Summary
이 연구는 마이크로 LED 어레이를 사용한 국소 광 자극 및 심 외막 전위의 동시 광학 매핑을 사용하여 트랜스 제닉 채널 로돕신 -2 (ChR2) 마우스의 손상되지 않은 뮤린 심장의 심장 리듬을 제어하는 방법을보고합니다.
Abstract
심실 빈맥은 전 세계적으로 사망률과 이환율의 주요 원인입니다. 고 에너지 전기 충격을 이용한 전기 제세동은 현재 생명을 위협하는 심실 세동의 유일한 치료법입니다. 그러나 제세동에는 참을 수 없는 통증, 조직 손상, 예후 악화 등의 부작용이 있을 수 있으며, 이는 보다 부드러운 심장 리듬 관리 전략의 개발에 대한 상당한 의학적 필요성을 나타냅니다. 에너지 감소 전기적 접근 방식 외에도 심장 광유전학은 빛에 민감한 막 이온 채널과 광 펄스를 사용하여 심장 활동에 영향을 미치는 강력한 도구로 도입되었습니다. 본 연구에서, 랑겐도르프 관류된 온전한 뮤린 하트의 성공적인 광자극을 위한 강력하고 유효한 방법은 마이크로 발광 다이오드(micro-LED)의 3 x 3 어레이를 적용하는 다중 사이트 페이싱에 기초하여 설명될 것이다. 심 외막 전압파의 동시 광학 매핑을 통해 영역 별 자극의 효과를 조사하고 새로 유도 된 심장 활동을 현장에서 직접 평가할 수 있습니다. 얻어진 결과는 제세동의 효능이 심장 부정맥 동안 광 자극을 위해 선택된 매개 변수에 크게 의존한다는 것을 보여줍니다. 심장의 조명 영역이 종결 성공에 중요한 역할을하며 부정맥 패턴을 수정하기위한 조명 중 심장 활동의 표적 제어가 어떻게 달성 될 수 있는지 입증 될 것입니다. 요약하면, 이 기술은 심장 리듬의 실시간 피드백 제어로 가는 길에 현장 메커니즘 조작을 최적화할 수 있는 가능성을 제공하고, 영역 특이성과 관련하여 비특이적 전기 충격 애플리케이션의 사용과 비교하여 심장계에 대한 잠재적 피해를 줄이는 새로운 접근 방식을 제공합니다.
Introduction
부정맥 동안의 공간-시간 역학에 대한 초기 조사는 심장 세동 동안의 복잡한 전기 패턴이 와류와 같은 회전 여기파에 의해 구동된다는 것을 밝혀 냈습니다1. 이 발견은 부정맥의 기본 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공했으며, 이는 심근 2,3,4의 다중 부위 흥분을 기반으로 한 새로운 전기 종단 요법의 개발로 이어졌습니다. 그러나 전기장 자극을 이용한 치료는 국소적이지 않으며 근육 조직을 포함한 모든 주변 흥분성 세포를 자극하여 세포 및 조직 손상과 견딜 수없는 통증을 유발할 수 있습니다. 전기 요법과 달리 광유전학적 접근법은 높은 공간적 및 시간적 정밀도로 심근세포 활동 전위를 유발하기 위한 특이적이고 조직적인 보호 기술을 제공합니다. 따라서, 광유전학적 자극은 심장세동 동안 혼돈의 활성화 패턴의 최소 침습적 제어의 잠재력을 갖는다.
유전자 조작 5,6,7을 통해 흥분성 세포에 감광성 이온 채널 채널로돕신-2(ChR2)를 도입함으로써 광자극을 사용하여 흥분성 세포의 막 전위의 탈분극이 가능해졌습니다. 신경 네트워크의 활성화, 심장 활동의 제어, 시력 및 청력의 회복, 척수 손상의 치료 및 기타 8,9,10,11,12,13,14를 포함한 여러 의료 응용 프로그램이 개발되었습니다. 심장학에서 ChR2의 적용은 밀리 초 응답 시간15로 인해 상당한 잠재력을 가지며, 부정맥 심장 역학의 표적 제어에 매우 적합합니다.
본 연구에서, 트랜스제닉 마우스 모델의 온전한 심장의 다중 부위 광자극이 보여진다. 요약하면, 트랜스제닉 알파-MHC-ChR2 마우스 라인은 유럽 공동체의 제7차 프레임워크 프로그램 FP7/2007-2013(HEALTH-F2-2009-241526)의 범위 내에서 확립되었으며 S. E. Lehnart 교수가 친절하게 제공했습니다. 일반적으로, 알파-MHC의 제어하에 Cre-재조합 효소를 발현하는 형질 전환 성인 남성 C57 / B6 / J는 암컷 B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sortm27.1 (CAG-COP4 * H134R / tdTomato) Hye / J와 짝을 이루었다. 심장 STOP 카세트가 2 세대에서 결실 되었기 때문에, 자손은 안정한 MHC-ChR2 발현을 보였고 심장 감광성 콜로니를 유지하는데 사용되었다. 모든 실험은 36-48 주령의 두 성별의 성인 마우스로 수행되었습니다. 조명은 실리콘 기반 하우징과 짧은 광학 유리 섬유가 구현되지 않는 것을 제외하고는16,17에 설명된 바와 같이 제작된 3 x 3 마이크로 LED 어레이를 사용하여 달성됩니다. 심장 응용 프로그램에서 첫 번째 사용은18에서 발견됩니다. 유사한 제조 기술에 기초한 선형 마이크로 LED 어레이가 심장 페이싱(19)을 위한 관통 프로브로서 적용되었다. 마이크로 LED는 550μm 피치에서 3 x 3 어레이로 배열되어 매우 작은 영역에서 높은 공간 분해능과 높은 복사 전력을 모두 제공합니다. 저자는이 연구에서 새로운 항 부정맥 치료 방법을 개발할 수있는 다재다능한 국소 다중 사이트 광 자극을 보여줍니다.
다음 실험 프로토콜은 역행 Langendorff ex vivo 관류를 포함하며, 이에 대해 캐뉼러 대동맥은 관류 입구로 기능합니다. 적용된 관류 압력과 심장 수축으로 인해 관류액은 대동맥에서 분기되는 관상 동맥을 통해 흐릅니다. 제시된 작업에서 심장은 관류 저장소를 1m 높이(73.2mmHg에 해당)로 상승시켜 달성한 일정한 압력 설정을 사용하여 관류되며, 이는 2.633± 0.583mL/min의 유속을 산출합니다. 두 종류의 Tyrode 용액이 실험 중에 관류수로 사용됩니다. 일반 Tyrode의 솔루션은 안정적인 부비동 리듬을 지원하는 반면, Low-K+ Tyrode의 솔루션은 Pinacidil과 혼합되어 쥐 심장에서 부정맥을 유도할 수 있습니다. 육각형 수조를 사용하면 6 개의 다른 평면 창을 통해 심장을 관찰 할 수 있으므로 굴절에 의한 왜곡이 적은 여러 광학 구성 요소의 결합이 가능합니다.
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Protocol
모든 실험은 독일 법률, 지역 규정 및 유럽 실험실 동물 과학 협회 연맹 (FELASA)의 권고에 따라 동물 복지 규정을 엄격히 따랐습니다. 동물 실험 승인 신청은 담당 동물 복지 당국의 승인을 받았으며 모든 실험은 동물 복지 담당자에게보고되었습니다.
1. 실험 준비 및 재료
- 광학 매핑 설정
노트: 광학 설정과 전기 설정은 그림 1에 나와 있습니다. 광학 및 전기 설정에 사용되는 모든 구성 요소는 재료 표에 자세히 나열되어 있습니다.- 부정맥 및 백업 제세동 유도를 위해 LED 1 및 LED 2를 사용하십시오. ChR26의 여기 파장의 피크인 475nm 근처에서 파장 λ파란색을 가진 고전력 LED를 선택하십시오. 광학 스펙트럼을 더 좁히려면 470nm ± 20nm 대역통과 필터를 사용하십시오.
참고 :이 작업에서 LED 1 및 LED 2는 데이터 시트 3.9에 따라 5.3W에서20W의 일반적인 복사 플럭스를 갖습니다. - 중심 파장이 λ 적색 = 625nm이고 복사 플럭스가 700mW21 인 빛을 방출하는 고출력적색 LED (그림 1의 LED 3)로 광학 매핑을 위해 심 외막을 비춥니다. 적색광은 628 ± 20nm 대역통과 필터로 필터링되고 차단 파장이 λ DM = 685nm인 장편 다이크로익 미러(DM)에 의해 반사됩니다.
- λfilter-cam = 775 ± 70nm의 방출 필터를 카메라 대물렌즈 앞에 사용하여 심장 활동의 형광 방출만 기록합니다. 저조도 응용 분야에 적합한 빠른 대물렌즈를 사용하십시오.
참고: 마우스 심장의 세동 빈도는 20Hz에서 35Hz 사이입니다. 따라서 1-2kHz 이상의 주파수로 녹화할 수 있을 만큼 충분히 빠른 카메라를 사용하십시오.
- 부정맥 및 백업 제세동 유도를 위해 LED 1 및 LED 2를 사용하십시오. ChR26의 여기 파장의 피크인 475nm 근처에서 파장 λ파란색을 가진 고전력 LED를 선택하십시오. 광학 스펙트럼을 더 좁히려면 470nm ± 20nm 대역통과 필터를 사용하십시오.
- 마이크로 LED 어레이
참고 : 여기에 적용된 마이크로 LED 어레이는 다른 곳에서 자세히 설명 된 마이크로 시스템 처리를 사용하여 실현됩니다16,17.- 5μm 두께의 폴리이미드(PI) 층을 4인치 실리콘 기판(단면 광택, 525μm 두께)에 스핀 코팅합니다.
- 이 PI 층을 질소 분위기 하에서 최대 온도 450°C에서 경화시킨다. 최대 온도를 10 분 동안 일정하게 유지하십시오.
- 자외선(UV) 리소그래피를 사용하여 이미지 반전 포토레지스트(PR)를 증착 및 패터닝하고 스퍼터링하여 250nm 박막 백금층(Pt)을 증착한다.
- 마스킹 층 역할을하는 패턴화 된 PR과 함께 1μm 두께의 금 (Au) 층을 전기 도금하여이 Pt 기반 금속 화를 두껍게합니다.
- 두 번째 PI 층을 스핀 코팅하기 전에 첫 번째 PI 층과 Au 전기 도금 금속 화가 있는 웨이퍼를 PI 층의 표면을 화학적으로 활성화하는 산소 플라즈마에 노출시킵니다.
- 제2 PI층을 다시 450°C에서 경화시키고, UV 리소그래피를 적용하여 PR층을 패터닝하고, 패터닝된 PR을 마스킹층으로 사용하여 반응성 이온 에칭(RIE)하여 마이크로 LED 칩과 인터페이스된 인쇄회로기판(PCB)용 어레이의 접촉 패드를 개방한다.
참고: 이 RIE 공정 단계에서는 각각 200W 및 100W를 10분 및 30분 동안 적용하여 접촉 패드 개구부와 2차원(2D) 마이크로 LED 어레이의 외부 모양을 정의하는 것이 좋습니다. - 용매와 플라즈마 에칭을 사용하여 PR을 벗겨냅니다. 추가로 6μm 두께의 금 층을 전기 도금하여 접촉 패드를 더욱 두껍게합니다.
- 플립 칩 본더를 사용하여 마이크로 LED 칩을 접촉 패드에 부착합니다.
- 산소 플라즈마에서 PI 표면을 활성화하고 무용제 접착제로 마이크로 LED 칩을 언더필합니다. 이어서 접착제를 120°C에서 12시간 동안 경화시킨다.
- 마이크로 LED 칩을 캡슐화하려면 아르곤으로 다른 플라즈마 처리를 수행하고 얇은 불소 중합체 층을 수동으로 적용하십시오. 이 층을 80°C에서 1시간 동안 예비경화시킨다.
- 마이크로 LED 어레이를 산소 플라즈마에 노출시킨 후 최종 캡슐화층으로서 실리콘을 수동으로 적용하여, 하부의 불소 중합체 층에 대한 실리콘 접착력을 향상시키기 위해 사용하였다. 실리콘 층을 80°C 및 180°C에서 각각 1시간 동안 경화시킨다. 이러한 최종 경화 단계는 또한 불소 중합체 층을 완전히 경화시킵니다.
- PI 기판의 접촉 패드를 어레이를 외부 계측기에 상호 연결하기 위한 스트립 커넥터를 운반하는 인쇄 회로 기판에 납땜합니다. 접착제를 사용하여 PCB의 솔더 패드를 덮으십시오.
- 전기 설정
- 심전도(ECG)를 기록하는 데 적합한 전극(예: 은/염화은 전극 또는 단일성 활동 전위(MAP) 전극 및 ECG 증폭기를 사용하여 심장의 전기적 활동을 지속적으로 모니터링합니다. 또한 적절한 획득 장치(AD)를 사용하여 획득한 모든 전기 신호를 기록하십시오.
- 각 장치에 적용되는 최대 전류를 관리할 수 있는 고전력 LED(LED 1, LED 2 및 LED 3)에 적합한 드라이버를 선택하십시오. 임의 함수 발생기(AFG)를 사용하여 LED 드라이버의 출력을 정확하게 제어합니다.
- 다중 채널 LED 드라이버를 사용하여 마이크로 LED 어레이를 통해 흐르는 전류를 제어합니다. 여러 출력이 있는 AFG도 이 작업에 적합합니다.
알림: 전류를 마이크로 LED의 최대 전류로 제한하는 LED 드라이버를 선택하는 것이 좋습니다., 그렇지 않으면 다이오드가 손상될 수 있습니다. 다중 채널 마이크로 LED 드라이버의 일 예가 다른 작품(18)에 설명되어 있다. 필요한 경우 AFG 또는 기타 LED 드라이버를 컴퓨터에 연결하여 마이크로 LED 설정을 원격으로 제어할 수 있습니다. 이 경우 LED 드라이버를 선택한 통신 프로토콜(예: 범용 인터페이스 버스(GPIB) 또는 직렬 연결)을 사용하여 컴퓨터에 연결합니다.
2. 실험 절차
- 용액 준비
- 티로드 용액을 준비하십시오 : 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 24 mM NaHCO3, 1.8 mM CaCl 2,1.2 mM KH2PO4, 5.6 mM 포도당, 0.1 % BSA / 알부민.
- Low-K+ Tyrode의 솔루션 준비: Low-K+ Tyrode는 KCl의 절반만 추가된다는 점을 제외하고는 일반 Tyrode의 솔루션과 동일한 방식으로 만들어집니다(4mM KCl 대신 2mM).
참고 : 3 시간 동안 지속되는 실험의 경우 일반적으로 2-3L의 Low-K + Tyrode (광학 매핑이 수행되는 경우 Blebbistatin (2.1.5 단계)와 추가로 혼합) 및 1-2L의 일반 Tyrode로 충분합니다. - Low-K+ Tyrode의 용액에 Pinacidil을 추가하여22에 설명된 대로 부정맥 유도 과정을 용이하게 하여 100mM 농도를 얻습니다. Pinacidil을 취급 할 때는 보호 실험실 장갑을 착용하십시오.
- 일반 티로드 용액으로 50μM DI-4-ANBDQPQ 1mL를 준비합니다. 광표백을 방지하기 위해 염료를 빛으로부터 보호하십시오.
- 블레비스타틴의 10mM 스톡 용액을 만드십시오. 광학 매핑을 위해 블레비스타틴을 100mM 피나시딜-티로드 용액(단계 2.1.3)과 혼합하여 5μM 용액을 얻습니다. 블레비스타틴을 취급 할 때는 보호 실험실 장갑을 착용하십시오.
알림: 광학 매핑이 시작될 때까지 염료와 Blebbistatin 용액을 모두 따로 보관하십시오.
- 랑겐도르프 관류
알림: 설정은 두 개의 Tyrode 솔루션을위한 두 개의 저장소로 구성됩니다. 그들은 3 방향 자지가있는 튜브를 통해 버블 트랩에 연결됩니다. 심장은 나중에 Luer 잠금 커넥터에 의해 버블 트랩에 부착 된 다음 육각형 수조에 매달려 있습니다. 수조는 사용 된 Tyrode의 용액을 수집하기 위해 폐기물 용기에 연결됩니다.- 완전히 탈염된 물로 모든 실험 전에 모든 튜브를 청소하십시오.
- 실험을 시작하기 전에 실온에서 30 분 동안 Carbogen (5 % CO 2 및 95 % O2)으로 Tyrode의 용액을 모두 폭기하십시오. Tyrode 용액의 pH 값을 NaOH로 7.4로 조정하십시오.
- 해당 저장소에 각 Tyrode의 용액 500mL를 채우고 튜브 또는 버블 트랩에 더 이상 갇힌 기포가 보이지 않을 때까지 관류 시스템을 통해 Tyrode의 용액을 실행하여 튜브와 버블 트랩을 탈기합니다.
- Carbogen을 사용하여 저장소에서 전체 실험 중에 Tyrode의 용액을 계속 폭기하여 관류 중에 향수의 pH가 나중에 안정적으로 유지되도록합니다.
- 물 열 펌프로 관류 시스템을 37°C로 가열합니다. 방수 가열 케이블과 같은 추가 발열체를 사용하여 수조 내에서 향수 온도를 일정하게 유지하십시오.
알림: 실험 중에 Tyrode의 저수지가 비워지기 전에 다시 채우는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 기포가 심장에 들어가 혈관을 막아 허혈을 유발할 수 있습니다.
- 마우스 준비
- 심장 격리 절차 30 분 전에 500 I.E. 헤파린 0.1 mL를 피하 주사하십시오.
- 6cm 페트리 접시와 2mL 주사기에 얼음처럼 차가운 Tyrode의 용액을 채 웁니다. 실체 현미경 아래에 놓습니다.
- 포화 이소 플루 란 환경에서 2 분 동안 마우스의 짧은 시간 마취를 수행하고 그 후 즉각적인 자궁 경부 탈구를 수행하십시오.
참고: 충분한 마취를 확인하려면 발가락 반사 음성을 확인하는 것이 절대적으로 필요합니다. - 다른 곳에서 설명한대로 가슴을 열고 심장을 제거하고23을 제거한 다음 얼음처럼 차가운 Tyrode의 용액으로 6cm 페트리 접시에 넣습니다. 심장 박동은 온도 강하로 인해 감소합니다.
- 실체 현미경으로 미세 준비를 수행하고, 다른 곳에서 자세히 설명한대로23. 대동맥을 무딘 바늘에 부착하고 봉합사 재료로 혈관을 고정하십시오.
- 대조군으로 바늘을 통해 얼음처럼 차가운 Tyrode의 용액을 심장에 주입하고 심장이 단단히 장착되어 있는지 확인하십시오. 이 단계는 또한 심장에서 남은 혈액을 씻어냅니다.
- 장착 된 심장을 관류 시스템으로 옮깁니다. 바늘을 버블 트랩에 연결하는 동안 공기가 심장으로 들어가는 것을 방지하기 위해 향수가 흐르고 있는지 확인하십시오. 심장이 수조에서 Tyrode의 용액으로 덮여 있는지 확인하십시오. 2.3.4, 2.3.5 및 2.3.7단계는 그림 2에 나와 있습니다.
- 몇 분 안에 심장이 뛰기 시작하는지 확인하십시오. 심장이 15분에서 20분 동안 관류 설정에 적응하도록 한 다음 광학 매핑을 수행해야 하는 경우 Pinacidil(단계 2.1.3)이 있는 low-K+ Tyrode 용액으로 전환하고 Pinacidil 및 Blebbistatin(단계 2.1.5)을 사용하는 low-K+ Tyrode 용액으로 전환합니다.
- 부정맥 유도 및 광학 제세동
- 좋은 신호 품질을 보장하기 위해 ECG 전극 중 하나를 심장 표면에 최대한 가깝게 배치하십시오. Tyrode의 용액에 두 번째 ECG 전극을 현탁시킵니다. 획득 한 ECG가 선택한 AD에 의해 기록되고 있는지 확인하십시오.
- 마이크로 LED 어레이를 연구의 관심 영역, 예를 들어 좌심실에 놓습니다.
- Pinacidil을 사용하여 관류를 낮은 K + Tyrode로 변경하고 15-30 분 동안 심장을 관류하십시오.
- 부정맥을 유도하기 위해, 25 내지 35 Hz의 주파수 f ind, 2 내지 15 ms의 펄스 지속 시간 Wind, 및 2.8 mW mm-2의 광도 LIopt_ind을 갖는 20 내지 50 광 펄스의 트레인으로 LED 1 및 LED 2로 심장을 비춘다.
- 부정맥이 유발 될 때까지이 과정을 반복하십시오.
알림: 부정맥은 신호의 주파수와 형태가 정상적인 부비동 리듬과 다르기 때문에 ECG 신호에서 쉽게 식별할 수 있습니다. 부정맥이 다음 5초 이내에 종료되면 자가 종결로 분류하고 새로운 유도 시도를 시작합니다. - 지속적인 부정맥이 육안으로 감지되면 15mA의 펄스 전류 I 펄스에서 어레이의 3, 6 또는 9 마이크로 LED를 사용하여 폭 Wdef 및 주파수 fdef가 다른펄스 버스트를 적용하여 광도 LIμLED = 33.31 ± 2.05mW mm-2를 생성합니다.
- 5번의 마이크로 LED 어레이 기반 제세동 시도 후에도 부정맥이 계속되면 시도를 실패한 것으로 분류하고 백업 제세동을 시작합니다.
- 백업 제세동의 경우 마이크로 LED 어레이에 설정된 것과 동일한 타이밍 매개변수를 사용하여 LED 1 및 LED 2를 사용합니다.
참고: 심장은 전체 실험 기간 동안 허혈성 및 대사성 스트레스에 노출되기 때문에 백업 제세동으로도 부정맥의 종결 시도가 실패할 수 있습니다. 이런 일이 발생할 때마다 관류 용액을 일반 Tyrode 용액으로 변경하고 심장이 5-10 분 동안 회복되도록하십시오. ECG가 부비동 리듬으로 돌아 오면 2.4.3 단계의 프로토콜을 다시 반복하십시오.
- 광학 매핑
- 2.1.5단계에서 준비한 블레비스타틴 용액으로 심장을 관류하고 기계적 분리가 발생할 때까지 기다립니다. 이것은 심장 박동이 멈출 때 수행되지만 ECG 신호는 여전히 측정 가능합니다.
참고: Blebbistatin 용액을 언급된 농도에 혼합하고 이 용액으로 심장을 관류된 상태로 유지하면 전체 실험 동안 전기적 활동에서 분리된 심장의 기계적 활동이 유지됩니다. - 1 mL 전압 염료 DI-4-ANBDQPQ (단계 2.1.4에서 제조)를 Langendorff 관류의 버블 트랩에 볼루스로서 수득하였다. 염료가 심장을 균일하게 관류 할 수 있도록 5-10 분 동안 기다리십시오.
알림: 녹음이 이루어지지 않을 때마다 빨간색 표시등을 꺼서 염료의 광표백을 피하십시오. 기록의 신호 대 잡음비가 너무 작아지면(수집된 신호에 잡음이 너무 많음) 2.1.4단계와 2.5.2단계를 반복합니다. - 카메라를 심장 표면에 초점을 맞추고 LED 3을 켠 다음 1.27mW mm-2 광 전력을 인가합니다.
- 실험실 조명을 끄고 녹음을 시작하십시오. 획득한 신호의 주파수를 기록된 ECG의 주파수와 비교하여 광 신호가 수집되고 있는지 확인하십시오. 이것은 획득 된 광 신호가 순전히 심장의 전기적 활동과 관련이 있음을 보장합니다.
참고: 염료에서 방출되는 형광광은 매우 일주일이기 때문에 광학 매핑은 어두운 방에서 수행됩니다. 이렇게 하면 다른 광원의 신호 간섭을 방지할 수 있습니다.
- 2.1.5단계에서 준비한 블레비스타틴 용액으로 심장을 관류하고 기계적 분리가 발생할 때까지 기다립니다. 이것은 심장 박동이 멈출 때 수행되지만 ECG 신호는 여전히 측정 가능합니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 25Hz와 35Hz 사이의 주파수 find와 2ms와 10ms 사이의 펄스 지속 시간 Wind를 갖는 LED 1 및 LED 2 (그림 1)에 의해 생성 된 광 자극 펄스를 사용하여 손상되지 않은 쥐 심장에서 심실 부정맥의 유도를 허용합니다. 이러한 빠른 광 펄스의 목적은 심장 리듬을 포착하는 것이 아니라 심장 활동의 균형을 깨뜨려 불규칙한 전기파가 생성되어 부정맥을 촉진하는 것입니다. 전기 자극으로 유도하는 것보다 빛으로 부정맥을 유도하는 이점은 ECG에서 인공물이 유발되지 않아 제한없이 획득 한 신호를 사후 분석하고 빠른 페이싱 동안 심장의 전기적 반응을 평가할 수있는 가능성을 제공한다는 것입니다.이 사실은 또한 광 제세동 동안 심장 행동을 관찰 할 수있는 가능성을 제공합니다. 이것은 전기 유도 또는 제세동 방법으로는 불가능합니다. 그럼에도 불구하고, 사용된 셋업이 예를 들어, 장소 제약으로 인해 외부 고전력 LED의 사용을 허용하지 않는 경우, 다른 곳(3,22,24)에 도시된 바와 같이, 부정맥을 유도하기 위해 추가적인 페이싱 전극이 심장에 배치될 수 있다.
세동이 유도되면 부정맥이 지속되도록 최소 5초 동안 지속되어야 하며, 그 후 마이크로 LED 기반 제세동 시도가 시작됩니다. 기본 주기 길이 또는 우성 주파수, 진폭 및 형태와 같은 심장 부정맥의 주요 매개변수가 지속적으로 변화하고 있으며 현재까지 어떤 광제세동 매개변수가 최상의 결과를 제공하는지 예측할 수 없기 때문에 주파수, 펄스 폭, 광 자극 및 종단 속도의 영역. 따라서 서로 다른 주파수 f def, 마이크로 LED 수 및 펄스 지속 시간 Wdef를 사용한 일련의 실험을 테스트하고 그림 3과 같이 N = 11 마우스에 대한 성공률을 추출했습니다.
1-20ms 기간의 펄스가 서로 다른 성공률로 변형될 수 있음을 입증할 수 있습니다(그림 3). 단계 2.4.6에서 언급한 바와 같이 광도 LIμLED 가 모든 광자극 펄스 동안 일정하게 유지되었고, 9개에 대한 3개의 마이크로 LED의 성공률이 현저히 낮기 때문에, 제시된 결과는 심장에 덮인 영역, 마이크로 LED의 수, 따라서 적용된 총 복사 플럭스가 제세동을 달성하는 데 중요한 요소임을 시사합니다. 어레이의 모든 마이크로 LED가 Lambertian 광원이고 조직까지의 대략적인 거리가 0이되도록 심장 표면에 직접 위치한다는 점을 고려할 때, 단일 마이크로 LED를 사용할 때 심장의 조명 영역의 조도 윤곽은A μLED = 0.059 mm², 도25 에 도시된 바와 같이 편평한 직사각형 LED에 대하여. 게다가, 일부 광자는 가장자리에서 측면으로 마이크로 LED를 떠날 수 있지만, 총 광도에 대한 광자의 기여도는 너무 작아서 그 효과를 무시할 수 있습니다. 어레이의 조사 된 빛을 정량화하기 위해 저자는 상용 전력계로 마이크로 LED 어레이의 복사 플럭스를 측정하고 표 1과 같이 심장에 도달하는 광도를 계산했습니다. 표 1 에서 사용된 마이크로 LED의 수에 따라 복사 플럭스가 증가하지만 광도는 앞서 언급한 조명 프로파일 의미로 인해 일정하게 유지된다는 것을 읽을 수 있습니다.
흥미롭게도 제세동 주파수 f def = 18Hz및 f def = 20Hz에서 W def = 1ms(그림 3a) 및 W def = 20ms(그림 3d)인 9개의 LED의 성공률도 비교적 높다는 것을 관찰할 수 있습니다. 유도 된 부정맥의 평균 빈도가 22.55 ± 4.03 Hz라는 것을 고려할 때,이 사실은 ChR2 쥐 심장의 경우 페이싱 빈도가 부정맥 빈도에 가까울수록 성공률이 크게 증가한다는 것을 나타낼 수 있습니다. 이것은 수치 시뮬레이션(26)에서도 나타난다. 그러나 이것은 복잡한 부정맥의 지배적 인 빈도가 끊임없이 변화하기 때문에 쉽게 일반화 할 수 없습니다. 이를 설명하기 위해 그림 4는 fdef = 14Hz인 두 가지 다른 제세동 시도를 보여줍니다. 도 4a)에서 심전도 세그먼트의 시작 부분에 심전도 신호의 형태에 따라 심실세동(VF)이 도시되어 있다. 마이크로 LED 광 자극이 시작되면 세동이 심실 빈맥 (VT) 일 가능성이 더 높은 더 질서 정연한 패턴으로 바뀝니다. 마이크로 LED 어레이가 꺼질 때마다 원래의 혼란스러운 VF 파가 다시 이어집니다. 따라서 부정맥은 종료되지 않습니다. 이 예에서는 VF를 지정된 매개변수로 종료할 수 없지만 방해를 받고 보다 규칙적인 패턴(VT)으로 변경할 수 있습니다. 그림 4b 세그먼트 1은 광 자극이 시작될 때까지 24Hz의 주 주파수가 약간 증가하고 VF가 세그먼트 2에서 VT로 바뀌고 주 주파수가 14Hz로 떨어지는 것을 보여줍니다. 또한, 도 4c는 도 4a에서와 동일한 f def로 종결될 수 있지만, 상이한 W def를 갖는 VT를 도시한다. 첫째, 마이크로 LED 광 자극은 부정맥의 형태를 변경하여 최종적으로 19번째 펄스부터 1 : 1 페이싱 캡처로 종료합니다. 이러한 결과는 광제세동 매개변수, 예를 들어 Wdef가 시간 경과에 따른 부정맥의 형태 변화에 적응해야 함을 의미할 수 있습니다. 이러한 결과로 이어지는 실험은 활동 전위 지속 시간 (APD)27의 결과 변화로 인해 Blebbistatin을 사용하지 않고 수행되었습니다. 따라서 이러한 시리즈에서는 광학 매핑이 수행되지 않았습니다.
또 다른 실험 세트는 적색 이동 전위차 염료를 사용하여 광학 매핑을 위해 수행되었습니다 (단계 2.1.4). 고속 카메라를 사용한 광학 매핑을 통해 부비동 리듬 (그림 5) 및 복잡한 빈맥부정맥 28 동안 심장 표면에서 전파되는 여기 파를 관찰 할 수 있습니다. 전위차 염료의 분수 변화가 매우 낮기 때문에, 얻어진 비디오는 수학적 프로그래밍 언어를 사용하여 후 처리되었다. 광 신호의 품질을 향상시키는 첫 번째 단계는 표준 편차가 σ = 1 인 가우스 평활 필터를 적용한 다음 코너 주파수 f high = 0.1Hz및 f low = 70Hz의 대역 통과 필터를 적용하여 노이즈를 제거하는 것입니다. fhigh 의 저지대역은 3Hz
그림 1: 전기 및 광학 설정의 개략도. (a) LED 1 및 LED 2는 부정맥 및 백업 제세동 유도에 사용되는 청색 광원을 제공합니다. LED 3은 적색 이동 염료 DI-4-ANBDQPQ의 여기 광원으로 사용됩니다. 붉은 빛은 이색성 거울 DM을 통해 심장으로 향합니다. 진한 빨간색으로 표시된 방출광은 텍스트에서 언급한 대로 방출 필터를 통해 고속 카메라에 의해 기록됩니다. LED 2 및 ECG 전극은 단순화를 위해 표시되지 않습니다. (b) 빨간색으로 표시된 기록 된 ECG 신호의 한 세그먼트. 진한 파란색은 세동을 유도하는 데 사용되는 주파수 f ind = 35Hz 및 Wind = 4ms에서 LED 1 및 LED 2로부터의 광 펄스를 나타냅니다. 광 자극을 마친 직후 심실 세동 (VF)이 관찰 될 수 있습니다. 하늘색 (fdef = 16Hz, Wdef = 20ms)으로 표시된 마이크로 LED 기반 광 자극은 부정맥을 성공적으로 종료합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 심장 준비 . (a) 온전한 심장과 주변 장기를 보여주는 쥐의 열린 가슴. (b) 추가 준비를 위해 얼음처럼 차가운 Tyrode의 용액에 담근 이식 된 심장. (c) 무딘 바늘에 제대로 부착 된 마우스 심장. (d) Tyrode의 용액에 매달린 뮤린 심장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 실험적으로 추출된 성공률. N = 11에 대해 서로 다른 펄스 지속 시간 W def 및 주파수 fdef에서 3개, 6개 및 9개의 LED를 사용하는 30개의 마이크로 LED 기반 광 자극 펄스의 성공률. 평균 SEM의 표준 오차와 함께 표시된 오차 막대 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 광 자극을 통한 심장 리듬 조작. (a) 종료되지 않은 부정맥의 ECG 기록 세그먼트. (b) 패널 a에 표시된 ECG의 스펙트로그램. 세그먼트 (1)의 전력 스펙트럼 밀도 (PSD)는 24Hz의 우세 주파수를 갖는 부정맥을 나타낸다. 세그먼트 (2) 표시된 매개 변수로 광 자극. 지배적 인 주파수가 14Hz로 떨어지는 것을 관찰 할 수 있습니다. 세그먼트 (3) 실패한 종료 및 24Hz의 지배적 인 주파수로 부정맥 행동으로 돌아갑니다. (c) 성공적인 제세동 시도의 ECG. (d) 패널 c에 표시된 성공적인 종료의 스펙트로그램. 세그먼트 (1)은 23 Hz의 우세 주파수를 갖는 심실 빈맥 (VT)을 나타낸다. 세그먼트 (2) 표시된 설정을 사용한 광 자극. 세그먼트 (3)은 성공적인 종료를 표시하여 기본 주파수 3.5Hz의 정상적인 부비동 리듬과 그에 따른 고조파로 이어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 전체 심장의 광학 매핑. 정상적인 부비동 리듬에서 심장의 단일 박동 동안 형광 강도의 변화가 표시됩니다. 심장은 오른쪽과 왼쪽 심실이 보이도록 카메라를 향하도록 배치되었습니다 (RV, LV). 별표는 맨 위에 표시된 활동 전위가 취해진 픽셀을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 마이크로 LED의 수 | 조사 영역 Aμled [mm2] | 복사 플럭스 φ [mW] | 광도 LI [mW mm-2] |
| 3 | 0.178 | 5.9 ± 0.47 | 33.11 ± 2.66 |
| 6 | 0.356 | 11.91 ± 0.84 | 33.42 ± 2.37 |
| 9 | 0.535 | 17.85 ± 0.61 | 33.39 ± 1.14 |
표 1: 마이크로 LED 어레이의 측정된 복사 플럭스와 해당 광도.
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Discussion
심장 빈맥의 성공적인 치료는 심장 치료의 핵심입니다. 그러나 부정맥 개시, 영속 및 종료의 기초가되는 생물 물리학 적 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다. 따라서 심장 연구는 부정맥의보다 부드러운 종결을 위해 전기 충격 요법을 최적화하여 환자 28,29,30,31의 삶의 질을 높이는 것을 목표로합니다. 저에너지 전기적 접근은 심각한 부작용의 상당한 감소를 약속하지만 여전히 원치 않는 근육 흥분을 유발할 수 있습니다. 심장 광유전학은 이러한 한계를 극복하고 조직-연질 종결 기술뿐만 아니라 온전한 쥐 심장 및 세포 배양에서 와류-유사 흥분파의 부정맥-특이적 표적 제어를 조사하기 위한 유연한 플랫폼을 제공할 수 있다32,33.
이러한 동기를 감안할 때, 강력한 광 자극 설정과 프로토콜이 설계 및 구현되었으며, 둘 다 고도로 적응 가능한 광학 시스템을 제공하며, 이는 3차원 파노라마 광학 매핑 연구(34)로 쉽게 확장될 수 있습니다.
심장 부정맥은 광 자극을 위해 선택된 매개 변수, 예를 들어 심장의 조명 영역에 따라 다른 성공률로 성공적으로 종료 될 수 있음을 보여줄 수 있습니다. 제시된 결과는 도22에 나타난 바와 같이 전도 차단에 의해 혼돈 활성을 소화시키는 임계 수의 심근 세포를 모집하여 조사된 표면을 증가시킨다는 것을 시사한다. 이 연구에서 광이체에 필요한 에너지는 E = 10.69 ± 0.37mJ입니다(9개의 마이크로 LED 사용, 30펄스 및 펄스 폭 Wdef = 20ms). 이것은 E 22 = 228.8 mJ 및 E 24 = 153.6 mJ로 22,24에서 이전에보고 된 것보다 낮은 것으로 밝혀졌으며, 여기서 더 큰 영역 22 또는 전체 심장 24가 각각 조명되었습니다. 그럼에도 불구하고, 잘 구분된 패턴화된 영역이E35 = 1.8mJ를 초래하는 10개의 광제세동 펄스로 조명되는 35에 도시된 접근법과 비교하여, 본 연구에서의 광제세동 에너지는 현저하게 더 높다. 다른 세 가지 접근 방식과 달리 제시된 프로토콜로는 90% 이상의 성공률에 도달할 수 없었습니다. 더 높은 광제세동 에너지에도 불구하고 성능이 저하되는 한 가지 가능한 이유는 근본적인 부정맥의 복잡성이 고려되지 않았기 때문일 수 있습니다. 심장의 작은 영역을 조명하고 동시에 부정맥의 공간-시간 역학을 측정함으로써 높은 종결률이 달성되는 35에 제시된 결과와 관련하여, 제시된 접근법은 피드백 제어를 고려함으로써 확실히 더욱 향상 될 수 있으며, 이는 심장의 현재 상태에 따라 마이크로 LED 조명의 다른 패턴으로 반응한다. 또한, 부정맥이 항상 현재의 방법으로 종결 될 수는 없지만, 광 자극 중에 본질적인 복잡한 역학이 방해되어보다 질서 정연한 시간 상태로 이어질 수 있음이 입증되었습니다. 도 36에 나타난 바와 같이, 종결률은 단형(더 정렬된) 및 다형성(덜 정렬된) 부정맥을 다룰 때 유의하게 다르다. 따라서 더 나은 제세동 속도를 향한 논리적 단계는 VF 에피소드 동안 심장 역학에 영향을 미치고 부정맥을 덜 복잡한 패턴으로 바꾸고 다른 펄스 세트로 종료하여 이러한 방식으로 2단계 광 자극 접근 방식을 구축하는 것일 수 있습니다.
관류 프로토콜과 관련하여 가장 중요한 단계는 심장의 올바른 추출 및 준비와 광학 매핑 광학의 올바른 조정에서 발견됩니다. 광학 맵핑을 포함하는 것은 엄격하게 염료 스펙트럼의 적절한 선택, 적절한 여기 광원 및 카메라(29)에 대한 잘 선택된 광학 필터를 필요로 한다. 그렇지 않으면 기록 된 광 신호가 너무 시끄럽고 염료 여기가있는 광 자극의 혼선이 포함될 수 있습니다. 따라서 후속 분석에서는 여러 분석 필터를 사용한 신호의 후처리가 필요하고 이미지 평활화가 종종 악화됩니다.
이 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 마이크로 LED 어레이의 정확하고 정확한 배치입니다. 마이크로 LED 어레이와 드라이버 사이의 상호 연결 리드는 매우 얇고 유연하기 때문에 어레이가 각 실험에 대해 심장 표면의 거의 동일한 위치에 위치하도록 하는 것이 때때로 어렵습니다. 위치 지정을 용이하게 하고 마이크로 LED 어레이의 획득된 위치를 고정하기 위해 홀더를 3D로 설계 및 인쇄하여 어레이를 마이크로 매니퓰레이터에 부착할 수 있습니다. 이렇게하면 Tyrode의 솔루션에서 배열의 이동을보다 잘 제어 할 수 있습니다. 마이크로 LED 어레이의 상호 연결 리드에 대해 선택한 재료에 따라 홀더를 사용할 필요가 없을 수도 있습니다.
게다가, 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 Pinacidil37과 같은 전 부정맥 약물의 추가입니다. 여러 화합물이 심장의 생리적 반응을 변화시키는 것으로 잘 알려져 있기 때문에 결과를 분석하고 해석 할 때이를 고려해야합니다. 광학 매핑에 관한 한, 제안 된 프로토콜은 Blebbistatin을 기계적 언 커플러로 사용합니다. 이는 레코딩 중에 모션 아티팩트를 제거하는 장점이 있지만, APD(27)를 연장시킬 수도 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해 기록 중 모션 추적 방법을 분석하는 것은38,39를 고려할 수 있습니다. 이렇게하면 심장의 정상적인 생리적 상태가 유지되고 고품질 신호를 얻을 수 있습니다.
제시된 프로토콜이 다중 사이트 광 제세동에 사용될 수 있음이 입증되었지만 여전히 몇 가지 한계가 있습니다. 어떤 경우에는 미세 LED 기반 광 자극에 의해 세동을 종결시킬 수 없으며 방해 만 받아 주파수 변화를 초래하는 것으로 밝혀졌습니다. 한 가지 가설은 심장의 구불구불한 파동이 좌심실에서만 옮겨져 심장의 다른 부분에서 재생된다는 것입니다. 글로벌 일루미네이션(24)과 같은 다른 방법과 비교하여, 본 방법은 심장의 커버리지가 더 작기 때문에 더 낮은 성공률을 제공한다. 그러나 나선형 활동의 적절한 하드웨어 기반 인식 방법을 사용하면 종료 성공률을 향상시킬 수 있다고 확신합니다.
결론적으로, 제시된 광 자극 시스템은 심장 부정맥의 다중 심장 율동 전환 접근법 및 조작 연구를위한 강력한 실험 도구를 확립합니다. 이 시스템에서 배운 지식은 임상 적으로 관련된 대형 동물 모델에서 새로운 잠재적 (사진) 제세동 프로토콜을 조사하고 평가하는 데 사용됩니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 실험 중 탁월한 기술 지원에 대해 Marion Kunze와 Tina Althaus에게 감사드립니다. 결과로 이어지는 연구는 보조금 계약 번호 HEALTH-F2-2009-241526에 따라 유럽 공동체의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 FP7 / 2007-2013으로부터 자금을 지원 받았습니다. 독일 심혈관 연구 센터, DZHK e.V. (프로젝트 MD28), 파트너 사이트 괴팅겐, 독일 연구 재단 CRC 1002 (프로젝트 C03) 및 막스 플랑크 학회에서도 지원을 제공했습니다. 이 연구는 독일 연구 재단 (DFG, 보조금 번호 EXC 1086)이 자금을 지원하는 우수 클러스터 인 BrainLinks-BrainTools의 지원을 부분적으로 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical Components | |||
| Blebbistatin | TargetMol | T6038 | 10 mM stock solution |
| BSA/Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Carbogen | Westfalen | 50 l bottle | |
| DI-4-ANBDQPQ | AAT Bioquest | 21499 | Dye for Optical Mapping |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | C6H12O6 |
| Heparin | LEO Pharma | Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription | |
| Hydrochlorid Acid | Merck | 1.09057.1000 | HCl, 1 M stock solution |
| Isoflurane | CP Pharma | 1 ml/ml, available only on prescription | |
| Magnesium Chloride | Merck | 8.14733.0500 | MgCl2 |
| Monopotassium Phosphate | Sigma-Aldrich | 30407 | KH2PO4 |
| Pinacidil monohydrate | Sigma-Aldrich | P154-500mg | 10 mM stock solution |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | KCl |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | NaCl |
| Sodium Hydroxide | Merck | 1.09137.1000 | NaOH, 1 M stock solution |
| Electrical Setup | |||
| Biopac MP150 | Biopac Systems | MP150WSW | data acquisition and analysis system |
| Custom-built ECG, alternative ECG100C | Biopac Systems | ECG100C | Electrocardiogram Amplifier |
| Custom-built water bath heater using heating cable | RMS Heating System | HK-5,0-12 | Heating cable 120W |
| Hexagonal water bath | |||
| LED Driver Power supply | Thorlabs | KPS101 | 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube. |
| LEDD1B LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current |
| MAP, ECG Electrode | Hugo Sachs Elektronik | BS4 73-0200 | Mini-ECG Electrode for isoalted hearts |
| micro-LED Driver e.g. AFG | Agilent Instruments | A-2230 | Arbitrary function generator (AFG) |
| Signal Generator | Agilent Instruments | A-2230 | AFG |
| micro-LED Array Components | |||
| Epoxid glue | Epoxy Technology | EPO-TEK 353ND | Two component epoxy |
| Fluoropolymer | Asahi Glass Co. Ltd. | Cytop 809M | Fluoropolymer with high transparency |
| Image reversal photoresist | Merck KGaA | AZ 5214E | Image Reversal Resist for High Resolution |
| LED chip | Cree Inc. | C460TR2227-S2100 | Blue micro-LED |
| Photoresist | Merck KGaA | AZ 9260 | Thick Positive Photoresists |
| Polyimide | UBE Industries Ltd. | U-Varnish S | Polyimide Solution |
| Silicone | NuSil Technology LLC | MED-6215 | Low viscosity silicone elastomer |
| Solvent free adhesive | John P. Kummer GmbH | Epo-Tek 301-2 | Epoxy resin with low viscosity |
| Optical Mapping | |||
| Blue Filter | Chroma Technology Corporation | ET470/40x | Blue excitation filter |
| Camera | Photometrics | Cascade 128+ | High performance EMCCD Camera |
| Camera Objective | Navitar | DO-5095 | Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras |
| Dichroic Mirror | Semrock | FF685-Di02-25x36 | 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter |
| Emmision Filter | Semrock | FF01-775/140-25 | 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter |
| Heatsink | Advanced Thermal Solutions | ATSEU-077A-C3-R0 | Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware |
| LED 1 and LED 2 | LED Engin Osram | LZ4-00B208 | High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA |
| LED 3 | Thorlabs | M625L3 | 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA |
| Lenses | LED Engin Osram | LLNF-2T06-H | LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM |
| Photodiode for power meter | Thorlabs | S120VC | Standard Photodiode Power Sensor |
| Power Meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter |
| Red Filter | Semrock | FF02-628/40-25 | BrightLine® single-band bandpass filter |
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