Summary
PDX-modeller för metastaser i centrala nervsystemet representerar fenotypiska och molekylära egenskaper hos humana metastaser, vilket gör dem till utmärkta modeller för prekliniska studier. Här beskrivs hur man etablerar PDX-modeller och de inokuleringsvägar som bäst används för prekliniska studier.
Abstract
Utvecklingen av nya terapier för metastaser i centrala nervsystemet (CNS) har hindrats av bristen på prekliniska modeller som exakt representerar sjukdomen. Patienthärledda xenograftmodeller (PDX) av CNS-metastaser har visat sig bättre representera de fenotypiska och molekylära egenskaperna hos den mänskliga sjukdomen, samt bättre återspegla heterogeniteten och klondynamiken hos mänskliga patienttumörer jämfört med historiska cellinjemodeller. Det finns flera platser som kan användas för att implantera vävnad från patient vid inrättande av prekliniska prövningar, var och en med sina egna fördelar och nackdelar, och var och en lämpad för att studera olika aspekter av den metastatiska kaskaden. Här beskriver protokollet hur man etablerar PDX-modeller och presenterar tre olika tillvägagångssätt för att använda PDX-modeller med CNS-metastaser i prekliniska studier, där man diskuterar var och en av deras tillämpningar och begränsningar. Dessa inkluderar flankimplantation, ortotopisk injektion i hjärnan och intrakardiell injektion. Subkutan flankimplantation är lättast att övervaka och därför mest lämplig för prekliniska studier. Dessutom observerades metastaser till hjärnan och andra vävnader från flankimplantation, vilket indikerar att tumören har genomgått flera steg av metastaser, inklusive intravasering, extravasering och kolonisering. Ortotopisk injektion i hjärnan är det bästa alternativet för att rekapitulera hjärntumörmikromiljön och är användbar för att bestämma effekten av biologiska läkemedel för att korsa blod-hjärnbarriären (BBB) men kringgår de flesta stegen i metastaseringskaskaden. Intrakardiell injektion underlättar metastaser till hjärnan och är också användbar för att studera organtropism. Medan denna metod avstår från tidigare steg i den metastatiska kaskaden, måste dessa celler fortfarande överleva cirkulationen, extravasera och kolonisera. Nyttan av en PDX-modell påverkas därför av vägen för tumörinokulering och valet av vilken som ska användas bör dikteras av den vetenskapliga frågan och experimentets övergripande mål.
Introduction
Incidensen av metastaser till centrala nervsystemet (CNS) har ökat de senaste åren 1,2,3. Traditionella terapier för CNS-metastaser, såsom tumörresektion, strålbehandling av hela hjärnan och stereotaktisk strålkirurgi, har till stor del varit palliativa och sällan botande och kan leda till försvagande biverkningar, såsom kognitiv försämring1. Nyligen utvecklas många nya riktade och immunologiska terapier för behandling av CNS-metastaser som visar löfte om att vara effektivare behandlingar, samtidigt som de har färre biverkningar4.
Att översätta prekliniska resultat till meningsfulla kliniska effektmått kräver ofta effektiva och prediktiva modelleringsstrategier. Historiskt sett var cellinjexenograftmodeller standarden för preklinisk forskning inom CNS-metastasforskning. Dessa cellinjemodeller återspeglar emellertid inte värdtumörens sanna tumörbeteende eller representerar sjukdomens histologiska eller molekylära heterogenitet. Dessutom kan cellinjemodeller anpassa sig till tillväxtförhållanden in vitro och förlorar därför värdtumörens ursprungliga egenskaper. Patienthärledda xenotransplantat (PDX), som transplanterar en patients tumör i en immunbristfällig eller humaniserad mus, används alltmer i translationell cancerforskning. Forskare har visat att PDX-modeller vanligtvis troget kan rekapitulera tumörtillväxt, histologiska egenskaper, upprätthålla tumörheterogenitet, metastatisk potential och molekylärgenetiska egenskaper. Dessutom är PDX-modeller prognostiska där PDX-tumörlatensperioden korrelerar med patientens totala överlevnad och de har också visat sig exakt förutsäga terapeutiskt svar i patientstudier 5,6.
Det har skett en uppkomst av CNS-metastaser PDX. För det mesta har dessa utvecklats som representerar tumörer som härrör från ett enda ursprung, såsom icke-småcellig lungcancer (NSCLC)7, bröstcancer8,9 och melanom10,11. På senare tid har en stor och mångsidig samling PDX-modeller utvecklats och karakteriserats, som representerar åtta olika histologiska subtyper12. Det har visats att PDX-modeller för CNS-metastaser liknar deras ursprungliga patienttumör, både histologiskt och molekylärt, och har också visat histologiska unika skillnader och likheter10,12. Dessutom, medan de flesta CNS-metastaser PDX-modeller upprätthåller den klonala heterogeniteten hos humana tumörer, visade vissa bevis på klonal succession12, vilket gör dem också idealiska för att studera resistens mot terapier genom att övervaka klonala förändringar efter behandling.
De protokoll som beskrivs här beskriver metoder för PDX-etablering och olika inokuleringsvägar som används i prekliniska studier av CNS-metastaser (figur 1). Dessa implantationsmetoder varierar i deras förmåga att efterlikna tillväxt och metastaser. Här belyser protokollet applikationerna för varje implantationsväg och visar hur de kan användas för studier av CNS-metastaser.
Protocol
Följande är en serie steg-för-steg-protokoll som används för att både etablera PDX-modeller genom subkutan flankimplantation och för att inrätta prekliniska studier som möjliggör testning av behandlingar, vilket kan hjälpa till att bedöma biologiska förändringar och olika steg i metastaseringskaskaden. Alla studier och modeller använde 3-8 veckor gamla kvinnliga NOG-möss. Alla vävnadsprover samlades in under informerat samtycke i enlighet med ett protokoll som godkänts av Institutional Review Board (IRB). Alla djurförsök utfördes i enlighet med ett IACUC-godkänt protokoll (Institutional Animal Care and Use Committee).
1. Etablering och förökning av PDX-modeller genom flankimplantation
- Etablering av PDX-modeller
- Efter kirurgisk resektion av tumören från patienten i operationssalen, förvara de färska tumörvävnaderna i en lämplig lösning (t.ex. DMEM) och placera den omedelbart på is. Använd ett överskott av lagringslösning (>10 ml) för att säkerställa att vävnaden är helt nedsänkt.
- Överför vävnad till vävnadsodlingsskålen och skölj med 5 ml DPBS.
OBS: Detta steg ska utföras i ett biosäkerhetsskåp med aseptisk teknik. Försiktighetsåtgärder bör vidtas genom att bära lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) för att skydda mot eventuella smittämnen hos människor. - Ta bort nekrotiska regioner från tumören.
OBS: Detta kan kännas igen som en vit grumlig region mot mitten av vävnaden. - Skär den återstående vävnaden i cirka 2 x 2 x 2 mm bitar.
- Överför vävnaderna till ett mikrocentrifugrör som innehåller tillväxtfaktorreducerad basalmembranmatris och förvara dem på is. Se till att tillräcklig basalmembranmatris (>200 μL) används för att helt nedsänka varje vävnadsbit.
- Kryobevara de återstående vävnaderna som inte kommer att implanteras enligt protokollet som beskrivs i steg 1.3.
- Bedöva djuret i en induktionskammare med 2-5% isofluran och syre. När det är bedövat, överför djuret till en noskon för att upprätthålla anestesi vid 1,5-2,5% isofluran med kontinuerlig syretillförsel. Bekräfta anestesidjupet via brist på pedalreflex. Applicera den veterinära oftalmiska salvan för att förhindra ögontorrhet under operationen. Ge termiskt stöd till djuret under hela proceduren tills djuret återhämtar sig.
- Identifiera implantationsstället på musen.
OBS: Detta bör vara på musens högra eller vänstra flank, i allmänhet landmärkt i sidled på sidan av bukregionen, caudal till bröstkorgen. - För att förbereda det kirurgiska området, raka pälsen och desinficera med tre alternerande skrubbar av povidonjod och 70% etanol.
- Använd pincett, lyft musens hud och gör ett snitt på 0,5-1 cm på huden.
- Sätt långsamt in en kirurgisk sax under huden vid snittstället för att skapa en ficka (0,5-1 cm djup) i det subkutana utrymmet.
- Placera försiktigt en tumörbit i fickan och tryck den, tryck den till botten av fickan för att förhindra att tumören glider ut.
- Stäng snittet med 4-0 nylonkirurgiska suturer.
OBS: Andra sårförslutningsmetoder såsom icke-absorberbara eller absorberbara suturer och sårklämmor kan också användas. - Överför musen tillbaka till buret och övervaka djurets återhämtning från anestesi tills det är ambulerande.
OBS: Analgetika krävs inte men kan administreras om smärta observeras hos mössen. - Övervaka tumörtillväxten varje vecka. En tumör förväntas per mus.
OBS: Tumörens volym vid transplantation verkar initialt minska men detta är inte en anledning till oro. En tumör anses ha tagit när den blir palpabel och går in i en logaritmisk tillväxtfas. Denna första passage representerar F0-generationen. - När tumörerna börjar växa, mäta tumörerna tre gånger per vecka. Mät tumörernas längd och bredd med en bromsok. För att beräkna tumörens volym, använd formeln: längd x bredd x bredd / 2.
- Avliva mössen implanterade med PDX-tumörer när tumörerna är större än 15 mm i diameter med tumörens längsta sida. Utför eutanasi genom CO 2-inandning i en CO2-induktionskammare, följt av cervikal dislokation som en sekundär metod.
- Resektera tumören från djurets flank genom att göra ett snitt. Dissekera den utskurna tumören försiktigt med trubbig sax och pincett. För att göra detta, först skära av huden ovanpå tumören och skär sedan tumören bort från muskelskiktet under den.
- Överför tumörvävnaden till >10 ml av en lämplig lagringslösning (t.ex. DMEM). Placera den omedelbart på is. Denna tumör kan kryokonserveras eller överföras till en annan uppsättning möss. Betrakta denna passage som F1.
OBS: Att passera igen skulle göra tumörpassagen F2 och så vidare.
- Förökning av PDX-modeller
- Börja med den resekterade tumören som förvaras i förvaringslösning från steg 1.1.19.
- Överför vävnaden till en vävnadsodlingsskål och skölj med 5 ml DPBS.
- Ta bort de nekrotiska regionerna från tumören.
- Skär vävnaden i ca 2 x 2 x 2 mm bitar.
- Överför vävnaderna till ett mikrocentrifugrör som innehåller tillväxtfaktorreducerad basalmembranmatris (>200 μL) och förvara på is.
- Kryokonservera den återstående vävnaden som inte används för förökning enligt protokollet som beskrivs i steg 1.3.
- Bedöva djuret i en induktionskammare med 2-5% isofluran och syre. När det är bedövat, överför djuret till en noskon för att upprätthålla anestesi vid 1,5-2,5% isofluran med kontinuerlig syretillförsel. Bekräfta anestesidjupet via brist på pedalreflex. Applicera den veterinära oftalmiska salvan för att förhindra ögontorrhet under operationen. Ge termiskt stöd till djuret under hela proceduren tills djuret återhämtar sig.
- Identifiera implantationsstället på musen.
OBS: Detta bör vara på musens högra eller vänstra flank, vanligtvis i bukregionen, kaudal till bröstkorgen. - För att förbereda det kirurgiska området, raka pälsen och desinficera med tre alternerande skrubbar av povidonjod och 70% etanol.
- Gör ett snitt på 0,5-1 cm på musens ena flank.
- Sätt långsamt in en kirurgisk sax under huden vid snittet för att skapa en ficka (0,5-1 cm djup) i det subkutana utrymmet.
- Placera försiktigt en tumörbit i fickan och tryck den till botten av fickan för att förhindra att tumören glider ut.
- Stäng snittet med 4-0 nylonkirurgiska suturer eller andra sårförslutningsmetoder.
- Överför musen tillbaka till buret och övervaka dess återhämtning från anestesi tills den är ambulerande.
OBS: Analgetika krävs inte men kan administreras om smärta observeras hos mössen. - Under latens (icke-tillväxtfas), övervaka tumörtillväxten varje vecka. En tumör förväntas per mus.
OBS: Tumörens volym vid transplantation verkar initialt minska men detta är inte en anledning till oro. En tumör anses tas när den blir påtaglig och börjar ständigt växa. - När tumörerna börjar växa, mäta tumörerna tre gånger per vecka. Mät tumörernas längd och bredd med en bromsok. Beräkna tumörens volym med formeln: längd x bredd x bredd / 2.
- Avliva mössen implanterade med PDX-tumörer när tumörerna är större än 15 mm i diameter med tumörens längsta sida. Utför eutanasi genom CO2-inandning i en CO2-induktionskammare, följt av cervikal dislokation som en sekundär metod.
- Resektera tumören från djurets flank genom att göra ett snitt och dissekera tumören försiktigt med trubbig sax och pincett.
- Överför tumörvävnaden till >10 ml av en lämplig lagringslösning (t.ex. DMEM) och lägg sedan omedelbart på is.
- Kryokonservering av PDX-tumörer
- Avliva mössen implanterade med PDX-tumörer när tumörerna är större än 15 mm i diameter med tumörens längsta sida. Utför eutanasi genom CO 2-inandning i en CO2-induktionskammare, följt av cervikal dislokation som en sekundär metod.
- Resektera tumören från djurets flank genom att göra ett snitt och dissekera tumören försiktigt med trubbig sax och pincett.
- Överför tumörvävnaden till >10 ml av en lämplig lagringslösning (t.ex. DMEM) och lägg sedan omedelbart på is.
- Överför vävnaden till en vävnadsodlingsskål och skölj med 5 ml DPBS.
- Ta bort nekrotiska regioner från tumören.
- Skär vävnaden i ca 2 x 2 x 2 mm bitar.
- Överför vävnaden till kryorör innehållande 20% DMEM, 70% FBS och 10% DMSO.
- Överför kryorören till en kryokonserveringsbehållare och placera i en frys på -80 °C.
- När kryorören kyls till -80 °C, överför dem till lagring av flytande kväve.
2. Inokuleringsvägar för prekliniska studier
- Subkutan flankimplantation.
OBS: Subkutan flankimplantation kan användas för enkelhet och kan vara till hjälp för att studera alla steg i metastaserad kaskade.- Använd växande PDX-tumörer eller kryokonserverade PDX-tumörer för initial flankimplantation.
- För odling av PDX-tumörer, avliva mössen med en IACUC-godkänd metod när tumörerna är längre än 15 mm; resektera tumören och överför tumörvävnaden till en lämplig lagringslösning (t.ex. DMEM) och placera omedelbart på is.
- För kryokonserverade PDX-tumörer, tina den kryokonserverade PDX-vävnaden snabbt genom nedsänkning i 37 ° C vattenbad.
- Följ stegen 1.2.2-1.2.19.
- Ortotopisk implantation genom intrakraniell injektion i hjärnan.
OBS: Denna modell kan användas för att testa effekten av läkemedel för att korsa BBB och för att studera tumörkolonisering. Detta avsnitt refererar främst till användningen av tumördissociationssatsen (se Tabell över material). Olika vävnadstyper kräver olika dissociationsprotokoll. Det rekommenderas att användaren testar och optimerar protokollet för att maximera dissociationseffektiviteten.- Avliva mössen implanterade med PDX-tumörer med en IACUC-godkänd metod när tumörerna är längre än 15 mm.
- Under sterila förhållanden i ett biosäkerhetsskåp, kirurgiskt resektera PDX-tumörerna och förvara i DMEM på is.
- Bered dissociationslösningen i lämpligt rör genom att tillsätta enzymblandningen i DMEM enligt tillverkarens protokoll.
- Tvätta tumören i 5 ml DPBS i en vävnadsodlingsskål.
- Ta bort de nekrotiska regionerna från tumören.
- Skär tumören i små bitar av 2-4 mm i längd.
- Överför tumörbitarna i röret som innehåller enzymblandningen.
- Fäst röret på vävnadsdissociatorn och kör det program som är lämpligt för vävnadstypen. Se tillverkarens protokoll för lämpligt program att köra och den dissociationstid som krävs.
- Efter avslutat program, sila cellerna genom en 70 μm cellsil.
- Tvätta cellsilen med 20 ml DMEM.
- Centrifugera de dissocierade cellerna vid 300 x g i 7 minuter.
- Aspirera supernatanten och suspendera cellerna i DPBS.
- Räkna cellerna och späd till önskad koncentration.
- Ställ in den stereotaxiska ramen enligt tillverkarens instruktioner och förbered en värmedyna för mössen. Sanera alla områden med 70% etanol.
- Bedöva djuret i en induktionskammare med 2-5% isofluran och syre. När det är bedövat, överför djuret till en noskon för att upprätthålla anestesi vid 1,5-2,5% isofluran med kontinuerlig syretillförsel. Bekräfta anestesidjupet via brist på pedalreflex. Applicera den veterinära oftalmiska salvan för att förhindra ögontorrhet under operationen. Ge termiskt stöd till djuret under hela proceduren tills djuret återhämtar sig.
- Förbered det kirurgiska området genom att raka pälsen på musens huvud för att exponera hårbotten.
- Ge musen lämpligt smärtstillande medel, såsom en dos på 1 mg/kg buprenorfin depottabletter (SR) administrerat som subkutan injektion.
- Överför musen till den stereotaxiska ramen. Se till att musen biter på bettblocket. Använd öronstängerna för att säkra musens huvud ordentligt.
Musen är ordentligt säkrad om huvudet inte rör sig när det trycks försiktigt med pincett. - Desinficera det rakade området med tre alternerande skrubbar av povidonjod och 70% etanol.
- Gör ett 5-7 mm längsgående snitt i hårbotten för att exponera skallen och dra tillbaka hårbotten.
- Skrapa bort periosteum med ett trubbigt kirurgiskt instrument som pincett.
- Leta reda på bregma på skallen.
- Placera nålen på den stereotaktiska ramen ovanpå bregma och återställ koordinaterna till 0 eller notera koordinaten på armen.
- Flytta armen 1 mm bakom (kaudalt) och 1 mm i sidled, höger om mittlinjen.
- Markera den här platsen med en permanent markör. Om armen innehåller en öppning för sprutan, fäst en markör på sprutspåret för att markera platsen.
- Borra ett litet borrhål i skallen på denna plats. Använd inte för mycket tryck för att förhindra borrning i hjärnan.
- Ladda en 5 μL, 26 G Hamilton spruta med 5-10 x 104 celler, i en volym på 1-2 μL, och fäst på stereotaxarmen.
- För långsamt in Hamiltons sprutnål 2 mm i hjärnan.
- Börja injicera celler med önskad hastighet, vanligtvis 0,2-0,5 μl/min.
- När injektionen är klar, dra långsamt tillbaka nålen från hjärnan.
- Fyll borrhålet med benvax.
- Stäng snittet med kirurgiska suturer eller kirurgiskt lim.
- Överför musen tillbaka till buret och övervaka dess återhämtning från anestesi.
- Övervaka djurens tillstånd regelbundet och avliva dem när kriterierna för humana slutpunkter har uppnåtts i det godkända protokollet.
OBS: Framgångsrik tumörtillväxt i hjärnan resulterar i djurets försämrade tillstånd, vilket ofta manifesterar sig med huvudlutning, grov hårrock, böjd kropp, kisade ögon, minskad aktivitet och låg kroppskondition (BCS < 2). - Utför en obduktion på de avlivade djuren, följt av histologisk analys för att bekräfta förekomsten av tumörer i hjärnan. Anteckna hur lång tid det tar från implantation till eutanasi.
- Implantation av PDX-modeller genom intrakardiell injektion
OBS: Denna modell kan användas för att studera organtropism när tumörceller är i omlopp. Detta avsnitt använder också Tumor Dissociation Kit och kräver optimering efter vävnadstyp.- Följ stegen 2.2.1-2.2.13.
- Bedöva djuret i en induktionskammare med 2-5% isofluran och syre. När det är bedövat, överför djuret till en noskon för att upprätthålla anestesi vid 1,5-2,5% isofluran med kontinuerlig syretillförsel. Bekräfta anestesidjupet via brist på pedalreflex. Applicera den veterinära oftalmiska salvan för att förhindra ögontorrhet under operationen. Ge termiskt stöd till djuret under hela proceduren tills djuret återhämtar sig.
- Placera sedan musen i ryggläge.
- För att förbereda det kirurgiska området på bröstet, raka pälsen och desinficera den med tre alternerande scrubs av povidonjod och 70% etanol.
- Dra 0,5-10 x 105 celler i en spruta på en 28 G nål, upp till en volym på 100 μl.
OBS: Antalet celler som krävs varierar beroende på modellens aggressivitet och det optimala antalet celler bör bestämmas empiriskt för varje modell. - Leta reda på injektionsstället (något till vänster om musens bröstben och halvvägs mellan bröstskåran och xyphoidprocessen).
- För in nålen vertikalt i musen på injektionsstället.
- Observera det framgångsrika inträdet i vänster kammare genom ett återflöde av blod som kommer in i sprutan. Fördela långsamt cellerna i vänster kammare utan att flytta nålen.
- Dra långsamt ut nålen vertikalt från musen.
- Applicera en bit steril gasväv över injektionsstället och tryck i cirka 1 minut tills blödningen upphör, samtidigt som bröströrelsen fortfarande kan andas.
- Ta bort musen från anestesi och låt den återhämta sig på en uppvärmd dyna.
OBS: Framgångsrik tumörtillväxt resulterar i försämrat tillstånd hos djuret, vilket ofta manifesterar sig med rufsig hårrock, böjd kropp, kisade ögon, minskad aktivitet och låg kroppskondition poäng (BCS < 2). - Övervaka djurens tillstånd regelbundet och avliva dem när kriterierna för humana slutpunkter har uppnåtts i det godkända protokollet.
- Utför en obduktion för att identifiera metastaser på de avlivade djuren, följt av histologisk analys för att bekräfta förekomsten av tumörer i målorganet. Registrera hur lång tid det tar från intrakardiell injektion till eutanasi.
Representative Results
Flankförökade PDX-tumörer är lättast att implantera, övervaka och resektera, och rekommenderas generellt för initial etablering och förökning av PDX-tumörer (figur 1). Vid etablering eller förökning av PDX-tumörer är det klokt att implantera tumörer i flera djur, eftersom tumörhastigheten kan variera och inte varje tumörbit alltid tar in möss. Metoder har utvecklats för etablering och förökning av CNS-metastaser PDX direkt i hjärnan13. Dessa metoder är dock fortfarande mer utmanande med lägre intagshastigheter och tumörerna är betydligt svårare att sprida och övervaka än flankimplantation.
Om patienttumörer inte är lättillgängliga kan CNS-metastaser PDX-tumörer också erhållas från en mängd olika källor, inklusive arkiv av akademiska laboratorier eller kommersiella företag. Efter att ha förvärvat tumörerna skulle den första prioriteten vara att sprida och kryokonservera så mycket material som möjligt, vilket säkerställer att ett stort antal tumörer med låg passage bevaras. Detta säkerställer att tillräckligt med material finns tillgängligt för ett obestämt antal efterföljande studier med PDX-modellerna. I likhet med odödliga cellinjer bör PDX-tumörer kryokonserveras och användas vid låga passager, eftersom genetisk drifting resulterar i förändringar i fenotypen och genotypen av PDX över tiden12,14,15. Oavsett källan till PDX-tumörer är det viktigt att utföra frekvent screening av PDX- och muskolonier för både humana och muspatogener, såsom HIV och hepatit för människor och Corynebacterium bovis för möss. Detta kommer att begränsa spridningen av oönskade patogener från PDX till både individen som hanterar dem och andra möss i studien och vivarium.
Implantationsmetoderna som beskrivs här kan användas för att studera tumörbiologi, utvärdera flera aspekter av den metastaserande kaskaden och för prekliniska studier. Den största fördelen med flankimplantation är den enkla tumörövervakningen över tiden, eftersom tumörer är synliga och dess tillväxt lätt kan mätas med hjälp av en bromsok. Denna metod kan vara ett bra ställe att börja för att fastställa genomförbarheten av ett läkemedelsmål. Intrakraniell implantation föredras om närvaron av hjärnans mikromiljö är viktig och kan förändra tumörens tillväxt eller molekylära profil. Dessutom placerar intrakraniell implantation tumören bakom blod-hjärnbarriären (BBB), vilket gör det viktigt för prekliniska studier som undersöker effekten av läkemedel som krävs för att korsa BBB. Det är dock svårt att övervaka tillväxten av PDX-tumörer och kräver radiologisk avbildning eller bioluminescerande avbildning om cellerna är märkta. Att veta när läkemedelsbehandlingen ska påbörjas prekliniskt skulle kräva antingen bilddata för att övervaka tillväxt eller kunskap om genomsnittlig överlevnad hos möss som bär en viss PDX-tumör. Dessutom kringgår intrakraniell implantation alla väsentliga steg i den metastatiska kaskaden, vilket gör den endast lämplig för att studera läkemedelseffektivitet och tumörmikromiljö i hjärnan. Trots skillnaderna i tumörmikromiljön är morfologin hos PDX-tumörer likartad oavsett implantationsstället, vilket kan ses i denna PDX-tumör (CM04) härledd från en hjärnmetastas som härstammar från en primärtumör i småcellig lungcancer (figur 2). Den småcelliga lungcancermorfologin hos tumörceller med små kärnor och knapp cytoplasma kan observeras i flanktumören, intrakraniell tumör och bukmetastaser som härrör från intrakardiell injektion. Vidare har spontan metastasering från tumörer implanterade i flanken tidigare observerats12, vilket tyder på att de metastatiska processerna såsom intravasation, extravasering och kolonisering kan rekapituleras och studeras i flanktumörer som annars inte skulle vara möjliga med ortotopiska tumörer i hjärnan. I allmänhet observeras att flankimplantation är en lämplig metod för att studera CNS-metastasbiologi och genomföra prekliniska studier.
Intrakardiell injektion används oftast för att studera organtropism och metastatisk potential hos tumörer. Injicerade tumörceller skulle behöva genomgå flera steg i den metastatiska kaskaden, inklusive överlevande cirkulation, extravasering och kolonisering av metastaseringsstället. Liksom ortotopisk injektion i hjärnan kan det vara svårt att spåra utvecklingen av tumörmetastaser utan radiologisk avbildning eller cellmärkning. Men som med ortotopisk implantation resulterar framgångsrik inokulering i försämring av djurens tillstånd över tiden när tumören sprider sig. Figur 3A visar metastaser till hjärnan efter intrakardiell injektion i CNS-metastasen PDX-modell, M2, som härstammar från ett melanom. Intrakardiell injektion av PDX-tumör (CM04) resulterade i metastaser i bukhålan och levern (Figur 3B). Andra organ som utvärderades, såsom lunga, njure och äggstockar, hade inga synliga metastaser.
Figur 1: Flödesschema som visar det allmänna arbetsflödet för att upprätta, sprida och använda PDX för prekliniska studier. För varje inokuleringsmetod listas stegen i den metastatiska kaskaden under varje metod. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Histologi av PDX-tumörer efter olika inokuleringsmetoder. Hematoxylin och eosin (H &E) färgning av en CNS-metastasering PDX-tumör som härstammar från småcellig lungcancer (CM04) implanterad i immunförsvagade möss med de tre metoderna har liknande tumörpatohistologiska och morfologiska egenskaper hos småcellig lungcancer, med små kärnor och knapp cytoplasma. Den intrakardiella injektionspanelen visar en bukmetastasering. Bon av små celler och högt nukleärt till cytoplasmatiskt förhållande är uppenbart i alla tre bilderna. Bilder togs på en bildskanner och förstorades till 10x. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Metastaser observerade efter intrakardiell injektion. H&E-färgning av vävnader med synliga metastaser vid obduktion efter intrakardiell injektion av (A) M2 och (B) CM04. Bilder togs (A) på en bildskanner och förstorades till 1x (vänster) eller 20x (höger) eller (B) på ett vanligt mikroskop vid 10x förstoring. Denna siffra har ändrats från vår tidigare publikation12. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
I det nuvarande manuskriptet har metoder för PDX-etablering och förökning beskrivits. Tre olika inokuleringsmetoder som kan användas för att lägga upp prekliniska studier vid utvärdering av CNS-metastaser har också visats. Metoden för val bör bero på experimentets mål. I vissa fall skulle det vara fördelaktigt att använda mer än en inokuleringsväg. Till exempel ger subkutan flankimplantation ett enkelt tillvägagångssätt för att studera effektiviteten av ett läkemedel på tumörtillväxt och bedöma läkemedlet på sitt mål och det ger också en visuell för tumörstorlek som lätt övervakas och mäts. Men när målet genomförbarhet och antitumör tillväxt egenskaper är etablerade, kan man inrätta en ortotopisk studie för att bedöma effekten av biologiska att korsa BBB och studera dess effekt inom hjärntumör mikromiljö. Överlevnaden bedöms också bättre i ortotopiska och intrakardiella injektionsstudier.
Intrakraniell injektion av hjärnmetastaser PDX-modeller är ofta den prekliniska modellen som valts på grund av närvaron av hjärnans mikromiljö och BBB. Studier har dock visat att hjärnmetastaser har förmågan att modifiera BBB, vilket påverkar molekylernas permeabilitet till tumören16. Dessa förändringar i BBB skulle inte återspeglas av intrakraniellt implanterade tumörer, och på grund av detta kan prekliniska läkemedelsstudier inte helt återspegla svaret hos patienttumörer. Även med denna varning är intrakraniell injektion fortfarande den bästa metoden för att testa permeabiliteten och effekten av läkemedel för att korsa BBB i prekliniska modeller. En annan utmaning med intrakraniella modeller är att de är svåra att övervaka tumörtillväxt och kräver användning av avbildningstekniker. Viral transduktion av PDX med fluorescerande eller bioluminescerande markörer har traditionellt använts men kan vara utmanande att utföra. Emellertid utvecklas flera avbildningstekniker för användning hos möss som inte kräver införande av markörer, vilket kan förbättra övervakningen av dessa ortotopiska hjärntumörer för prekliniska studier. Dessa inkluderar bildtekniker som magnetisk resonanstomografi (MRT) och positronemissionstomografi (PET) avbildning och mikrodatortomografi (mikro-CT). Slutligen kan intrakraniell injektion inte korrekt återspegla mikromiljön för CNS-metastaser utanför hjärnan, såsom vid leptomeningeal metastasering. I detta fall kan injektion i cisterna magna utföras för att mer exakt representera leptomeningeala metastaser17.
Karakterisering av både fenotypiska och molekylära egenskaper hos PDX-modellen är viktig för att välja de bästa modellerna för prekliniska studier. Tumörlatens kan variera från 7-140 dagar och ta priser kan också vara mycket varierande12. Det optimala antalet djur att implantera och tidpunkten för behandlingsstart måste baseras på egenskaperna hos varje PDX-modell och måste bestämmas empiriskt. Vidare är den molekylära profilen för PDX-tumörer också viktig för valet av de mest representativa PDX-modellerna för prekliniska studier. Ju närmare modellen molekylärt representerar donatorvävnaden, desto mer prediktiv för kliniskt svar är det sannolikt. Det är också viktigt att säkerställa att de mål som väljs från humandata finns i de PDX:er som väljs ut för studier och upprätthålls under några generationer, eftersom den klonala successionen är associerad med en annan genomisk profil hos den etablerade dominerande klonen. Mot bakgrund av detta har de fenotypiska och molekylära profilerna för CNS-metastaserna PDX-tumörer karakteriserats i stor utsträckning över flera generationer12.
Trots de många fördelarna med att använda PDX-modeller med CNS-metastaser finns det flera begränsningar relaterade till deras användning. För det första är en alternativ tumörmikromiljö och särskilt brist på immunförsvar väldokumenterade begränsningar av PDX-modeller18. Xenograft av en mänsklig tumör i möss resulterar i att humant stroma ersätts med musstroma med varje efterföljande passage och det mänskliga stroma ersätts i allmänhet helt efter flera passager19. Skillnaderna i tumörmikromiljön resulterar emellertid inte i stora skillnader i molekylprofilen för flankimplanterade PDX-tumörer jämfört med den ursprungliga patienttumören12, vilket tyder på att flankmodeller fortfarande representerar bra experimentella modeller för att studera CNS-metastaser. För det andra resulterar användningen av immunkomprometterade djur i brist på immuncellsinfiltration i tumören och ett allmänt immunsvar från värden, vilket begränsar ett grundläggande sätt på vilket värden försöker bekämpa cancertillväxt12. Medan humaniserade möss inympade med humana immunceller är tillgängliga för att studera interaktionerna mellan specifika immunceller och tumören, finns det fortfarande många frågor och kontroverser om tillvägagångssätt, metoder och tolkning av dessa resultat20.
Medan majoriteten av PDX har visat sig vara genetiskt stabila, har vi och andra visat att i sällsynta fall, även i avsaknad av behandlingar eller andra externa selektiva tryck, kan det finnas förändringar i klonerna av tumörerna, såsom mindre klonövertagande12,14,15. Detta kan resultera i dramatiska förändringar i molekylprofilen, vilket i slutändan skulle göra att tumören inte återspeglar de dominerande klonerna i patienttumören12. Medan PDX som uppvisar klonal succession kan ha användning i prekliniska studier, kan många gener avsedda för målinriktning (t.ex. Her2) gå förlorade med klonal succession. Därför uppmuntras frekvent screening av PDX-modeller för att avgöra om de fortfarande bibehåller molekylprofilen för den önskade klonen.
Sammanfattningsvis representerar PDX-modeller ett utmärkt modellsystem för studier av inte bara CNS-metastaser utan även andra tumörtyper. Utvecklingen av dessa modeller har visat att de till stor del återspeglar fenotypen, molekylprofilen och heterogeniteten hos humana CNS-metastaser 8,9,10,12. De fungerar som effektiva modeller för att studera både CNS-metastasbiologi och fungerar också bra som fysiologiskt relevanta prekliniska modeller, och ersätter överanvända cellinjemodeller som historiskt använts för in vivo-studier av CNS-metastaser. Utan tvekan finns skillnader mellan PDX och donatorpatienttumör12,18. Att veta vad dessa skillnader är är viktigt för korrekt planering och genomförande av prekliniska studier. Slutligen, genom att välja mellan flera inokuleringsvägar, är PDX-modeller mångsidiga i sin användning som möjliggör studier av flera aspekter av sjukdomen. PDX-modeller kommer utan tvekan att spela en viktig roll för att öka vår förståelse av CNS-metastaser och utvecklingen av nya terapier.
Disclosures
Författarna har inga avslöjanden.
Acknowledgments
Figur 3A togs från vår tidigare publikation12 och genererades i Dr. Jann Sarkarias laboratorium vid Mayo Clinic.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25G needle | VWR | BD305122 | |
| 70 µm Cell strainer | VWR | 21008-952 | |
| 70% ethanol wipes | VWR | 470106-486 | |
| Bone wax | MedVet | W31G-RL | |
| CIEA NOG mouse | Taconic | NOG-F | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | |
| Ethiqa XR (buprenorphine SR) | MWI | 072117 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| gentleMACS C Tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi | 130-095-937 | |
| Hamilton syringe | Sigma | 20919 | |
| Matrigel growth factor reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Ophthalmic ointment | MedVet | PH-PURALUBE-VET | |
| PBS/DPBS | ThermoFisher | 14040133 | |
| Povidone iodine swabs | VWR | 15648-906 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical drill | Stoelting | 58610 | |
| Surgical glue | MedVet | VG3 | |
| Surgical sutures | MedVet | MMV-661-V | |
| Syringe | VWR | 53548-001 | |
| Tumor dissociation kit | Miltenyi | 130-095-929 |
References
- Cruz-Munoz, W., Kerbel, R. S. Preclinical approaches to study the biology and treatment of brain metastases. Seminars in Cancer Biology. 21 (2), 123-130 (2011).
- Owonikoko, T. K., et al. Current approaches to the treatment of metastatic brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 11 (4), 203-222 (2014).
- Salhia, B., et al. Integrated genomic and epigenomic analysis of breast cancer brain metastasis. PLoS One. 9 (1), 85448 (2014).
- Kotecha, R., Gondi, V., Ahluwalia, M. S., Brastianos, P. K., Mehta, M. P.
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Klinghammer, K., et al. A comprehensively characterized large panel of head and neck cancer patient-derived xenografts identifies the mTOR inhibitor everolimus as potential new treatment option. International Journal of Cancer. 136 (12), 2940-2948 (2015).
- Lee, H. W., et al. Patient-derived xenografts from non-small cell lung cancer brain metastases are valuable translational platforms for the development of personalized targeted therapy. Clincal Cancer Research: An Official journal of the American Association of Cancer Research. 21 (5), 1172-1182 (2015).
- Ni, J., et al. Combination inhibition of PI3K and mTORC1 yields durable remissions in mice bearing orthotopic patient-derived xenografts of HER2-positive breast cancer brain metastases. Nature Medicine. 22 (7), 723-726 (2016).
- Oshi, M., et al. Novel breast cancer brain metastasis patient-derived orthotopic xenograft model for preclinical studies. Cancers (Basel). 12 (2), 444 (2020).
- Garman, B., et al. Genetic and genomic characterization of 462 melanoma patient-derived xenografts, tumor biopsies, and cell lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al. A comprehensive patient-derived xenograft collection representing the heterogeneity of melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Tew, B. Y., et al. Patient-derived xenografts of central nervous system metastasis reveal expansion of aggressive minor clones. Neuro-Oncology. 22 (1), 70-83 (2020).
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Davies, N. J., et al. Dynamic changes in clonal cytogenetic architecture during progression of chronic lymphocytic leukemia in patients and patient-derived murine xenografts. Oncotarget. 8 (27), 44749-44760 (2017).
- Eirew, P., et al. Dynamics of genomic clones in breast cancer patient xenografts at single-cell resolution. Nature. 518 (7539), 422-426 (2015).
- Arvanitis, C. D., Ferraro, G. B., Jain, R. K. The blood-brain barrier and blood-tumour barrier in brain tumours and metastases. Nature Reviews. Cancer. 20 (1), 26-41 (2020).
- Choi, S., et al. In vivo bioluminescence imaging for leptomeningeal dissemination of medulloblastoma in mouse models. BMC Cancer. 16 (1), 723 (2016).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Bradford, J. R., et al. Whole transcriptome profiling of patient-derived xenograft models as a tool to identify both tumor and stromal specific biomarkers. Oncotarget. 7 (15), 20773-20787 (2016).
- Yip, H., Haupt, C., Maresh, G., Zhang, X., Li, L. Humanized mice for immune checkpoint blockade in human solid tumors. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (5), 313-320 (2019).
