requeriría datos de imágenes para monitorear el crecimiento o el conocimiento de la supervivencia promedio de ratones portadores de un tumor PDX en particular. Además, la implantación intracraneal evita todos los pasos esenciales de la cascada metastásica, por lo que solo es adecuada para estudiar la eficacia del fármaco y el microambiente tumoral dentro del cerebro. A pesar de las diferencias en el microambiente tumoral, la morfología de los tumores PDX es similar independientemente del sitio de implantación como se puede observar en este tumor PDX (CM04) derivado de una metástasis cerebral que se originó a partir de un tumor primario de cáncer de pulmón de células pequeñas (Figura 2). La morfología del cáncer de pulmón de células pequeñas de las células tumorales con núcleos pequeños y citoplasma escaso se puede observar en el tumor del flanco, el tumor intracraneal y la metástasis abdominal resultante de la inyección intracardíaca. Además, se han observado previamente metástasis espontáneas de tumores implantados en el flanco12, lo que sugiere que los procesos metastásicos como la intravasación, la extravasación y la colonización pueden ser recapitulados y estudiados en tumores del flanco que de otro modo no serían posibles con tumores ortotópicos en el cerebro. En general, se observa que la implantación de flanco es un método adecuado para estudiar la biología de la metástasis del SNC y realizar estudios preclínicos.
La inyección intracardíaca se usa con mayor frecuencia para estudiar el tropismo orgánico y el potencial metastásico de los tumores. Las células tumorales inyectadas tendrían que someterse a varios pasos de la cascada metastásica, incluida la circulación sobreviviente, la extravasación y la colonización del sitio metastásico. Al igual que la inyección ortotópica en el cerebro, puede ser difícil rastrear el progreso de la metástasis tumoral sin imágenes radiológicas o etiquetado celular. Sin embargo, al igual que con la implantación ortotópica, la inoculación exitosa resulta en el deterioro de la condición de los animales con el tiempo a medida que el tumor se disemina. La Figura 3A demuestra metástasis al cerebro después de la inyección intracardíaca en el modelo PDX de metástasis del SNC, M2, que se originó a partir de un melanoma. La inyección intracardíaca del tumor PDX (CM04) produjo metástasis en la cavidad abdominal y el hígado (figura 3B). Otros órganos evaluados, como el pulmón, el riñón y los ovarios, no tenían metástasis visibles.
Figura 1: Diagrama de flujo que muestra el flujo de trabajo general de establecimiento, propagación y uso de PDX para estudios preclínicos. Para cada método de inoculación, los pasos de la cascada metastásica involucrada se enumeran debajo de cada método. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Histología de los tumores PDX siguiendo diferentes métodos de inoculación. La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de un tumor PDX de metástasis en el SNC que se originó a partir de cáncer de pulmón de células pequeñas (CM04) implantado en ratones inmunocomprometidos por los tres métodos tiene características patohistológicas y morfológicas tumorales similares a las de los cánceres de pulmón de células pequeñas, con núcleos pequeños y citoplasma escaso. El panel de inyección intracardíaca muestra una metástasis abdominal. Nidos de células de pequeño tamaño y alta proporción nuclear a citoplasmática es evidente en las tres imágenes. Las imágenes se tomaron en un escáner de diapositivas y se ampliaron a 10x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Metástasis observadas después de la inyección intracardíaca. Tinción H&E de tejidos con metástasis visibles durante la evaluación por necropsia después de la inyección intracardíaca de (A) M2 y (B) CM04. Las imágenes se tomaron (A) en un escáner de diapositivas y se ampliaron a 1x (izquierda) o 20x (derecha) o (B) en un microscopio regular con un aumento de 10x. Esta cifra ha sido modificada de nuestra publicación anterior12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
En el presente manuscrito, se han detallado los métodos para el establecimiento y propagación de PDX. También se han demostrado tres métodos de inoculación diferentes que se pueden utilizar para establecer estudios preclínicos al evaluar la metástasis del SNC. El método de elección debe depender de los objetivos del experimento. En algunos casos, sería beneficioso utilizar más de una vía de inoculación. Por ejemplo, la implantación del flanco subcutáneo proporciona un enfoque simple para estudiar la efectividad de un fármaco en el crecimiento tumoral y evaluar el fármaco en su objetivo y también proporciona una imagen del tamaño del tumor que se controla y mide fácilmente. Sin embargo, una vez que se establecen la viabilidad del objetivo y las propiedades antitumorales, se podría establecer un estudio ortotópico para evaluar la eficacia del biológico para cruzar la barrera hematoencefálica y estudiar su efecto dentro del microambiente del tumor cerebral. Además, la supervivencia se evalúa mejor en estudios ortotópicos e intracardíacos de inyección.
La inyección intracraneal de los modelos PDX de metástasis cerebral es a menudo el modelo preclínico de elección debido a la presencia del microambiente cerebral y la barrera hematoencefálica. Sin embargo, los estudios han demostrado que las metástasis cerebrales tienen la capacidad de modificar la barrera hematoencefálica, lo que afecta la permeabilidad de las moléculas al tumor16. Estos cambios en la barrera hematoencefálica no se reflejarían en tumores implantados intracranealmente, y debido a esto los estudios preclínicos de fármacos pueden no reflejar completamente la respuesta de los tumores de los pacientes. Incluso con esta advertencia, la inyección intracraneal sigue siendo el mejor método para probar la permeabilidad y eficacia de los fármacos para cruzar la barrera hematoencefálica en modelos preclínicos. Otro desafío con los modelos intracraneales es que son difíciles para monitorear el crecimiento tumoral y requieren el uso de técnicas de imagen. La transducción viral de PDX con marcadores fluorescentes o bioluminiscentes se ha utilizado tradicionalmente, pero puede ser difícil de realizar. Sin embargo, se están desarrollando varias técnicas de imagen para su uso en ratones que no requieren la introducción de marcadores, lo que podría mejorar la facilidad de monitoreo de estos tumores cerebrales ortotópicos para estudios preclínicos. Estos incluyen tecnologías de imagen como imágenes de resonancia magnética (MRI) y tomografía por emisión de positrones (PET) y tomografía microcomputarizada (micro-CT). Finalmente, la inyección intracraneal puede no reflejar con precisión el microambiente de las metástasis del SNC fuera del cerebro, como en la metástasis leptomeníngea. En este caso, la inyección en la cisterna magna podría realizarse para representar con mayor precisión las metástasis leptomeníngeas17.
La caracterización de las características fenotípicas y moleculares del modelo PDX es importante para seleccionar los mejores modelos para estudios preclínicos. La latencia tumoral puede variar de 7 a 140 días y las tasas de toma también pueden ser muy variables12. El número óptimo de animales a implantar y el momento para comenzar el tratamiento tendrían que basarse en las características de cada modelo PDX y deben determinarse empíricamente. Además, el perfil molecular de los tumores PDX también es importante para la selección de los modelos PDX más representativos para estudios preclínicos. Cuanto más cerca represente molecularmente el modelo el tejido donante, más predictivo de la respuesta clínica es probable que sea. Además, es fundamental garantizar que los objetivos seleccionados a partir de datos humanos estén presentes en las PDX que se eligen para los estudios y se mantengan a lo largo de unas pocas generaciones, como se muestra que la sucesión clonal está asociada con un perfil genómico diferente del clon dominante establecido. A la luz de esto, los perfiles fenotípicos y moleculares de los tumores PDX de metástasis del SNC han sido ampliamente caracterizados a lo largo de múltiples generaciones12.
A pesar de las muchas ventajas de usar modelos PDX de metástasis del SNC, existen varias limitaciones relacionadas con su uso. En primer lugar, un microambiente tumoral alternativo y especialmente la falta de un sistema inmune son limitaciones bien documentadas de los modelos PDX18. El xenoinjerto de un tumor humano en ratones resulta en el reemplazo del estroma humano con estroma de ratón con cada pasaje posterior y el estroma humano generalmente se reemplaza por completo después de varios pasajes19. Sin embargo, las diferencias en el microambiente tumoral no dan lugar a grandes diferencias en el perfil molecular de los tumores PDX implantados en el flanco en comparación con el tumor original del paciente12, lo que sugiere que los modelos de flanco todavía representan buenos modelos experimentales para estudiar la metástasis del SNC. En segundo lugar, el uso de animales inmunocomprometidos resulta en una falta de infiltración de células inmunes en el tumor y una respuesta inmune general por parte del huésped, limitando una forma fundamental en que el huésped intenta combatir el crecimiento del cáncer12. Si bien los ratones humanizados injertados con células inmunes humanas están disponibles para estudiar las interacciones de células inmunes específicas con el tumor, todavía hay muchas preguntas y controversias sobre los enfoques, métodos e interpretación de esos resultados20.
Si bien se ha demostrado que la mayoría de las PDX son genéticamente estables, nosotros y otros hemos demostrado que en casos raros, incluso en ausencia de tratamientos u otras presiones selectivas externas, podría haber cambios en los clones de los tumores, como la adquisición de clones menores12,14,15. Esto podría resultar en cambios dramáticos en el perfil molecular, lo que en última instancia haría que el tumor no reflejara los clones dominantes en el tumor del paciente12. Si bien las PDX que muestran sucesión clonal pueden tener uso en estudios preclínicos, muchos genes destinados a la focalización (por ejemplo, Her2) podrían perderse con la sucesión clonal. Por lo tanto, se recomienda la detección frecuente de modelos PDX para determinar si aún mantienen el perfil molecular del clon deseado.
En resumen, los modelos PDX representan un excelente sistema modelo para el estudio no solo de la metástasis del SNC sino también de otros tipos de tumores. El desarrollo de estos modelos ha demostrado que reflejan en gran medida el perfil fenotípico, molecular y la heterogeneidad de la metástasis del SNC humano 8,9,10,12. Sirven como modelos efectivos para estudiar tanto la biología de la metástasis del SNC como los modelos preclínicos fisiológicamente relevantes, reemplazando los modelos de líneas celulares utilizados en exceso históricamente utilizados para estudios in vivo de metástasis del SNC. Sin duda, existen diferencias entre el PDX y el tumor del paciente donante12,18. Saber cuáles son estas diferencias es importante para la planificación y ejecución adecuadas de los estudios preclínicos. Por último, al elegir entre varias vías de inoculación, los modelos PDX son versátiles en su uso permitiendo el estudio de múltiples aspectos de la enfermedad. Los modelos PDX sin duda jugarán un papel importante en el avance de nuestra comprensión de la metástasis del SNC y el desarrollo de nuevas terapias.
Disclosures
Los autores no tienen revelaciones.
Acknowledgments
La figura 3A fue tomada de nuestra publicación anterior12 y fue generada en el laboratorio del Dr. Jann Sarkaria en la Clínica Mayo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25G needle | VWR | BD305122 | |
| 70 µm Cell strainer | VWR | 21008-952 | |
| 70% ethanol wipes | VWR | 470106-486 | |
| Bone wax | MedVet | W31G-RL | |
| CIEA NOG mouse | Taconic | NOG-F | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | |
| Ethiqa XR (buprenorphine SR) | MWI | 072117 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| gentleMACS C Tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi | 130-095-937 | |
| Hamilton syringe | Sigma | 20919 | |
| Matrigel growth factor reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Ophthalmic ointment | MedVet | PH-PURALUBE-VET | |
| PBS/DPBS | ThermoFisher | 14040133 | |
| Povidone iodine swabs | VWR | 15648-906 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical drill | Stoelting | 58610 | |
| Surgical glue | MedVet | VG3 | |
| Surgical sutures | MedVet | MMV-661-V | |
| Syringe | VWR | 53548-001 | |
| Tumor dissociation kit | Miltenyi | 130-095-929 |
References
- Cruz-Munoz, W., Kerbel, R. S. Preclinical approaches to study the biology and treatment of brain metastases. Seminars in Cancer Biology. 21 (2), 123-130 (2011).
- Owonikoko, T. K., et al. Current approaches to the treatment of metastatic brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 11 (4), 203-222 (2014).
- Salhia, B., et al. Integrated genomic and epigenomic analysis of breast cancer brain metastasis. PLoS One. 9 (1), 85448 (2014).
- Kotecha, R., Gondi, V., Ahluwalia, M. S., Brastianos, P. K., Mehta, M. P.
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Klinghammer, K., et al. A comprehensively characterized large panel of head and neck cancer patient-derived xenografts identifies the mTOR inhibitor everolimus as potential new treatment option. International Journal of Cancer. 136 (12), 2940-2948 (2015).
- Lee, H. W., et al. Patient-derived xenografts from non-small cell lung cancer brain metastases are valuable translational platforms for the development of personalized targeted therapy. Clincal Cancer Research: An Official journal of the American Association of Cancer Research. 21 (5), 1172-1182 (2015).
- Ni, J., et al. Combination inhibition of PI3K and mTORC1 yields durable remissions in mice bearing orthotopic patient-derived xenografts of HER2-positive breast cancer brain metastases. Nature Medicine. 22 (7), 723-726 (2016).
- Oshi, M., et al. Novel breast cancer brain metastasis patient-derived orthotopic xenograft model for preclinical studies. Cancers (Basel). 12 (2), 444 (2020).
- Garman, B., et al. Genetic and genomic characterization of 462 melanoma patient-derived xenografts, tumor biopsies, and cell lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al. A comprehensive patient-derived xenograft collection representing the heterogeneity of melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Tew, B. Y., et al. Patient-derived xenografts of central nervous system metastasis reveal expansion of aggressive minor clones. Neuro-Oncology. 22 (1), 70-83 (2020).
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Davies, N. J., et al. Dynamic changes in clonal cytogenetic architecture during progression of chronic lymphocytic leukemia in patients and patient-derived murine xenografts. Oncotarget. 8 (27), 44749-44760 (2017).
- Eirew, P., et al. Dynamics of genomic clones in breast cancer patient xenografts at single-cell resolution. Nature. 518 (7539), 422-426 (2015).
- Arvanitis, C. D., Ferraro, G. B., Jain, R. K. The blood-brain barrier and blood-tumour barrier in brain tumours and metastases. Nature Reviews. Cancer. 20 (1), 26-41 (2020).
- Choi, S., et al. In vivo bioluminescence imaging for leptomeningeal dissemination of medulloblastoma in mouse models. BMC Cancer. 16 (1), 723 (2016).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Bradford, J. R., et al. Whole transcriptome profiling of patient-derived xenograft models as a tool to identify both tumor and stromal specific biomarkers. Oncotarget. 7 (15), 20773-20787 (2016).
- Yip, H., Haupt, C., Maresh, G., Zhang, X., Li, L. Humanized mice for immune checkpoint blockade in human solid tumors. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (5), 313-320 (2019).
