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Manejo avanzado del ritmo cardíaco mediante la aplicación de fotoestimulación optogenética multisitio en corazones murinos

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62335
Automatic Translation
*1,2, *1, 8,9, 1,3,4,6, 8,9, 1,5,6,7
1Research Group Biomedical Physics, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 2Research Electronics Department, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, 4Institute for Nonlinear Dynamics, Georg-August-University Goettingen, 5Department of Cardiology and Pneumology, University Medical Center Goettingen, 6German Center for Cardiovascular Research, DZHK e.V., partner site Goettingen, 7Laboratory Animal Science Unit, German Primate Center Leibniz Institute for Primate Research, 8Department of Microsystems Engineering (IMTEK), University of Freiburg, 9Cluster of Excellence BrainLinks-BrainTools, University of Freiburg
* These authors contributed equally

Summary

Este trabajo informa un método para controlar el ritmo cardíaco de corazones murinos intactos de ratones transgénicos con canalrodopsina-2 (ChR2) utilizando fotoestimulación local con una matriz de micro-LED y mapeo óptico simultáneo del potencial de la membrana epicárdica.

Abstract

Las taquiarritmias ventriculares son una causa importante de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. La desfibrilación eléctrica mediante descargas eléctricas de alta energía es actualmente el único tratamiento para la fibrilación ventricular potencialmente mortal. Sin embargo, la desfibrilación puede tener efectos secundarios, como dolor intolerable, daño tisular y empeoramiento del pronóstico, lo que indica una necesidad médica significativa para el desarrollo de estrategias de manejo del ritmo cardíaco más suaves. Además de los enfoques eléctricos reductores de energía, la optogenética cardíaca se introdujo como una herramienta poderosa para influir en la actividad cardíaca utilizando canales iónicos de membrana sensibles a la luz y pulsos de luz. En el presente estudio, se describirá un método robusto y válido para la fotoestimulación exitosa de corazones murinos intactos perfundidos por Langendorff basado en la estimulación multisitio aplicando una matriz de 3 x 3 de micro diodos emisores de luz (micro-LED). El mapeo óptico simultáneo de las ondas de voltaje de la membrana epicárdica permite la investigación de los efectos de la estimulación específica de la región y evalúa la actividad cardíaca recién inducida directamente en el sitio. Los resultados obtenidos muestran que la eficacia de la desfibrilación depende en gran medida de los parámetros elegidos para la fotoestimulación durante una arritmia cardíaca. Se demostrará que el área iluminada del corazón juega un papel crucial para el éxito de la terminación, así como cómo se puede lograr el control específico de la actividad cardíaca durante la iluminación para modificar los patrones de arritmia. En resumen, esta técnica ofrece la posibilidad de optimizar la manipulación del mecanismo in situ en el camino hacia el control de retroalimentación en tiempo real del ritmo cardíaco y, con respecto a la especificidad de la región, nuevos enfoques para reducir el daño potencial al sistema cardíaco en comparación con el uso de aplicaciones de descargas eléctricas no específicas.

Introduction

Las primeras investigaciones de la dinámica espacio-temporal durante la arritmia revelaron que los complejos patrones eléctricos durante la fibrilación cardíaca son impulsados por ondas de excitación giratorias similares a vórtices1. Este hallazgo proporcionó nuevos conocimientos sobre los mecanismos subyacentes de las arritmias, que luego condujeron al desarrollo de nuevas terapias de terminación eléctrica basadas en la excitación multisitio del miocardio 2,3,4. Sin embargo, los tratamientos que utilizan estimulación del campo eléctrico no son locales y pueden inervar todas las células excitables circundantes, incluido el tejido muscular, causando daño celular y tisular, así como dolor intolerable. A diferencia de las terapias eléctricas, los enfoques optogenéticos proporcionan una técnica específica y protectora de tejidos para evocar potenciales de acción de cardiomiocitos con alta precisión espacial y temporal. Por lo tanto, la estimulación optogenética tiene el potencial de un control mínimamente invasivo de los patrones de activación caótica durante la fibrilación cardíaca.

La introducción del canal iónico sensible a la luz canalrodopsina-2 (ChR2) en células excitables mediante manipulación genética 5,6,7, permitió la despolarización del potencial de membrana de las células excitables mediante fotoestimulación. Se han desarrollado varias aplicaciones médicas, incluyendo la activación de redes neuronales, el control de la actividad cardíaca, la restauración de la visión y la audición, el tratamiento de lesiones medulares, y otras 8,9,10,11,12,13,14. La aplicación de ChR2 en cardiología tiene un potencial significativo debido a su tiempo de respuesta de milisegundos15, lo que lo hace muy adecuado para el control dirigido de la dinámica cardíaca arrítmica.

En este estudio, se muestra la fotoestimulación multisitio de corazones intactos de un modelo de ratón transgénico. En resumen, se estableció una línea de ratones alfa-MHC-ChR2 transgénicos en el ámbito del Séptimo Programa Marco FP7/2007-2013 de la Comunidad Europea (HEALTH-F2-2009-241526) y amablemente proporcionada por el Prof. S. E. Lehnart. En general, los machos adultos transgénicos C57/B6/J, que expresaban Cre-recombinasa bajo control de alfa-MHC se emparejaron para aparearse con hembras B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Dado que el casete STOP cardíaco se eliminó en la segunda generación, la descendencia mostró una expresión estable de MHC-ChR2 y se utilizó para mantener colonias fotosensibles cardíacas. Todos los experimentos se realizaron con ratones adultos de ambos sexos a una edad de 36 a 48 semanas. La iluminación se logra utilizando una matriz de micro-LED de 3 x 3, fabricada como se describe en16,17, excepto que la carcasa a base de silicio y las fibras cortas de vidrio óptico no están implementadas. Su primer uso en una aplicación cardíaca se encuentra en18. Se ha aplicado una matriz lineal de micro-LED basada en una tecnología de fabricación similar como sonda penetrante para la estimulación cardíaca19. Los micro-LED están dispuestos en una matriz de 3 x 3 a un paso de 550 μm, proporcionando una alta resolución espacial y una alta potencia radiante en un área muy pequeña. Los autores demuestran en este trabajo una fotoestimulación multisitio local versátil que puede abrir el camino para desarrollar nuevos métodos de terapia antiarrítmica.

El siguiente protocolo experimental implica una perfusión de Langendorff retrógrada ex vivo, para la cual la aorta canulada funciona como entrada de perfusión. Debido a la presión de perfusión aplicada y la contracción cardíaca, el perfusión fluye a través de las arterias coronarias, que se ramifican de la aorta. En el trabajo presentado, el corazón se perfunde utilizando una configuración de presión constante lograda elevando los reservorios de perfusión a 1 m de altura, equivalente a 73.2 mmHg, lo que produce un caudal de 2.633 ± 0.583 mL / min. Dos tipos de solución de Tyrode se utilizan como perfusión durante el experimento. La solución regular de Tyrode apoya un ritmo sinusal estable, mientras que la solución de Low-K+ Tyrode se mezcla con Pinacidil para permitir la inducción de arritmia en corazones murinos. El uso de un baño de agua hexagonal permite la observación del corazón a través de seis ventanas planas diferentes, lo que permite el acoplamiento de varios componentes ópticos con menos distorsión por refracción.

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Protocol

Todos los experimentos siguieron estrictamente la regulación de bienestar animal, de acuerdo con la legislación alemana, las estipulaciones locales y de acuerdo con las recomendaciones de la Federación Europea de Asociaciones de Ciencia de Animales de Laboratorio (FELASA). La solicitud de aprobación de experimentos con animales ha sido aprobada por la autoridad responsable de bienestar animal, y todos los experimentos fueron reportados a nuestros representantes de bienestar animal.

1. Preparación de experimentos y materiales

  1. Configuración de mapeo óptico
    NOTA: La configuración óptica, así como la configuración eléctrica, se muestran en la Figura 1. Todos los componentes utilizados en la configuración óptica y eléctrica se enumeran en detalle en la Tabla de materiales.
    1. Utilice el LED 1 y el LED 2 para la inducción de arritmias y la desfibrilación de respaldo. Elija LED de alta potencia con una longitud de onda λazul cercana a 475 nm, que es el pico de la longitud de onda de excitación de ChR26. Para reducir aún más el espectro óptico, utilice un filtro de paso de banda de 470 ± 20 nm.
      NOTA: En este trabajo, el LED 1 y el LED 2 tienen un flujo radiante típico de 3.9 a 5.3 W, según la hoja de datos20.
    2. Ilumine el epicardio para el mapeo óptico con un LED rojo de alta potencia (LED 3 en la Figura 1), que emite luz con una longitud de onda central de λrojo = 625 nm y un flujo radiante de 700 mW21. La luz roja se filtra con un filtro de paso de banda de 628 ± 20 nm y se refleja en un espejo dicroico (DM) de paso largo con una longitud de onda de corte de λDM = 685 nm.
    3. Utilice un filtro de emisión con λfiltro-leva = 775 ± 70 nm delante del objetivo de la cámara para registrar solo la emisión de fluorescencia de la actividad cardíaca. Utilice un objetivo rápido que sea adecuado para aplicaciones con poca luz.
      NOTA: La frecuencia de fibrilación del corazón de un ratón varía de 20 a 35 Hz; por lo tanto, use una cámara lo suficientemente rápida para grabar con una frecuencia de 1 a 2 kHz, o incluso superior.
  2. Matriz de micro-LED
    NOTA: Las matrices de micro-LED aplicadas aquí se realizan utilizando el procesamiento de microsistemas como se detalla en otra parte16,17.
    1. Capa de centrifugación de una capa de poliimida (PI) de 5 μm de espesor sobre sustratos de silicio de 4 pulgadas (pulido por una sola cara, 525 μm de espesor).
    2. Curar esta capa PI a una temperatura máxima de 450 °C bajo una atmósfera de nitrógeno. Mantenga la temperatura máxima constante durante 10 min.
    3. Deposite y modele una fotorresistencia (PR) de inversión de imagen utilizando litografía ultravioleta (UV) y deposite una capa de platino delgada (Pt) de 250 nm.
    4. Espesar esta metalización basada en Pt galvanoplastia una capa de oro (Au) de 1 μm de espesor con el PR estampado que sirve como capa de enmascaramiento.
    5. Antes de recubrir por centrifugado una segunda capa PI, exponga la oblea con su primera capa PI y la metalización galvanizada con Au-galvanizado a un plasma de oxígeno que activa químicamente la superficie de la capa PI.
    6. Curar la segunda capa PI de nuevo a 450 °C, aplicar litografía UV para modelar una capa PR y abrir las almohadillas de contacto de la matriz para los chips micro-LED y la placa de circuito impreso de interfaz (PCB) mediante grabado iónico reactivo (RIE) utilizando el PR modelado como capa de enmascaramiento.
      NOTA: En estos pasos del proceso RIE, se recomienda aplicar 200 W y 100 W durante 10 y 30 min, respectivamente, para definir las aberturas de la almohadilla de contacto, así como la forma exterior de la matriz de microLED bidimensional (2D).
    7. Pelar el PR utilizando disolventes y grabado por plasma. Espesar aún más las almohadillas de contacto galvanoplastia una capa adicional de oro de 6 μm de espesor.
    8. Conecte los chips micro-LED a las almohadillas de contacto utilizando un adhesivor flip-chip.
    9. Active la superficie PI en un plasma de oxígeno y rellene los chips micro-LED con un adhesivo sin disolventes. Curar el adhesivo durante 12 h a 120 °C.
    10. Para encapsular los chips micro-LED, realice otro tratamiento de plasma con argón y aplique una capa delgada de fluoropolímero manualmente. Precurar esta capa a 80 °C durante 1 h.
    11. Aplique manualmente silicona como capa de encapsulación final después de exponer la matriz de micro-LED a un plasma de oxígeno, utilizado para mejorar la adhesión del silicio a la capa de fluoropolímero subyacente. Curar la capa de silicona a 80 °C y 180 °C durante 1 h cada una. Estos pasos finales de curado también curan completamente la capa de fluoropolímero.
    12. Suelde las almohadillas de contacto del sustrato PI a una placa de circuito impreso que lleva conectores de tira para la interconexión de la matriz a una instrumentación externa. Cubra las almohadillas de soldadura en la PCB con un adhesivo.
  3. Configuración eléctrica
    1. Use electrodos adecuados para registrar un electrocardiograma (ECG), por ejemplo, electrodos de plata/cloruro de plata o electrodos de potencial de acción monofásico (MAP) y un amplificador de ECG para monitorear la actividad eléctrica del corazón continuamente. Además, utilice un dispositivo de adquisición (AD) adecuado para registrar todas las señales eléctricas obtenidas.
    2. Elija un controlador adecuado para los LED de alta potencia (LED 1, LED 2 y LED 3), que pueden administrar la corriente máxima aplicada a cada dispositivo. Utilice un generador de funciones arbitrarias (AFG) para controlar la salida de los controladores LED con precisión.
    3. Utilice un controlador LED multicanal para controlar la corriente que fluye a través de la matriz de micro-LED. Un AFG con múltiples salidas también es adecuado para esta tarea.
      NOTA: Es recomendable elegir controladores LED que limiten la corriente a la corriente máxima del micro-LED, de lo contrario los diodos podrían dañarse. Un ejemplo de un controlador micro-LED multicanal se describe en otro trabajo18. Si es necesario, el AFG o cualquier otro controlador LED puede conectarse a una computadora para controlar de forma remota la configuración del micro-LED. Si este es el caso, conecte el controlador LED a la computadora con el protocolo de comunicación de su elección, por ejemplo, Bus de interfaz de propósito general (GPIB) o una conexión serie.

   

2. Procedimientos experimentales

  1. Preparación de la solución
    1. Prepare la solución de Tyrode: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 24 mM NaHCO3, 1.8 mM CaCl 2, 1.2 mM KH2 PO4, 5.6 mM Glucosa, 0.1% BSA/Albúmina.
    2. Prepare la solución de Low-K+ Tyrode: Low-K+ Tyrode's se fabrica de la misma manera que la solución regular de Tyrode, excepto que solo se agrega la mitad de la cantidad de KCl (2 mM en lugar de 4 mM KCl).
      NOTA: Para un experimento que dura 3 h, generalmente 2-3 L de Tyrode de Low-K+ (mezclado adicionalmente con Blebbistatin (Paso 2.1.5) si se realiza mapeo óptico) y 1-2 L de Tyrode regular son suficientes.
    3. Agregue Pinacidil a la solución de Low-K+ Tyrode para facilitar el proceso de inducción de arritmias, como se describe en22, para obtener una concentración de 100 mM. Use guantes protectores de laboratorio cuando manipule Pinacidil.
    4. Preparar 1 ml de 50 μM DI-4-ANBDQPQ con la solución regular de Tyrode. Proteja el tinte de la luz para evitar el fotoblanqueo.
    5. Haga una solución madre de 10 mM de blebbistatina. Para el mapeo óptico, mezclar Blebbistatin con la solución de Pinacidil-Tyrode de 100 mM (Paso 2.1.3) para obtener una solución de 5 μM. Use guantes protectores de laboratorio cuando manipule blebbistatina.
      NOTA: Mantenga el tinte y la solución de blebbistatina a un lado hasta que comience el mapeo óptico.
  2. Perfusión de Langendorff
    NOTA: La configuración consta de dos depósitos para las dos soluciones de Tyrode. Están conectados a una trampa de burbujas a través de tubos con pollos de tres vías. El corazón se une más tarde a la trampa de burbujas mediante un conector de bloqueo Luer, y luego se suspende en un baño de agua hexagonal. El baño de agua está, a su vez, conectado a un contenedor de residuos para recoger la solución usada de Tyrode.
    1. Limpie todos los tubos antes de cada experimento con agua totalmente desmineralizada.
    2. Airear ambas soluciones de Tyrode con Carbogen (5% CO2 y 95%O2) durante 30 min a temperatura ambiente antes de comenzar el experimento. Ajuste el valor de pH de las soluciones de Tyrode a 7,4 con NaOH.
    3. Llene 500 ml de cada solución de Tyrode en el depósito correspondiente y desairee los tubos, así como la trampa de burbujas, pasando la solución de Tyrode a través del sistema de perfusión hasta que no se vean más burbujas de aire atrapadas en los tubos o en la trampa de burbujas.
    4. Continuar aireando las soluciones de Tyrode durante todo el experimento en los depósitos con Carbogen para garantizar que el pH del perfusato permanezca estable más adelante durante la perfusión.
    5. Calentar el sistema de perfusión a 37 °C con una bomba de calor de agua. Mantenga constante la temperatura de perfusión dentro del baño de agua utilizando un elemento calefactor adicional, como un cable calefactor impermeable.
      NOTA: Durante el experimento, es crucial volver a llenar los depósitos del Tyrode antes de que se vacíen. De lo contrario, las burbujas de aire pueden ingresar al corazón, lo que puede obstruir los vasos y provocar isquemia.
  3. Preparación del ratón
    1. Inyecte por vía subcutánea 0,1 ml de 500 I.E. heparina 30 min antes del procedimiento de aislamiento cardíaco.
    2. Llene una placa de Petri de 6 cm y una jeringa de 2 ml con la solución helada de Tyrode. Colocar bajo el microscopio estereoscópico.
    3. Realizar anestesia a corto plazo de ratones por un ambiente saturado de isoflurano durante 2 min y luxación cervical inmediata después.
      NOTA: Para verificar suficiente anestesia es absolutamente necesario verificar el reflejo negativo entre los dedos del pie.
    4. Abra el pecho, retire el corazón, como se describe en otra parte23, y colóquelo en la placa de Petri de 6 cm con la solución helada de Tyrode. Los latidos cardíacos disminuirán debido a la caída de la temperatura.
    5. Hacer la preparación fina bajo un microscopio estereoscópico, como se detalla en otra parte23. Coloque la aorta en la aguja roma y fije el vaso con material de sutura.
    6. Como control, inyecte la solución helada de Tyrode a través de la aguja en el corazón y verifique que el corazón esté bien montado. Este paso también enjuaga la sangre restante del corazón.
    7. Transfiera el corazón montado al sistema de perfusión. Asegúrese de que el perfusado fluya para evitar que el aire entre en el corazón mientras conecta la aguja con la trampa de burbujas. Compruebe que el corazón esté cubierto con la solución de Tyrode en el baño maría. Los pasos 2.3.4, 2.3.5 y 2.3.7 se ilustran en la Figura 2.
    8. Asegúrese de que el corazón comience a latir en unos pocos minutos. Deje que el corazón se adapte a la configuración de perfusión durante 15 a 20 minutos, luego cambie a la solución de Tyrode bajo K + con Pinacidil (Paso 2.1.3) respectivamente la solución de Tyrode bajo K + con Pinacidil y Blebbistatin (Paso 2.1.5) si se va a realizar un mapeo óptico.
  4. Inducción de arritmias y desfibrilación óptica
    1. Coloque uno de los electrodos de ECG lo más cerca posible de la superficie del corazón para garantizar una buena calidad de señal. Suspenda el segundo electrodo de ECG en la solución de Tyrode. Asegúrese de que el ECG adquirido está siendo registrado por el AD de elección.
    2. Coloque la matriz de micro-LED en el área de interés del estudio, por ejemplo, en el ventrículo izquierdo.
    3. Cambie la perfusión a Tyrode's low-K+ con Pinacidil y perfunda el corazón durante 15 a 30 min.
    4. Para inducir arritmia, ilumine el corazón con LED 1 y LED 2 con un tren de 20 a 50 pulsos de luz con una frecuencia f ind de 25 a 35 Hz, duración del pulso Wind de 2 a 15 ms e intensidad de luz LIopt_ind de 2.8 mW mm-2.
    5. Repita el proceso hasta que se induzca la arritmia.
      NOTA: Las arritmias son fáciles de identificar en la señal del ECG porque la frecuencia y la morfología de la señal difieren del ritmo sinusal normal. Si la arritmia termina dentro de los próximos 5 s, clasifíquela como autoterminada y comience un nuevo intento de inducción.
    6. Una vez que se detecta visualmente una arritmia sostenida, aplique una ráfaga de pulsos con diferentes anchos W def y frecuencias fdef, utilizando tres, seis o nueve micro-LEDs de la matriz a unpulso de corriente pulsante I de 15 mA que produzca una intensidad de luz LIμLED = 33.31 ± 2.05 mW mm-2.
    7. Si la arritmia continúa después de cinco ensayos de desfibrilación basados en matrices de micro-LED, clasifique el intento como fallido y comience la desfibrilación de respaldo.
    8. Para la desfibrilación de respaldo, use LED 1 y LED 2 utilizando los mismos parámetros de sincronización establecidos para la matriz de micro-LED.
      NOTA: Debido a que el corazón está expuesto al estrés isquémico y metabólico durante todo el período experimental, es posible que los intentos de terminación de la arritmia no tengan éxito incluso con la desfibrilación de respaldo. Siempre que esto suceda, cambie la solución de perfusión a la de Tyrode regular y deje que el corazón se recupere durante 5 a 10 minutos. Cuando el ECG vuelva al ritmo sinusal, repita de nuevo el protocolo del paso 2.4.3.
  5. Mapeo óptico
    1. Perfundir el corazón con la solución de Blebbistatin preparada en el paso 2.1.5 y esperar hasta que se produzca el desacoplamiento mecánico. Esto se logra cuando el corazón deja de latir, pero una señal de ECG sigue siendo medible.
      NOTA: Mezclar la solución de Blebbistatin a la concentración mencionada y mantener el corazón perfundido con esta solución mantiene la actividad mecánica cardíaca desacoplada de la actividad eléctrica durante todo el experimento.
    2. Dar el colorante de tensión DI-4-ANBDQPQ de 1 ml (preparado en el paso 2.1.4) como bolo en la trampa de burbujas de la perfusión de Langendorff. Espere de 5 a 10 minutos para permitir que el tinte perfunda el corazón de manera uniforme.
      NOTA: Evite el fotoblanqueo del tinte apagando la luz roja siempre que no se realice ninguna grabación. Si la relación señal/ruido de la grabación se vuelve demasiado pequeña (la señal adquirida es demasiado ruidosa), repita los pasos 2.1.4 y 2.5.2.
    3. Enfoque la cámara sobre la superficie del corazón, encienda el LED 3 y aplique una potencia óptica de 1,27 mW mm-2 .
    4. Apague las luces del laboratorio y comience a grabar. Asegúrese de que se está adquiriendo una señal óptica comparando la frecuencia de la señal obtenida con la frecuencia del ECG grabado. Esto asegura que la señal óptica obtenida esté puramente relacionada con la actividad eléctrica del corazón.
      NOTA: Dado que la luz fluorescente emitida por el tinte es muy semanal, el mapeo óptico se realiza en una habitación oscura. Esto evita la interferencia de la señal de cualquier otra fuente de luz.

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Representative Results

El protocolo permite la inducción de arritmias ventriculares en corazones murinos intactos mediante pulsos de fotoestimulación generados por LED 1 y LED 2 (Figura 1) con una frecuencia f ind entre 25 Hz y 35 Hz y una duración de pulso Wind entre 2 ms y 10 ms. Tenga en cuenta que el objetivo de tales pulsos de luz rápidos no es capturar el ritmo cardíaco, sino desequilibrar la actividad cardíaca para que se puedan generar ondas eléctricas erráticas, que luego facilitan una arritmia. La ventaja de inducir arritmia con luz sobre la inducción con estimulación eléctrica es que no se provocan artefactos en el ECG, proporcionando la posibilidad de post-analizar la señal adquirida sin restricciones e incluso evaluar la respuesta eléctrica del corazón durante la estimulación rápida, este hecho también proporciona la posibilidad de observar el comportamiento del corazón durante la fotodesfibrilación. Esto no es posible con métodos de inducción eléctrica o desfibrilación. Sin embargo, si la configuración utilizada no permite el uso de LED externos de alta potencia, por ejemplo, debido a restricciones de lugar, se puede colocar un electrodo de estimulación adicional en el corazón para inducir arritmia, como se muestra en otra parte 3,22,24.

Una vez que se induce la fibrilación, la arritmia debe durar al menos 5 segundos para garantizar que se mantenga, luego se inician los intentos de desfibrilación basados en micro-LED. Dado que los principales parámetros de la arritmia cardíaca, como la duración básica del ciclo o la frecuencia dominante, la amplitud y la morfología, cambian continuamente y, como hasta la fecha no es posible predecir qué parámetros de fotodesfibrilación proporcionan el mejor resultado, fue de gran interés comprender si existe una relación entre la frecuencia, el ancho del pulso, Área de fotoestimulación y tasa de terminación. Por lo tanto, se probaron una serie de experimentos con diferentes frecuencias f def, número de micro-LEDs y duraciones de pulso Wdef, y se extrajo la tasa de éxito para N = 11 ratones, como se muestra en la Figura 3.

Se pudo demostrar que los pulsos de 1 a 20 ms de duración pueden desfibrilar con diferentes tasas de éxito (Figura 3). Dado que la intensidad de la luz LIμLED se mantuvo constante durante cada pulso de fotoestimulación, como se mencionó en el Paso 2.4.6, y la tasa de éxito de tres micro-LED contra nueve es notablemente menor, los resultados presentados sugieren que el área cubierta en el corazón, el número de micro-LED y, por lo tanto, el flujo radiante total aplicado son factores cruciales para lograr la desfibrilación. Teniendo en cuenta que cada micro-LED en la matriz es una fuente de luz Lambertiana y que se colocan directamente sobre la superficie del corazón de modo que la distancia aproximada al tejido es cero, se puede suponer que el contorno de irradiancia del área iluminada en el corazón cuando se utiliza un solo micro-LED es equivalente a AμLED = 0,059 mm², como también se muestra en25 para LED rectangulares planos. Además, aunque algunos fotones pueden salir del micro-LED lateralmente desde los bordes, la contribución de estos a la intensidad total de la luz se considera tan pequeña que su efecto puede ser descuidado. Para cuantificar la luz irradiada de la matriz, los autores midieron el flujo radiante de la matriz de micro-LED con un medidor de potencia comercial y calcularon la intensidad de la luz que llega al corazón como se muestra en la Tabla 1. De la Tabla 1 también se puede leer que el flujo radiante aumenta con el número de micro-LED utilizados, pero la intensidad de la luz permanece constante debido a las implicaciones del perfil de iluminación mencionadas anteriormente.

Curiosamente, también se puede observar que la tasa de éxito de nueve LED conW def = 1 ms (Figura 3a) y W def = 20 ms (Figura 3d) a una frecuencia de desfibrilación f def = 18 Hz y f def = 20 Hz son comparativamente altas. Teniendo en cuenta que la frecuencia promedio de las arritmias inducidas es de 22,55 ± 4,03 Hz, este hecho podría indicar que para los corazones murinos ChR2, la tasa de éxito aumenta significativamente cuanto más cerca está la frecuencia de estimulación de la frecuencia de arritmia. Esto también se muestra en las simulaciones numéricas26. Sin embargo, esto no se puede generalizar fácilmente porque la frecuencia dominante de arritmias complejas cambia constantemente. Para ilustrar esto, la Figura 4 muestra dos intentos de desfibrilación diferentes con fdef = 14 Hz. Al inicio del segmento ECG en la Figura 4a) y según la morfología de la señal del ECG se muestra una fibrilación ventricular (FV). Cuando comienza la fotoestimulación micro-LED, la fibrilación se convierte en un patrón más ordenado que es más probable que sea una taquicardia ventricular (TV). Cada vez que se apaga la matriz de micro-LED, las caóticas ondas VF originales vuelven a tomar el control. Por lo tanto, la arritmia no se termina. Aunque en este ejemplo el VF no se puede terminar con los parámetros dados, se altera y se puede cambiar a un patrón más regular (VT). Figura 4b El segmento 1 muestra que la frecuencia dominante de 24 Hz aumenta ligeramente hasta que comienza la fotoestimulación y la FV se convierte en una TV en el segmento 2, donde la frecuencia dominante cae a 14 Hz. Además, la Figura 4c muestra un VT que puede ser terminado con la mismaf def que en la Figura 4a, pero con unadefinición W diferente. Primero, la fotoestimulación micro-LED cambia la morfología de la arritmia, para finalmente terminarla con una captura de ritmo 1: 1 desde el pulso19 en adelante. Estos resultados podrían implicar que los parámetros de fotodesfibrilación, por ejemplo Wdef, deben adaptarse al cambio morfológico de la arritmia con el tiempo. Los experimentos que condujeron a estos resultados se realizaron sin usar Blebbistatin debido al cambio resultante en la duración del potencial de acción (APD)27. Por lo tanto, no se realizó ningún mapeo óptico en estas series.

Se realizó otro conjunto de experimentos para el mapeo óptico utilizando el tinte potenciométrico desplazado al rojo (Paso 2.1.4). El mapeo óptico con cámaras de alta velocidad permite observar la propagación de ondas de excitación en la superficie del corazón durante el ritmo sinusal (Figura 5) y taquiarritmias complejas28. Dado que el cambio fraccionario del colorante potenciométrico es muy bajo, los videos obtenidos fueron post-procesados utilizando un lenguaje de programación matemático. El primer paso para mejorar la calidad de las señales ópticas es eliminar el ruido aplicando un filtro de suavizado gaussiano con una desviación estándar de σ = 1, seguido de un filtro de paso de banda con frecuencias de esquina falto = 0.1 Hz y fbajo = 70 Hz. La banda de parada en f alta elimina los cambios lentos en la señal que no están relacionados con la frecuencia sinusal del corazón que se encuentra entre 3 Hz< seno f < 8 Hz, mientras que la banda de paradaf baja elimina el ruido dealta frecuencia que es capturado por la cámara. Es importante tener en cuenta que tanto las emisiones de luz azul del LED 1, LED 2 y de la matriz de micro-LED pueden causar diafonía y una señal de interferencia muy alta en el mapeo óptico. Además, se observó que ni siquiera un filtro de paso de banda muy estrecho delante de la cámara, con unacámara de filtro λ de longitud de onda, como se mencionó en el Paso 1.2.3, filtraría la influencia de la luz azul. Esto podría ser causado en parte por la respuesta de excitación del tinte en sí. Por lo tanto, tenga mucho cuidado al elegir la óptica para el mapeo óptico. Para los medios de análisis de video, todos los fotogramas en los que se ha grabado luz azul tuvieron que ser descuidados para que en muchos casos no sea posible visualizar el corazón durante la fotoestimulación, como también se mencionó en otro estudio29.

Figure 1
Figura 1: Esquema de la configuración eléctrica y óptica. (a) Los LED 1 y 2 proporcionan una fuente de luz azul utilizada para la inducción de arritmias y la desfibrilación de respaldo. El LED 3 se utiliza como fuente de luz de excitación para el tinte DI-4-ANBDQPQ desplazado al rojo. La luz roja se dirige al corazón por medio del espejo dicroico DM. La luz de emisión mostrada en rojo oscuro es grabada por la cámara de alta velocidad a través de un filtro de emisión, como se menciona en el texto. Los electrodos LED 2 y ECG no se muestran para simplificar. (b) Un segmento de la señal de ECG grabada que se muestra en rojo. El azul oscuro muestra los pulsos de luz de LED 1 y LED 2 a una frecuencia f ind = 35 Hz y Wind = 4 ms utilizados parainducir la fibrilación. Inmediatamente después de terminar el estímulo de luz, se puede observar fibrilación ventricular (FV). La fotoestimulación basada en micro-LED que se muestra en azul claro (f def = 16 Hz, Wdef = 20 ms) termina con éxito la arritmia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Preparación del corazón. (a) Pecho abierto de un ratón que muestra el corazón intacto y los órganos circundantes. (b) Corazón explantado sumergido en la solución helada de Tyrode para su posterior preparación. (c) Corazón de ratón correctamente unido a una aguja roma. d) Corazón murino suspendido en la solución de Tyrode. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Tasas de éxito extraídas experimentalmente. Tasas de éxito para 30 pulsos de fotoestimulación basados en micro-LED utilizando tres, seis y nueve LED a diferentes duraciones de pulso Wdef y frecuencias fdef para N = 11. Barras de error mostradas con el error estándar de la media S.E.M. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Manipulación del ritmo cardíaco mediante fotoestimulación . (a) Segmento de un registro de ECG de una arritmia no terminada. b) Espectrograma del ECG mostrado en el panel a. La densidad espectral de potencia (PSD) del Segmento (1) muestra una arritmia con una frecuencia dominante de 24 Hz. Segmento (2) fotoestimulación con los parámetros mostrados. Se puede observar que la frecuencia dominante cae a 14 Hz. Segmento (3) Terminación fallida y retorno al comportamiento arrítmico con una frecuencia dominante de 24 Hz. (c) ECG de un intento exitoso de desfibrilación. d) Espectrograma de la terminación satisfactoria que figura en el panel c. El segmento (1) muestra una taquicardia ventricular (TV) con frecuencia dominante de 23 Hz. Segmento (2) fotoestimulación utilizando los ajustes mostrados. El segmento (3) muestra una terminación exitosa, que conduce a un ritmo sinusal normal con una frecuencia fundamental de 3.5 Hz y los armónicos resultantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Mapeo óptico de todo el corazón. Se muestra el cambio de intensidad de fluorescencia durante un solo latido del corazón en ritmo sinusal normal. El corazón se colocó frente a la cámara de modo que el ventrículo derecho e izquierdo sean visibles (RV, VI). El asterisco muestra el píxel en el que se tomó el potencial de acción que se muestra en la parte superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Número de microLED Zona irradiada Aμled [mm2] Flujo radiante φ [mW] Intensidad de luz LI [mW mm-2]
3 0.178 5,9 ± 0,47 33,11 ± 2,66
6 0.356 11,91 ± 0,84 33,42 ± 2,37
9 0.535 17,85 ± 0,61 33,39 ± 1,14

Tabla 1: Flujo radiante medido de la matriz de micro-LED y la intensidad de luz correspondiente.

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Discussion

Un tratamiento exitoso de las taquiarritmias cardíacas es clave para la terapia cardíaca. Sin embargo, los mecanismos biofísicos subyacentes a la iniciación, perpetuación y terminación de la arritmia no se comprenden completamente. Por lo tanto, la investigación cardíaca tiene como objetivo optimizar la terapia de choque eléctrico hacia una terminación más suave de las arritmias, aumentando así la calidad de vida de los pacientes 28,29,30,31. Los enfoques eléctricos de baja energía prometen una reducción significativa de los efectos secundarios graves, sin embargo, aún podrían inducir una excitación muscular no deseada. La optogenética cardíaca podría superar esta limitación y proporcionar no solo una técnica de terminación suave del tejido, sino también una plataforma flexible para investigar el control dirigido específico de arritmias de ondas de excitación similares a vórtices en el corazón murino intacto y en cultivos celulares32,33.

Dada esa motivación, se diseñó e implementó una configuración robusta de fotoestimulación, así como un protocolo, ambos ofreciendo un sistema óptico altamente adaptable, que podría extenderse fácilmente a estudios de mapeo óptico panorámico tridimensional34.

Se podría demostrar que las arritmias cardíacas se pueden terminar con éxito con diferentes tasas de éxito dependiendo de los parámetros que se elijan para la fotoestimulación, por ejemplo, el área iluminada en el corazón. Los resultados presentados sugieren que el aumento de la superficie irradiada reclutó un número crítico de cardiomiocitos que extinguen la actividad caótica por bloqueo de conducción como también se muestra en22. En este estudio, la energía requerida para fotodesfibrilar es E = 10,69 ± 0,37 mJ (utilizando nueve micro-LEDs, 30 pulsos y ancho de pulso Wdef = 20 ms). Esto resulta ser más bajo que el reportado anteriormente en 22,24 con E 22 = 228.8 mJ y E 24 = 153.6 mJ, donde se iluminó un área más grande22 o todo el corazón 24, respectivamente. Sin embargo, en comparación con el enfoque mostrado en 35, donde un área modelada bien delimitada se ilumina con 10 pulsos de fotodesfibrilación que resultan en E 35 = 1.8 mJ, la energía de fotodesfibrilación en el presente estudio es notablemente mayor. A diferencia de los otros tres enfoques, no se pudo alcanzar una tasa de éxito superior al 90% con el protocolo presentado. Una posible razón para el rendimiento reducido a pesar de una mayor energía de fotodesfibrilación podría ser que no se está considerando la complejidad de la arritmia subyacente. Con respecto a los resultados presentados en 35, donde se logra una alta tasa de terminación iluminando un área pequeña en el corazón y midiendo simultáneamente la dinámica espacio-temporal de una arritmia, el enfoque presentado ciertamente puede mejorarse aún más considerando el control de retroalimentación, que responde con un patrón diferente de iluminación micro-LED dependiendo del estado actual del corazón.  Además, también se demostró que, aunque las arritmias no siempre se pueden terminar con el método actual, la dinámica compleja intrínseca puede alterarse durante la fotoestimulación que conduce a un estado temporal más ordenado. Como se muestra en36, la tasa de terminación es significativamente diferente cuando se abordan arritmias monomórficas (más ordenadas) y polimórficas (menos ordenadas). Por lo tanto, el paso lógico hacia una mejor tasa de desfibrilación podría ser influir en la dinámica cardíaca durante un episodio de FV, convertir la arritmia en un patrón menos complejo y terminar con otro conjunto de pulsos, construyendo de esta manera un enfoque de fotoestimulación de dos pasos.

En cuanto al protocolo de perfusión, los pasos más críticos se encuentran en la correcta extracción y preparación del corazón, así como en el correcto ajuste de la óptica de mapeo óptico. El mapeo óptico requiere estrictamente la selección adecuada de espectros de tinte, fuentes de luz de excitación apropiadas y filtros ópticos bien elegidos para la cámara29. De lo contrario, las señales ópticas grabadas podrían ser demasiado ruidosas y también podrían contener diafonía de fotoestimulación con excitación de tinte. Por lo tanto, el análisis posterior requeriría el procesamiento posterior de las señales con varios filtros analíticos y el suavizado de la imagen, lo que a menudo resultaría en un empeoramiento.

Otro paso crucial en este protocolo es la colocación correcta y precisa de la matriz de micro-LED. Dado que el cable de interconexión entre la matriz de micro-LED y el controlador es muy delgado y flexible, a veces es difícil garantizar que la matriz se ubique aproximadamente en la misma ubicación en la superficie del corazón para cada experimento. Para facilitar el posicionamiento y fijar la posición adquirida de la matriz de micro-LED, se diseñó e imprimió un soporte en 3D, lo que permite que la matriz se conecte a un micromanipulador. Esto da más control sobre el movimiento de la matriz en la solución de Tyrode. Dependiendo del material elegido para el cable de interconexión de la matriz de micro-LED, el uso de un soporte podría no ser necesario.

Además, otro paso crítico del protocolo es la adición de medicamentos pro-arritmia, como por ejemplo, Pinacidil37. Dado que varios compuestos químicos son bien conocidos por cambiar la respuesta fisiológica del corazón, esto debe considerarse al analizar e interpretar los resultados. En lo que respecta al mapeo óptico, el protocolo propuesto utiliza Blebbistatin como desacoplador mecánico. Esto tiene la ventaja de eliminar artefactos de movimiento durante la grabación, pero también puede prolongar el APD27. Para superar este inconveniente, el análisis de los métodos de seguimiento de movimiento durante la grabación podría considerarse38,39. De esta manera, se preservaría la condición fisiológica normal del corazón y se puede obtener una señal de alta calidad.

Aunque se demostró que el protocolo presentado se puede utilizar para la fotodesfibrilación multisitio, todavía tiene algunas limitaciones. Se ha encontrado que en algunos casos la fibrilación no puede ser terminada por la fotoestimulación basada en micro-LED, sino que sólo ser perturbada, lo que resulta en cambios de frecuencia. Una hipótesis es que las ondas serpenteantes en el corazón solo están siendo desplazadas desde el ventrículo izquierdo, regenerándose en otras partes del corazón. En comparación con otros métodos como la iluminación global24, el presente método ofrece una menor tasa de éxito debido a una menor cobertura del corazón. Sin embargo, estamos seguros de que con el método de reconocimiento basado en hardware adecuado de la actividad en espiral, la mejora de la tasa de éxito de terminación es factible.

En conclusión, el sistema de fotoestimulación presentado establece una poderosa herramienta experimental para múltiples enfoques de cardioversión y estudios de manipulación de arritmias cardíacas. El conocimiento aprendido en este sistema se utilizará para investigar y evaluar nuevos protocolos potenciales (foto) de desfibrilación en modelos animales grandes clínicamente relevantes.

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Disclosures

Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Marion Kunze y Tina Althaus por su excelente apoyo técnico durante los experimentos. La investigación que ha dado lugar a los resultados ha recibido financiación del Séptimo Programa Marco FP7/2007-2013 de la Comunidad Europea en virtud del acuerdo de subvención número HEALTH-F2-2009-241526. El apoyo también fue proporcionado por el Centro Alemán de Investigación Cardiovascular, DZHK e.V. (Proyecto MD28), el sitio asociado Goettingen, la Fundación Alemana de Investigación CRC 1002 (proyecto C03) y la Sociedad Max Planck. Este trabajo fue apoyado en parte por BrainLinks-BrainTools, Cluster of Excellence financiado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG, número de subvención EXC 1086).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical Components
Blebbistatin TargetMol T6038 10 mM stock solution
BSA/Albumin Sigma-Aldrich A4919
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016 CaCl2
Carbogen Westfalen 50 l bottle
DI-4-ANBDQPQ AAT Bioquest 21499 Dye for Optical Mapping
Glucose Sigma-Aldrich D9434 C6H12O6
Heparin LEO Pharma Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription
Hydrochlorid Acid Merck 1.09057.1000 HCl, 1 M stock solution
Isoflurane CP Pharma 1 ml/ml, available only on prescription
Magnesium Chloride Merck 8.14733.0500 MgCl2
Monopotassium Phosphate Sigma-Aldrich 30407 KH2PO4
Pinacidil monohydrate Sigma-Aldrich P154-500mg 10 mM stock solution
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 KCl
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 NaHCO3
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 NaCl
Sodium Hydroxide Merck 1.09137.1000 NaOH, 1 M stock solution
Electrical Setup
Biopac MP150 Biopac Systems MP150WSW data acquisition and analysis system
Custom-built ECG, alternative ECG100C Biopac Systems ECG100C Electrocardiogram Amplifier
Custom-built water bath heater using heating cable RMS Heating System HK-5,0-12 Heating cable 120W
Hexagonal water bath
LED Driver Power supply Thorlabs KPS101 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube.
LEDD1B LED Driver Thorlabs LEDD1B T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current
MAP, ECG Electrode Hugo Sachs Elektronik BS4 73-0200 Mini-ECG Electrode for isoalted hearts
micro-LED Driver e.g. AFG Agilent Instruments A-2230 Arbitrary function generator (AFG)
Signal Generator Agilent Instruments A-2230 AFG
micro-LED Array Components
Epoxid glue Epoxy Technology EPO-TEK 353ND Two component epoxy
Fluoropolymer  Asahi Glass Co. Ltd. Cytop 809M Fluoropolymer with high transparency
Image reversal photoresist Merck KGaA AZ 5214E Image Reversal Resist for High Resolution
LED chip  Cree Inc. C460TR2227-S2100 Blue micro-LED
Photoresist Merck KGaA AZ 9260 Thick Positive Photoresists
Polyimide UBE Industries Ltd. U-Varnish S Polyimide Solution
Silicone NuSil Technology LLC MED-6215 Low viscosity silicone elastomer
Solvent free adhesive John P. Kummer GmbH Epo-Tek 301-2 Epoxy resin with low viscosity
Optical Mapping
Blue Filter Chroma Technology Corporation ET470/40x Blue excitation filter
Camera Photometrics Cascade 128+ High performance EMCCD Camera
Camera Objective Navitar DO-5095 Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras
Dichroic Mirror Semrock FF685-Di02-25x36 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter
Emmision Filter Semrock FF01-775/140-25 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter
Heatsink Advanced Thermal Solutions ATSEU-077A-C3-R0 Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware
LED 1 and LED 2 LED Engin Osram LZ4-00B208 High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3 Thorlabs M625L3 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA
Lenses LED Engin Osram LLNF-2T06-H LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Photodiode for power meter Thorlabs S120VC Standard Photodiode Power Sensor
Power Meter Thorlabs PM100D Compact Power and Energy Meter
Red Filter Semrock FF02-628/40-25 BrightLine® single-band bandpass filter

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Medicina Número 174 optogenética cardíaca mapeo óptico LED DI-4-ANBDQPQ Blebbistatin canalrodopsina-2 ChR2
Manejo avanzado del ritmo cardíaco mediante la aplicación de fotoestimulación optogenética multisitio en corazones murinos
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Diaz-Maue, L., Steinebach, J., Schwaerzle, M., Luther, S., Ruther, P., Richter, C. Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts. J. Vis. Exp. (174), e62335, doi:10.3791/62335 (2021).

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