Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Avanceret hjerterytmestyring ved anvendelse af optogenetisk multi-site fotostimulation i Murine Hearts

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62335
Automatic Translation
*1,2, *1, 8,9, 1,3,4,6, 8,9, 1,5,6,7
1Research Group Biomedical Physics, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 2Research Electronics Department, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, 4Institute for Nonlinear Dynamics, Georg-August-University Goettingen, 5Department of Cardiology and Pneumology, University Medical Center Goettingen, 6German Center for Cardiovascular Research, DZHK e.V., partner site Goettingen, 7Laboratory Animal Science Unit, German Primate Center Leibniz Institute for Primate Research, 8Department of Microsystems Engineering (IMTEK), University of Freiburg, 9Cluster of Excellence BrainLinks-BrainTools, University of Freiburg
* These authors contributed equally

Summary

Dette arbejde rapporterer en metode til styring af hjerterytmen hos intakte murinhjerter hos transgene channelrhodopsin-2 (ChR2) mus ved hjælp af lokal fotostimulation med et mikro-LED-array og samtidig optisk kortlægning af epikardiemembranpotentiale.

Abstract

Ventrikulær takyarytmier er en væsentlig årsag til dødelighed og sygelighed over hele verden. Elektrisk defibrillering ved hjælp af elektriske stød med høj energi er i øjeblikket den eneste behandling for livstruende ventrikelflimmer. Defibrillering kan dog have bivirkninger, herunder utålelig smerte, vævsskade og forværring af prognosen, hvilket indikerer et betydeligt medicinsk behov for udvikling af mere blide hjerterytmestyringsstrategier. Udover energireducerende elektriske tilgange blev hjerteoptogenetik introduceret som et kraftfuldt værktøj til at påvirke hjerteaktivitet ved hjælp af lysfølsomme membranionkanaler og lysimpulser. I denne undersøgelse vil en robust og gyldig metode til vellykket fotostimulation af Langendorff perfunderede intakte murinehjerter blive beskrevet baseret på multi-site pacing ved anvendelse af en 3 x 3 række mikrolysemitterende dioder (mikro-LED). Samtidig optisk kortlægning af epikardiale membranspændingsbølger gør det muligt at undersøge virkningerne af regionsspecifik stimulering og evaluerer den nyligt inducerede hjerteaktivitet direkte på stedet. De opnåede resultater viser, at effekten af defibrillering er stærkt afhængig af de parametre, der er valgt til fotostimulation under en hjertearytmi. Det vil blive demonstreret, at det belyste område af hjertet spiller en afgørende rolle for afslutning succes samt hvordan den målrettede kontrol af hjerteaktivitet under belysning til ændring af arytmi mønstre kan opnås. Sammenfattende giver denne teknik mulighed for at optimere mekanismemanipulationen på stedet på vej til realtidsfeedbackkontrol af hjerterytmen og, hvad angår regionens specificitet, nye tilgange til at reducere den potentielle skade på hjertesystemet sammenlignet med brugen af ikke-specifikke elektriske stødapplikationer.

Introduction

Tidlige undersøgelser af den rumlige-temporale dynamik under arytmi afslørede, at de komplekse elektriske mønstre under hjerteflimmer drives af hvirvellignende roterende excitationsbølger1. Dette fund gav ny indsigt i de underliggende mekanismer for arytmier, som derefter førte til udviklingen af nye elektriske termineringsterapier baseret på multi-site excitation af myokardiet 2,3,4. Imidlertid er behandlinger ved hjælp af elektrisk feltstimulering ikke-lokale og kan innervere alle omgivende excitable celler, herunder muskelvæv, hvilket forårsager cellulær og vævsskade samt uacceptabel smerte. I modsætning til elektriske terapier giver optogenetiske tilgange en specifik og vævsbeskyttende teknik til fremkaldelse af kardiomyocythandlingspotentialer med høj rumlig og tidsmæssig præcision. Derfor har optogenetisk stimulering potentialet for minimal invasiv kontrol af de kaotiske aktiveringsmønstre under hjerteflimmer.

Introduktionen af den lysfølsomme ionkanal channelrhodopsin-2 (ChR2) i excitable celler via genetisk manipulation 5,6,7 muliggjorde depolarisering af membranpotentialet i excitable celler ved hjælp af fotostimulation. Flere medicinske anvendelser, herunder aktivering af neuronale netværk, kontrol af hjerteaktivitet, genoprettelse af syn og hørelse, behandling af rygmarvsskader og andre 8,9,10,11,12,13,14 er blevet udviklet. Anvendelsen af ChR2 i kardiologi har et betydeligt potentiale på grund af dets millisekunders responstid15, hvilket gør det velegnet til målrettet kontrol af arytmisk hjertedynamik.

I denne undersøgelse vises multi-site fotostimulation af intakte hjerter af en transgen musemodel. Sammenfattende blev der oprettet en transgen alfa-MHC-ChR2-muselinje inden for rammerne af Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) og venligst leveret af prof. S. E. Lehnart. Generelt blev transgene voksne hanner C57/B6/J, der udtrykker Cre-rekombinase under kontrol af alfa-MHC, parret med at parre sig med hunnen B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Da hjertets STOP-kassette blev slettet i anden generation, viste afkomene et stabilt MHC-ChR2-udtryk og blev brugt til at opretholde hjertelysfølsomme kolonier. Alle forsøg blev udført med voksne mus af begge køn i en alder af 36 - 48 uger. Belysningen opnås ved hjælp af et 3 x 3 mikro-LED-array, fremstillet som beskrevet i16,17, bortset fra at det siliciumbaserede hus og de korte optiske glasfibre ikke er implementeret. Dens første anvendelse i en hjerteapplikation findes i18. Et lineært mikro-LED-array baseret på en lignende fabrikationsteknologi er blevet anvendt som en penetrerende sonde til hjertetempo19. Mikro-LED'erne er arrangeret i et 3 x 3 array med en stigning på 550 μm, hvilket giver både en høj rumlig opløsning og en høj strålingseffekt på et meget lille område. Forfatterne demonstrerer i dette arbejde en alsidig lokal multi-site fotostimulation, der kan åbne vejen for udvikling af nye anti-arytmiske terapimetoder.

Følgende forsøgsprotokol involverer en retrograd Langendorff perfusion ex vivo, for hvilken den kannelerede aorta fungerer som perfusionsindløb. På grund af det påførte perfusionstryk og hjertekontraktionen strømmer perfusatet gennem koronararterierne, som forgrener sig fra aorta. I det præsenterede arbejde perfunderes hjertet ved hjælp af en konstant trykopsætning opnået ved at hæve perfusatreservoirerne til 1 m højde, svarende til 73,2 mmHg, hvilket giver en strømningshastighed på 2,633 ± 0,583 ml / min. To slags Tyrodes opløsning anvendes som perfusat under eksperimentet. Regelmæssig tyrodes opløsning understøtter en stabil sinusrytme, mens Low-K + Tyrodes opløsning blandes med Pinacidil for at muliggøre induktion af arytmi i murinhjerter. Brugen af et sekskantet vandbad tillader observation af hjertet gennem seks forskellige plane vinduer, hvilket muliggør kobling af flere optiske komponenter med mindre forvrængning ved brydning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg fulgte nøje dyrevelfærdsforordningen i overensstemmelse med tysk lovgivning, lokale bestemmelser og i overensstemmelse med anbefalinger fra Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA). Ansøgningen om godkendelse af dyreforsøg er godkendt af den ansvarlige dyrevelfærdsmyndighed, og alle forsøg blev rapporteret til vores dyrevelfærdsrepræsentanter.

1. Eksperimentforberedelse og materialer

  1. Opsætning af optisk kortlægning
    BEMÆRK: Den optiske opsætning samt den elektriske opsætning er vist i figur 1. Alle komponenter, der anvendes i den optiske og elektriske opsætning, er angivet detaljeret i materialetabellen.
    1. Brug LED 1 og LED 2 til induktion af arytmi og backup defibrillering. Vælg højeffekt-LED'er med en bølgelængde λblå nær 475 nm, hvilket er toppen af excitationsbølgelængden på ChR26. For yderligere at indsnævre det optiske spektrum skal du bruge et 470 ± 20 nm båndpasfilter.
      BEMÆRK: I dette arbejde har LED 1 og LED 2 en typisk strålestrøm på 3,9 til 5,3 W ifølge datablad20.
    2. Belys epikardiet til optisk kortlægning med en højeffekt rød LED (LED 3 i figur 1), som udsender lys med en centerbølgelængde på λrød = 625 nm og en strålingsflux på 700 mW21. Det røde lys filtreres med et 628 ± 20 nm båndpasfilter og reflekteres af et langpasseret dikroisk spejl (DM) med en afskæringsbølgelængde på λDM = 685 nm.
    3. Brug et emissionsfilter med λfilter-cam = 775 ± 70 nm foran kameramålet for kun at registrere fluorescensemissionen af hjerteaktiviteten. Brug et hurtigt mål, der er velegnet til applikationer med svagt lys.
      BEMÆRK: Frekvensen af fibrillering af et musehjerte varierer fra 20 til 35 Hz; Brug derfor et hurtigt nok kamera til at optage med en frekvens på 1 til 2 kHz eller endnu højere.
  2. Mikro-LED-array
    BEMÆRK: De mikro-LED-arrays, der anvendes her, realiseres ved hjælp af mikrosystembehandling som yderligere beskrevet andetsteds16,17.
    1. Spin belægger et 5 μm-tykt polyimid (PI) lag på 4-tommer siliciumsubstrater (enkeltsidet poleret, 525 μm tykt).
    2. Hærd dette PI-lag ved en maksimal temperatur på 450 °C under en nitrogenatmosfære. Hold den maksimale temperatur konstant i 10 min.
    3. Deponer og mønster en billedreverseringsfotoresist (PR) ved hjælp af ultraviolet (UV) litografi og sprutteaflejring af et 250 nm tyndt platinlag (Pt).
    4. Fortyk denne Pt-baserede metallisering ved at galvanisere et 1 μm-tykt guld (Au) lag med den mønstrede PR, der tjener som et maskeringslag.
    5. Før spin-coating et andet PI-lag, udsæt waferen med sit første PI-lag og Au-galvaniseret metallisering for et iltplasma, der kemisk aktiverer overfladen af PI-laget.
    6. Hærd det andet PI-lag igen ved 450 °C, påfør UV-litografi for at mønstre et PR-lag, og åbn arrayets kontaktpuder til mikro-LED-chips og grænsefladeprintkortet (PCB) ved reaktiv ionætsning (RIE) ved hjælp af den mønstrede PR som et maskeringslag.
      BEMÆRK: I disse RIE-procestrin anbefales det at anvende 200 W og 100 W i henholdsvis 10 og 30 minutter for at definere kontaktfladeåbningerne samt den ydre form af det todimensionale (2D) mikro-LED-array.
    7. Strip PR ved hjælp af opløsningsmidler og plasmaætsning. Fortyk kontaktpuderne yderligere ved at galvanisere et yderligere 6 μm tykt guldlag.
    8. Fastgør mikro-LED-chips til kontaktpuderne ved hjælp af en flip-chip bonder.
    9. Aktiver PI-overfladen i et iltplasma, og underfyld mikro-LED-chipsene med et opløsningsmiddelfrit klæbemiddel. Derefter hærdes klæbemidlet i 12 timer ved 120 °C.
    10. For at indkapsle mikro-LED-chipsene skal du udføre en anden plasmabehandling med Argon og anvende et tyndt fluorpolymerlag manuelt. Forhærd dette lag ved 80 °C i 1 time.
    11. Påfør manuelt silikone som det endelige indkapslingslag efter at have udsat mikro-LED-arrayet for et iltplasma, der bruges til at forbedre siliciumadhæsionen til det underliggende fluorpolymerlag. Silikonelaget hærdes ved 80 °C og 180 °C i 1 time hver. Disse sidste hærdningstrin hærder også fluorpolymerlaget fuldstændigt.
    12. Lodde kontaktpuderne på PI-substratet til et printkort, der bærer strimmelstik til sammenkobling af arrayet til en ekstern instrumentering. Dæk loddepuderne på printkortet ved hjælp af et klæbemiddel.
  3. Elektrisk opsætning
    1. Brug elektroder, der er egnede til optagelse af et elektrokardiogram (EKG), f.eks. sølv / sølvchloridelektroder eller monofasisk handlingspotentiale (MAP) elektroder og en EKG-forstærker til kontinuerlig overvågning af hjertets elektriske aktivitet. Brug desuden en passende anskaffelsesenhed (AD) til at registrere alle opnåede elektriske signaler.
    2. Vælg en velegnet driver til højeffekt-LED'erne (LED 1, LED 2 og LED 3), som kan styre den maksimale strøm, der påføres hver enhed. Brug en vilkårlig funktionsgenerator (AFG) til at styre LED-drivernes output nøjagtigt.
    3. Brug en flerkanals LED-driver til at styre strømmen, der strømmer gennem mikro-LED-arrayet. En AFG med flere udgange er lige så velegnet til denne opgave.
      BEMÆRK: Det tilrådes at vælge LED-drivere, der begrænser strømmen til mikro-LED'ens maksimale strøm, ellers kan dioderne blive beskadiget. Et eksempel på en flerkanals mikro-LED-driver er beskrevet i et andet arbejde18. Om nødvendigt kan AFG eller en anden LED-driver være tilsluttet en computer for at fjernstyre mikro-LED-indstillingerne. Hvis dette er tilfældet, skal du slutte LED-driveren til computeren med den kommunikationsprotokol, du vælger, f.eks. GPIB (General Purpose Interface Bus) eller en seriel forbindelse.

   

2. Forsøgsprocedurer

  1. Forberedelse af opløsning
    1. Forbered Tyrodes opløsning: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 24 mM NaHCO3, 1,8 mM CaCl 2, 1,2 mM KH2 PO4, 5,6 mM glucose, 0,1% BSA/albumin.
    2. Forbered Low-K+ Tyrodes løsning: Low-K+ Tyrode's fremstilles på samme måde som almindelig Tyrodes opløsning, bortset fra at kun halvdelen af mængden af KCl tilsættes (2 mM i stedet for 4 mM KCl).
      BEMÆRK: For et eksperiment, der varer 3 timer, er normalt 2-3 L Low-K + Tyrode's (desuden blandet med Blebbistatin (trin 2.1.5), hvis der udføres optisk kortlægning) og 1-2 L almindelige Tyrode'er tilstrækkelige.
    3. Tilsæt Pinacidil til Low-K + Tyrodes opløsning for at lette processen med arytmiinduktion, som beskrevet i22, for at opnå en koncentration på 100 mM. Brug beskyttende laboratoriehandsker, når du håndterer Pinacidil.
    4. Forbered 1 ml 50 μM DI-4-ANBDQPQ med almindelig Tyrodes opløsning. Beskyt farvestoffet mod lys for at forhindre fotoblegning.
    5. Lav en 10 mM stamopløsning af Blebbistatin. Til optisk kortlægning blandes Blebbistatin med 100 mM Pinacidil-Tyrode's-opløsningen (trin 2.1.3) for at opnå en 5 μM-opløsning. Brug beskyttende laboratoriehandsker, når du håndterer Blebbistatin.
      BEMÆRK: Hold både farvestoffet og Blebbistatin-opløsningen til side, indtil optisk kortlægning begynder.
  2. Langendorff perfusion
    OBS: Opsætningen består af to reservoirer til de to Tyrodes løsninger. De er forbundet til en boblefælde via rør med trevejshaner. Hjertet fastgøres senere til boblefælden med et Luer-låsestik, og det suspenderes derefter i et sekskantet vandbad. Vandbadet er igen forbundet til en affaldsbeholder for at indsamle den brugte Tyrodes opløsning.
    1. Rengør alle rør før hvert eksperiment med fuldt demineraliseret vand.
    2. Luft begge Tyrodes opløsninger med Carbogen (5% CO 2 og 95% O2) i 30 minutter ved stuetemperatur, inden forsøget påbegyndes. Juster pH-værdien af Tyrodes opløsninger til 7,4 med NaOH.
    3. Fyld 500 ml af hver Tyrodes opløsning i det tilsvarende reservoir og afluftning af rørene samt boblefælden ved at køre Tyrodes opløsning gennem perfusionssystemet, indtil der ikke ses flere fangede luftbobler i rørene eller i boblefælden.
    4. Fortsæt med at lufte Tyrodes opløsninger under hele eksperimentet i reservoirerne med Carbogen for at sikre, at perfusatets pH forbliver stabil senere under perfusion.
    5. Perfusionssystemet opvarmes til 37 °C med en vandvarmepumpe. Hold perfusattemperaturen konstant i vandbadet ved hjælp af et ekstra varmeelement såsom et vandtæt varmekabel.
      BEMÆRK: Under eksperimentet er det afgørende at genopfylde Tyrodes reservoirer, før de løber tomme. Ellers kan luftbobler komme ind i hjertet, hvilket kan tilstoppe karrene og føre til iskæmi.
  3. Forberedelse af mus
    1. Injicer subkutant 0,1 ml 500 dvs. heparin 30 minutter før hjerteisoleringsproceduren.
    2. Fyld en 6 cm petriskål og en 2 ml sprøjte med iskold Tyrodes opløsning. Placer under stereoskopisk mikroskop.
    3. Udfør kort tidsbedøvelse af mus ved et mættet Isoflurane-miljø i 2 minutter og øjeblikkelig cervikal dislokation bagefter.
      BEMÆRK: For at verificere tilstrækkelig anæstesi er en kontrol af den negative inter-toe refleks absolut nødvendig.
    4. Åbn brystet, fjern hjertet, som beskrevet andetsteds23, og læg det i 6 cm petriskålen med iskold Tyrodes opløsning. Hjerteslag vil blive formindsket på grund af temperaturfald.
    5. Gør den fine forberedelse under et stereoskopisk mikroskop, som beskrevet andetsteds23. Fastgør aorta på den stumpe nål og fastgør beholderen med suturmateriale.
    6. Som en kontrol skal du injicere iskold Tyrodes opløsning gennem nålen i hjertet og kontrollere, at hjertet er tæt monteret. Dette trin skyller også det resterende blod ud af hjertet.
    7. Overfør det monterede hjerte til perfusionssystemet. Sørg for, at perfusatet flyder for at forhindre luft i at komme ind i hjertet, mens nålen forbindes med boblefælden. Kontroller, at hjertet er dækket af Tyrodes opløsning i vandbadet. Trin 2.3.4, 2.3.5 og 2.3.7 er illustreret i figur 2.
    8. Sørg for, at hjertet begynder at slå inden for få minutter. Lad hjertet tilpasse sig perfusionsopsætningen i 15 til 20 min, og skift derefter til lav-K+ Tyrodes opløsning med Pinacidil (trin 2.1.3) henholdsvis lav-K+ Tyrodes opløsning med Pinacidil og Blebbistatin (trin 2.1.5), hvis der skal udføres optisk kortlægning.
  4. Arytmiinduktion og optisk defibrillering
    1. Placer en af EKG-elektroderne så tæt som muligt på hjerteoverfladen for at sikre god signalkvalitet. Suspender den anden EKG-elektrode i Tyrodes opløsning. Sørg for, at det erhvervede EKG registreres af den valgte AD.
    2. Placer mikro-LED-arrayet på undersøgelsens interesseområde, for eksempel på venstre ventrikel.
    3. Skift perfusion til lav-K + Tyrode's med Pinacidil og perfuse hjertet i 15 til 30 min.
    4. For at inducere arytmi skal hjertet belyses med LED 1 og LED 2 med et tog på 20 til 50 lysimpulser med en frekvens f ind på 25 til 35 Hz, pulsvarighed Wind på 2 til 15 ms og lysintensitet LIopt_ind på 2,8 mW mm-2.
    5. Gentag processen, indtil arytmi er induceret.
      BEMÆRK: Arytmier er lette at identificere i EKG-signalet, fordi signalets frekvens og morfologi adskiller sig fra normal sinusrytme. Hvis arytmi slutter inden for de næste 5 s, skal du klassificere den som selvafsluttet og starte et nyt induktionsforsøg.
    6. Når en vedvarende arytmi er visuelt detekteret, påføres en udbrud af impulser med forskellige bredder W def og frekvenser fdef ved hjælp af tre, seks eller ni mikro-LED'er af arrayet ved en pulserende strømI-puls på 15 mA, der giver en lysintensitet LIμLED = 33,31 ± 2,05 mW mm-2.
    7. Hvis arytmi fortsætter efter fem mikro-LED-array-baserede defibrilleringsforsøg, skal du klassificere forsøget som mislykket og starte backup-defibrillering.
    8. Ved backup defibrillering skal du bruge LED 1 og LED 2 ved hjælp af de samme timingparametre som indstillet til mikro-LED-arrayet.
      BEMÆRK: Fordi hjertet udsættes for iskæmisk og metabolisk stress over hele forsøgsperioden, er det muligt, at afslutningsforsøg af arytmi ikke lykkes, selv med backup defibrillering. Når dette sker, skal du ændre perfusionsopløsningen til den almindelige Tyrode's og lade hjertet komme sig i 5 til 10 minutter. Når EKG vender tilbage til sinusrytmen, skal du gentage protokollen fra trin 2.4.3 igen.
  5. Optisk kortlægning
    1. Gennemsyr hjertet med Blebbistatin-opløsningen, der er fremstillet i trin 2.1.5, og vent, indtil der sker mekanisk afkobling. Dette opnås, når hjertet holder op med at slå, men et EKG-signal er stadig målbart.
      BEMÆRK: Blanding af Blebbistatin-opløsningen til den nævnte koncentration og opbevaring af hjertet perfunderet med denne opløsning opretholder den hjertemekaniske aktivitet, der er afkoblet fra den elektriske aktivitet under hele eksperimentet.
    2. Giv 1 ml spændingsfarvestof DI-4-ANBDQPQ (fremstillet i trin 2.1.4) som en bolus i boblefælden ved Langendorff-perfusionen. Vent i 5 til 10 minutter for at lade farvestoffet sive hjertet ensartet.
      BEMÆRK: Undgå fotoblegning af farvestoffet ved at slukke for det røde lys, når der ikke foretages nogen optagelse. Hvis signal/støj-forholdet under optagelsen bliver for lille (det erhvervede signal er for støjende), gentages trin 2.1.4 og 2.5.2.
    3. Fokuser kameraet på hjerteoverfladen, tænd LED 3, og anvend 1.27 mW mm-2 optisk effekt.
    4. Sluk laboratorielamperne, og start optagelsen. Sørg for, at der erhverves et optisk signal ved at sammenligne frekvensen af det opnåede signal med frekvensen af det optagede EKG. Dette sikrer, at det opnåede optiske signal udelukkende er relateret til hjertets elektriske aktivitet.
      BEMÆRK: Da fluorescenslyset, der udsendes af farvestoffet, er meget uge, udføres optisk kortlægning i et mørkt rum. Dette undgår signalinterferens fra andre lyskilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen tillader induktion af ventrikulære arytmier i intakte murinehjerter ved hjælp af fotostimulationsimpulser genereret af LED 1 og LED 2 (figur 1) med en frekvens f ind mellem 25 Hz og 35 Hz og en pulsvarighed Wind mellem 2 ms og 10 ms. Bemærk, at formålet med sådanne hurtige lysimpulser ikke er at fange hjerterytmen, men snarere at afbalancere hjerteaktiviteten, så uberegnelige elektriske bølger kan genereres, som derefter letter en arytmi. Fordelen ved at inducere arytmi med lys over induktion med elektrisk stimulering er, at der ikke fremkaldes artefakter i EKG, hvilket giver mulighed for at efteranalysere det erhvervede signal uden begrænsninger og endda evaluere hjertets elektriske respons under hurtig tempo, denne kendsgerning giver også mulighed for at observere hjerteadfærden under foto-defibrillering. Dette er ikke muligt med elektriske induktions- eller defibrilleringsmetoder. Ikke desto mindre, hvis den anvendte opsætning ikke tillader brug af eksterne højeffekt-lysdioder, for eksempel på grund af pladsbegrænsninger, kan en ekstra tempoelektrode placeres på hjertet for at fremkalde arytmi, som vist andetsteds 3,22,24.

Når fibrillering er induceret, skal arytmi vare mindst 5 sekunder for at sikre, at den opretholdes, hvorefter de mikro-LED-baserede defibrilleringsforsøg startes. Da de vigtigste parametre for hjertearytmi, såsom grundlæggende cykluslængde eller dominerende frekvens, amplitude og morfologi, konstant ændrer sig, og da det er opdateret ikke muligt at forudsige, hvilke fotodefibrilleringsparametre der giver det bedste resultat, var det af væsentlig interesse at forstå, om der er et forhold mellem frekvensen, pulsbredden, område med fotostimulation og opsigelsesrate. Derfor blev en række eksperimenter med forskellige frekvenser f def, antal mikro-LED'er og pulsvarigheder Wdef testet, og succesraten for N = 11 mus blev ekstraheret, som vist i figur 3.

Det kunne påvises, at pulser af 1 til 20 ms varighed kan defibrillere med forskellige succesrater (figur 3). Da lysintensiteten LIμLED blev holdt konstant under hver fotostimuleringspuls, som nævnt i trin 2.4.6, og succesraten for tre mikro-LED'er mod ni er markant lavere, tyder de præsenterede resultater på, at det område, der er dækket på hjertet, antallet af mikro-LED'er og dermed den samlede anvendte strålingsflux er afgørende faktorer for at opnå defibrillering. I betragtning af at hver mikro-LED på arrayet er en Lambertian-lyskilde, og at de er placeret direkte på hjertets overflade, så den omtrentlige afstand til vævet er nul, kan det antages, at bestrålingskonturen af det belyste område på hjertet, når der anvendes en enkelt mikro-LED, svarer til AμLED = 0,059 mm², som også vist i25 for flade rektangulære lysdioder. Desuden, selvom nogle fotoner kan forlade mikro-LED'en sideværts fra kanterne, betragtes deres bidrag til den samlede lysintensitet som så lille, at deres virkning kan overses. For at kvantificere arrayets bestrålede lys målte forfatterne strålingsfluxen fra mikro-LED-arrayet med en kommerciel effektmåler og beregnede lysintensiteten, der når hjertet som vist i tabel 1. Fra tabel 1 kan det også læses, at strålingsstrømmen stiger med antallet af brugte mikro-LED'er, men lysintensiteten forbliver konstant på grund af de tidligere nævnte belysningsprofilimplikationer.

Interessant nok kan det også observeres, at succesraten for ni lysdioder med W def = 1 ms (figur 3a) og W def = 20 ms (figur 3d) ved en defibrilleringsfrekvens f def = 18 Hz og f def = 20 Hz er sammenligneligt høje. I betragtning af at den gennemsnitlige frekvens af de inducerede arytmier er 22,55 ± 4,03 Hz, kan denne kendsgerning indikere, at for ChR2 murinehjerter øges succesraten betydeligt, jo tættere tempofrekvensen er på arytmifrekvensen. Dette fremgår også af numeriske simuleringer26. Dette kan imidlertid ikke let generaliseres, fordi den dominerende frekvens af komplekse arytmier konstant ændrer sig. For at illustrere dette viser figur 4 to forskellige defibrilleringsforsøg med fdef = 14 Hz.. I begyndelsen af EKG-segmentet i figur 4a) og ifølge EKG-signalets morfologi vises en ventrikelflimmer (VF). Når mikro-LED-fotostimulationen starter, omdannes fibrilleringen til et mere ordnet mønster, som er mere tilbøjeligt til at være en ventrikulær takykardi (VT). Når mikro-LED-arrayet er slukket, tager de originale kaotiske VF-bølger over igen. Således afsluttes arytmien ikke. Selvom VF'en i dette eksempel ikke kan afsluttes med de givne parametre, bliver den forstyrret, og den kan ændres til et mere regelmæssigt mønster (VT). Figur 4b Segment 1 viser, at den dominerende frekvens på 24 Hz stiger lidt, indtil fotostimulationen begynder, og VF'en omdannes til en VT i segment 2, hvor den dominerende frekvens falder til 14 Hz. Desuden viser figur 4c en VT, der kan afsluttes med samme f def som i figur 4a, men med en anden Wdef. For det første ændrer mikro-LED-fotostimulationen arytmiens morfologi for endelig at afslutte den med 1: 1 pacing-optagelse fra den 19. puls og fremefter. Disse resultater kan betyde, at fotodefibrilleringsparametrene, for eksempel Wdef, skal tilpasse sig morfologiændringen af arytmien over tid. De eksperimenter, der førte til disse resultater, blev udført uden brug af Blebbistatin på grund af den resulterende ændring i aktionspotentialevarighed (APD)27. Derfor blev der ikke udført nogen optisk kortlægning i disse serier.

Et andet sæt eksperimenter blev udført til optisk kortlægning ved hjælp af det rødforskudte potentiometriske farvestof (trin 2.1.4). Optisk kortlægning med højhastighedskameraer gør det muligt at observere formerende excitationsbølger på hjertets overflade under sinusrytme (figur 5) og komplekse takyarytmier28. Da den fraktionerede ændring af det potentiometriske farvestof er meget lav, blev de opnåede videoer efterbehandlet ved hjælp af et matematisk programmeringssprog. Det første skridt til at forbedre kvaliteten af de optiske signaler er at fjerne støj, der anvender et gaussisk udjævningsfilter med en standardafvigelse på σ = 1, efterfulgt af et båndpasfilter med hjørnefrekvenser fhøj = 0,1 Hz og flav = 70 Hz. Stopbåndet ved fhøj fjerner langsomme ændringer i signalet, som ikke er relateret til hjertets sinusfrekvens, der ligger mellem 3 Hz < fsinus < 8 Hz, mens stopbåndet flav fjerner højfrekvent støj, der fanges af kameraet. Det er vigtigt at bemærke, at både emissioner af blåt lys fra LED 1, LED 2 og fra mikro-LED-arrayet kan forårsage krydstale og et meget højt interferenssignal i optisk kortlægning. Derudover blev det observeret, at ikke engang et meget smalt båndpasfilter foran kameraet med bølgelængde λfilter-cam , som nævnt i trin 1.2.3, ville filtrere indflydelsen fra det blå lys fra. Dette kan delvis skyldes excitationsresponset fra selve farvestoffet. Vær derfor meget forsigtig, når du vælger optik til optisk kortlægning. Til videoanalyse måtte alle rammer, hvor blåt lys er optaget, overses, så det i mange tilfælde ikke er muligt at visualisere hjertet under fotostimulation, som også nævnt i en anden undersøgelse29.

Figure 1
Figur 1: Skematisk over den elektriske og optiske opsætning. a) LED 1 og LED 2 giver en blå lyskilde, der anvendes til induktion af arytmi og backup defibrillering. LED 3 bruges som en excitationslyskilde til det rødforskudte farvestof DI-4-ANBDQPQ. Det røde lys ledes til hjertet ved hjælp af det dikroiske spejl DM. Emissionslyset vist med mørkerødt registreres af højhastighedskameraet gennem et emissionsfilter, som nævnt i teksten. LED 2- og EKG-elektroder vises ikke for enkelhedens skyld. b) Et segment af det optagede EKG-signal vist med rødt. Mørkeblå viser lysimpulserne fra LED 1 og LED 2 med en frekvens f ind = 35 Hz og Wind = 4 ms, der bruges til at fremkalde fibrillering. Umiddelbart efter afslutningen af lysstimuleringen kan ventrikulær fibrillering (VF) observeres. Den mikro-LED-baserede fotostimulation vist i lyseblå (f def = 16 Hz, Wdef = 20 ms) afslutter arytmien med succes. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Forberedelse af hjertet . a) Åben musebryst, der viser det intakte hjerte og de omgivende organer. b) Udplantet hjerte nedsænket i iskold tyrodes opløsning til yderligere tilberedning. c) Musehjerte, der er fastgjort korrekt til en stump nål. (d) Murine hjerte suspenderet i Tyrodes løsning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Eksperimentelt udtrukne succesrater. Succesrater for 30 mikro-LED-baserede fotostimulationsimpulser ved hjælp af tre, seks og ni lysdioder ved forskellige pulsvarigheder W def og frekvenser fdef for N = 11. Fejllinjer vist med standardfejl af middel S.E.M. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Manipulation af hjerterytmen ved hjælp af fotostimulation . a) Segment af en EKG-optagelse af en ikke-afsluttet arytmi. b) Spektrogram af EKG vist i panel a. Effektspektraltætheden (PSD) for segment (1) viser en arytmi med en dominerende frekvens på 24 Hz. Segment (2) fotostimulation med de viste parametre. Det kan observeres, at den dominerende frekvens falder til 14 Hz. Segment (3) Mislykket afslutning og tilbagevenden til arytmisk adfærd med en dominerende frekvens på 24 Hz. (c) EKG af et vellykket defibrilleringsforsøg. d) Spektrogram over den vellykkede afslutning vist i panel c. Segment (1) viser en ventrikulær takykardi (VT) med en dominerende frekvens på 23 Hz. Segment (2) fotostimulation ved hjælp af de viste indstillinger. Segment (3) viser en vellykket afslutning, hvilket fører til en normal sinusrytme med en grundlæggende frekvens på 3, 5 Hz og de resulterende harmoniske. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Optisk kortlægning af hele hjertet. Ændringen af fluorescensintensitet under et enkelt hjerteslag i normal sinusrytme vises. Hjertet var placeret mod kameraet, så højre og venstre ventrikel er synlige (RV, LV). Stjernen viser den pixel, hvor handlingspotentialet vist ovenpå blev taget. Klik her for at se en større version af denne figur.

Antal microLED Bestrålet område Aμled [mm2] Stråleflux φ [mW] Lysintensitet LI [mW mm-2]
3 0.178 5,9 ± 0,47 33.11 ± 2,66
6 0.356 11,91 ± 0,84 33.42 ± 2,37
9 0.535 17,85 ± 0,61 33.39 ± 1.14

Tabel 1: Målt strålingsflux af mikro-LED-arrayet og den tilsvarende lysintensitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En vellykket behandling af hjertetakyarytmier er nøglen til hjerteterapi. Imidlertid er de biofysiske mekanismer, der ligger til grund for arytmiinitiering, fortsættelse og afslutning, ikke fuldt ud forstået. Derfor sigter hjerteforskning mod at optimere elektrisk stødterapi mod en mere skånsom afslutning af arytmier og derved øge patienternes livskvalitet 28,29,30,31. Lavenergi elektriske tilgange lover en betydelig reduktion af alvorlige bivirkninger, men kan stadig fremkalde uønsket muskel excitation. Hjerteoptogenetik kunne overvinde denne begrænsning og ikke kun give en vævs-blid afslutningsteknik, men også en fleksibel platform til at undersøge den arytmi-specifikke målrettede kontrol af hvirvellignende excitationsbølger i det intakte murinhjerte og i cellekulturer32,33.

I betragtning af denne motivation blev en robust fotostimulationsopsætning samt en protokol designet og implementeret, der begge tilbyder et meget tilpasningsdygtigt optisk system, som let kunne udvides til tredimensionelle panoramiske optiske kortlægningsundersøgelser34.

Det kunne påvises, at hjertearytmier med succes kan afsluttes med forskellige succesrater afhængigt af de parametre, der vælges til fotostimulering, for eksempel det oplyste område på hjertet. De præsenterede resultater tyder på, at forøgelse af den bestrålede overflade rekrutterede et kritisk antal kardiomyocytter, der slukkede den kaotiske aktivitet ved ledningsblok, som også vist i22. I denne undersøgelse er den energi, der kræves for at fotodefibrillere, E = 10,69 ± 0,37 mJ (ved hjælp af ni mikro-LED'er, 30 impulser og pulsbredde Wdef = 20 ms). Dette viser sig at være lavere end tidligere rapporteret i henholdsvis 22,24 med E 22 = 228,8 mJ og E 24 = 153,6 mJ, hvor henholdsvis et større område 22 eller hele hjertet 24 blev belyst. Ikke desto mindre er fotodefibrilleringsenergien i denne undersøgelse markant højere sammenlignet med den fremgangsmåde, der er vist i 35, hvor et godt afgrænset mønsterområde belyses med 10 fotodefibrilleringsimpulser, hvilket resulterer i E 35 = 1,8 mJ. I modsætning til de tre andre tilgange kunne en succesrate på over 90% ikke nås med den fremlagte protokol. En mulig årsag til den reducerede ydeevne på trods af en højere fotodefibrilleringsenergi kan være, at kompleksiteten af den underliggende arytmi ikke overvejes. Med hensyn til resultaterne præsenteret i 35, hvor en høj termineringshastighed opnås ved at belyse et lille område på hjertet og samtidig måle den rumlige-tidsmæssige dynamik i en arytmi, kan den præsenterede tilgang helt sikkert forbedres yderligere ved at overveje feedback-kontrol, som reagerer med et andet mønster af mikro-LED-belysning afhængigt af hjertets aktuelle tilstand.  Desuden blev det også demonstreret, at selvom arytmier ikke altid kan afsluttes med den nuværende metode, kan den iboende komplekse dynamik forstyrres under fotostimulering, hvilket fører til en mere ordnet tidsmæssig tilstand. Som vist i36 er termineringsraten signifikant anderledes, når man adresserer monomorfe (mere ordnede) og polymorfe (mindre ordnede) arytmier. Derfor kan det logiske skridt mod en bedre defibrilleringshastighed være at påvirke hjertedynamikken under en VF-episode, gøre arytmi til et mindre komplekst mønster og afslutte med et andet sæt impulser og opbygge på denne måde en to-trins fotostimulationsmetode.

Med hensyn til perfusionsprotokollen findes de mest kritiske trin i den korrekte ekstraktion og forberedelse af hjertet samt i den korrekte justering af den optiske kortlægningsoptik. Inddragelse af optisk kortlægning kræver strengt det korrekte valg af farvespektre, passende excitationslyskilder og velvalgte optiske filtre til kameraet29. Ellers kan de optagede optiske signaler være for støjende og kan også indeholde krydstale om fotostimulation med farvestofspænding. Efterfølgende analyse ville derfor kræve efterbehandling af signaler med flere analytiske filtre og billedudjævning, hvilket ofte resulterer i forværring.

Et andet afgørende trin i denne protokol er den korrekte og præcise placering af mikro-LED-arrayet. Da forbindelsesledningen mellem mikro-LED-arrayet og driveren er meget tynd og fleksibel, er det undertiden udfordrende at sikre, at arrayet vil være placeret på omtrent samme sted på hjerteoverfladen for hvert eksperiment. For at lette positionering og for at fastgøre den erhvervede position af mikro-LED-arrayet blev en holder designet og trykt i 3D, så arrayet kunne fastgøres til en mikromanipulator. Dette giver mere kontrol over bevægelsen af arrayet i Tyrodes løsning. Afhængigt af det materiale, der er valgt til mikro-LED-arrayets sammenkoblingsledning, er det muligvis ikke nødvendigt at bruge en holder.

Desuden er et andet kritisk trin i protokollen tilføjelsen af pro-arytmi-lægemidler, som f.eks. Pinacidil37. Da flere kemiske forbindelser er velkendte for at ændre hjertets fysiologiske respons, bør dette overvejes ved analyse og fortolkning af resultaterne. Hvad angår optisk kortlægning, anvender den foreslåede protokol Blebbistatin som en mekanisk afkobling. Dette har fordelen ved at fjerne bevægelsesartefakter under optagelse, men det kan også forlænge APD27. For at overvinde denne ulempe kan analyse af metoder til bevægelsessporing under optagelse betragtes som38,39. På denne måde bevares hjertets normale fysiologiske tilstand, og der kan opnås et signal af høj kvalitet.

Selvom det blev bevist, at den præsenterede protokol kan bruges til multi-site foto-defibrillering, har den stadig nogle begrænsninger. Det har vist sig, at fibrillering i nogle tilfælde ikke kan afsluttes af den mikro-LED-baserede fotostimulation, men kun forstyrres, hvilket resulterer i frekvensændringer. En hypotese er, at de bugtende bølger på hjertet kun forskydes fra venstre ventrikel og regenererer sig selv i andre dele af hjertet. Sammenlignet med andre metoder såsom global belysning24 tilbyder den nuværende metode en lavere succesrate på grund af en mindre dækning af hjertet. Selvom vi er overbeviste om, at med den korrekte hardwarebaserede genkendelsesmetode for spiralaktivitet er forbedring af afslutningssuccesraten mulig.

Afslutningsvis etablerer det præsenterede fotostimulationssystem et kraftfuldt eksperimentelt værktøj til flere kardioversionsmetoder og manipulationsstudier af hjertearytmi. Den viden, der læres i dette system, vil blive brugt til at undersøge og evaluere nye potentielle (foto) defibrilleringsprotokoller i klinisk relevante modeller for store dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Marion Kunze og Tina Althaus for deres fremragende tekniske support under eksperimenter. Den forskning, der har ført til resultaterne, har modtaget støtte fra Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram FP7/2007-2013 under tilskudsaftale nummer HEALTH-F2-2009-241526. Der blev også ydet støtte fra det tyske center for kardiovaskulær forskning, DZHK e.V. (projekt MD28), partnersiden Goettingen, den tyske forskningsfond CRC 1002 (projekt C03) og Max Planck Society. Dette arbejde blev delvist støttet af BrainLinks-BrainTools, Cluster of Excellence finansieret af den tyske forskningsfond (DFG, bevillingsnummer EXC 1086).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical Components
Blebbistatin TargetMol T6038 10 mM stock solution
BSA/Albumin Sigma-Aldrich A4919
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016 CaCl2
Carbogen Westfalen 50 l bottle
DI-4-ANBDQPQ AAT Bioquest 21499 Dye for Optical Mapping
Glucose Sigma-Aldrich D9434 C6H12O6
Heparin LEO Pharma Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription
Hydrochlorid Acid Merck 1.09057.1000 HCl, 1 M stock solution
Isoflurane CP Pharma 1 ml/ml, available only on prescription
Magnesium Chloride Merck 8.14733.0500 MgCl2
Monopotassium Phosphate Sigma-Aldrich 30407 KH2PO4
Pinacidil monohydrate Sigma-Aldrich P154-500mg 10 mM stock solution
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 KCl
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 NaHCO3
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 NaCl
Sodium Hydroxide Merck 1.09137.1000 NaOH, 1 M stock solution
Electrical Setup
Biopac MP150 Biopac Systems MP150WSW data acquisition and analysis system
Custom-built ECG, alternative ECG100C Biopac Systems ECG100C Electrocardiogram Amplifier
Custom-built water bath heater using heating cable RMS Heating System HK-5,0-12 Heating cable 120W
Hexagonal water bath
LED Driver Power supply Thorlabs KPS101 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube.
LEDD1B LED Driver Thorlabs LEDD1B T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current
MAP, ECG Electrode Hugo Sachs Elektronik BS4 73-0200 Mini-ECG Electrode for isoalted hearts
micro-LED Driver e.g. AFG Agilent Instruments A-2230 Arbitrary function generator (AFG)
Signal Generator Agilent Instruments A-2230 AFG
micro-LED Array Components
Epoxid glue Epoxy Technology EPO-TEK 353ND Two component epoxy
Fluoropolymer  Asahi Glass Co. Ltd. Cytop 809M Fluoropolymer with high transparency
Image reversal photoresist Merck KGaA AZ 5214E Image Reversal Resist for High Resolution
LED chip  Cree Inc. C460TR2227-S2100 Blue micro-LED
Photoresist Merck KGaA AZ 9260 Thick Positive Photoresists
Polyimide UBE Industries Ltd. U-Varnish S Polyimide Solution
Silicone NuSil Technology LLC MED-6215 Low viscosity silicone elastomer
Solvent free adhesive John P. Kummer GmbH Epo-Tek 301-2 Epoxy resin with low viscosity
Optical Mapping
Blue Filter Chroma Technology Corporation ET470/40x Blue excitation filter
Camera Photometrics Cascade 128+ High performance EMCCD Camera
Camera Objective Navitar DO-5095 Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras
Dichroic Mirror Semrock FF685-Di02-25x36 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter
Emmision Filter Semrock FF01-775/140-25 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter
Heatsink Advanced Thermal Solutions ATSEU-077A-C3-R0 Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware
LED 1 and LED 2 LED Engin Osram LZ4-00B208 High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3 Thorlabs M625L3 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA
Lenses LED Engin Osram LLNF-2T06-H LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Photodiode for power meter Thorlabs S120VC Standard Photodiode Power Sensor
Power Meter Thorlabs PM100D Compact Power and Energy Meter
Red Filter Semrock FF02-628/40-25 BrightLine® single-band bandpass filter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
  2. Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation. Circulation. 120 (6), 467-476 (2009).
  3. Luther, S., et al. Low-energy control of electrical turbulence in the heart. Nature. 475, 235-239 (2011).
  4. Pumir, A., et al. Wave emission from heterogeneities opens a way to controlling chaos in the heart. Physical Review Letters. 99, 208101 (2007).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  6. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  7. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  8. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7, 897-900 (2010).
  9. Natasha, G., et al. et al.Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch. New Biotechnology. 30 (5), 461-474 (2013).
  10. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  11. Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 28 (46), 11862-11870 (2008).
  12. Ahmad, A., Ashraf, S., Komai, S. Optogenetics applications for treating spinal cord injury. Asian Spine Journal. 9 (2), 299-305 (2015).
  13. Dieter, A., Keppeler, D., Moser, T. Towards the optical cochlear implant: Optogenetic approaches for hearing restoration. EMBO Molecular Medicine. 12 (4), e11618 (2020).
  14. Keppeler, D., et al. Multichannel optogenetic stimulation of the auditory pathway using microfabricated LED cochlear implants in rodents. Science Translational Medicine. 12 (553), eabb8086 (2020).
  15. Verhoefen, M. K., Bamann, C., Blöcher, R., Förster, U., Bamberg, E. The photocycle of channelrhodopsin-2: ultrafast reaction dynamics and subsequent reaction steps. ChemPhysChem. 11 (14), 3113-3122 (2010).
  16. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized tool for optogenetics based on an LED and an optical fiber interfaced by a silicon housing. 36th Annual Internation Conference IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Chicago, IL, , 5252-5255 (2014).
  17. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized 3 x 3 optical fiber array for optogenetics with integrated 460 nm light sources and flexible electrical interconnection. 28th IEEE Proceedigns. MEMS, Estoril, , 162-165 (2015).
  18. Diaz-Maue, L., Schwaerzle, M., Ruther, P., Luther, S., Richter, C. Follow the light - From low-energy defibrillation to multi-site photostimulation. 40thAnnual International Conference of IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Honolulu, HI, , 4832-4835 (2018).
  19. Zgierski-Johnston, C., et al. Cardiac pacing using transmural multi-LED probes in channelrhodopsin-expressing mouse hearts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , 51-61 (2020).
  20. mouser.de, LED Engin, [Online]. , Available: https://www.mouser.de/datasheet/2/228/5412893-LED_2520Engin_Datasheet_LuxiGen_LZ4-00B208- 1531969.pdf (2020).
  21. thorlabs.com, thorlabs, [Online]. , Available: https://www.thorlabs.com/_sd.cfm?fileName=25135-S01.pdf&partNumber=M625L3 (2020).
  22. Bruegmann, T., et al. Optogenetic defibrillation terminates ventricular arrhythmia in mouse hearts and human simulations. Journal of Clinical Investigation. 126 (10), 3894-3904 (2016).
  23. Richter, C., Christoph, J., Lehnart, S. E., Luther, S. Optogenetic light crafting tools for the control of cardiac arrhythmias. Methods in Molecular Biology. 1408, 293-302 (2016).
  24. Quiñonez Uribe, R. A., Luther, S., Diaz-Maue, L., Richter, C. Energy-reduced arrhythmia termination using global photostimulation in optogenetic murine hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1651), (2018).
  25. Moreno, I. LED irradiance pattern at short distances. Applied Optics. 59 (1), 190-195 (2020).
  26. Predicting unpinning success rates for a pinned spiral in an excitable medium. Behrend, A., Bittihn, P., Luther, S. Computing in Cardiology, Belfast, , 345-348 (2010).
  27. Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11 (464), (2020).
  28. Christoph, J., et al. Electromechanical vortex filaments during cardiac fibrillation. Nature. 555, 667-672 (2018).
  29. O'Shea, C. Cardiac optogenetics and optical mapping - Overcoming spectral congestion in all-optical cardiac electrophysiology. Frontiers in Physiology. 10 (182), (2019).
  30. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), e006692 (2018).
  31. Trayanova, N., Doshi, A. N., Prakosa, A. How personalized heart modeling can help treatment of lethal arrhythmias: A focus on ventricular tachycardia ablation strategies in post-infarction patients. Wiley Interdisciplinary Reviews in System Biology and Medicine. 12 (3), 1477 (2020).
  32. Bingen, B., et al. Light-induced termination of spiral wave arrhythmias by optogenetic engineering of atrial cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 104 (1), 194-205 (2014).
  33. Burton, R. A. B., et al. Optical control of excitation waves in cardiac tissue. Nature Photonics. 9 (12), 813-816 (2015).
  34. Dura, M., Schröder-Schetelig, J., Luther, S., Lehnart, S. E. Toward panoramic in situ mapping of action potential propagation in transgenic hearts to investigate initiation and therapeutic control of arrhythmias. Frontiers in Physiology. 5, 337 (2014).
  35. Crocini, C., et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Science Reports. 6 (35628), (2016).
  36. Nyns, E. C. A., et al. Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management. European Heart Journal. 38 (27), 2132-2136 (2017).
  37. Wilde, A. A. K+atp channel opening and arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 24 (4), 35-40 (1994).
  38. Christoph, J., Luther, S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1483), (2018).
  39. Christoph, J., Schröder-Schetelig, J., Luther, S. Electromechanical optical mapping. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130(B), 150-169 (2017).

Tags

Medicin udgave 174 hjerteoptogenetik optisk kortlægning LED DI-4-ANBDQPQ Blebbistatin channelrhodopsin-2 ChR2
Avanceret hjerterytmestyring ved anvendelse af optogenetisk multi-site fotostimulation i Murine Hearts
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diaz-Maue, L., Steinebach, J.,… More

Diaz-Maue, L., Steinebach, J., Schwaerzle, M., Luther, S., Ruther, P., Richter, C. Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts. J. Vis. Exp. (174), e62335, doi:10.3791/62335 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter