Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Avancerad hjärtrytmhantering genom att tillämpa optogenetisk fotostimulering på flera platser i murina hjärtan

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62335
Automatic Translation
*1,2, *1, 8,9, 1,3,4,6, 8,9, 1,5,6,7
1Research Group Biomedical Physics, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 2Research Electronics Department, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, 4Institute for Nonlinear Dynamics, Georg-August-University Goettingen, 5Department of Cardiology and Pneumology, University Medical Center Goettingen, 6German Center for Cardiovascular Research, DZHK e.V., partner site Goettingen, 7Laboratory Animal Science Unit, German Primate Center Leibniz Institute for Primate Research, 8Department of Microsystems Engineering (IMTEK), University of Freiburg, 9Cluster of Excellence BrainLinks-BrainTools, University of Freiburg
* These authors contributed equally

Summary

Detta arbete rapporterar en metod för att kontrollera hjärtrytmen hos intakta murina hjärtan hos transgena channelrhodopsin-2 (ChR2) möss med hjälp av lokal fotostimulering med en mikro-LED-array och samtidig optisk kartläggning av epikardiell membranpotential.

Abstract

Ventrikulära takyarytmier är en viktig orsak till dödlighet och sjuklighet över hela världen. Elektriskt defibrillering med högenergiska elektriska stötar är för närvarande den enda behandlingen för livshotande ventrikelflimmer. Defibrillering kan dock ha biverkningar, inklusive oacceptabel smärta, vävnadsskada och försämring av prognosen, vilket indikerar ett betydande medicinskt behov av utveckling av mer skonsamma strategier för hjärtrytmhantering. Förutom energireducerande elektriska tillvägagångssätt introducerades hjärtoptogenetik som ett kraftfullt verktyg för att påverka hjärtaktiviteten med hjälp av ljuskänsliga membranjonkanaler och ljuspulser. I den aktuella studien kommer en robust och giltig metod för framgångsrik fotostimulering av Langendorff genomsyrade intakta murina hjärtan att beskrivas baserat på pacing på flera platser som applicerar en 3 x 3 uppsättning mikroljusemitterande dioder (mikro-LED). Samtidig optisk kartläggning av epikardiella membranspänningsvågor möjliggör undersökning av effekterna av regionspecifik stimulering och utvärderar den nyligen inducerade hjärtaktiviteten direkt på plats. De erhållna resultaten visar att effekten av defibrillering är starkt beroende av de parametrar som valts för fotostimulering under en hjärtarytmi. Det kommer att visas att det upplysta området i hjärtat spelar en avgörande roll för termineringsframgång samt hur den riktade kontrollen av hjärtaktivitet under belysning för att modifiera arytmimönster kan uppnås. Sammanfattningsvis ger denna teknik en möjlighet att optimera mekanismmanipulationen på plats på vägen till återkopplingskontroll i realtid av hjärtrytmen och, när det gäller regionspecificiteten, nya tillvägagångssätt för att minska den potentiella skadan på hjärtsystemet jämfört med användningen av icke-specifika elektriska chockapplikationer.

Introduction

Tidiga undersökningar av den rumsliga-temporala dynamiken under arytmi avslöjade att de komplexa elektriska mönstren under hjärtflimmer drivs av virvelliknande roterande excitationsvågor1. Detta fynd gav nya insikter i de underliggande mekanismerna för arytmier, vilket sedan ledde till utvecklingen av nya elektriska termineringsterapier baserade på multi-site excitation av myokardiet 2,3,4. Behandlingar som använder elektrisk fältstimulering är dock icke-lokala och kan innervera alla omgivande exciterbara celler, inklusive muskelvävnad, vilket orsakar cell- och vävnadsskador samt oacceptabel smärta. Till skillnad från elektriska terapier ger optogenetiska tillvägagångssätt en specifik och vävnadsskyddande teknik för att framkalla kardiomyocytverkanspotentialer med hög rumslig och tidsmässig precision. Därför har optogenetisk stimulering potential för minimal invasiv kontroll av de kaotiska aktiveringsmönstren under hjärtflimmer.

Införandet av den ljuskänsliga jonkanalen channelrhodopsin-2 (ChR2) i exciterbara celler via genmanipulation 5,6,7, möjliggjorde depolarisering av membranpotentialen hos exciterbara celler med hjälp av fotostimulering. Flera medicinska tillämpningar, inklusive aktivering av neuronala nätverk, kontroll av hjärtaktivitet, återställande av syn och hörsel, behandling av ryggmärgsskador och andra 8,9,10,11,12,13,14 har utvecklats. Tillämpningen av ChR2 i kardiologi har betydande potential på grund av dess millisekunds responstid15, vilket gör den väl lämpad för riktad kontroll av arytmisk hjärtdynamik.

I denna studie visas fotostimulering på flera platser av intakta hjärtan i en transgen musmodell. Sammanfattningsvis upprättades en transgen alfa-MHC-ChR2-muslinje inom ramen för Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) och tillhandahölls vänligen av prof. S. E. Lehnart. I allmänhet parades transgent vuxen hane C57/B6/J, som uttrycker Cre-rekombinas under kontroll av alfa-MHC, för att para sig med kvinnlig B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sortm27.1 (CAG-COP4 * H134R / tdTomato) Hye / J. Eftersom hjärtstoppkassetten raderades i andra generationen visade avkomman ett stabilt MHC-ChR2-uttryck och användes för att upprätthålla hjärtljuskänsliga kolonier. Alla experiment gjordes med vuxna möss av båda könen i en ålder av 36 - 48 veckor. Belysningen uppnås med hjälp av en 3 x 3 mikro-LED-matris, tillverkad enligt beskrivningen i16,17 förutom att det kiselbaserade höljet och de korta optiska glasfibrerna inte implementeras. Dess första användning i en hjärtapplikation finns i18. En linjär mikro-LED-array baserad på en liknande tillverkningsteknik har tillämpats som en penetrerande sond för hjärtpacing19. Mikro-lysdioderna är anordnade i en 3 x 3-array med en tonhöjd på 550 μm, vilket ger både en hög rumslig upplösning och en hög strålningseffekt på ett mycket litet område. Författarna visar i detta arbete en mångsidig lokal fotostimulering på flera platser som kan öppna vägen för att utveckla nya antiarytmiska terapimetoder.

Följande experimentella protokoll innefattar en retrograd Langendorff-perfusion ex vivo, för vilken den kannulerade aortan fungerar som perfusionsinlopp. På grund av det applicerade perfusionstrycket och hjärtkontraktionen strömmar perfusatet genom kranskärlen, som förgrenar sig från aortan. I det presenterade arbetet perfuseras hjärtat med hjälp av en konstant tryckinställning som uppnås genom att höja perfusatbehållarna till 1 m höjd, motsvarande 73,2 mmHg, vilket ger en flödeshastighet på 2,633 ± 0,583 ml / min. Två typer av Tyrodes lösning används som perfusat under experimentet. Regular Tyrodes lösning stöder en stabil sinusrytm, medan Low-K+ Tyrodes lösning blandas med Pinacidil för att möjliggöra induktion av arytmi i murina hjärtan. Användningen av ett sexkantigt vattenbad möjliggör observation av hjärtat genom sex olika plana fönster, vilket möjliggör koppling av flera optiska komponenter med mindre förvrängning genom brytning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment följde strikt djurskyddsförordningen, i enlighet med tysk lagstiftning, lokala bestämmelser och i enlighet med rekommendationer från Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA). Ansökan om godkännande av djurförsök har godkänts av ansvarig djurskyddsmyndighet och alla försök har rapporterats till våra djurskyddsombud.

1. Experimentberedning och material

  1. Optisk kartläggning
    OBS: Den optiska inställningen, liksom den elektriska inställningen, visas i figur 1. Alla komponenter som används i den optiska och elektriska installationen listas i detalj i materialförteckningen.
    1. Använd LED 1 och LED 2 för induktion av arytmi och backup defibrillering. Välj lysdioder med hög effekt med en våglängd λblå nära 475 nm, vilket är toppen av excitationsvåglängden för ChR26. För att ytterligare begränsa det optiska spektrumet, använd ett 470 ± 20 nm bandpassfilter.
      OBS: I detta arbete har LED 1 och LED 2 ett typiskt strålningsflöde på 3,9 till 5,3 W, enligt databladet20.
    2. Belys epikardiet för optisk kartläggning med en röd lysdiod med hög effekt (LED 3 i figur 1), som avger ljus med en mittvåglängd på λröd = 625 nm och ett strålningsflöde på 700 mW21. Det röda ljuset filtreras med ett 628 ± 20 nm bandpassfilter och reflekteras av en dikroisk spegel med långt pass (DM) med en cutoff-våglängd på λDM = 685 nm.
    3. Använd ett emissionsfilter med λfilter-cam = 775 ± 70 nm framför kamerans mål för att endast registrera fluorescensemissionen av hjärtaktiviteten. Använd ett snabbt mål som är väl lämpat för applikationer med svagt ljus.
      OBS: Frekvensen för fibrillering av ett mushjärta varierar från 20 till 35 Hz; Använd därför en tillräckligt snabb kamera för att spela in med en frekvens på 1 till 2 kHz eller ännu högre.
  2. Micro-LED-matris
    OBS: Mikro-LED-matriserna som appliceras här realiseras med hjälp av mikrosystembearbetning som beskrivs närmare någon annanstans16,17.
    1. Snurra ett 5 μm tjockt polyimid (PI) lager på 4-tums kiselsubstrat (ensidigt polerat, 525 μm tjockt).
    2. Bota detta PI-skikt vid en maximal temperatur på 450 °C under en kväveatmosfär. Håll den maximala temperaturen konstant i 10 min.
    3. Avsätt och mönstra en bildomvandlingsfotoresist (PR) med ultraviolett (UV) litografi och spruteravsättning ett 250 nm tunt platinaskikt (Pt).
    4. Tjockna denna Pt-baserade metallisering genom att galvanisera ett 1 μm tjockt guldskikt (Au) med den mönstrade PR som ett maskeringsskikt.
    5. Innan du spinnbelägger ett andra PI-lager, exponera skivan med sitt första PI-skikt och den Au-elektropläterade metalliseringen för en syreplasma som kemiskt aktiverar ytan på PI-skiktet.
    6. Bota det andra PI-skiktet igen vid 450 °C, applicera UV-litografi för att mönstra ett PR-lager och öppna kontaktdynorna i matrisen för mikro-LED-chips och det gränssnittstryckta kretskortet (PCB) genom reaktiv jonetsning (RIE) med hjälp av den mönstrade PR som ett maskeringsskikt.
      OBS: I detta RIE-processteg rekommenderas att du applicerar 200 W och 100 W i 10 respektive 30 minuter för att definiera kontaktplattans öppningar samt den yttre formen på den tvådimensionella (2D) mikro-LED-matrisen.
    7. Ta bort PR med lösningsmedel och plasmaetsning. Förtjocka kontaktdynorna ytterligare genom elektroplätering av ytterligare 6 μm tjockt guldskikt.
    8. Fäst mikro-LED-chipsen på kontaktdynorna med en flip-chip bonder.
    9. Aktivera PI-ytan i en syreplasma och underfyll mikro-LED-chipsen med ett lösningsmedelsfritt lim. Härda sedan limmet i 12 timmar vid 120 °C.
    10. För att kapsla in mikro-LED-chipsen, utför en annan plasmabehandling med Argon och applicera ett tunt fluorpolymerskikt manuellt. Förhärda detta skikt vid 80 °C i 1 timme.
    11. Applicera silikon manuellt som det slutliga inkapslingsskiktet efter att ha utsatt mikro-LED-matrisen för en syreplasma, som används för att förbättra kiselvidhäftningen till det underliggande fluorpolymerskiktet. Härda silikonskiktet vid 80 °C och 180 °C i 1 timme vardera. Dessa slutliga härdningssteg härdar också fluorpolymerskiktet helt.
    12. Löd kontaktdynorna på PI-substratet till ett kretskort som bär remskontakter för sammankoppling av matrisen till en extern instrumentering. Täck lödkuddarna på kretskortet med ett lim.
  3. Elektrisk installation
    1. Använd elektroder som är lämpliga för registrering av ett elektrokardiogram (EKG), t.ex. silver/ silverkloridelektroder eller MAP-elektroder (Monophasic Action Potential) och en EKG-förstärkare för att kontinuerligt övervaka hjärtats elektriska aktivitet. Använd dessutom en lämplig anskaffningsanordning (AD) för att registrera alla erhållna elektriska signaler.
    2. Välj en väl lämpad drivrutin för lysdioderna med hög effekt (LED 1, LED 2 och LED 3), som kan hantera den maximala strömmen som appliceras på varje enhet. Använd en godtycklig funktionsgenerator (AFG) för att styra utgången från LED-drivrutinerna exakt.
    3. Använd en flerkanalig LED-drivrutin för att styra strömmen som strömmar genom mikro-LED-matrisen. En AFG med flera utgångar är lika bra lämplig för denna uppgift.
      OBS: Det är lämpligt att välja LED-drivrutiner som begränsar strömmen till mikro-LED: s maximala ström, annars kan dioderna skadas. Ett exempel på en flerkanalig mikro-LED-drivrutin beskrivs i ett annat arbete18. Vid behov kan AFG eller någon annan LED-drivrutin anslutas till en dator för att fjärrstyra mikro-LED-inställningarna. Om så är fallet, anslut LED-drivrutinen till datorn med det kommunikationsprotokoll du väljer, t.ex. GPIB (General Purpose Interface Bus) eller en seriell anslutning.

   

2. Experimentella förfaranden

  1. Beredning av lösning
    1. Förbered Tyrodes lösning: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 24 mM NaHCO3, 1,8 mM CaCl 2, 1,2 mM KH2 PO4, 5,6 mM Glukos, 0,1% BSA/Albumin.
    2. Förbered Low-K+ Tyrodes lösning: Low-K+ Tyrode's tillverkas på samma sätt som vanliga Tyrodes lösning förutom att endast hälften av mängden KCl tillsätts (2 mM istället för 4 mM KCl).
      OBS: För ett experiment som varar 3 timmar är vanligtvis 2-3 L Low-K + Tyrode (dessutom blandat med Blebbistatin (steg 2.1.5) om optisk kartläggning utförs) och 1-2 L vanliga Tyrode tillräckliga.
    3. Tillsätt Pinacidil till Low-K+ Tyrodes lösning för att underlätta processen med arytmiinduktion, som beskrivs i22, för att erhålla en koncentration på 100 mM. Använd skyddande laboratoriehandskar vid hantering av Pinacidil.
    4. Bered 1 ml 50 μM DI-4-ANBDQPQ med vanlig Tyrodes lösning. Skydda färgämnet från ljus för att förhindra fotoblekning.
    5. Gör en 10 mM stamlösning av Blebbistatin. För optisk kartläggning, blanda Blebbistatin med 100 mM Pinacidil-Tyrode's-lösning (steg 2.1.3) för att erhålla en 5 μM-lösning. Använd skyddande laboratoriehandskar vid hantering av Blebbistatin.
      OBS: Håll både färgämnet och Blebbistatin-lösningen åt sidan tills optisk kartläggning börjar.
  2. Langendorff perfusion
    OBS: Upplägget består av två reservoarer för de två Tyrodes lösningar. De är anslutna till en bubbelfälla via rör med trevägs. Hjärtat fästs senare på bubbelfällan med en Luer-låskontakt, och den hängs sedan upp i ett sexkantigt vattenbad. Vattenbadet är i sin tur anslutet till en avfallsbehållare för att samla upp den använda Tyrodes lösning.
    1. Rengör alla rör före varje experiment med helt demineraliserat vatten.
    2. Lufta båda Tyrodes lösningar med Carbogen (5% CO2 och 95%O2) i 30 min vid rumstemperatur innan experimentet påbörjas. Justera pH-värdet för Tyrodes lösningar till 7,4 med NaOH.
    3. Fyll 500 ml av varje Tyrodes lösning i motsvarande behållare och lufta rören samt bubbelfällan genom att köra Tyrodes lösning genom perfusionssystemet tills inga fler instängda luftbubblor syns i rören eller i bubbelfällan.
    4. Fortsätt lufta Tyrodes lösningar under hela experimentet i reservoarerna med Carbogen för att säkerställa att perfusatets pH förblir stabilt senare under perfusion.
    5. Värm perfusionssystemet till 37 °C med en vattenvärmepump. Håll perfusattemperaturen konstant i vattenbadet genom att använda ett extra värmeelement som en vattentät värmekabel.
      OBS: Under experimentet är det viktigt att fylla på Tyrodes reservoarer innan de går tomma. Annars kan luftbubblor komma in i hjärtat, vilket kan täppa till kärlen och leda till ischemi.
  3. Mus förberedelse
    1. Injicera subkutant 0,1 ml 500 I.E. Heparin 30 min före hjärtisoleringsproceduren.
    2. Fyll en 6 cm petriskål och en 2 ml spruta med iskall Tyrodes lösning. Placera under stereoskopet.
    3. Utför korttidsanestesi av möss av en mättad Isoflurane-miljö i 2 minuter och omedelbar cervikal dislokation efteråt.
      OBS: För att verifiera tillräcklig anestesi är en kontroll av den negativa inter-toereflexen absolut nödvändig.
    4. Öppna bröstet, ta bort hjärtat, som beskrivs någon annanstans23, och lägg det i 6 cm petriskålen med iskall Tyrodes lösning. Hjärtslag kommer att minska på grund av temperaturfall.
    5. Gör den fina förberedelsen under ett stereoskopiskt mikroskop, som beskrivs någon annanstans23. Fäst aortan på den trubbiga nålen och fixera kärlet med suturmaterial.
    6. Som en kontroll, injicera iskall Tyrodes lösning genom nålen i hjärtat och kontrollera att hjärtat är tätt monterat. Detta steg sköljer också det återstående blodet ur hjärtat.
    7. Överför det monterade hjärtat till perfusionssystemet. Se till att perfusatet flyter för att förhindra att luft kommer in i hjärtat medan du ansluter nålen till bubbelfällan. Kontrollera att hjärtat är täckt med Tyrodes lösning i vattenbadet. Steg 2.3.4, 2.3.5 och 2.3.7 illustreras i figur 2.
    8. Se till att hjärtat börjar slå inom några minuter. Låt hjärtat anpassa sig till perfusionsinställningen i 15 till 20 minuter och byt sedan till låg-K+ Tyrodes lösning med Pinacidil (Steg 2.1.3) respektive låg-K+ Tyrods lösning med Pinacidil och Blebbistatin (Steg 2.1.5) om optisk kartläggning ska utföras.
  4. Arytmiinduktion och optiskt defibrillering
    1. Placera en av EKG-elektroderna så nära hjärtytan som möjligt för att säkerställa god signalkvalitet. Suspendera den andra EKG-elektroden i Tyrodens lösning. Se till att EKG som förvärvats registreras av valfri AD.
    2. Placera mikro-LED-matrisen på studiens intresseområde, till exempel på vänster kammare.
    3. Byt perfusion till låg-K + Tyrode med Pinacidil och perfuse hjärtat i 15 till 30 min.
    4. För att inducera arytmi, belysa hjärtat med LED 1 och LED 2 med ett tåg på 20 till 50 ljuspulser med en frekvens f ind på 25 till 35 Hz, pulsvaraktighet Wind på 2 till 15 ms, och ljusintensitet LIopt_ind på 2,8 mW mm-2.
    5. Upprepa processen tills arytmi induceras.
      OBS: Arytmier är lätta att identifiera i EKG-signalen eftersom signalens frekvens och morfologi skiljer sig från normal sinusrytm. Om arytmin upphör inom de närmaste 5 s, klassificera den som självavslutad och starta ett nytt induktionsförsök.
    6. När en ihållande arytmi har detekterats visuellt, applicera en explosion av pulser med olika bredder W def och frekvenser fdef, med hjälp av tre, sex eller nio mikro-lysdioder i matrisen vid en pulserande strömI-puls på 15 mA som ger en ljusintensitetLI μLED = 33,31 ± 2,05 mW mm-2.
    7. Om arytmin fortsätter efter fem mikro-LED-arraybaserade defibrilleringsförsök, klassificera försöket som misslyckat och starta backup defibrillering.
    8. För säkerhetskopiering, använd LED 1 och LED 2 med samma tidsparametrar som ställts in för mikro-LED-matrisen.
      OBS: Eftersom hjärtat utsätts för ischemisk och metabolisk stress under hela experimentperioden är det möjligt att avslutningsförsök av arytmi misslyckas även med backup defibrillering. När detta händer, byt perfusionslösningen till de vanliga Tyrode och låt hjärtat återhämta sig i 5 till 10 minuter. När EKG återgår till sinusrytmen, upprepa protokollet från steg 2.4.3 igen.
  5. Optisk kartläggning
    1. Genomlida hjärtat med blebbistatinlösningen som beretts i steg 2.1.5 och vänta tills mekanisk frikoppling sker. Detta uppnås när hjärtat slutar slå, men en EKG-signal är fortfarande mätbar.
      OBS: Blandning av Blebbistatin-lösningen till den nämnda koncentrationen och att hålla hjärtat perfuserat med denna lösning upprätthåller den hjärtmekaniska aktiviteten frikopplad från den elektriska aktiviteten under hela experimentet.
    2. Ge 1 ml spänningsfärgämnet DI-4-ANBDQPQ (framställt i steg 2.1.4) som en bolus i bubbelfällan vid Langendorff-perfusionen. Vänta i 5 till 10 minuter så att färgämnet kan genomsyra hjärtat jämnt.
      OBS: Undvik fotoblekning av färgämnet genom att stänga av det röda ljuset när ingen inspelning görs. Om signal-brusförhållandet för inspelningen blir för litet (den förvärvade signalen är för bullrig), upprepa steg 2.1.4 och 2.5.2.
    3. Fokusera kameran på hjärtytan, slå på LED 3 och applicera 1,27 mW mm-2 optisk effekt.
    4. Stäng av laboratorielamporna och börja spela in. Se till att en optisk signal förvärvas genom att jämföra frekvensen för den erhållna signalen med frekvensen för det inspelade EKG. Detta säkerställer att den erhållna optiska signalen är rent relaterad till hjärtans elektriska aktivitet.
      OBS: Eftersom fluorescensljuset som avges av färgämnet är mycket vecka, görs optisk kartläggning i ett mörkt rum. Detta undviker signalstörningar från andra ljuskällor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollet tillåter induktion av ventrikulära arytmier i intakta murina hjärtan med hjälp av fotostimuleringspulser genererade av LED 1 och LED 2 (figur 1) med en frekvens f ind mellan 25 Hz och 35 Hz och en pulsvaraktighet Wind mellan 2 ms och 10 ms. Observera att syftet med sådana snabba ljuspulser inte är att fånga hjärtrytmen utan snarare att balansera hjärtaktiviteten så att oregelbundna elektriska vågor kan genereras, vilket sedan underlättar en arytmi. Fördelen med att inducera arytmi med ljus över induktion med elektrisk stimulering är att inga artefakter provoceras i EKG, vilket ger möjlighet att efteranalysera den förvärvade signalen utan begränsningar och till och med utvärdera hjärtats elektriska svar under snabb pacing, detta faktum ger också möjlighet att observera hjärtbeteendet under fotodefibrillering. Detta är inte möjligt med elektriska induktions- eller defibrilleringsmetoder. Ändå, om den använda inställningen inte tillåter användning av externa lysdioder med hög effekt, till exempel på grund av platsbegränsningar, kan en extra pacingelektrod placeras på hjärtat för att inducera arytmi, som visas någon annanstans 3,22,24.

När fibrillering har inducerats måste arytmin pågå i minst 5 sekunder för att säkerställa att den upprätthålls, därefter startas de mikro-LED-baserade defibrilleringsförsöken. Eftersom huvudparametrarna för hjärtarytmi, såsom grundläggande cykellängd eller dominerande frekvens, amplitud och morfologi, ständigt förändras och eftersom det är aktuellt inte möjligt att förutsäga vilka fotodefibrilleringsparametrar som ger det bästa resultatet, var det av betydande intresse att förstå om det finns ett samband mellan frekvensen, pulsbredden, område för fotostimulering och termineringshastighet. Därför testades en serie experiment med olika frekvenser f def, antal mikro-lysdioder och pulsvaraktigheter Wdef, och framgångsgraden för N = 11 möss extraherades, som visas i figur 3.

Det kan påvisas att pulser på 1 till 20 ms varaktigheter kan defibrilleras med olika framgångsgrader (figur 3). Eftersom ljusintensiteten LIμLED hölls konstant under varje fotostimuleringspuls, som nämnts i steg 2.4.6, och framgångsgraden för tre mikro-lysdioder mot nio är särskilt lägre, tyder de presenterade resultaten på att det område som täcks på hjärtat, antalet mikro-lysdioder och därmed det totala strålningsflödet som appliceras är avgörande faktorer för att uppnå defibrillering. Med tanke på att varje mikro-LED på matrisen är en Lambertian-ljuskälla och att de är placerade direkt på hjärtans yta så att det ungefärliga avståndet till vävnaden är noll, kan det antas att bestrålningskonturen för det upplysta området på hjärtat när man använder en enda mikro-LED motsvarar AμLED = 0,059 mm², som också visas i25 för platta rektangulära lysdioder. Dessutom, även om vissa fotoner kan lämna mikro-LED i sidled från kanterna, anses bidraget från dem till den totala ljusintensiteten vara så liten att deras effekt kan försummas. För att kvantifiera det bestrålade ljuset i matrisen mätte författarna strålningsflödet från mikro-LED-matrisen med en kommersiell effektmätare och beräknade ljusintensiteten som når hjärtat som visas i tabell 1. Från tabell 1 kan man också läsa att strålningsflödet ökar med antalet använda mikro-lysdioder, men ljusintensiteten förblir konstant på grund av belysningsprofilens konsekvenser som nämnts tidigare.

Intressant nog kan det också observeras att framgångsgraden för nio lysdioder med W def = 1 ms (Figur 3a) och W def = 20 ms (Figur 3d) vid en defibrilleringsfrekvens f def = 18 Hz och f def = 20 Hz är jämförbart höga. Med tanke på att den genomsnittliga frekvensen för de inducerade arytmierna är 22,55 ± 4,03 Hz, kan detta faktum indikera att för ChR2 murina hjärtan ökar framgångsgraden avsevärt ju närmare pacingfrekvensen är arytmifrekvensen. Detta visas också i numeriska simuleringar26. Detta kan emellertid inte lätt generaliseras eftersom den dominerande frekvensen av komplexa arytmier ständigt förändras. För att illustrera detta visar figur 4 två olika defibrilleringsförsök med fdef = 14 Hz.. I början av EKG-segmentet i figur 4a) och enligt EKG-signalens morfologi visas ett ventrikelflimmer (VF). När mikro-LED-fotostimuleringen startar, fibrillering förvandlas till ett mer ordnat mönster som är mer sannolikt att vara en ventrikulär takykardi (VT). När mikro-LED-matrisen är avstängd tar de ursprungliga kaotiska VF-vågorna över igen. Således avslutas inte arytmi. Även om VF i det här exemplet inte kan avslutas med de angivna parametrarna, störs det och det kan ändras till ett mer regelbundet mönster (VT). Figur 4b Segment 1 visar att den dominerande frekvensen på 24 Hz ökar något tills fotostimuleringen börjar och VF förvandlas till en VT i segment 2, där den dominerande frekvensen sjunker till 14 Hz. Dessutom visar figur 4c en VT som kan avslutas med samma f def som i figur 4a, men med en annan Wdef. Först ändrar mikro-LED-fotostimuleringen arytmins morfologi för att slutligen avsluta den med 1: 1 pacing-fångst från den 19:e pulsen och framåt. Dessa resultat kan innebära att fotodefibrilleringsparametrarna, till exempel Wdef, måste anpassas till arytmins morfologiska förändring över tid. Experimenten som ledde till dessa resultat utfördes utan att använda Blebbistatin på grund av den resulterande förändringen i verkningspotentialvaraktighet (APD)27. Därför utfördes ingen optisk kartläggning i dessa serier.

En annan uppsättning experiment utfördes för optisk kartläggning med användning av det rödförskjutna potentiometriska färgämnet (steg 2.1.4). Optisk kartläggning med höghastighetskameror gör det möjligt att observera förökande excitationsvågor på hjärtans yta under sinusrytmen (figur 5) och komplexa takyarytmier28. Eftersom den fraktionerade förändringen av det potentiometriska färgämnet är mycket lågt, efterbehandlades de erhållna videorna med hjälp av ett matematiskt programmeringsspråk. Det första steget för att förbättra kvaliteten på de optiska signalerna är att ta bort brus med ett Gaussiskt utjämningsfilter med en standardavvikelse på σ = 1, följt av ett bandpassfilter med hörnfrekvenser fhög = 0,1 Hz och flåg = 70 Hz. Stoppbandet vid fhög tar bort långsamma förändringar i signalen som inte är relaterade till hjärtats sinusfrekvens som ligger mellan 3 Hz < fsinus < 8 Hz, medan stoppbandet flow tar bort högfrekvent brus som fångas av kameran. Det är viktigt att notera att både blått ljusutsläpp från LED 1, LED 2 och från mikro-LED-matrisen kan orsaka korsprat och en mycket hög störningssignal vid optisk kartläggning. Dessutom observerades att inte ens ett mycket smalt bandpassfilter framför kameran, med våglängden λfilter-cam , som nämns i steg 1.2.3, skulle filtrera bort påverkan av det blå ljuset. Detta kan delvis orsakas av själva färgämnets excitationsrespons. Var därför mycket försiktig när du väljer optik för optisk kartläggning. För videoanalys måste alla ramar där blått ljus har spelats in försummas så att det i många fall inte är möjligt att visualisera hjärtat under fotostimulering, vilket också nämns i en annan studie29.

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av den elektriska och optiska inställningen. (a) LED 1 och LED 2 ger en blå ljuskälla som används för induktion av arytmi och backup defibrillering. LED 3 används som en excitationsljuskälla för det rödförskjutna färgämnet DI-4-ANBDQPQ. Det röda ljuset riktas mot hjärtat med hjälp av den dikroiska spegeln DM. Emissionsljuset som visas i mörkrött registreras av höghastighetskameran genom ett emissionsfilter, som nämns i texten. LED 2 och EKG-elektroder visas inte för enkelhetens skull. b) Ett segment av den registrerade EKG-signalen som visas i rött. Mörkblått visar ljuspulserna från LED 1 och LED 2 med en frekvens f ind = 35 Hz och Wind = 4 ms som används för att inducera fibrillering. Omedelbart efter avslutad ljusstimulans kan ventrikelflimmer (VF) observeras. Den mikro-LED-baserade fotostimuleringen som visas i ljusblå (f def = 16 Hz, Wdef = 20 ms) avslutar framgångsrikt arytmi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Hjärtförberedelse . (a) Öppna bröstet på en mus som visar det intakta hjärtat och de omgivande organen. b) Utplanterat hjärta nedsänkt i iskall Tyrodes lösning för vidare beredning. c) Mushjärta ordentligt fastsatt på en trubbig nål. (d) Murinhjärtat suspenderat i Tyrodes lösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3: Experimentellt extraherade framgångsgrader. Framgångsgrader för 30 mikro-LED-baserade fotostimuleringspulser med tre, sex och nio lysdioder vid olika pulsvaraktigheter W def och frekvenser fdef för N = 11. Felstaplar visas med standardfel på medelvärdet S.E.M. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Manipulering av hjärtrytmen med hjälp av fotostimulering . (a) Segment av en EKG-inspelning av en icke-avslutad arytmi. b) Spektrogram för EKG som visas i panel a. Effektspektraldensiteten (PSD) för segment (1) visar en arytmi med en dominerande frekvens på 24 Hz. Segment (2) fotostimulering med de visade parametrarna. Det kan observeras att den dominerande frekvensen sjunker till 14 Hz. Segment (3) Misslyckad avslutning och återgång till arytmiskt beteende med en dominerande frekvens på 24 Hz. (c) EKG för ett framgångsrikt defibrilleringsförsök. d) Spektrogram över den lyckade avslutningen som visas i panel c. Segment (1) visar en ventrikulär takykardi (VT) med dominerande frekvens på 23 Hz. Segment (2) fotostimulering med de visade inställningarna. Segment (3) visar en framgångsrik avslutning, vilket leder till en normal sinusrytm med en grundläggande frekvens på 3, 5 Hz och de resulterande övertonerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Optisk kartläggning av hela hjärtat. Förändringen av fluorescensintensiteten under ett enda slag i hjärtat i normal sinusrytm visas. Hjärtat placerades vänd mot kameran så att höger och vänster kammare är synliga (RV, LV). Asterisken visar pixeln där åtgärdspotentialen som visas överst vidtogs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Antal microLED Bestrålad yta Aμled [mm2] Strålande flöde φ [mW] Ljusintensitet LI [mW mm-2]
3 0.178 5,9 ± 0,47 33.11 ± 2.66
6 0.356 11,91 ± 0,84 33.42 ± 2.37
9 0.535 17,85 ± 0,61 33.39 ± 1.14

Tabell 1: Uppmätt strålningsflöde för mikro-LED-matrisen och motsvarande ljusintensitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En framgångsrik behandling av hjärttakyarytmier är nyckeln till hjärtbehandling. De biofysiska mekanismerna som ligger till grund för initiering, vidmakthållande och avslutning av arytmi är emellertid inte helt förstådda. Därför syftar hjärtforskningen till att optimera elchocksterapi mot en mer skonsam avslutning av arytmier och därigenom öka livskvaliteten för patienter 28,29,30,31. Elektriska metoder med låg energi lovar en betydande minskning av allvarliga biverkningar, men kan fortfarande inducera oönskad muskelexcitation. Hjärtoptogenetik kan övervinna denna begränsning och ge inte bara en vävnadsmild avslutningsteknik utan också en flexibel plattform för att undersöka den arytmispecifika riktade kontrollen av virvelliknande excitationsvågor i det intakta murina hjärtat och i cellkulturer32,33.

Med tanke på den motivationen designades och implementerades en robust fotostimuleringsinställning samt ett protokoll, som båda erbjuder ett mycket anpassningsbart optiskt system, som lätt kan utvidgas till tredimensionella panoramaoptiska kartläggningsstudier34.

Det kan visas att hjärtarytmier framgångsrikt kan avslutas med olika framgångsgrader beroende på de parametrar som väljs för fotostimulering, till exempel det upplysta området på hjärtat. De presenterade resultaten tyder på att en ökning av den bestrålade ytan rekryterade ett kritiskt antal kardiomyocyter som släckte den kaotiska aktiviteten genom ledningsblock som också visas i22. I denna studie är den energi som krävs för att fotodefibrillat E = 10,69 ± 0,37 mJ (med nio mikro-lysdioder, 30 pulser och pulsbredd Wdef = 20 ms). Detta visar sig vara lägre än vad som tidigare rapporterats i 22,24 med E 22 = 228,8 mJ och E 24 = 153,6 mJ, där ett större område 22 respektive hela hjärtat 24 var upplysta. Men jämfört med det tillvägagångssätt som visas i 35, där ett väl avgränsat mönstrat område belyses med 10 fotodefibrilleringspulser som resulterar i E 35 = 1,8 mJ, är fotodefibrilleringsenergin i denna studie betydligt högre. Till skillnad från de tre andra tillvägagångssätten kunde en framgångsgrad på över 90 % inte uppnås med det presenterade protokollet. En möjlig orsak till den minskade prestandan trots en högre fotodefibrilleringsenergi kan vara att komplexiteten i den underliggande arytmin inte beaktas. När det gäller resultaten som presenteras i 35, där en hög termineringshastighet uppnås genom att belysa ett litet område på hjärtat och samtidigt mäta den rumsliga-temporala dynamiken hos en arytmi, kan det presenterade tillvägagångssättet säkert förbättras ytterligare genom att överväga återkopplingskontroll, som svarar med ett annat mönster av mikro-LED-belysning beroende på hjärtats nuvarande tillstånd.  Dessutom visades det också att även om arytmier inte alltid kan avslutas med den nuvarande metoden, kan den inneboende komplexa dynamiken störas under fotostimulering vilket leder till ett mer ordnat tidstillstånd. Som visas i36 är termineringshastigheten signifikant annorlunda när man adresserar monomorfa (mer ordnade) och polymorfa (mindre ordnade) arytmier. Därför kan det logiska steget mot en bättre defibrilleringshastighet vara att påverka hjärtdynamiken under en VF-episod, förvandla arytmin till ett mindre komplext mönster och avsluta med en annan uppsättning pulser och bygga på detta sätt en tvåstegs fotostimuleringsmetod.

När det gäller perfusionsprotokollet finns de mest kritiska stegen i korrekt extraktion och beredning av hjärtat samt i korrekt justering av den optiska kartläggningsoptiken. Att involvera optisk kartläggning kräver strikt korrekt val av färgämnesspektra, lämpliga excitationsljuskällor och väl valda optiska filter för kameran29. Annars kan de inspelade optiska signalerna vara för bullriga och kan också innehålla korsprat om fotostimulering med färgämnesexcitation. Efterföljande analys skulle därför kräva efterbehandling av signaler med flera analytiska filter och bildutjämning som ofta resulterar i försämring.

Ett annat viktigt steg i detta protokoll är korrekt och exakt placering av mikro-LED-matrisen. Eftersom den sammankopplade ledningen mellan mikro-LED-matrisen och föraren är mycket tunn och flexibel är det ibland utmanande att säkerställa att matrisen kommer att placeras på ungefär samma plats på hjärtytan för varje experiment. För att underlätta positionering och för att fixa den förvärvade positionen för mikro-LED-matrisen designades en hållare och skrevs ut i 3D, så att matrisen kunde fästas på en mikromanipulator. Detta ger mer kontroll över arrayens rörelse i Tyrodes lösning. Beroende på vilket material som valts för den sammankopplade ledningen för mikro-LED-matrisen kanske det inte är nödvändigt att använda en hållare.

Dessutom är ett annat kritiskt steg i protokollet tillsatsen av pro-arytmiläkemedel, som t.ex. Pinacidil37. Eftersom flera kemiska föreningar är välkända för att förändra hjärtans fysiologiska svar, bör detta beaktas vid analys och tolkning av resultaten. När det gäller optisk kartläggning använder det föreslagna protokollet Blebbistatin som en mekanisk frikoppling. Detta har fördelen att ta bort rörelseartefakter under inspelningen, men det kan också förlänga APD27. För att övervinna denna nackdel kan analysmetoder för rörelsespårning under inspelning betraktas som38,39. På så sätt skulle hjärtans normala fysiologiska tillstånd bevaras och en högkvalitativ signal kan erhållas.

Även om det visade sig att det presenterade protokollet kan användas för fotodefibrillering på flera platser, har det fortfarande vissa begränsningar. Det har visat sig att fibrillering i vissa fall inte kan avslutas av den mikro-LED-baserade fotostimuleringen utan endast störs, vilket resulterar i frekvensförändringar. En hypotes är att de slingrande vågorna på hjärtat bara förskjuts från vänster kammare och regenererar sig i andra delar av hjärtat. Jämfört med andra metoder som global belysning24, erbjuder den nuvarande metoden en lägre framgångsgrad på grund av en mindre täckning av hjärtat. Vi är dock övertygade om att med rätt hårdvarubaserad igenkänningsmetod för spiralaktivitet är det möjligt att förbättra framgångsgraden för uppsägning.

Sammanfattningsvis etablerar det presenterade fotostimuleringssystemet ett kraftfullt experimentellt verktyg för flera kardioversionsmetoder och manipulationsstudier av hjärtarytmi. Kunskapen som lärs in i detta system kommer att användas för att undersöka och utvärdera nya potentiella (foto)defibrilleringsprotokoll i kliniskt relevanta stordjursmodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inte någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Marion Kunze och Tina Althaus för deras utmärkta tekniska stöd under experiment. Forskningen som leder fram till resultaten har fått finansiering från Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram FP7/2007-2013 under bidragsavtalsnummer HEALTH-F2-2009-241526. Stöd gavs också av det tyska centret för kardiovaskulär forskning, DZHK e.V. (Project MD28), partnerwebbplatsen Goettingen, den tyska forskningsstiftelsen CRC 1002 (projekt C03) och Max Planck Society. Detta arbete stöddes delvis av BrainLinks-BrainTools, Cluster of Excellence finansierat av den tyska forskningsstiftelsen (DFG, bidragsnummer EXC 1086).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical Components
Blebbistatin TargetMol T6038 10 mM stock solution
BSA/Albumin Sigma-Aldrich A4919
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016 CaCl2
Carbogen Westfalen 50 l bottle
DI-4-ANBDQPQ AAT Bioquest 21499 Dye for Optical Mapping
Glucose Sigma-Aldrich D9434 C6H12O6
Heparin LEO Pharma Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription
Hydrochlorid Acid Merck 1.09057.1000 HCl, 1 M stock solution
Isoflurane CP Pharma 1 ml/ml, available only on prescription
Magnesium Chloride Merck 8.14733.0500 MgCl2
Monopotassium Phosphate Sigma-Aldrich 30407 KH2PO4
Pinacidil monohydrate Sigma-Aldrich P154-500mg 10 mM stock solution
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 KCl
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 NaHCO3
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 NaCl
Sodium Hydroxide Merck 1.09137.1000 NaOH, 1 M stock solution
Electrical Setup
Biopac MP150 Biopac Systems MP150WSW data acquisition and analysis system
Custom-built ECG, alternative ECG100C Biopac Systems ECG100C Electrocardiogram Amplifier
Custom-built water bath heater using heating cable RMS Heating System HK-5,0-12 Heating cable 120W
Hexagonal water bath
LED Driver Power supply Thorlabs KPS101 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube.
LEDD1B LED Driver Thorlabs LEDD1B T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current
MAP, ECG Electrode Hugo Sachs Elektronik BS4 73-0200 Mini-ECG Electrode for isoalted hearts
micro-LED Driver e.g. AFG Agilent Instruments A-2230 Arbitrary function generator (AFG)
Signal Generator Agilent Instruments A-2230 AFG
micro-LED Array Components
Epoxid glue Epoxy Technology EPO-TEK 353ND Two component epoxy
Fluoropolymer  Asahi Glass Co. Ltd. Cytop 809M Fluoropolymer with high transparency
Image reversal photoresist Merck KGaA AZ 5214E Image Reversal Resist for High Resolution
LED chip  Cree Inc. C460TR2227-S2100 Blue micro-LED
Photoresist Merck KGaA AZ 9260 Thick Positive Photoresists
Polyimide UBE Industries Ltd. U-Varnish S Polyimide Solution
Silicone NuSil Technology LLC MED-6215 Low viscosity silicone elastomer
Solvent free adhesive John P. Kummer GmbH Epo-Tek 301-2 Epoxy resin with low viscosity
Optical Mapping
Blue Filter Chroma Technology Corporation ET470/40x Blue excitation filter
Camera Photometrics Cascade 128+ High performance EMCCD Camera
Camera Objective Navitar DO-5095 Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras
Dichroic Mirror Semrock FF685-Di02-25x36 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter
Emmision Filter Semrock FF01-775/140-25 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter
Heatsink Advanced Thermal Solutions ATSEU-077A-C3-R0 Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware
LED 1 and LED 2 LED Engin Osram LZ4-00B208 High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3 Thorlabs M625L3 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA
Lenses LED Engin Osram LLNF-2T06-H LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Photodiode for power meter Thorlabs S120VC Standard Photodiode Power Sensor
Power Meter Thorlabs PM100D Compact Power and Energy Meter
Red Filter Semrock FF02-628/40-25 BrightLine® single-band bandpass filter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
  2. Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation. Circulation. 120 (6), 467-476 (2009).
  3. Luther, S., et al. Low-energy control of electrical turbulence in the heart. Nature. 475, 235-239 (2011).
  4. Pumir, A., et al. Wave emission from heterogeneities opens a way to controlling chaos in the heart. Physical Review Letters. 99, 208101 (2007).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  6. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  7. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  8. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7, 897-900 (2010).
  9. Natasha, G., et al. et al.Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch. New Biotechnology. 30 (5), 461-474 (2013).
  10. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  11. Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 28 (46), 11862-11870 (2008).
  12. Ahmad, A., Ashraf, S., Komai, S. Optogenetics applications for treating spinal cord injury. Asian Spine Journal. 9 (2), 299-305 (2015).
  13. Dieter, A., Keppeler, D., Moser, T. Towards the optical cochlear implant: Optogenetic approaches for hearing restoration. EMBO Molecular Medicine. 12 (4), e11618 (2020).
  14. Keppeler, D., et al. Multichannel optogenetic stimulation of the auditory pathway using microfabricated LED cochlear implants in rodents. Science Translational Medicine. 12 (553), eabb8086 (2020).
  15. Verhoefen, M. K., Bamann, C., Blöcher, R., Förster, U., Bamberg, E. The photocycle of channelrhodopsin-2: ultrafast reaction dynamics and subsequent reaction steps. ChemPhysChem. 11 (14), 3113-3122 (2010).
  16. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized tool for optogenetics based on an LED and an optical fiber interfaced by a silicon housing. 36th Annual Internation Conference IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Chicago, IL, , 5252-5255 (2014).
  17. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized 3 x 3 optical fiber array for optogenetics with integrated 460 nm light sources and flexible electrical interconnection. 28th IEEE Proceedigns. MEMS, Estoril, , 162-165 (2015).
  18. Diaz-Maue, L., Schwaerzle, M., Ruther, P., Luther, S., Richter, C. Follow the light - From low-energy defibrillation to multi-site photostimulation. 40thAnnual International Conference of IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Honolulu, HI, , 4832-4835 (2018).
  19. Zgierski-Johnston, C., et al. Cardiac pacing using transmural multi-LED probes in channelrhodopsin-expressing mouse hearts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , 51-61 (2020).
  20. mouser.de, LED Engin, [Online]. , Available: https://www.mouser.de/datasheet/2/228/5412893-LED_2520Engin_Datasheet_LuxiGen_LZ4-00B208- 1531969.pdf (2020).
  21. thorlabs.com, thorlabs, [Online]. , Available: https://www.thorlabs.com/_sd.cfm?fileName=25135-S01.pdf&partNumber=M625L3 (2020).
  22. Bruegmann, T., et al. Optogenetic defibrillation terminates ventricular arrhythmia in mouse hearts and human simulations. Journal of Clinical Investigation. 126 (10), 3894-3904 (2016).
  23. Richter, C., Christoph, J., Lehnart, S. E., Luther, S. Optogenetic light crafting tools for the control of cardiac arrhythmias. Methods in Molecular Biology. 1408, 293-302 (2016).
  24. Quiñonez Uribe, R. A., Luther, S., Diaz-Maue, L., Richter, C. Energy-reduced arrhythmia termination using global photostimulation in optogenetic murine hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1651), (2018).
  25. Moreno, I. LED irradiance pattern at short distances. Applied Optics. 59 (1), 190-195 (2020).
  26. Predicting unpinning success rates for a pinned spiral in an excitable medium. Behrend, A., Bittihn, P., Luther, S. Computing in Cardiology, Belfast, , 345-348 (2010).
  27. Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11 (464), (2020).
  28. Christoph, J., et al. Electromechanical vortex filaments during cardiac fibrillation. Nature. 555, 667-672 (2018).
  29. O'Shea, C. Cardiac optogenetics and optical mapping - Overcoming spectral congestion in all-optical cardiac electrophysiology. Frontiers in Physiology. 10 (182), (2019).
  30. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), e006692 (2018).
  31. Trayanova, N., Doshi, A. N., Prakosa, A. How personalized heart modeling can help treatment of lethal arrhythmias: A focus on ventricular tachycardia ablation strategies in post-infarction patients. Wiley Interdisciplinary Reviews in System Biology and Medicine. 12 (3), 1477 (2020).
  32. Bingen, B., et al. Light-induced termination of spiral wave arrhythmias by optogenetic engineering of atrial cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 104 (1), 194-205 (2014).
  33. Burton, R. A. B., et al. Optical control of excitation waves in cardiac tissue. Nature Photonics. 9 (12), 813-816 (2015).
  34. Dura, M., Schröder-Schetelig, J., Luther, S., Lehnart, S. E. Toward panoramic in situ mapping of action potential propagation in transgenic hearts to investigate initiation and therapeutic control of arrhythmias. Frontiers in Physiology. 5, 337 (2014).
  35. Crocini, C., et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Science Reports. 6 (35628), (2016).
  36. Nyns, E. C. A., et al. Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management. European Heart Journal. 38 (27), 2132-2136 (2017).
  37. Wilde, A. A. K+atp channel opening and arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 24 (4), 35-40 (1994).
  38. Christoph, J., Luther, S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1483), (2018).
  39. Christoph, J., Schröder-Schetelig, J., Luther, S. Electromechanical optical mapping. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130(B), 150-169 (2017).

Tags

Medicin Utgåva 174 hjärtoptogenetik optisk kartläggning LED DI-4-ANBDQPQ Blebbistatin channelrhodopsin-2 ChR2
Avancerad hjärtrytmhantering genom att tillämpa optogenetisk fotostimulering på flera platser i murina hjärtan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diaz-Maue, L., Steinebach, J.,… More

Diaz-Maue, L., Steinebach, J., Schwaerzle, M., Luther, S., Ruther, P., Richter, C. Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts. J. Vis. Exp. (174), e62335, doi:10.3791/62335 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter