Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ניהול מתקדם של קצב הלב על ידי יישום פוטו-גירוי אופטוגנטי מרובה אתרים בלבבות מורין

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62335
Automatic Translation
*1,2, *1, 8,9, 1,3,4,6, 8,9, 1,5,6,7
1Research Group Biomedical Physics, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 2Research Electronics Department, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, 4Institute for Nonlinear Dynamics, Georg-August-University Goettingen, 5Department of Cardiology and Pneumology, University Medical Center Goettingen, 6German Center for Cardiovascular Research, DZHK e.V., partner site Goettingen, 7Laboratory Animal Science Unit, German Primate Center Leibniz Institute for Primate Research, 8Department of Microsystems Engineering (IMTEK), University of Freiburg, 9Cluster of Excellence BrainLinks-BrainTools, University of Freiburg
* These authors contributed equally

Summary

עבודה זו מדווחת על שיטה לשליטה בקצב הלב של לבבות מורין שלמים של עכברי channelrhodopsin-2 מהונדסים (ChR2) באמצעות פוטוסטימולציה מקומית עם מערך מיקרו-LED ומיפוי אופטי סימולטני של פוטנציאל קרום הלב.

Abstract

טכיאריתמיות חדריות הן גורם מרכזי לתמותה ולתחלואה ברחבי העולם. דפיברילציה חשמלית באמצעות שוקים חשמליים באנרגיה גבוהה היא כיום הטיפול היחיד בפרפור חדרים מסכן חיים. עם זאת, לדפיברילציה עלולות להיות תופעות לוואי, כולל כאבים בלתי נסבלים, נזק לרקמות והחמרה בפרוגנוזה, מה שמעיד על צורך רפואי משמעותי בפיתוח אסטרטגיות עדינות יותר לניהול קצב הלב. מלבד גישות חשמליות מפחיתות אנרגיה, אופטוגנטיקה לבבית הוצגה ככלי רב עוצמה להשפעה על פעילות הלב באמצעות תעלות יונים רגישות לאור ופולסים של אור. במחקר הנוכחי תתואר שיטה חזקה ותקפה לפוטוסימולציה מוצלחת של לבבות מורין שלמים של לנגנדורף על בסיס קצב רב-אתרים המפעיל מערך של 3 x 3 של דיודות פולטות אור מיקרו (micro-LED). מיפוי אופטי סימולטני של גלי מתח ממברנה אפיקרדיאלית מאפשר לחקור את ההשפעות של גירוי ספציפי לאזור ומעריך את הפעילות הלבבית החדשה שנוצרה ישירות באתר. התוצאות המתקבלות מראות כי היעילות של דפיברילציה תלויה מאוד בפרמטרים שנבחרו עבור פוטוסטימולציה במהלך הפרעת קצב לב. יודגם כי האזור המואר של הלב ממלא תפקיד מכריע להצלחת ההפסקה, כמו גם כיצד ניתן להשיג שליטה ממוקדת בפעילות הלב במהלך ההארה לשינוי דפוסי הפרעות קצב. לסיכום, טכניקה זו מספקת אפשרות לייעל את מניפולציית המנגנון באתר בדרך לבקרת משוב בזמן אמת של קצב הלב, ובנוגע לספציפיות האזור, גישות חדשות בהפחתת הנזק הפוטנציאלי למערכת הלב בהשוואה לשימוש ביישומי הלם חשמלי לא ספציפיים.

Introduction

חקירות מוקדמות של הדינמיקה המרחבית-טמפורלית במהלך הפרעות קצב גילו כי הדפוסים החשמליים המורכבים במהלך פרפור הלב מונעים על ידי גלי עירור מסתובבים דמויי מערבולת1. ממצא זה נתן תובנות חדשות על המנגנונים הבסיסיים של הפרעות קצב, מה שהוביל לאחר מכן לפיתוח טיפולים חדשניים לסיום חשמלי המבוססים על עירור רב-אתרים של שריר הלב 2,3,4. עם זאת, טיפולים באמצעות גירוי שדה חשמלי אינם מקומיים ועלולים להחדיר את כל התאים המעוררים שמסביב, כולל רקמת שריר, ולגרום נזק לתאים ולרקמות, כמו גם לכאב בלתי נסבל. בניגוד לטיפולים חשמליים, גישות אופטוגנטיות מספקות טכניקה ספציפית ומגינה על רקמות לעידוד פוטנציאל פעולה קרדיומיוציטים בדיוק מרחבי וזמני גבוה. לכן, לגירוי אופטוגנטי יש פוטנציאל לשליטה זעיר פולשנית בדפוסי ההפעלה הכאוטיים במהלך פרפור הלב.

הכנסת תעלת היונים הרגישה לאור channelrhodopsin-2 (ChR2) לתאים מעוררים באמצעות מניפולציה גנטית 5,6,7, אפשרה דה-פולריזציה של פוטנציאל הממברנה של תאים מעוררים באמצעות פוטוסטימולציה. מספר יישומים רפואיים, כולל הפעלת רשתות נוירונים, שליטה על פעילות הלב, שחזור ראייה ושמיעה, טיפול בפגיעות בחוט השדרה ואחריםפותחו 8,9,10,11,12,13,14. היישום של ChR2 בקרדיולוגיה הוא בעל פוטנציאל משמעותי בשל זמן התגובה של אלפית השנייה15, מה שהופך אותו מתאים היטב לבקרה ממוקדת של דינמיקה לבבית קצבית.

במחקר זה מוצגת פוטוסטימולציה מרובת אתרים של לבבות שלמים של מודל עכבר מהונדס. לסיכום, קו עכברי אלפא-MHC-ChR2 מהונדסים הוקם במסגרת תוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) וסופק בחביבות על ידי פרופ 'ס. א. לנארט. באופן כללי, זכר בוגר מהונדס C57/B6/J, המבטא Cre-recombinase תחת שליטה של אלפא-MHC היו מזווגים להזדווג עם נקבה B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. מכיוון שקלטת ה-STOP של הלב נמחקה בדור השני, הצאצאים הראו ביטוי MHC-ChR2 יציב ושימשו לשמירה על מושבות רגישות לב. כל הניסויים נעשו עם עכברים בוגרים משני המינים בגיל 36 - 48 שבועות. התאורה מושגת באמצעות מערך מיקרו-LED בגודל 3 x 3, המיוצר כמתוארב-16,17, אלא שהמארז המבוסס על סיליקון וסיבי הזכוכית האופטיים הקצרים אינם מיושמים. השימוש הראשון שלה ביישום לב נמצא ב18. מערך מיקרו-LED ליניארי המבוסס על טכנולוגיית ייצור דומה יושם כגשושית חודרת לקצב לב19. נוריות המיקרו-נוריות מסודרות במערך של 3 על 3 במגרש של 550 מיקרומטר, ומספקות הן רזולוציה מרחבית גבוהה והן הספק קורן גבוה על שטח קטן מאוד. המחברים מדגימים בעבודה זו פוטוסטימולציה מקומית רב-תכליתית מרובת אתרים שעשויה לפתוח את הדרך לפיתוח שיטות טיפול חדשניות נגד הפרעות קצב.

הפרוטוקול הניסיוני הבא כולל פרפוזיה מדרדרת של Langendorff ex vivo, שעבורה אבי העורקים המשומר מתפקד ככניסת פרפוזיה. בשל לחץ הזלוף המופעל והתכווצות הלב המבושם זורם דרך העורקים הכליליים, המסתעפים מאבי העורקים. בעבודה המוצגת, הלב הוא perfused באמצעות מערך לחץ קבוע שהושג על ידי העלאת מאגרי perfusate לגובה 1 מ ', שווה ערך 73.2 מ"מ כספית, אשר מניב לקצב זרימה של 2.633 ± 0.583 מ"ל / דקה. שני סוגים של תמיסה של טירודה משמשים כמטען במהלך הניסוי. התמיסה של טירודה רגילה תומכת בקצב סינוסים יציב, בעוד שהפתרון של Low-K+ Tyrode מעורבב עם Pinacidil כדי לאפשר השראה של הפרעות קצב בלבבות מורין. השימוש באמבט מים משושה מאפשר תצפית על הלב דרך שישה חלונות מישוריים שונים, ומאפשר צימוד של מספר רכיבים אופטיים עם פחות עיוות על ידי שבירה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים פעלו בקפדנות על פי הרגולציה לרווחת בעלי חיים, בהסכמה עם החקיקה הגרמנית, התניות מקומיות, ובהתאם להמלצות הפדרציה של איגודי מדעי חיות המעבדה האירופיים (FELASA). הבקשה לאישור ניסויים בבעלי חיים אושרה על ידי הרשות האחראית לרווחת בעלי חיים, וכל הניסויים דווחו לנציגי רווחת בעלי החיים שלנו.

1. הכנת ניסויים וחומרים

  1. הגדרת מיפוי אופטי
    הערה: ההתקנה האופטית, כמו גם ההתקנה החשמלית, מוצגים באיור 1. כל הרכיבים המשמשים במערך האופטי והחשמלי מפורטים בפירוט בטבלת החומרים.
    1. השתמש ב-LED 1 ו-LED 2 להשראת הפרעות קצב ודפיברילציה לגיבוי. בחר נוריות LED בהספק גבוה עם אורך גלλ כחול ליד 475 ננומטר, שהוא שיא אורך גל העירור של ChR26. כדי לצמצם עוד יותר את הספקטרום האופטי, השתמש במסנן פס פס של 470 ± 20 ננומטר.
      הערה: בעבודה זו, LED 1 ו- LED 2 הם בעלי שטף קורן טיפוסי של 3.9 עד 5.3 W, על פי גליון הנתונים20.
    2. האר את האפיקרדיום למיפוי אופטי באמצעות נורית LED אדומה בעוצמה גבוהה (LED 3 באיור 1), הפולטת אור עם אורך גל מרכזי של λאדום = 625 ננומטר ושטף קורן של 700 mW21. האור האדום מסונן באמצעות מסנן פס פס של 628 ± 20 ננומטר ומוחזר על ידי מראה דיכרואית בעלת מעבר ארוך (DM) עם אורך גל מנותק של λDM = 685 ננומטר.
    3. השתמש במסנן פליטה עםמצלמת מסנן λ = 775 ± 70 ננומטר מול מטרת המצלמה כדי להקליט רק את הפליטה הפלואורסצנטית של פעילות הלב. השתמש במטרה מהירה המתאימה היטב ליישומים בתאורה חלשה.
      הערה: תדירות הפרפור של לב עכבר נעה בין 20 ל -35 הרץ; לכן, השתמש במצלמה מהירה מספיק כדי להקליט בתדר של 1 עד 2 קילוהרץ, או אפילו גבוה יותר.
  2. מערך מיקרו-LED
    הערה: מערכי המיקרו-LED המיושמים כאן מתממשים באמצעות עיבוד מיקרו-מערכות כמפורט במקום אחר16,17.
    1. יש לסובב שכבת פולימיד (PI) בעובי 5 מיקרומטר על מצעי סיליקון בגודל 4 אינץ' (מלוטשים בצד אחד, בעובי 525 מיקרומטר).
    2. לרפא שכבת PI זו בטמפרטורה מקסימלית של 450 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירת חנקן. שמור על טמפרטורה מקסימלית קבועה למשך 10 דקות.
    3. הפקדה ותבנית של פוטורסיסט היפוך תמונה (PR) באמצעות ליתוגרפיה אולטרה סגולה (UV) והפקדת מפזר שכבת פלטינה דקה של 250 ננומטר (Pt).
    4. עבו את המטליזציה מבוססת ה-Pt הזו על ידי ציפוי חשמלי של שכבת זהב (Au) בעובי 1 מיקרומטר, כאשר ה-PR המעוצב משמש כשכבת מיסוך.
    5. לפני סיבוב שכבת PI שנייה, חשוף את הוופל עם שכבת ה-PI הראשונה שלו ואת המטאליזציה המצופה Au-electroplated לפלזמת חמצן שמפעילה כימית את פני השטח של שכבת ה-PI.
    6. לרפא שוב את שכבת ה-PI השנייה בטמפרטורה של 450 מעלות צלזיוס, להחיל ליתוגרפיה של UV על תבנית שכבת יחסי ציבור ולפתוח את רפידות המגע של המערך עבור שבבי המיקרו-LED והמעגל המודפס המתממשק (PCB) על ידי תחריט יונים תגובתי (RIE) באמצעות יחסי הציבור המעוצבים כשכבת מיסוך.
      הערה: בשלבי תהליך RIE אלה, מומלץ להחיל 200 W ו- 100 W למשך 10 ו- 30 דקות, בהתאמה, כדי להגדיר את פתחי כריות המגע וכן את הצורה החיצונית של מערך המיקרו-LED הדו-ממדי (2D).
    7. הפשיטו את יחסי הציבור באמצעות ממיסים ותחריטי פלזמה. עיבוי נוסף של רפידות המגע על ידי ציפוי חשמלי נוסף של שכבת זהב בעובי 6 מיקרומטר.
    8. חבר את שבבי המיקרו-LED לרפידות המגע באמצעות בונדר שבב הפוך.
    9. הפעל את משטח ה- PI בפלזמת חמצן ומלא את שבבי המיקרו-LED בדבק ללא ממסים. לרפא לאחר מכן את הדבק במשך 12 שעות ב 120 מעלות צלזיוס.
    10. כדי לתמצת את שבבי המיקרו-LED, בצע טיפול פלזמה נוסף עם ארגון ויישם שכבת פלואורופולימר דקה באופן ידני. יש לרפא שכבה זו מראש בטמפרטורה של 80°C למשך שעה אחת.
    11. יש למרוח סיליקון באופן ידני כשכבת האנקפסולציה הסופית לאחר חשיפת מערך המיקרו-LED לפלסמת חמצן, המשמשת לשיפור הידבקות הסיליקון לשכבת הפלואורופולימר שמתחת. לרפא את שכבת הסיליקון ב-80°C וב-180°C למשך שעה כל אחת. שלבי הריפוי הסופיים האלה גם מרפאים לחלוטין את שכבת הפלואורופולימר.
    12. הלחמה של רפידות המגע של מצע PI למעגל מודפס הנושא מחברי פס לחיבור המערך למכשור חיצוני. כסו את רפידות ההלחמה על לוח המעגלים המודפסים באמצעות דבק.
  3. מערך חשמלי
    1. השתמש באלקטרודות המתאימות לרישום אלקטרוקרדיוגרמה (א.ק.ג.), כגון אלקטרודות כסף/כסף-כלוריד או אלקטרודות פוטנציאל פעולה מונופאזי (MAP) ומגבר א.ק.ג. כדי לנטר את הפעילות החשמלית של הלב באופן רציף. יתר על כן, השתמש במכשיר רכישה מתאים (AD) כדי להקליט את כל האותות החשמליים שהתקבלו.
    2. בחר מנהל התקן מתאים היטב עבור נוריות LED בעלות הספק גבוה (LED 1, LED 2 ו- LED 3), שיכולות לנהל את הזרם המרבי המוחל על כל התקן. השתמש במחולל פונקציות שרירותי (AFG) כדי לשלוט בפלט של מנהלי ההתקן של LED באופן מדויק.
    3. השתמש בדרייבר LED רב-ערוצי כדי לשלוט בזרם הזורם דרך מערך המיקרו-LED. AFG עם יציאות מרובות מתאים גם למשימה זו.
      הערה: מומלץ לבחור מנהלי התקן LED המגבילים את הזרם לזרם המרבי של המיקרו-LED, אחרת הדיודות עלולות להינזק. דוגמה אחת של מנהל התקן מיקרו-LED רב-ערוצי מתוארת בעבודה אחרת18. במידת הצורך, ייתכן שה-AFG או כל מנהל התקן LED אחר מחובר למחשב כדי לשלוט מרחוק בהגדרות ה-micro-LED. במקרה זה, חבר את מנהל ההתקן של נורית ה-LED למחשב באמצעות פרוטוקול התקשורת שבחרת, לדוגמה, אפיק ממשק לשימוש כללי (GPIB) או חיבור טורי.

   

2. הליכים ניסיוניים

  1. הכנת פתרונות
    1. הכן את הפתרון של טירוד: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 24 mM NaHCO3, 1.8 mM CaCl 2, 1.2 mM KH 2 PO4, 5.6 mM גלוקוז, 0.1% BSA / אלבומין.
    2. הכן את הפתרון של Low-K+ Tyrode: Low-K+ Tyrode's מיוצר באותו אופן כמו הפתרון של טירודה רגילה, אלא שרק מחצית מכמות ה-KCl מתווספת (2 mM במקום 4 mM KCl).
      הערה: לניסוי שנמשך 3 שעות בדרך כלל מספיקים 2-3 ליטר של טירוד Low-K+ (מעורבב בנוסף עם Blebbistatin (שלב 2.1.5) אם מתבצע מיפוי אופטי) ו-1-2 ליטר של טירודה רגילה.
    3. הוסיפו את Pinacidil לתמיסת הטירודה Low-K+ כדי להקל על תהליך אינדוקציה של הפרעות קצב, כפי שמתוארב-22, כדי להגיע לריכוז של 100 mM. יש ללבוש כפפות מעבדה מגן בעת טיפול Pinacidil.
    4. הכן 1 מ"ל של 50 μM DI-4-ANBDQPQ עם פתרון רגיל של טירוד. יש להגן על הצבע מפני אור כדי למנוע הלבנת תמונות.
    5. צור פתרון מלאי של 10 mM של Blebbistatin. למיפוי אופטי, ערבבו את Blebbistatin עם התמיסה של 100 mM Pinacidil-Tyrode (שלב 2.1.3) כדי לקבל תמיסה של 5 מיקרומטר. יש ללבוש כפפות מעבדה מגן בעת טיפול בבלביסטטין.
      הערה: שמור הן את הצבע והן את תמיסת Blebbistatin בצד עד לתחילת המיפוי האופטי.
  2. לנגנדורף
    הערה: ההתקנה מורכבת משני מאגרים עבור שני הפתרונות של Tyrode. הם מחוברים למלכודת בועות דרך צינורות עם תלת כיווני. הלב מחובר מאוחר יותר למלכודת הבועות על ידי מחבר מנעול Luer, ולאחר מכן הוא תלוי באמבט מים משושה. אמבט המים, בתורו, מחובר למיכל פסולת כדי לאסוף את הפתרון המשומש של טירוד.
    1. נקו את כל הצינורות לפני כל ניסוי עם מים שעברו דה-מינרליזציה מלאה.
    2. אווררו את שני הפתרונות של טירודה עם קרבוגן (5% CO 2 ו-95% O2) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני תחילת הניסוי. התאם את ערך ה- pH של פתרונות הטירודה ל- 7.4 עם NaOH.
    3. מלאו 500 מ"ל של כל תמיסה של טירודה במאגר המתאים ואווררו את הצינורות כמו גם את מלכודת הבועות על ידי הפעלת התמיסה של טירודה דרך מערכת הזלוף עד שלא ייראו עוד בועות אוויר לכודות בצינורות או במלכודת הבועות.
    4. המשך לאוורר את תמיסות הטירודה במהלך כל הניסוי במאגרים עם קרבוגן כדי להבטיח שה- pH של המבוך יישאר יציב מאוחר יותר במהלך הזליפה.
    5. מחממים את מערכת הזלוף ל-37°C באמצעות משאבת חום מים. שמרו על טמפרטורה קבועה בתוך אמבט המים באמצעות גוף חימום נוסף כגון כבל חימום עמיד למים.
      הערה: במהלך הניסוי, חיוני למלא מחדש את מאגרי הטירוד לפני שהם מתרוקנים. אחרת, בועות אוויר יכול להיכנס ללב, אשר יכול לסתום את כלי ולהוביל איסכמיה.
  3. הכנת עכבר
    1. להזריק תת עורית 0.1 מ"ל של 500 I.E. הפרין 30 דקות לפני הליך בידוד לב.
    2. מלאו צלחת פטרי בקוטר 6 ס"מ ומזרק 2 מ"ל בתמיסת טיירוד קרה כקרח. מניחים מתחת למיקרוסקופ הסטריאוסקופי.
    3. בצע הרדמה בזמן קצר של עכברים על ידי סביבת איזופלורן רוויה למשך 2 דקות ונקע צוואר הרחם מיידי לאחר מכן.
      הערה: על מנת לוודא הרדמה מספקת, יש צורך בהחלט לבדוק את הרפלקס השלילי בין האצבעות.
    4. פותחים את החזה, מסירים את הלב, כפי שתואר במקום אחר23, ומכניסים אותו לתוך צלחת פטרי בקוטר 6 ס"מ עם התמיסה של טירודה קרה כקרח. פעימות הלב יפחתו עקב ירידת הטמפרטורה.
    5. בצע את ההכנה העדינה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, כמפורט במקום אחר23. חבר את אבי העורקים על מחט קהה לקבע את הכלי עם חומר תפר.
    6. כבקרה, הזריקו את התמיסה של טירודה קרה כקרח דרך המחט לתוך הלב ובדקו שהלב מותקן היטב. שלב זה גם שוטף את שארית הדם מהלב.
    7. העבר את הלב רכוב למערכת הזליפה. ודאו שהבקבוק זורם כדי למנוע כניסת אוויר ללב תוך חיבור המחט למלכודת הבועות. בדוק כי הלב מכוסה בתמיסה של טירוד באמבט המים. שלבים 2.3.4, 2.3.5 ו-2.3.7 מתוארים באיור 2.
    8. ודא שהלב מתחיל לפעום תוך מספר דקות. תן ללב להסתגל למערך הזלוף למשך 15 עד 20 דקות, ולאחר מכן עבור לפתרון של טירודה נמוכה+ K עם Pinacidil (שלב 2.1.3) בהתאמה פתרון של טירודה נמוכה+ עם Pinacidil ו- Blebbistatin (שלב 2.1.5) אם יש לבצע מיפוי אופטי.
  4. אינדוקציה של הפרעות קצב ודפיברילציה אופטית
    1. הניחו את אחת מאלקטרודות האק"ג קרוב ככל האפשר למשטח הלב כדי להבטיח איכות אות טובה. השעה את אלקטרודת האק"ג השנייה בתמיסת הטירודה. ודא שהאק"ג שנרכש נרשם על ידי המודעה שבחרת.
    2. מקם את מערך המיקרו-LED על אזור העניין של המחקר, למשל, על החדר השמאלי.
    3. החליפו את הזלוף ל-+Low-K + Tyrode's עם Pinacidil והכניסו את הלב למשך 15 עד 30 דקות.
    4. כדי לגרום להפרעות קצב, להאיר את הלב עם LED 1 ו- LED 2 עם רכבת של 20 עד 50 פולסים קלים עם תדר f ind של 25 עד 35 הרץ, משך הדופק Wind של 2 עד 15 ms, ועוצמת האור LIopt_ind של 2.8 mW mm-2.
    5. חזור על התהליך עד הפרעות קצב הוא המושרה.
      הערה: קל לזהות הפרעות קצב באות האק"ג מכיוון שהתדר והמורפולוגיה של האות שונים מקצב סינוסים רגיל. אם הפרעת הקצב תסתיים בתוך 5 השניות הבאות, סווג אותה כסיום עצמי, והתחל ניסיון אינדוקציה חדש.
    6. לאחר זיהוי חזותי של הפרעת קצב מתמשכת, יש להפעיל פרץ של פולסים ברוחב שונה W def ותדרים fdef, באמצעות שלוש, שישה או תשעה מיקרו-נוריות של המערך בזרם פועם Iפולס של 15 mA הנכנע לעוצמת אור LIμLED = 33.31 ± 2.05 mW mm-2.
    7. אם הפרעת הקצב תמשיך להימשך לאחר חמישה ניסויי דפיברילציה מבוססי מערך מיקרו-LED, סווג את הניסיון כלא מוצלח והתחל דפיברילציה לגיבוי.
    8. עבור דפיברילציה לגיבוי, השתמש ב-LED 1 וב-LED 2 באמצעות אותם פרמטרי תזמון שנקבעו עבור מערך המיקרו-LED.
      הערה: מכיוון שהלב חשוף ללחץ איסכמי ומטבולי במשך כל תקופת הניסוי, ייתכן שניסיונות הפסקת הפרעות קצב אינם מצליחים אפילו עם דפיברילציה לגיבוי. בכל פעם שזה קורה, לשנות את פתרון הזלוף הרגיל של Tyrode ולתת ללב להתאושש במשך 5 עד 10 דקות. כאשר האק"ג חוזר לקצב הסינוסים, חזור שוב על הפרוטוקול משלב 2.4.3.
  5. מיפוי אופטי
    1. יש לחדור ללב עם תמיסת Blebbistatin שהוכנה בשלב 2.1.5 ולהמתין עד להתרחשות פירוק מכני. זה נעשה כאשר הלב מפסיק לפעום, אבל אות א.ק.ג. עדיין ניתן למדידה.
      הערה: ערבוב תמיסת Blebbistatin לריכוז שהוזכר ושמירה על הלב מחובר לתמיסה זו שומרת על הפעילות המכנית של הלב ללא פעילות חשמלית במהלך הניסוי כולו.
    2. תן את צבע המתח של 1 מ"ל DI-4-ANBDQPQ (מוכן בשלב 2.1.4) כבולוס במלכודת הבועות של הזלוף לנגנדורף. המתן 5 עד 10 דקות כדי לאפשר לצבע לחדור ללב באופן אחיד.
      הערה: הימנע מהלבנת תמונות של הצבע על-ידי כיבוי האור האדום בכל פעם שלא מתבצעת הקלטה. אם יחס האות לרעש של ההקלטה הופך קטן מדי (האות הנרכש רועש מדי), חזור על שלבים 2.1.4 ו- 2.5.2.
    3. מקד את המצלמה על משטח הלב, הפעל את LED 3 והפעל הספק אופטי של 1.27 mW mm-2 .
    4. כבו את אורות המעבדה והתחילו להקליט. ודא כי אות אופטי נרכש על ידי השוואת תדירות האות המתקבל לתדר האק"ג המוקלט. זה מבטיח כי האות האופטי המתקבל קשור אך ורק לפעילות החשמלית של הלב.
      הערה: מאחר שהאור הפלואורסצנטי הנפלט מהצבע הוא שבועי מאוד, המיפוי האופטי נעשה בחדר חשוך. פעולה זו מונעת הפרעות אות ממקורות אור אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול מאפשר אינדוקציה של הפרעות קצב חדריות בלבבות מורין שלמים באמצעות פולסים פוטוסטימולציה הנוצרים על ידי LED 1 ו-LED 2 (איור 1) עם תדר f ind בין 25 הרץ ל-35 הרץ ומשך פולס Wind בין 2 אלפיות השנייה ל-10 אלפיות השנייה. שימו לב שהמטרה של פעימות אור מהירות כאלה היא לא ללכוד את קצב הלב אלא לאזן את פעילות הלב כך שניתן יהיה ליצור גלים חשמליים לא יציבים, מה שמקל על הפרעת קצב. היתרון של גרימת הפרעת קצב עם אור על פני אינדוקציה עם גירוי חשמלי הוא כי לא חפצים מתעוררים באק"ג, מתן אפשרות לנתח את האות הנרכש ללא הגבלות ואפילו להעריך את התגובה החשמלית של הלב במהלך קצב מהיר, עובדה זו גם מספקת את האפשרות לבחון את התנהגות הלב במהלך פוטו דפיברילציה. זה לא אפשרי בשיטות אינדוקציה חשמלית או דפיברילציה. עם זאת, אם ההתקנה המשמשת אינה מאפשרת שימוש בנורות LED חיצוניות בעלות הספק גבוה, למשל, בגלל אילוצי מקום, ניתן למקם אלקטרודת קצב נוספת על הלב כדי לגרום להפרעות קצב, כפי שמוצג במקום אחר 3,22,24.

ברגע שהפרפור מושרה, הפרעת הקצב חייבת להימשך לפחות 5 שניות כדי להבטיח שהיא תתקיים, לאחר מכן מתחילים ניסיונות הדפיברילציה מבוססי micro-LED. מכיוון שהפרמטרים העיקריים של הפרעות קצב לב, כגון אורך מחזור בסיסי או תדירות דומיננטית, משרעת ומורפולוגיה, משתנים ללא הרף וכיוון שלא ניתן לחזות אילו פרמטרים של פוטו-דפיברילציה מספקים את התוצאה הטובה ביותר, היה עניין משמעותי להבין האם קיים קשר בין התדר, רוחב הדופק, שטח של פוטוסימולציה ושיעור סיום. לכן, סדרה של ניסויים עם תדרים שונים f def, מספר מיקרו-נוריות ומשך פולסים Wdef נבדקו, ושיעור ההצלחה של N = 11 עכברים הוצא, כפי שמוצג באיור 3.

ניתן להראות כי פולסים של 1 עד 20 אלפיות השנייה יכולים להתפרק עם שיעורי הצלחה שונים (איור 3). מכיוון שעוצמת האורLI μLED נשמרה קבועה במהלך כל פולס פוטוסטימולציה, כפי שצוין בשלב 2.4.6, ושיעור ההצלחה של שלוש נוריות מיקרו-LED כנגד תשע נמוך משמעותית, התוצאות המוצגות מצביעות על כך שהאזור המכוסה על הלב, מספר המיקרו-נוריות, ולכן השטף הקורן הכולל המופעל הם גורמים מכריעים בהשגת דפיברילציה. בהתחשב בכך שכל מיקרו-LED במערך הוא מקור אור למברטיני ושהם ממוקמים ישירות על פני השטח של הלב כך שהמרחק המשוער לרקמה הוא אפס, ניתן להניח כי קווי המתאר של ההקרנה של האזור המואר על הלב בעת שימוש במיקרו-LED יחיד שווה ערך ל- μLED = 0.059 מ"מ², כפי שמוצג גםב-25 עבור נוריות LED מלבניות שטוחות. יתר על כן, אף על פי שחלק מהפוטונים עשויים לעזוב את המיקרו-LED לרוחב מן הקצוות, תרומתם של אלה לעוצמת האור הכוללת נחשבת כה קטנה עד שניתן להזניח את השפעתם. כדי לכמת את האור המוקרן של המערך, החוקרים מדדו את השטף הקורן ממערך המיקרו-LED באמצעות מד הספק מסחרי וחישבו את עוצמת האור המגיעה ללב כפי שמוצג בטבלה 1. מטבלה 1 ניתן גם לקרוא כי השטף הקורן עולה עם מספר המיקרו-נוריות המשומשות, אך עוצמת האור נשארת קבועה בשל השלכות פרופיל התאורה שהוזכרו קודם לכן.

באופן מעניין, ניתן גם לראות ששיעור ההצלחה של תשע נוריות LED עם W def = 1 ms (איור 3a) ו- W def = 20 ms (איור 3d) בתדר דפיברילציה f def = 18 Hz ו- f def = 20 Hz הם גבוהים באופן דומה. בהתחשב בכך שהתדר הממוצע של הפרעות קצב המושרות הוא 22.55 ± 4.03 הרץ, עובדה זו עשויה להצביע על כך שעבור לבבות מורין ChR2, שיעור ההצלחה עולה באופן משמעותי ככל שתדירות הקצב קרובה יותר לתדר הפרעות הקצב. זה מוצג גם בסימולציות נומריות26. עם זאת, לא ניתן להכליל זאת בקלות מכיוון שהתדירות הדומיננטית של הפרעות קצב מורכבות משתנה כל הזמן. כדי להמחיש זאת, איור 4 מראה שני ניסיונות דפיברילציה שונים עם fdef = 14 Hz.. בתחילת מקטע האק"ג באיור 4a) ועל פי המורפולוגיה של אות האק"ג מוצג פרפור חדרים (VF). כאשר מתחילה פוטוסימולציה של מיקרו-LED, הפרפור הופך לדפוס מסודר יותר אשר סביר יותר להיות טכיקרדיה חדרית (VT). בכל פעם שמערך המיקרו-LED כבוי, גלי ה-VF הכאוטיים המקוריים משתלטים שוב. לפיכך, הפרעת הקצב אינה מסתיימת. למרות שבדוגמה זו לא ניתן לסיים את ה- VF עם הפרמטרים הנתונים, הוא כן מופרע וניתן לשנות אותו לתבנית רגילה יותר (VT). תרשים 4ב קטע 1 מראה שהתדר הדומיננטי של 24 הרץ עולה מעט עד שמתחילה פוטוסימולציה וה-VF הופך ל-VT בקטע 2, שבו התדר הדומיננטי יורד ל-14 הרץ. יתר על כן, איור 4c מראה VT שניתן לסיים אותועם אותו f def כמו באיור 4a, אך עםW def שונה. ראשית, פוטוסטימולציה מיקרו-LED משנה את המורפולוגיה של הפרעת הקצב, כדי לסיים אותה לבסוף עם לכידת קצב 1:1 מהדופקה-19 ואילך. תוצאות אלה עשויות לרמוז כי הפרמטרים של פוטודפיברילציה, למשל Wdef, חייבים להתאים את עצמם לשינוי המורפולוגיה של הפרעת הקצב לאורך זמן. הניסויים שהובילו לתוצאות אלה נערכו ללא שימוש ב-Blebbistatin בגלל השינוי שנוצר במשך פוטנציאל הפעולה (APD)27. לכן, לא בוצע מיפוי אופטי בסדרות אלה.

סדרה נוספת של ניסויים בוצעה למיפוי אופטי באמצעות הצבע הפוטנציומטרי בעל ההזזה האדומה (שלב 2.1.4). מיפוי אופטי באמצעות מצלמות מהירות מאפשר לצפות בגלי עירור מתפשטים על פני השטח של הלב במהלך קצב הסינוסים (איור 5) וטכיאריתמיות מורכבות28. מכיוון שהשינוי החלקי של הצבע הפוטנציומטרי נמוך מאוד, הסרטונים שהתקבלו עובדו לאחר מכן באמצעות שפת תכנות מתמטית. הצעד הראשון לשיפור איכות האותות האופטיים הוא להסיר רעש החל על מסנן החלקה של גאוס עם סטיית תקן של σ = 1, ואחריו מסנן פס פס עם תדרי פינהf גבוה = 0.1 הרץ ו- fנמוך = 70 הרץ. פס העצירה ב- fhigh מסיר שינויים איטיים באות שאינם קשורים לתדר הסינוסים של הלב שנמצא בין 3 הרץ < fסינוס < 8 הרץ, ואילו פס העצירה fנמוך מסיר רעש בתדר גבוה אשר נלכד על ידי המצלמה. חשוב לציין שגם פליטות אור כחול מ-LED 1, LED 2 וגם ממערך המיקרו-LED יכולות לגרום לדיבור צולב ולאות הפרעה גבוה מאוד במיפוי אופטי. בנוסף, נצפה כי אפילו מסנן פס צר מאוד מול המצלמה, עםמצלמת פילטר λ באורך גל, כפי שצוין בשלב 1.2.3, יסנן את השפעת האור הכחול. זה יכול להיגרם בחלקו על ידי תגובת העירור של הצבע עצמו. לכן היזהר מאוד בעת בחירת האופטיקה למיפוי אופטי. עבור אמצעי ניתוח וידאו, כל המסגרות שבהן נרשם אור כחול היה צריך להיות מוזנח, כך שבמקרים רבים לא ניתן לדמיין את הלב במהלך phototimulation, כפי שצוין גם במחקר אחר29.

Figure 1
איור 1: סכימה של ההתקנה החשמלית והאופטית. (א) נורות LED 1 ו-LED 2 מספקות מקור אור כחול המשמש להשראת הפרעות קצב ודפיברילציה לגיבוי. LED 3 משמש כמקור אור עירור עבור הצבע המוסט לאדום DI-4-ANBDQPQ. האור האדום מופנה אל הלב באמצעות המראה הדיכרואית DM. אור הפליטה המוצג באדום כהה מוקלט על ידי המצלמה המהירה דרך מסנן פליטה, כפי שצוין בטקסט. אלקטרודות LED 2 ו-ECG אינן מוצגות מטעמי פשטות. (ב) מקטע אחד של אות האק"ג המוקלט המוצג באדום. כחול כהה מראה את פעימות האור מ-LED 1 ו-LED 2 בתדר f ind = 35 Hz ו-Wind = 4 אלפיות השנייה המשמשות להשראת פרפור. מיד לאחר סיום גירוי האור, פרפור חדרים (VF) ניתן לראות. פוטוסטימולציה מבוססת מיקרו-LED המוצגת בכחול בהיר (f def = 16 Hz, Wdef = 20 ms) מסיימת בהצלחה את הפרעת הקצב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הכנה ללב . (א) חזה פתוח של עכבר המציג את הלב השלם ואת האיברים הסובבים אותו. (ב) לב מושתל שקוע בפתרון של טיירודה קרה כקרח להכנה נוספת. (ג) לב עכבר מחובר כראוי למחט קהה. (ד) לב מורין תלוי בפתרון של טירוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: שיעורי הצלחה שחולצו בניסוי. שיעורי הצלחה עבור 30 פולסים פוטוסטימולציה מבוססי מיקרו-LED באמצעות שלוש, שש ותשע נוריות LED במשכי פולסים שונים W def ותדרים fdef עבור N = 11. קווי שגיאה מוצגים עם שגיאת תקן של S.E.M. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: מניפולציה של קצב הלב באמצעות פוטוסימולציה. (א) מקטע של רישום א.ק.ג. של הפרעת קצב שאינה מסתיימת. (ב) ספקטרוגרמה של האק"ג המוצגת בלוח א'. צפיפות הספקטרלית של הספק (PSD) של מקטע (1) מראה הפרעת קצב עם תדר דומיננטי של 24 הרץ. ניתן לראות כי התדר הדומיננטי יורד ל -14 הרץ. קטע (3) סיום לא מוצלח וחזרה להתנהגות קצבית עם תדר דומיננטי של 24 הרץ. (ג) אק"ג של ניסיון דפיברילציה מוצלח. (ד) ספקטרוגרמה של הסיום המוצלח המוצגת בלוח c. מקטע (1) מראה טכיקרדיה חדרית (VT) עם תדר דומיננטי של 23 הרץ. קטע (3) מציג סיום מוצלח, מה שמוביל לקצב סינוס רגיל עם תדר בסיסי של 3.5 הרץ וההרמוניות המתקבלות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: מיפוי אופטי של כל הלב. השינוי בעוצמת הפלואורסצנציה במהלך פעימה אחת בודדת של הלב בקצב סינוס רגיל מוצג. הלב הוצב מול המצלמה כך שהחדר הימני והשמאלי נראים לעין (RV, LV). הכוכבית מציגה את הפיקסל שבו נלקח פוטנציאל הפעולה המוצג למעלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

מספר מיקרו-LED אזור מוקרן Aμled [מ"מ2] שטף קורן φ [mW] עוצמת אור LI [mW mm-2]
3 0.178 5.9 ± 0.47 33.11 ± 2.66
6 0.356 11.91 ± 0.84 33.42 ± 2.37
9 0.535 17.85 ± 0.61 33.39 ± 1.14

טבלה 1: שטף קורן נמדד של מערך המיקרו-LED ועוצמת האור המתאימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

טיפול מוצלח של tachyarrhythmias לב הוא המפתח לטיפול לב. עם זאת, המנגנונים הביופיזיקליים העומדים בבסיס התחלת הפרעות קצב, הנצחה וסיום אינם מובנים במלואם. לכן, מחקר לב שואף לייעל את הטיפול בהלם חשמלי לקראת סיום עדין יותר של הפרעות קצב, ובכך להגדיל את איכות החיים של המטופלים 28,29,30,31. גישות חשמליות דלות אנרגיה מבטיחות הפחתה משמעותית של תופעות לוואי חמורות, אולם עדיין עלולות לגרום לעירור שרירים לא רצוי. אופטוגנטיקה לבבית יכולה להתגבר על מגבלה זו ולספק לא רק טכניקת סיום עדינה של רקמות, אלא גם פלטפורמה גמישה לחקור את השליטה הממוקדת הספציפית להפרעות קצב של גלי עירור דמויי מערבולת בלב המורין השלם ובתרביות תאים32,33.

בהתחשב במוטיבציה זו, תוכננו ויושמו מערך פוטו-טימולציה חזק, כמו גם פרוטוקול, שניהם מציעים מערכת אופטית ניתנת להתאמה גבוהה, שניתן להרחיב בקלות למחקרי מיפוי אופטי פנורמי תלת-ממדי34.

ניתן להראות כי הפרעות קצב לב יכולות להסתיים בהצלחה בשיעורי הצלחה שונים בהתאם לפרמטרים שנבחרו עבור פוטוסטימולציה, למשל האזור המואר על הלב. התוצאות המוצגות מצביעות על כך שהגדלת המשטח המוקרן גייסה מספר קריטי של קרדיומיוציטים המכבים את הפעילות הכאוטית על ידי בלוק הולכה כפי שמוצג גם ב-22. במחקר זה, האנרגיה הנדרשת לפוטו-דפיברילציה היא E = 10.69 ± 0.37 mJ (באמצעות תשע נוריות מיקרו-נוריות, 30 פולסים ורוחב פולס Wdef = 20 אלפיות השנייה). מסתבר שזה נמוך יותר ממה שדווח קודם לכן ב-22,24 עם E 22 = 228.8 mJ ו-E 24 = 153.6 mJ, כאשר שטח גדול יותר 22 או כל הלב 24 היו מוארים, בהתאמה. עם זאת, בהשוואה לגישה שהוצגה ב-35, שבה אזור מעוצב מופרד היטב מואר ב-10 פולסים של פוטו-דפיברילציה וכתוצאה מכך E 35= 1.8 mJ, אנרגיית הפוטו-דפיברילציה במחקר הנוכחי גבוהה משמעותית. בניגוד לשלוש הגישות האחרות, לא ניתן היה להגיע לשיעור הצלחה של מעל 90% עם הפרוטוקול המוצג. סיבה אפשרית אחת לירידה בביצועים למרות אנרגיית פוטו-דפיברילציה גבוהה יותר עשויה להיות שהמורכבות של הפרעת הקצב הבסיסית אינה נלקחת בחשבון. לגבי התוצאות המוצגות בשנת 35, שבהן שיעור סיום גבוה מושג על ידי הארת שטח קטן על הלב, ובמקביל מדידת הדינמיקה המרחבית-טמפורלית של הפרעת קצב, הגישה המוצגת בהחלט יכולה להשתפר עוד יותר על ידי התחשבות בבקרת משוב, המגיבה בתבנית שונה של תאורת מיקרו-LED בהתאם למצב הנוכחי של הלב.  יתר על כן, הוכח גם כי למרות שלא תמיד ניתן לסיים הפרעות קצב בשיטה הנוכחית, הדינמיקה המורכבת הפנימית יכולה להיות מופרעת במהלך פוטוסטימולציה המובילה למצב טמפורלי מסודר יותר. כפי שניתן לראותב-36, קצב הסיום שונה באופן משמעותי כאשר מטפלים בהפרעות קצב מונומורפיות (מסודרות יותר) ופולימורפיות (פחות מסודרות). מכאן שהצעד ההגיוני לקראת קצב דפיברילציה טוב יותר עשוי להיות להשפיע על הדינמיקה הלבבית במהלך פרק VF, להפוך את הפרעת הקצב לתבנית פחות מורכבת ולסיים עם קבוצה אחרת של פולסים, תוך בניית גישה של פוטוסטימולציה דו-שלבית.

לגבי פרוטוקול הזליפה, השלבים הקריטיים ביותר נמצאים במיצוי והכנה נכונה של הלב, כמו גם בהתאמה נכונה של אופטיקת המיפוי האופטי. שילוב של מיפוי אופטי דורש בחירה נכונה של ספקטרום צבע, עירור מתאים של מקורות אור ומסננים אופטיים שנבחרו היטב עבור המצלמה29. אחרת, האותות האופטיים המוקלטים עשויים להיות רועשים מדי וגם יכולים להכיל שיחות צולבות של פוטוסטימולציה עם עירור צבע. ניתוח מאוחר יותר יחייב אפוא עיבוד לאחר עיבוד של אותות עם מספר מסננים אנליטיים והחלקת תמונה שלעתים קרובות גורמת להחמרה.

שלב מכריע נוסף בפרוטוקול זה הוא המיקום הנכון והמדויק של מערך המיקרו-LED. מכיוון שהמוליך המקשר בין מערך המיקרו-LED לבין הדרייבר הוא דק וגמיש מאוד, לעיתים מאתגר להבטיח שהמערך ימוקם בערך באותו מיקום על פני הלב בכל ניסוי. כדי להקל על המיקום ולתקן את המיקום הנרכש של מערך המיקרו-LED, תוכנן והודפס מחזיק בתלת-ממד, המאפשר לחבר את המערך למיקרומניפולטור. זה נותן יותר שליטה על תנועת המערך בפתרון של הטירוד. בהתאם לחומר שנבחר עבור העופרת המקשרת של מערך המיקרו-LED, ייתכן שלא יהיה צורך להשתמש במחזיק.

חוץ מזה, שלב קריטי נוסף של הפרוטוקול הוא תוספת של תרופות פרו-הפרעות קצב, כמו למשל, Pinacidil37. מאחר שמספר תרכובות כימיות ידועות בשינוי התגובה הפיזיולוגית של הלב, יש לקחת זאת בחשבון בעת ניתוח ופירוש התוצאות. בכל הנוגע למיפוי אופטי, הפרוטוקול המוצע משתמש ב-Blebbistatin כ-uncoupler מכני. זה יש את היתרון של הסרת חפצים תנועה במהלך ההקלטה, אבל זה יכול גם להאריך את APD27. כדי להתגבר על החיסרון הזה, ניתוח שיטות של מעקב אחר תנועה במהלך ההקלטה יכול להיחשב38,39. בדרך זו, המצב הפיזיולוגי הרגיל של הלב יישמר, וניתן לקבל אות באיכות גבוהה.

למרות שהוכח כי ניתן להשתמש בפרוטוקול המוצג עבור דפיברילציה של תמונות מרובות אתרים, עדיין יש לו כמה מגבלות. נמצא כי במקרים מסוימים לא ניתן להפסיק את הפרפור על ידי פוטוסטימולציה מבוססת מיקרו-LED אלא רק להיות מופרע, וכתוצאה מכך שינויים בתדר. אחת ההשערות היא שהגלים המתפתלים על הלב נעקרים רק מהחדר השמאלי, ומתחדשים בחלקים אחרים של הלב. בהשוואה לשיטות אחרות כגון תאורה גלובלית24, השיטה הנוכחית מציעה אחוזי הצלחה נמוכים יותר בשל כיסוי קטן יותר של הלב. עם זאת, אנו בטוחים כי עם שיטת הזיהוי הנכונה מבוססת החומרה של פעילות ספירלית, שיפור שיעור ההצלחה של סיום הוא אפשרי.

לסיכום, מערכת הפוטוסטימולציה המוצגת מבססת כלי ניסיוני רב עוצמה לגישות קרדיוברציה מרובות ומחקרי מניפולציה של הפרעות קצב לב. הידע שנלמד במערכת זו ישמש לחקירה והערכה של פרוטוקולי דפיברילציה פוטנציאליים (תמונה) חדשים במודלים רלוונטיים מבחינה קלינית של בעלי חיים גדולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגוד עניינים כלשהו.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות למריון קונזה וטינה אלטהאוס על התמיכה הטכנית המצוינת שלהם במהלך הניסויים. המחקר שהוביל לתוצאות קיבל מימון מתוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית FP7/2007-2013 במסגרת הסכם מענק מספר HEALTH-F2-2009-241526. התמיכה ניתנה גם על ידי המרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם, DZHK e.V. (פרויקט MD28), האתר השותף Goettingen, קרן המחקר הגרמנית CRC 1002 (פרויקט C03), ואגודת מקס פלנק. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי BrainLinks-BrainTools, אשכול מצוינות במימון קרן המחקר הגרמנית (DFG, מענק מספר EXC 1086).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical Components
Blebbistatin TargetMol T6038 10 mM stock solution
BSA/Albumin Sigma-Aldrich A4919
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016 CaCl2
Carbogen Westfalen 50 l bottle
DI-4-ANBDQPQ AAT Bioquest 21499 Dye for Optical Mapping
Glucose Sigma-Aldrich D9434 C6H12O6
Heparin LEO Pharma Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription
Hydrochlorid Acid Merck 1.09057.1000 HCl, 1 M stock solution
Isoflurane CP Pharma 1 ml/ml, available only on prescription
Magnesium Chloride Merck 8.14733.0500 MgCl2
Monopotassium Phosphate Sigma-Aldrich 30407 KH2PO4
Pinacidil monohydrate Sigma-Aldrich P154-500mg 10 mM stock solution
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 KCl
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 NaHCO3
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 NaCl
Sodium Hydroxide Merck 1.09137.1000 NaOH, 1 M stock solution
Electrical Setup
Biopac MP150 Biopac Systems MP150WSW data acquisition and analysis system
Custom-built ECG, alternative ECG100C Biopac Systems ECG100C Electrocardiogram Amplifier
Custom-built water bath heater using heating cable RMS Heating System HK-5,0-12 Heating cable 120W
Hexagonal water bath
LED Driver Power supply Thorlabs KPS101 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube.
LEDD1B LED Driver Thorlabs LEDD1B T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current
MAP, ECG Electrode Hugo Sachs Elektronik BS4 73-0200 Mini-ECG Electrode for isoalted hearts
micro-LED Driver e.g. AFG Agilent Instruments A-2230 Arbitrary function generator (AFG)
Signal Generator Agilent Instruments A-2230 AFG
micro-LED Array Components
Epoxid glue Epoxy Technology EPO-TEK 353ND Two component epoxy
Fluoropolymer  Asahi Glass Co. Ltd. Cytop 809M Fluoropolymer with high transparency
Image reversal photoresist Merck KGaA AZ 5214E Image Reversal Resist for High Resolution
LED chip  Cree Inc. C460TR2227-S2100 Blue micro-LED
Photoresist Merck KGaA AZ 9260 Thick Positive Photoresists
Polyimide UBE Industries Ltd. U-Varnish S Polyimide Solution
Silicone NuSil Technology LLC MED-6215 Low viscosity silicone elastomer
Solvent free adhesive John P. Kummer GmbH Epo-Tek 301-2 Epoxy resin with low viscosity
Optical Mapping
Blue Filter Chroma Technology Corporation ET470/40x Blue excitation filter
Camera Photometrics Cascade 128+ High performance EMCCD Camera
Camera Objective Navitar DO-5095 Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras
Dichroic Mirror Semrock FF685-Di02-25x36 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter
Emmision Filter Semrock FF01-775/140-25 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter
Heatsink Advanced Thermal Solutions ATSEU-077A-C3-R0 Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware
LED 1 and LED 2 LED Engin Osram LZ4-00B208 High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3 Thorlabs M625L3 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA
Lenses LED Engin Osram LLNF-2T06-H LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Photodiode for power meter Thorlabs S120VC Standard Photodiode Power Sensor
Power Meter Thorlabs PM100D Compact Power and Energy Meter
Red Filter Semrock FF02-628/40-25 BrightLine® single-band bandpass filter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
  2. Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation. Circulation. 120 (6), 467-476 (2009).
  3. Luther, S., et al. Low-energy control of electrical turbulence in the heart. Nature. 475, 235-239 (2011).
  4. Pumir, A., et al. Wave emission from heterogeneities opens a way to controlling chaos in the heart. Physical Review Letters. 99, 208101 (2007).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  6. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  7. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  8. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7, 897-900 (2010).
  9. Natasha, G., et al. et al.Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch. New Biotechnology. 30 (5), 461-474 (2013).
  10. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  11. Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 28 (46), 11862-11870 (2008).
  12. Ahmad, A., Ashraf, S., Komai, S. Optogenetics applications for treating spinal cord injury. Asian Spine Journal. 9 (2), 299-305 (2015).
  13. Dieter, A., Keppeler, D., Moser, T. Towards the optical cochlear implant: Optogenetic approaches for hearing restoration. EMBO Molecular Medicine. 12 (4), e11618 (2020).
  14. Keppeler, D., et al. Multichannel optogenetic stimulation of the auditory pathway using microfabricated LED cochlear implants in rodents. Science Translational Medicine. 12 (553), eabb8086 (2020).
  15. Verhoefen, M. K., Bamann, C., Blöcher, R., Förster, U., Bamberg, E. The photocycle of channelrhodopsin-2: ultrafast reaction dynamics and subsequent reaction steps. ChemPhysChem. 11 (14), 3113-3122 (2010).
  16. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized tool for optogenetics based on an LED and an optical fiber interfaced by a silicon housing. 36th Annual Internation Conference IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Chicago, IL, , 5252-5255 (2014).
  17. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized 3 x 3 optical fiber array for optogenetics with integrated 460 nm light sources and flexible electrical interconnection. 28th IEEE Proceedigns. MEMS, Estoril, , 162-165 (2015).
  18. Diaz-Maue, L., Schwaerzle, M., Ruther, P., Luther, S., Richter, C. Follow the light - From low-energy defibrillation to multi-site photostimulation. 40thAnnual International Conference of IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Honolulu, HI, , 4832-4835 (2018).
  19. Zgierski-Johnston, C., et al. Cardiac pacing using transmural multi-LED probes in channelrhodopsin-expressing mouse hearts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , 51-61 (2020).
  20. mouser.de, LED Engin, [Online]. , Available: https://www.mouser.de/datasheet/2/228/5412893-LED_2520Engin_Datasheet_LuxiGen_LZ4-00B208- 1531969.pdf (2020).
  21. thorlabs.com, thorlabs, [Online]. , Available: https://www.thorlabs.com/_sd.cfm?fileName=25135-S01.pdf&partNumber=M625L3 (2020).
  22. Bruegmann, T., et al. Optogenetic defibrillation terminates ventricular arrhythmia in mouse hearts and human simulations. Journal of Clinical Investigation. 126 (10), 3894-3904 (2016).
  23. Richter, C., Christoph, J., Lehnart, S. E., Luther, S. Optogenetic light crafting tools for the control of cardiac arrhythmias. Methods in Molecular Biology. 1408, 293-302 (2016).
  24. Quiñonez Uribe, R. A., Luther, S., Diaz-Maue, L., Richter, C. Energy-reduced arrhythmia termination using global photostimulation in optogenetic murine hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1651), (2018).
  25. Moreno, I. LED irradiance pattern at short distances. Applied Optics. 59 (1), 190-195 (2020).
  26. Predicting unpinning success rates for a pinned spiral in an excitable medium. Behrend, A., Bittihn, P., Luther, S. Computing in Cardiology, Belfast, , 345-348 (2010).
  27. Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11 (464), (2020).
  28. Christoph, J., et al. Electromechanical vortex filaments during cardiac fibrillation. Nature. 555, 667-672 (2018).
  29. O'Shea, C. Cardiac optogenetics and optical mapping - Overcoming spectral congestion in all-optical cardiac electrophysiology. Frontiers in Physiology. 10 (182), (2019).
  30. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), e006692 (2018).
  31. Trayanova, N., Doshi, A. N., Prakosa, A. How personalized heart modeling can help treatment of lethal arrhythmias: A focus on ventricular tachycardia ablation strategies in post-infarction patients. Wiley Interdisciplinary Reviews in System Biology and Medicine. 12 (3), 1477 (2020).
  32. Bingen, B., et al. Light-induced termination of spiral wave arrhythmias by optogenetic engineering of atrial cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 104 (1), 194-205 (2014).
  33. Burton, R. A. B., et al. Optical control of excitation waves in cardiac tissue. Nature Photonics. 9 (12), 813-816 (2015).
  34. Dura, M., Schröder-Schetelig, J., Luther, S., Lehnart, S. E. Toward panoramic in situ mapping of action potential propagation in transgenic hearts to investigate initiation and therapeutic control of arrhythmias. Frontiers in Physiology. 5, 337 (2014).
  35. Crocini, C., et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Science Reports. 6 (35628), (2016).
  36. Nyns, E. C. A., et al. Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management. European Heart Journal. 38 (27), 2132-2136 (2017).
  37. Wilde, A. A. K+atp channel opening and arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 24 (4), 35-40 (1994).
  38. Christoph, J., Luther, S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1483), (2018).
  39. Christoph, J., Schröder-Schetelig, J., Luther, S. Electromechanical optical mapping. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130(B), 150-169 (2017).

Tags

רפואה גיליון 174 אופטוגנטיקה לבבית מיפוי אופטי LED DI-4-ANBDQPQ Blebbistatin channelrhodopsin-2 ChR2
ניהול מתקדם של קצב הלב על ידי יישום פוטו-גירוי אופטוגנטי מרובה אתרים בלבבות מורין
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diaz-Maue, L., Steinebach, J.,… More

Diaz-Maue, L., Steinebach, J., Schwaerzle, M., Luther, S., Ruther, P., Richter, C. Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts. J. Vis. Exp. (174), e62335, doi:10.3791/62335 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter