Summary
PDX-modeller for metastaser i sentralnervesystemet representerer de fenotypiske og molekylære egenskapene til human metastase, noe som gjør dem til gode modeller for prekliniske studier. Beskrevet her er hvordan man etablerer PDX-modeller og inokulasjonsruter som er best brukt til prekliniske studier.
Abstract
Utviklingen av nye terapier for metastase i sentralnervesystemet (CNS) har blitt hindret av mangelen på prekliniske modeller som nøyaktig representerer sykdommen. Pasientavledede xenograft (PDX) modeller av CNS-metastase har vist seg å bedre representere fenotypiske og molekylære egenskaper av den menneskelige sykdommen, samt bedre reflektere heterogeniteten og klonal dynamikk av humane pasienttumorer sammenlignet med historiske cellelinjemodeller. Det er flere steder som kan brukes til å implantere pasientavledet vev når du setter opp prekliniske studier, hver med sine egne fordeler og ulemper, og hver egnet for å studere ulike aspekter av metastatisk kaskade. Her beskriver protokollen hvordan man etablerer PDX-modeller og presenterer tre forskjellige tilnærminger for å utnytte CNS-metastase PDX-modeller i prekliniske studier, og diskuterer hver av deres applikasjoner og begrensninger. Disse inkluderer flankeimplantasjon, ortotopisk injeksjon i hjernen og intrakardial injeksjon. Subkutan flankeimplantasjon er den enkleste å overvåke og derfor mest praktisk for prekliniske studier. I tillegg ble det observert metastaser til hjerne og annet vev fra flankeimplantasjon, noe som indikerer at svulsten har gjennomgått flere metastasetrinn, inkludert intravasasjon, ekstravasasjon og kolonisering. Ortotopisk injeksjon i hjernen er det beste alternativet for å rekapitulere hjernesvulstens mikromiljø og er nyttig for å bestemme effekten av biologiske legemidler for å krysse blod-hjernebarrieren (BBB), men omgår de fleste trinnene i metastatisk kaskade. Intrakardial injeksjon letter metastase til hjernen og er også nyttig for å studere organtropisme. Selv om denne metoden gir avkall på tidligere trinn i den metastatiske kaskaden, vil disse cellene fortsatt måtte overleve sirkulasjon, ekstravasere og kolonisere. Nytten av en PDX-modell påvirkes derfor av ruten for tumorinokulasjon, og valget av hvilken som skal brukes, bør dikteres av det vitenskapelige spørsmålet og de overordnede målene for forsøket.
Introduction
Insidensen av metastaser til sentralnervesystemet (CNS) har økt de siste årenemed 1,2,3. Tradisjonelle terapier for CNS-metastase, som tumorreseksjon, strålebehandling av hele hjernen og stereotaktisk radiokirurgi, har i stor grad vært palliativ og sjelden kurativ, og kan føre til svekkende bivirkninger, som kognitiv forverring1. Nylig utvikles mange nye målrettede og immunologiske terapier for behandling av CNS-metastase som viser løfte om å være mer effektive behandlinger, samtidig som de har færre bivirkninger4.
Å oversette prekliniske resultater til meningsfulle kliniske endepunkter krever ofte effektive og prediktive modelleringsstrategier. Historisk sett var cellelinje xenograft-modeller standarden for preklinisk forskning innen CNS-metastaseforskning. Imidlertid reflekterer disse cellelinjemodellene ikke den sanne tumoroppførselen til vertstumoren eller representerer den histologiske eller molekylære heterogeniteten til sykdommen. Videre er cellelinjemodeller i stand til å tilpasse seg in vitro vekstforhold og mister derfor de opprinnelige egenskapene til vertstumoren. Pasientavledede xenotransplantater (PDX), som engraft pasientens svulst inn i en immundefekt eller humanisert mus, blir i økende grad brukt i translasjonell kreftforskning. Forskere har vist at PDX-modeller vanligvis trofast kan rekapitulere tumorvekst, histologiske egenskaper, opprettholde tumorheterogenitet, metastatisk potensial og molekylære genetiske egenskaper. I tillegg er PDX-modeller prognostiske der PDX-tumorlatensperioden korrelerer med pasientens totale overlevelse, og de har også vist seg å nøyaktig forutsi terapeutisk respons i pasientforsøk 5,6.
Det har vært en fremvekst av CNS-metastase PDX. For det meste har disse blitt utviklet som representerer svulster som stammer fra en enkelt opprinnelse, for eksempel ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) 7, brystkreft8,9 og melanom10,11. Mer nylig har en stor og variert samling av PDX-modeller blitt utviklet og karakterisert, som representerer åtte forskjellige histologiske subtyper12. Det er vist at PDX-modeller for CNS-metastaser ligner deres opprinnelige pasienttumor, både histologisk og molekylært, og har også vist histologiske unike forskjeller og likheter10,12. Videre, mens de fleste CNS-metastase PDX-modeller opprettholder den klonale heterogeniteten til humane svulster, viste noen tegn på klonal suksess12, noe som gjør dem også ideelle for å studere resistens mot terapier ved å overvåke klonale endringer etter behandling.
Protokollene beskrevet her skisserer metoder for PDX-etablering og ulike inokulasjonsveier brukt i prekliniske studier av CNS-metastase (figur 1). Disse implantasjonsmetodene varierer i deres evne til å etterligne vekst og metastase. Her fremhever protokollen applikasjonene for hver implantasjonsvei og demonstrerer hvordan de kan brukes til studier av CNS-metastase.
Protocol
Følgende er en serie trinnvise protokoller som brukes til både å etablere PDX-modeller ved subkutan flankeimplantasjon og for å sette opp prekliniske studier som muliggjør testing av behandlinger, som kan hjelpe til med å vurdere biologiske endringer og ulike trinn i metastatisk kaskade. Alle studiene og modellene brukte 3-8 uker gamle kvinnelige NOG-mus. Alle vevsprøvene ble samlet inn under informert samtykke i samsvar med en protokoll godkjent av Institutional Review Board (IRB). Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med en Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) godkjent protokoll.
1. Etablering og utbredelse av PDX-modeller ved flankeimplantasjon
- Etablering av PDX-modeller
- Etter kirurgisk reseksjon av svulsten fra pasienten i operasjonssalen, oppbevar det friske tumorvevet i en egnet løsning (for eksempel DMEM) og legg det umiddelbart på is. Bruk et overskudd av lagringsoppløsning (>10 ml) for å sikre at vevet er helt nedsenket.
- Overfør vev til vevskulturfat og skyll med 5 ml DPBS.
MERK: Dette trinnet skal utføres i et biosikkerhetsskap ved hjelp av aseptiske teknikker. Forholdsregler bør tas ved å bruke egnet personlig verneutstyr (PPE) for å beskytte mot mulige smittestoffer hos mennesker. - Fjern nekrotiske regioner fra svulsten.
MERK: Dette kan gjenkjennes som en hvit grøtaktig region mot midten av vevet. - Skjær resten av vevet i ca. 2 x 2 x 2 mm biter.
- Overfør vevene til et mikrosentrifugerør som inneholder vekstfaktoren redusert kjellermembranmatrise og lagre dem på is. Sørg for at tilstrekkelig kjellermembranmatrise (>200 μL) brukes til å senke hvert vevstykke helt.
- Kryokonreserver det gjenværende vevet som ikke vil bli implantert i henhold til protokollen beskrevet i trinn 1.3.
- Bedøv dyret i et induksjonskammer med 2-5% isofluran og oksygen. Når det er bedøvet, overfør dyret til en nesekegle for å opprettholde anestesi ved 1,5-2,5% isofluran med kontinuerlig oksygenforsyning. Bekreft anestesidybden ved mangel på pedalrefleks. Påfør veterinær oftalmisk salve for å forhindre øyetørrhet under operasjonen. Gi termisk støtte til dyret gjennom hele prosedyren til dyret gjenoppretter.
- Identifiser implantasjonsstedet på musen.
MERK: Dette skal være på høyre eller venstre flanke av musen, vanligvis landmerket lateralt på siden av bukregionen, kaudalt til brystkassen. - For å forberede det kirurgiske området, barbere pelsen og desinfiser med tre vekslende skrubber povidonjod og 70% etanol.
- Bruk tang, løft musens hud og gjør et snitt på 0,5-1 cm på huden.
- Sett saks sakte under huden på snittstedet for å lage en lomme (0,5-1 cm dyp) i det subkutane rommet.
- Legg forsiktig ett svulststykke i lommen og skyv det, skyv det til bunnen av lommen for å forhindre at svulsten glir ut.
- Lukk snittet ved hjelp av 4-0 nylon kirurgiske suturer.
MERK: Andre sårlukkingsmetoder som ikke-absorberbare eller absorberbare suturer og sårklemmer kan også brukes. - Overfør musen tilbake til buret og overvåke dyrets utvinning fra anestesi, til den er ambulerende.
MERK: Analgetika er ikke nødvendig, men kan administreres hvis smerte observeres hos musene. - Overvåk tumorveksten ukentlig. Det forventes én svulst per mus.
MERK: Svulstens volum ved transplantasjon ser ut til å innledningsvis reduseres, men dette er ikke en grunn til bekymring. En svulst anses å ha tatt når den blir palpabel og går inn i en logaritmisk vekstfase. Denne første passasjen representerer F0-generasjonen. - Når svulstene begynner å vokse, måle svulstene tre ganger per uke. Mål lengden og bredden på svulstene med en tykkelse. For å beregne volumet av svulsten, bruk formelen: lengde x bredde x bredde / 2.
- Avlive musene implantert med PDX-svulster når svulstene er større enn 15 mm i diameter ved hjelp av den lengste siden av svulsten. Utfør eutanasi ved CO 2 -inhalasjon i et CO2 -induksjonskammer, etterfulgt av cervikal dislokasjon som en sekundær metode.
- Resect svulsten fra dyrets flanke ved å lage et snitt. Dissekere den utskårne svulsten forsiktig med stump saks og tang. For å gjøre dette, kutt først av huden på toppen av svulsten, og kutt deretter svulsten vekk fra muskellaget under den.
- Overfør tumorvevet til >10 ml av en egnet lagringsløsning (som DMEM). Legg den umiddelbart på is. Denne svulsten kan kryopreserveres eller overføres til et annet sett med mus. Betrakt dette avsnittet som F1.
MERK: Passaging igjen ville gjengi tumorpassasjen F2 og så videre.
- Forplantning av PDX-modeller
- Begynn med resektert tumor holdt i lagringsoppløsning fra trinn 1.1.19.
- Overfør vevet til en vevskulturskål og skyll med 5 ml DPBS.
- Fjern de nekrotiske områdene fra svulsten.
- Skjær vevet i ca. 2 x 2 x 2 mm biter.
- Overfør vevet til et mikrosentrifugerør som inneholder vekstfaktorredusert kjellermembranmatrise (>200 μL) og oppbevar på is.
- Kryokonservere det gjenværende vevet som ikke brukes til formering i henhold til protokollen beskrevet i trinn 1.3.
- Bedøv dyret i et induksjonskammer med 2-5% isofluran og oksygen. Når det er bedøvet, overfør dyret til en nesekegle for å opprettholde anestesi ved 1,5-2,5% isofluran med kontinuerlig oksygenforsyning. Bekreft anestesidybden ved mangel på pedalrefleks. Påfør veterinær oftalmisk salve for å forhindre øyetørrhet under operasjonen. Gi termisk støtte til dyret gjennom hele prosedyren til dyret gjenoppretter.
- Identifiser implantasjonsstedet på musen.
MERK: Dette bør være på høyre eller venstre flanke av musen, vanligvis i mageregionen, kaudalt til brystkassen. - For å forberede det kirurgiske området, barbere pelsen og desinfiser med tre vekslende skrubber povidonjod og 70% etanol.
- Gjør et snitt på 0,5-1 cm på den ene flanken av musen.
- Sett en kirurgisk saks sakte under huden ved snittet for å lage en lomme (0,5-1 cm dyp) i det subkutane rommet.
- Legg forsiktig ett svulststykke i lommen og skyv det til bunnen av lommen for å forhindre at svulsten glir ut.
- Lukk snittet ved hjelp av 4-0 nylon kirurgiske suturer eller andre sårlukkingsmetoder.
- Overfør musen tilbake til buret og følg utvinningen fra anestesi, til den er ambulerende.
MERK: Analgetika er ikke nødvendig, men kan administreres hvis smerte observeres hos musene. - Under latens (ikke-vekstfase), overvåke tumorveksten ukentlig. Det forventes én svulst per mus.
MERK: Svulstens volum ved transplantasjon ser ut til å innledningsvis reduseres, men dette er ikke en grunn til bekymring. En svulst anses å være tatt når den blir håndgripelig og begynner å vokse kontinuerlig. - Når svulstene begynner å vokse, måle svulstene tre ganger per uke. Mål lengden og bredden på svulstene med en tykkelse. Beregn volumet av svulsten ved hjelp av formelen: lengde x bredde x bredde / 2.
- Avlive musene implantert med PDX-svulster når svulstene er større enn 15 mm i diameter ved hjelp av den lengste siden av svulsten. Utføre eutanasi ved CO2-inhalasjon i et CO2-induksjonskammer, etterfulgt av cervikal dislokasjon som sekundær metode.
- Resect svulsten fra flanken av dyret ved å lage et snitt og dissekere svulsten forsiktig ut med stump saks og tang.
- Overfør tumorvevet til >10 ml av en egnet lagringsløsning (som DMEM) og legg deretter umiddelbart på is.
- Kryopreservering av PDX-svulster
- Avlive musene implantert med PDX-svulster når svulstene er større enn 15 mm i diameter ved hjelp av den lengste siden av svulsten. Utfør eutanasi ved CO 2 -inhalasjon i et CO2 -induksjonskammer, etterfulgt av cervikal dislokasjon som sekundær metode.
- Resect svulsten fra flanken av dyret ved å lage et snitt og dissekere svulsten forsiktig ut med stump saks og tang.
- Overfør tumorvevet til >10 ml av en egnet lagringsløsning (som DMEM) og legg deretter umiddelbart på is.
- Overfør vevet til en vevskulturskål og skyll med 5 ml DPBS.
- Fjern nekrotiske regioner fra svulsten.
- Skjær vevet i ca. 2 x 2 x 2 mm biter.
- Overfør vevet til kryorør som inneholder 20% DMEM, 70% FBS og 10% DMSO.
- Overfør kryorørene til en kryopreserveringsbeholder og sett i en fryser på -80 °C.
- Når kryorørene kjøles ned til -80 °C, overføres de til lagring av flytende nitrogen.
2. Vaksinasjonsruter for prekliniske studier
- Implantasjon av subkutan flanke.
MERK: Subkutan flankeimplantasjon kan brukes for enkel og kan være nyttig for å studere alle trinnene i metastatisk kaskade.- Bruk voksende PDX-svulster eller kryopreserverte PDX-svulster for første flankeimplantasjon.
- For voksende PDX-svulster, avlive musene ved hjelp av en IACUC-godkjent metode når svulstene er større enn 15 mm i lengde; resekt svulsten og overfør tumorvevet til en egnet lagringsløsning (for eksempel DMEM) og legg umiddelbart på is.
- For kryopreserverte PDX-svulster, tine det kryopreserverte PDX-vevet raskt ved å senke det i 37 °C vannbad.
- Følg trinnene 1.2.2-1.2.19.
- Ortotopisk implantasjon ved intrakraniell injeksjon i hjernen.
MERK: Denne modellen kan brukes til å teste effekten av medisiner for å krysse BBB og for å studere tumorkolonisering. Denne delen refererer primært til bruk av tumordissosiasjonssettet (se Tabell over materialer). Ulike vevstyper krever forskjellige dissosiasjonsprotokoller. Det anbefales at brukeren tester og optimaliserer protokollen for å maksimere dissosiasjonseffektiviteten.- Avlive musene implantert med PDX-svulster ved hjelp av en IACUC-godkjent metode når svulstene er større enn 15 mm i lengde.
- Under sterile forhold i et biosikkerhetsskap, kirurgisk resektere PDX-svulstene og lagre i DMEM på is.
- Forbered dissosiasjonsløsningen i det aktuelle røret ved å tilsette enzymblandingen i DMEM som angitt av produsentens protokoll.
- Vask svulsten i 5 ml DPBS i en vevskulturskål.
- Fjern de nekrotiske områdene fra svulsten.
- Klipp svulsten i små biter på 2-4 mm i lengde.
- Overfør tumorbitene inn i røret som inneholder enzymblandingen.
- Fest røret til vevsdissosiatoren og kjør programmet som passer for vevstypen. Se produsentens protokoll for det aktuelle programmet som skal kjøres, og dissosiasjonstiden som kreves.
- Etter fullføring av programmet, sil cellene gjennom en 70 μm cellesil.
- Vask cellesilen med 20 ml DMEM.
- Sentrifuger de dissosierte cellene ved 300 x g i 7 minutter.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellene i DPBS.
- Telle cellene og fortynn til ønsket konsentrasjon.
- Sett opp den stereotaktiske rammen i henhold til produsentens instruksjoner og klargjør en varmepute for musene. Desinfiser alle områder med 70% etanol.
- Bedøv dyret i et induksjonskammer med 2-5% isofluran og oksygen. Når det er bedøvet, overfør dyret til en nesekegle for å opprettholde anestesi ved 1,5-2,5% isofluran med kontinuerlig oksygenforsyning. Bekreft anestesidybden ved mangel på pedalrefleks. Påfør veterinær oftalmisk salve for å forhindre øyetørrhet under operasjonen. Gi termisk støtte til dyret gjennom hele prosedyren til dyret gjenoppretter.
- Forbered det kirurgiske området ved å barbere pelsen på musens hode for å avsløre hodebunnen.
- Gi musen egnet smertestillende middel, slik som én dose med 1 mg/kg Buprenorfin Sustained Release (SR) administrert ved subkutan injeksjon.
- Overfør musen til den stereotaksiske rammen. Forsikre deg om at musen biter på biteblokken. Bruk ørestengene til å feste musens hode godt.
MERK: Musen er ordentlig festet hvis hodet ikke beveger seg når det skyves forsiktig med tang. - Desinfiser det barberte området med tre vekslende skrubber povidon-jod og 70% etanol.
- Lag et 5-7 mm langsgående snitt i hodebunnen for å avsløre skallen og trekke hodebunnen tilbake.
- Skrap av periosteum med et stumpt kirurgisk instrument som tang.
- Finn bregma på skallen.
- Plasser nålen på den stereotaktiske rammen på toppen av bregmaen og tilbakestill koordinatene til 0 eller noter koordinaten på armen.
- Beveg armen 1 mm bakover (kaudalt) og 1 mm sideveis, til høyre for midtlinjen.
- Merk dette stedet med en permanent markør. Hvis armen inneholder et spor for sprøyten, fest en markør til sprøytesporet for å markere plasseringen.
- Bor et lite burrhull i skallen på dette stedet. Ikke bruk for mye press for å hindre boring i hjernen.
- Legg en 5 μL, 26 G Hamilton sprøyte med 5-10 x 104 celler, i et volum på 1-2 μL, og fest den til den stereotaktiske armen.
- Sett Hamilton sprøytenålen 2 mm langsomt inn i hjernen.
- Begynn å injisere celler med ønsket hastighet, vanligvis 0,2-0,5 μL / min.
- Etter at injeksjonen er fullført, trekkes nålen sakte ut av hjernen.
- Fyll burrhullet med beinvoks.
- Lukk snittet med kirurgiske suturer eller kirurgisk lim.
- Overfør musen tilbake til buret og følg utvinningen fra anestesi.
- Overvåk tilstanden til dyrene regelmessig og avlive dem når de humane endepunktkriteriene er nådd i den godkjente protokollen.
MERK: Vellykket tumorvekst i hjernen resulterer i forverret tilstand av dyret, som ofte manifesterer seg med hodet tilt, grovt hår pels, bøyd kropp, myste øyne, redusert aktivitet, og lav kroppstilstand score (BCS < 2). - Utfør en nekropsi på de euthaniserte dyrene, etterfulgt av histologisk analyse for å bekrefte tilstedeværelsen av svulster i hjernen. Registrer hvor lang tid det tar fra implantasjon til aktiv dødshjelp.
- Implantasjon av PDX-modeller ved intrakardial injeksjon
MERK: Denne modellen kan brukes til å studere organtropisme når tumorceller er i omløp. Denne delen bruker også Tumor Dissociation Kit og krever optimalisering etter vevstype.- Følg trinnene 2.2.1-2.2.13.
- Bedøv dyret i et induksjonskammer med 2-5% isofluran og oksygen. Når det er bedøvet, overfør dyret til en nesekegle for å opprettholde anestesi ved 1,5-2,5% isofluran med kontinuerlig oksygenforsyning. Bekreft anestesidybden ved mangel på pedalrefleks. Påfør veterinær oftalmisk salve for å forhindre øyetørrhet under operasjonen. Gi termisk støtte til dyret gjennom hele prosedyren til dyret gjenoppretter.
- Plasser deretter musen i en liggende stilling.
- For å forberede det kirurgiske området på brystet, barbere pelsen og desinfiser den med tre vekslende skrubber povidon-jod og 70% etanol.
- Trekk 0,5-10 x 105 celler inn i en sprøyte på en 28 G kanyle, opp til et volum på 100 μL.
MERK: Antall celler som kreves varierer avhengig av modellens aggressivitet, og det optimale antallet celler bør bestemmes empirisk for hver modell. - Finn injeksjonsstedet (litt til venstre for musens brystben og halvveis mellom sternal hakk og xyphoid prosess).
- Stikk nålen vertikalt inn i musen på injeksjonsstedet.
- Vær oppmerksom på den vellykkede inngangen til venstre ventrikel gjennom en tilbakestrømning av blod som kommer inn i sprøyten. Dispenser sakte cellene inn i venstre ventrikkel uten å bevege nålen.
- Trekk kanylen langsomt ut vertikalt fra musen.
- Påfør et stykke sterilt gasbind over injeksjonsstedet og trykk i ca. 1 min til blødningen stopper, samtidig som du tillater brystbevegelse for åndedrett.
- Fjern musen fra anestesi og la den komme seg på en oppvarmet pute.
MERK: Vellykket tumorvekst resulterer i forverret tilstand av dyret, som ofte manifesterer seg med ruffled hårfrakk, bøyd kropp, knuste øyne, redusert aktivitet og lav kroppstilstandsscore (BCS < 2). - Overvåk tilstanden til dyrene regelmessig og avlive dem når de humane endepunktkriteriene er nådd i den godkjente protokollen.
- Utfør en nekropsi for å identifisere metastaser på de euthaniserte dyrene, etterfulgt av histologisk analyse for å bekrefte tilstedeværelsen av svulster i målorganet. Registrer hvor lang tid det tar fra intrakardial injeksjon til eutanasi.
Representative Results
Flankeforplantede PDX-svulster er lettest å implantere, overvåke og resektere, og anbefales generelt for initial etablering og forplantning av PDX-svulster (figur 1). Ved etablering eller forplantning av PDX-svulster er det forsvarlig å implantere svulster i flere dyr, da tumorfrekvensen kan variere, og ikke alle deler av svulsten vil alltid ta inn mus. Det er utviklet metoder for etablering og forplantning av CNS-metastase PDX direkte i hjernen13. Imidlertid er disse metodene fortsatt mer utfordrende med lavere opptakshastigheter, og svulstene er betydelig vanskeligere å forplante seg og overvåke enn flankeimplantasjon.
Hvis pasienttumorer ikke er lett tilgjengelige, kan CNS-metastase PDX-svulster også fås fra en rekke kilder, inkludert repositorier av akademiske laboratorier eller kommersielle selskaper. Etter å ha anskaffet svulstene, ville første prioritet være å forplante og kryobevare så mye materiale som mulig, slik at et stort antall svulster med lav passasje blir bevart. Dette sikrer at tilstrekkelig materiale er tilgjengelig for et ubestemt antall påfølgende studier med PDX-modellene. I likhet med udødeliggjorte cellelinjer, bør PDX-svulster kryopreserveres og brukes ved lave passasjetall, da genetisk drift resulterer i endringer i fenotypen og genotypen til PDXene over tid12,14,15. Uavhengig av kilden til PDX-svulster, er det viktig å utføre hyppig screening av PDX og musekolonier for både humane og musepatogener, som HIV og hepatitt for mennesker og Corynebacterium bovis for mus. Dette vil begrense spredningen av uønskede patogener fra PDX til både individet som håndterer dem og andre mus i studien og vivarium.
Implantasjonsmetodene beskrevet her kan brukes til å studere tumorbiologi, evaluere flere aspekter av metastatisk kaskade og for prekliniske studier. Den største fordelen med flankeimplantasjon er den enkle tumorovervåkingen over tid, da svulster er synlige, og veksten kan lett måles ved hjelp av en tykkelse. Denne metoden kan være et godt sted å starte for å etablere gjennomførbarhet av et narkotikamål. Intrakraniell implantasjon foretrekkes hvis tilstedeværelsen av hjernens mikromiljø er viktig og kan endre veksten eller molekylærprofilen til svulsten. I tillegg plasserer intrakraniell implantasjon svulsten bak blodhjernebarrieren (BBB), noe som gjør det viktig for prekliniske studier som undersøker effekten av legemidler som kreves for å krysse BBB. Det er imidlertid vanskelig å overvåke veksten av PDX-svulster og krever radiologisk avbildning eller bioluminescerende avbildning hvis cellene er merket. Å vite når man skal starte medikamentell behandling preklinisk, vil kreve enten bildedata for å overvåke vekst eller kunnskap om gjennomsnittlig overlevelse av mus som bærer en bestemt PDX-svulst. Videre omgår intrakraniell implantasjon alle de essensielle trinnene i metastatisk kaskade, noe som gjør den bare egnet for å studere legemiddeleffektivitet og tumormikromiljø i hjernen. Til tross for forskjellene i tumormikromiljøet er morfologien til PDX-svulster lik uavhengig av implantasjonsstedet som kan ses i denne PDX-svulsten (CM04) avledet fra en hjernemetastase som stammer fra en småcellet lungekreft primærtumor (figur 2). Morfologien til småcellet lungekreft hos tumorceller med små kjerner og lite cytoplasma kan observeres i flanketumor, intrakranial tumor og abdominal metastase som følge av intrakardial injeksjon. Videre er spontanmetastase fra svulster implantert i flanken tidligere observert12, noe som tyder på at metastatiske prosesser som intravasasjon, ekstravasasjon og kolonisering kan rekapituleres og studeres i flanketumorer som ellers ikke ville være mulig med ortotopiske svulster i hjernen. Generelt observeres det at flankeimplantasjon er en egnet metode for å studere CNS-metastasebiologi og gjennomføre prekliniske studier.
Intrakardial injeksjon brukes oftest til å studere organtropisme og metastatisk potensial av svulster. Injiserte tumorceller må gjennomgå flere trinn i metastatisk kaskade, inkludert overlevende sirkulasjon, ekstravasasjon og kolonisering av metastatisk sted. I likhet med ortotopisk injeksjon i hjernen, kan det være vanskelig å spore fremdriften av tumormetastase uten radiologisk avbildning eller cellemerking. Imidlertid, som med ortotopisk implantasjon, resulterer vellykket inokulering i forverring av tilstanden til dyrene over tid ettersom svulsten sprer seg. Figur 3A viser metastaser til hjernen etter intrakardial injeksjon i CNS-metastase PDX-modell, M2, som utgikk fra et melanom. Intrakardial injeksjon av PDX-tumor (CM04) ga metastaser til bukhule og lever (figur 3B). Andre organer som ble vurdert, som lunge, nyre og eggstokker, hadde ingen synlige metastaser.
Figur 1: Flytskjema som viser den generelle arbeidsflyten for etablering, forplantning og bruk av PDX for prekliniske studier. For hver inokulasjonsmetode er trinnene i den metastatiske kaskaden som er involvert oppført under hver metode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Histologi av PDX-svulster etter ulike inokulasjonsmetoder. Hematoksylin og eosin (H &E) farging av en CNS-metastase PDX-svulst som stammer fra småcellet lungekreft (CM04) implantert i immunkompromitterte mus ved de tre metodene, har lignende tumorpatohistologiske og morfologiske trekk ved småcellet lungekreft, med små kjerner og lite cytoplasma. Det intrakardiale injeksjonspanelet viser en abdominal metastase. Reir av små celler og høyt nukleært til cytoplasmatisk forhold er tydelig i alle de tre bildene. Bildene ble tatt på en lysbildeskanner og forstørret til 10x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Metastaser observert etter intrakardial injeksjon. H&E-farging av vev med synlig metastase under vurdering ved nekropsi etter intrakardial injeksjon av (A) M2 og (B) CM04. Bildene ble tatt (A) på en lysbildeskanner og forstørret til 1x (venstre) eller 20x (høyre) eller (B) på et vanlig mikroskop ved 10x forstørrelse. Dette tallet er endret fra vår forrige publikasjon12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
I det nåværende manuskriptet er metoder for PDX-etablering og utbredelse blitt detaljert. Tre forskjellige inokulasjonsmetoder som kan brukes til å sette opp prekliniske studier ved evaluering av CNS-metastase har også blitt demonstrert. Den valgte metoden bør avhenge av målene for forsøket. I noen tilfeller vil det være fordelaktig å bruke mer enn én vaksinasjonsvei. For eksempel gir subkutan flankeimplantasjon en enkel tilnærming til å studere effektiviteten av et legemiddel på tumorvekst og vurdere stoffet på målet, og det gir også et visuelt for tumorstørrelse som lett overvåkes og måles. Men når målet gjennomførbarhet og anti-tumor vekst egenskaper er etablert, kan man sette opp en ortotopisk studie for å vurdere effekten av den biologiske å krysse BBB og studere dens effekt i hjernesvulst mikromiljø. Overlevelse er også bedre vurdert i ortotopiske og intrakardiale injeksjonsstudier.
Intrakraniell injeksjon av hjernemetastase PDX-modeller er ofte den prekliniske modellen som velges på grunn av tilstedeværelsen av hjernens mikromiljø og BBB. Studier har imidlertid vist at hjernemetastaser har evnen til å modifisere BBB, noe som påvirker permeabiliteten av molekyler til svulsten16. Disse endringene i BBB vil ikke bli reflektert av intrakranielt implanterte svulster, og på grunn av dette kan prekliniske legemiddelstudier ikke fullt ut reflektere responsen fra pasienttumorer. Selv med denne advarselen forblir intrakraniell injeksjon den beste metoden for å teste permeabiliteten og effekten av legemidler for å krysse BBB i prekliniske modeller. En annen utfordring med intrakraniale modeller er at de er vanskelige for å overvåke tumorvekst og krever bruk av avbildningsteknikker. Viral transduksjon av PDX med fluorescerende eller bioluminescerende markører har tradisjonelt vært brukt, men kan være utfordrende å utføre. Imidlertid utvikles flere bildebehandlingsteknikker for bruk hos mus som ikke krever innføring av markører, noe som kan forbedre enkel overvåking av disse ortotopiske hjernesvulstene for prekliniske studier. Disse inkluderer bildebehandlingsteknologier som magnetisk resonansavbildning (MRI) og positronemisjonstomografi (PET) avbildning og mikrocomputertomografi (mikro-CT). Endelig kan intrakraniell injeksjon ikke nøyaktig gjenspeile mikromiljøet til CNS-metastaser utenfor hjernen, slik som i leptomeningeal metastase. I dette tilfellet kan injeksjon i cisterna magna utføres for å representere leptomeningeale metastasermer nøyaktig 17.
Karakterisering av både fenotypiske og molekylære trekk ved PDX-modellen er viktig for å velge de beste modellene for prekliniske studier. Tumor latency kan variere fra 7-140 dager og ta priser kan også være svært variabel12. Det optimale antallet dyr som skal implanteres og tidspunktet for behandlingsstart må baseres på egenskapene til hver PDX-modell og må bestemmes empirisk. Videre er den molekylære profilen til PDX-svulster også viktig for valg av de mest representative PDX-modellene for prekliniske studier. Jo nærmere modellen molekylært representerer donorvevet, desto mer prediktiv for klinisk respons er det sannsynlig å være. Det er også viktig å sikre at målene valgt fra menneskelige data er til stede i PDX-ene som velges for studier og opprettholdes gjennom noen generasjoner, som vist klonal suksesjon er forbundet med en annen genomisk profil av den sittende dominerende klonen. I lys av dette har de fenotypiske og molekylære profilene til CNS-metastasen PDX-svulster blitt omfattende karakterisert over flere generasjoner12.
Til tross for de mange fordelene ved å bruke CNS-metastase PDX-modeller, er det flere begrensninger knyttet til bruken av dem. For det første er et alternativt tumormikromiljø og spesielt mangel på immunsystem veldokumenterte begrensninger for PDX-modeller18. Xenograft av en human tumor i mus resulterer i erstatning av human stroma med musestroma med hver påfølgende passasje, og den menneskelige stroma er generelt helt erstattet etter flere passasjer19. Forskjellene i tumormikromiljøet resulterer imidlertid ikke i store forskjeller i molekylærprofilen til flankeimplanterte PDX-svulster sammenlignet med den opprinnelige pasienttumor12, noe som tyder på at flankemodeller fortsatt representerer gode eksperimentelle modeller for å studere CNS-metastase. For det andre resulterer bruken av immunkompromitterte dyr i mangel på immuncelleinfiltrasjon i svulsten og en generell immunrespons fra verten, noe som begrenser en grunnleggende måte som verten forsøker å bekjempe kreftvekst12. Mens humaniserte mus podet med humane immunceller er tilgjengelige for å studere samspillet mellom spesifikke immunceller med svulsten, er det fortsatt mange spørsmål og kontroverser om tilnærmingene, metodene og tolkningen av disse resultatene20.
Mens flertallet av PDXer har vist seg å være genetisk stabile, har vi og andre vist at i sjeldne tilfeller, selv i fravær av behandlinger eller annet eksternt selektivt trykk, kan det være endringer i klonene til svulstene, for eksempel mindre klonovertakelse12,14,15. Dette kan resultere i dramatiske endringer i molekylærprofilen, noe som til slutt vil gjøre at svulsten ikke reflekterer de dominerende klonene i pasientsvulsten12. Mens PDX-er som viser klonal suksesjon kan ha bruk i prekliniske studier, kan mange gener beregnet for målretting (f.eks. Her2) gå tapt med klonal suksesjon. Derfor oppfordres hyppig screening av PDX-modeller for å avgjøre om de fortsatt opprettholder den molekylære profilen til den ønskede klonen.
Oppsummert representerer PDX-modeller et utmerket modellsystem for studier av ikke bare CNS-metastase, men også andre tumortyper. Utvikling av disse modellene har vist at de i stor grad reflekterer den fenotypicske, molekylære profilen og heterogeniteten til human CNS-metastase 8,9,10,12. De tjener som effektive modeller for å studere både CNS-metastasebiologi og fungerer også godt som fysiologisk relevante prekliniske modeller, og erstatter overbrukte cellelinjemodeller som historisk ble brukt til in vivo-studier av CNS-metastase. Utvilsomt eksisterer forskjeller mellom PDX og donorpasienttumor12,18. Å vite hva disse forskjellene er er viktig for riktig planlegging og gjennomføring av prekliniske studier. Til slutt, ved å velge mellom flere inokulasjonsruter, er PDX-modeller allsidige i bruk som tillater studier av flere aspekter av sykdommen. PDX-modeller vil uten tvil spille en viktig rolle i å fremme vår forståelse av CNS-metastase og utvikling av nye terapier.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer.
Acknowledgments
Figur 3A er hentet fra vår forrige publikasjon12 og ble generert i Dr. Jann Sarkarias laboratorium ved Mayo Clinic.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25G needle | VWR | BD305122 | |
| 70 µm Cell strainer | VWR | 21008-952 | |
| 70% ethanol wipes | VWR | 470106-486 | |
| Bone wax | MedVet | W31G-RL | |
| CIEA NOG mouse | Taconic | NOG-F | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | |
| Ethiqa XR (buprenorphine SR) | MWI | 072117 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| gentleMACS C Tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi | 130-095-937 | |
| Hamilton syringe | Sigma | 20919 | |
| Matrigel growth factor reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Ophthalmic ointment | MedVet | PH-PURALUBE-VET | |
| PBS/DPBS | ThermoFisher | 14040133 | |
| Povidone iodine swabs | VWR | 15648-906 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical drill | Stoelting | 58610 | |
| Surgical glue | MedVet | VG3 | |
| Surgical sutures | MedVet | MMV-661-V | |
| Syringe | VWR | 53548-001 | |
| Tumor dissociation kit | Miltenyi | 130-095-929 |
References
- Cruz-Munoz, W., Kerbel, R. S. Preclinical approaches to study the biology and treatment of brain metastases. Seminars in Cancer Biology. 21 (2), 123-130 (2011).
- Owonikoko, T. K., et al. Current approaches to the treatment of metastatic brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 11 (4), 203-222 (2014).
- Salhia, B., et al. Integrated genomic and epigenomic analysis of breast cancer brain metastasis. PLoS One. 9 (1), 85448 (2014).
- Kotecha, R., Gondi, V., Ahluwalia, M. S., Brastianos, P. K., Mehta, M. P.
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Klinghammer, K., et al. A comprehensively characterized large panel of head and neck cancer patient-derived xenografts identifies the mTOR inhibitor everolimus as potential new treatment option. International Journal of Cancer. 136 (12), 2940-2948 (2015).
- Lee, H. W., et al. Patient-derived xenografts from non-small cell lung cancer brain metastases are valuable translational platforms for the development of personalized targeted therapy. Clincal Cancer Research: An Official journal of the American Association of Cancer Research. 21 (5), 1172-1182 (2015).
- Ni, J., et al. Combination inhibition of PI3K and mTORC1 yields durable remissions in mice bearing orthotopic patient-derived xenografts of HER2-positive breast cancer brain metastases. Nature Medicine. 22 (7), 723-726 (2016).
- Oshi, M., et al. Novel breast cancer brain metastasis patient-derived orthotopic xenograft model for preclinical studies. Cancers (Basel). 12 (2), 444 (2020).
- Garman, B., et al. Genetic and genomic characterization of 462 melanoma patient-derived xenografts, tumor biopsies, and cell lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al. A comprehensive patient-derived xenograft collection representing the heterogeneity of melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Tew, B. Y., et al. Patient-derived xenografts of central nervous system metastasis reveal expansion of aggressive minor clones. Neuro-Oncology. 22 (1), 70-83 (2020).
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Davies, N. J., et al. Dynamic changes in clonal cytogenetic architecture during progression of chronic lymphocytic leukemia in patients and patient-derived murine xenografts. Oncotarget. 8 (27), 44749-44760 (2017).
- Eirew, P., et al. Dynamics of genomic clones in breast cancer patient xenografts at single-cell resolution. Nature. 518 (7539), 422-426 (2015).
- Arvanitis, C. D., Ferraro, G. B., Jain, R. K. The blood-brain barrier and blood-tumour barrier in brain tumours and metastases. Nature Reviews. Cancer. 20 (1), 26-41 (2020).
- Choi, S., et al. In vivo bioluminescence imaging for leptomeningeal dissemination of medulloblastoma in mouse models. BMC Cancer. 16 (1), 723 (2016).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Bradford, J. R., et al. Whole transcriptome profiling of patient-derived xenograft models as a tool to identify both tumor and stromal specific biomarkers. Oncotarget. 7 (15), 20773-20787 (2016).
- Yip, H., Haupt, C., Maresh, G., Zhang, X., Li, L. Humanized mice for immune checkpoint blockade in human solid tumors. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (5), 313-320 (2019).
