Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

通过在小鼠心脏中应用光遗传学多位点光刺激进行高级心律管理

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62335
Automatic Translation
*1,2, *1, 8,9, 1,3,4,6, 8,9, 1,5,6,7
1Research Group Biomedical Physics, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 2Research Electronics Department, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, 4Institute for Nonlinear Dynamics, Georg-August-University Goettingen, 5Department of Cardiology and Pneumology, University Medical Center Goettingen, 6German Center for Cardiovascular Research, DZHK e.V., partner site Goettingen, 7Laboratory Animal Science Unit, German Primate Center Leibniz Institute for Primate Research, 8Department of Microsystems Engineering (IMTEK), University of Freiburg, 9Cluster of Excellence BrainLinks-BrainTools, University of Freiburg
* These authors contributed equally

Summary

这项工作报告了一种使用micro-LED阵列的局部光刺激和同时光学映射心外膜电位来控制转基因通道视紫红质-2（ChR2）小鼠完整鼠心脏心律的方法。

Abstract

室性快速性心律失常是全世界死亡和发病的主要原因。使用高能电击的电除颤是目前危及生命的心室颤动的唯一治疗方法。然而，除颤可能有副作用，包括无法忍受的疼痛、组织损伤和预后恶化，这表明开发更温和的心律管理策略的医学需求很大。除了降低能量的电方法外，心脏光遗传学还被引入，作为使用光敏膜离子通道和光脉冲影响心脏活动的有力工具。在本研究中，将描述一种基于应用3 x 3微发光二极管（micro-LED）阵列的多位点起搏成功光刺激Langendorff灌注的完整鼠心脏的稳健有效的方法。心外膜电压波的同时光学映射允许研究区域特异性刺激的影响，并直接在现场评估新诱导的心脏活动。获得的结果表明，除颤的功效在很大程度上取决于心律失常期间为光刺激选择的参数。将证明心脏的照明区域对于终止成功以及如何在照明期间实现心脏活动的靶向控制以改变心律失常模式起着至关重要的作用。总之，该技术提供了一种优化现场机制操作的可能性，以实现心律的实时反馈控制，并且与使用非特异性电击应用相比，在区域特异性方面，减少了对心脏系统的潜在危害的新方法。

Introduction

对心律失常期间时空动力学的早期研究表明，心脏颤动期间的复杂电模式是由涡状旋转激励波驱动的1。这一发现为心律失常的潜在机制提供了新的见解，从而开发了基于心肌多位点激发的新型电终止疗法2，3，4。然而，使用电场刺激的治疗是非局部的，可能会支配周围所有可兴奋的细胞，包括肌肉组织，导致细胞和组织损伤，以及无法忍受的疼痛。与电疗法相比，光遗传学方法提供了一种特异性和组织保护技术，以高空间和时间精度唤起心肌细胞动作电位。因此，光遗传学刺激具有对心脏颤动期间混沌激活模式进行微创控制的潜力。

通过遗传操作将光敏离子通道通道视紫红质-2（ChR2）引入可兴奋细胞5，6，7，使得使用光刺激可兴奋细胞的膜电位去极化成为可能。已经开发了几种医学应用，包括激活神经元网络，控制心脏活动，恢复视力和听力，治疗脊髓损伤等8，9，10，11，12，13，14。由于其毫秒响应时间15，ChR2在心脏病学中的应用具有巨大的潜力，使其非常适合心律失常的心脏动力学的靶向控制。

在这项研究中，显示了转基因小鼠模型完整心脏的多位点光刺激。总之，在欧洲共同体第七框架计划FP7/2007-2013（HEALTH-F2-2009-241526）的范围内建立了转基因α-MHC-ChR2小鼠系，并由S. E. Lehnart教授慷慨提供。一般情况下，在α-MHC控制下表达Cre-重组酶的转基因成年雄性C57/B6/J与雌性 B6.Cg-Gt（ROSA）26Sortm27.1（CAG-COP4*H134R/tdTomato）Hye/J配对交配。由于心脏STOP盒在第二代中被删除，后代表现出稳定的MHC-ChR2表达，并用于维持心脏光敏集落。所有实验均在36-48周龄的两性成年小鼠中进行。照明是使用3 x 3微型LED阵列实现的，该阵列如16，17 中所述制造，只是未实现硅基外壳和短光学玻璃光纤。它在心脏应用中的首次使用是在18年。基于类似制造技术的线性微型LED阵列已被用作心脏起搏的穿透探针19。微型 LED 排列在 3 x 3 阵列中，间距为 550 μm，可在非常小的区域内提供高空间分辨率和高辐射功率。作者在这项工作中展示了一种多功能的局部多位点光刺激，这可能为开发新的抗心律失常治疗方法开辟道路。

以下实验方案涉及离体逆行朗根道夫灌注，其空心主动脉用作灌注入口。由于施加的灌注压和心脏收缩，灌注液流经冠状动脉，冠状动脉从主动脉分支出来。在所展示的工作中，使用恒压设置灌注心脏，通过将灌注储液罐提升到 1 m 高度（相当于 73.2 mmHg）来实现，从而产生 2.633 ± 0.583 mL/min 的流速。在实验过程中使用两种Tyrode溶液作为灌注剂。常规Tyrode溶液支持稳定的窦性心律，而Low-K + Tyrode溶液与Pinacidil混合，以诱导小鼠心脏的心律失常。使用六角形水浴允许通过六个不同的平面窗口观察心脏，允许耦合多个光学元件，通过折射引起的失真较小。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

所有实验都严格遵守动物福利法规，符合德国立法、当地规定，并符合欧洲实验动物科学协会联合会 （FELASA） 的建议。动物实验的批准申请已获得负责动物福利当局的批准，所有实验均已报告给我们的动物福利代表。

1. 实验准备和材料

  1. 光学映射设置
    注：光学设置以及电气设置如图 1所示。材料表中详细列出了光学和电气设置中使用的所有组件。
    1. 使用 LED 1 和 LED 2 诱导心律失常和备用除颤。选择波长λ蓝色 接近475 nm的高功率LED，这是ChR26激发波长的峰值。要进一步缩小光谱，请使用 470 ± 20 nm 带通滤光片。
      注意：根据数据表20，在本工作中，LED 1 和 LED 2 的典型辐射通量为 3.9 至 5.3 W。
    2. 用高功率红色 LED（ 图 1 中的 LED 3）照亮心外膜以进行光学映射，该 LED 发出的光的中心波长为 λ红色 = 625 nm，辐射通量为 700 mW21。红光用628 ± 20 nm带通滤光片过滤，并由截止波长为λ DM = 685 nm的长通二向色镜（DM ）反射。
    3. 在相机物镜前使用λ滤光片凸轮= 775±70nm的发射滤光片，以仅记录心脏活动的荧光发射。使用非常适合低光应用的快速物镜。
      注意：小鼠心脏的颤动频率范围为20至35 Hz;因此，请使用足够快的相机以 1 到 2 kHz 甚至更高的频率进行录制。
  2. 微型发光二极管阵列
    注意：此处应用的micro-LED阵列是使用微系统处理实现的，详见其他地方16，17。
    1. 将 5 μm 厚的聚酰亚胺 （PI） 层旋转涂覆到 4 英寸硅基板上（单面抛光，525 μm 厚）。
    2. 在氮气气氛下，最高温度为450°C，固化该PI层。保持最高温度恒定10分钟。
    3. 使用紫外 （UV） 光刻技术沉积和图案化图像反转光刻胶 （PR），并溅射沉积 250 nm 薄铂层 （Pt）。
    4. 通过电镀 1 μm 厚的金 （Au） 层，将图案化的 PR 用作掩蔽层来增厚这种基于 Pt 的金属化。
    5. 在旋涂第二个PI层之前，将具有第一个PI层和金电镀金属化的晶圆暴露于氧等离子体中，该等离子体化学激活PI层的表面。
    6. 在450°C下再次固化第二层PI，应用UV光刻技术对PR层进行图案化，并使用图案化的PR作为掩蔽层，通过反应离子蚀刻（RIE）打开micro-LED芯片和接口印刷电路板（PCB）阵列的接触焊盘。
      注意：在此RIE工艺步骤中，建议分别施加200 W和100 W10和30分钟，以定义接触垫开口以及二维（2D）micro-LED阵列的外部形状。
    7. 使用溶剂和等离子蚀刻剥离PR。通过电镀额外的 6 μm 厚的金层来进一步加厚接触垫。
    8. 使用倒装芯片键合机将微型LED芯片连接到接触垫上。
    9. 激活氧气等离子体中的PI表面，并用无溶剂粘合剂填充micro-LED芯片。然后将粘合剂在120°C下固化12小时。
    10. 要封装微型LED芯片，请用氩气进行另一次等离子处理，并手动应用薄的含氟聚合物层。在80°C下预固化该层1小时。
    11. 将micro-LED阵列暴露于氧等离子体后，手动应用有机硅作为最终封装层，用于提高硅与底层含氟聚合物层的附着力。将硅胶层在80°C和180°C下固化1小时。这些最后的固化步骤也完全固化了含氟聚合物层。
    12. 将PI基板的接触焊盘焊接到印刷电路板上，该印刷电路板带有条形连接器，用于将阵列互连到外部仪器。使用粘合剂覆盖PCB上的焊盘。
  3. 电气设置
    1. 使用适合记录心电图 （ECG） 的电极，例如银/氯化银电极或单相动作电位 （MAP） 电极和 ECG 放大器来连续监测心脏的电活动。此外，使用适当的采集设备（AD）记录获得的所有电信号。
    2. 为大功率 LED（LED 1、LED 2 和 LED 3）选择合适的驱动器，它可以管理施加到每个器件的最大电流。使用任意函数发生器 （AFG） 精确控制 LED 驱动器的输出。
    3. 使用多通道 LED 驱动器控制流过微型 LED 阵列的电流。具有多个输出的 AFG 也适合此任务。
      注意：建议选择将电流限制为微型LED最大电流的LED驱动器，否则二极管可能会损坏。多通道微型LED驱动器的一个示例在另一部作品18中描述。如有必要，AFG 或任何其他 LED 驱动器可能会连接到计算机以远程控制微型 LED 设置。如果是这种情况，请使用您选择的通信协议将 LED 驱动器连接到计算机，例如通用接口总线 （GPIB） 或串行连接。

   

2. 实验程序

  1. 溶液制备
    1. 准备Tyrode溶液：130 mM NaCl，4 mM KCl，1 mM MgCl 2，24 mM NaHCO3，1.8 mM CaCl 2，1.2 mM KH2 PO4，5.6 mM葡萄糖，0.1%BSA /白蛋白。
    2. 准备低K+泰罗德溶液：低K+泰罗德溶液的制备方法与常规泰罗德溶液相同，只是只添加了一半的KCl（2 mM而不是4 mM KCl）。
      注意：对于持续3小时的实验，通常2-3升低K + Tyrode（如果进行光学映射，则与Blebbistatin（步骤2.1.5）混合）和1-2L常规Tyrode就足够了。
    3. 将匹纳地尔添加到低K + Tyrode溶液中以缓解心律失常诱导过程，如22中所述，以获得100mM浓度。处理松西地尔时戴上实验室防护手套。
    4. 用常规泰罗德溶液制备 1 mL 50 μM DI-4-ANBDQPQ。保护染料避光，防止光漂白。
    5. 制作10mM的布比他汀储备溶液。对于光学映射，将布比他汀与100mM松酸地尔-泰罗德溶液（步骤2.1.3）混合以获得5μM溶液。处理布比他汀时戴上实验室防护手套。
      注意：将染料和布比他汀溶液放在一边，直到光学映射开始。
  2. 朗根道夫灌注
    注意：该装置由两个储液罐组成，用于两个 Tyrode 解决方案。它们通过带有三向旋塞的管子连接到气泡捕集器。心脏随后通过鲁尔锁连接器连接到气泡阱上，然后将其悬挂在六角形水浴中。反过来，水浴连接到废物容器以收集用过的Tyrode溶液。
    1. 每次实验前用完全软化水清洁所有试管。
    2. 在实验开始之前，在室温下用碳原（5%CO2 和95%O2）给Tyrode的溶液充气30分钟。用NaOH将Tyrode溶液的pH值调节至7.4。
    3. 将每个 Tyrode 溶液填充 500 mL 到相应的储液器中，并通过灌注系统运行 Tyrode 溶液对管和气泡阱进行脱气，直到在管中或气泡阱中看不到更多的被困气泡。
    4. 在整个实验过程中，继续用碳原在储层中给Tyrode溶液充气，以确保灌注液的pH值在灌注过程中保持稳定。
    5. 用水热泵将灌注系统加热至37°C。通过使用额外的加热元件（如防水加热电缆）来保持水浴内的灌注液温度恒定。
      注意：在实验过程中，在 Tyrode 的储液罐耗尽之前重新填充它们至关重要。否则，气泡会进入心脏，堵塞血管并导致缺血。
  3. 鼠标制备
    1. 在心脏隔离程序前30分钟皮下注射0.1mL的500即肝素。
    2. 用冰冷的Tyrode溶液填充6厘米培养皿和2毫升注射器。放在体视显微镜下。
    3. 通过饱和异氟醚环境对小鼠进行短时间麻醉2分钟，然后立即颈椎脱位。
      注意：为了验证足够的麻醉，检查阴性的脚趾间反射是绝对必要的。
    4. 打开胸部，取出心脏，如其他地方所述23，并将其放入6厘米培养皿中，用冰冷的Tyrode溶液。由于温度下降，心脏跳动会减少。
    5. 在体视显微镜下进行精细准备，详见其他部分23。将主动脉连接到钝针上，并用缝合材料固定血管。
    6. 作为对照，通过针头将冰冷的Tyrode溶液注入心脏，并检查心脏是否紧密安装。这一步还将剩余的血液冲洗出心脏。
    7. 将安装的心脏转移到灌注系统。确保灌注液流动以防止空气进入心脏，同时将针头与气泡阱连接。检查心脏是否在水浴中被泰罗德溶液覆盖。步骤 2.3.4、2.3.5 和 2.3.7 如图 2 所示。
    8. 确保心脏在几分钟内开始跳动。让心脏适应灌注设置15至20分钟，如果要进行光学映射，则分别切换到低K +泰罗德溶液与匹纳地尔和布比他汀（步骤2.1.5）。
  4. 心律失常诱导和光学除颤
    1. 将其中一个心电图电极尽可能靠近心脏表面，以确保良好的信号质量。将第二个心电图电极悬浮在泰罗德的溶液中。确保所选AD记录采集的心电图。
    2. 将micro-LED阵列放在研究的感兴趣区域，例如，放在左心室上。
    3. 将灌注改为低K + Tyrode's和Pinacidil，并灌注心脏15至30分钟。
    4. 为了诱发心律失常，用 LED 1 和 LED 2 照射心脏，用 20 到 50 个光脉冲串亮心脏，频率为 25 到 35 Hz，脉冲持续时间 Wind 为 2 到 15 ms，光强度 LIopt_ind 为 2.8 mW mm-2。
    5. 重复该过程，直到诱发心律失常。
      注意：心律失常很容易在心电图信号中识别，因为信号的频率和形态与正常的窦性心律不同。如果心律失常在接下来的 5 秒内终止，将其归类为自我终止，并开始新的诱导尝试。
    6. 一旦目视检测到持续性心律失常，使用阵列的三个、六个或九个微型 LED 以 15 mA 的脉冲电流 I 脉冲施加不同宽度 W def 和频率 fdef 的脉冲脉冲脉冲，产生光强度 LIμLED = 33.31 ± 2.05 mW mm-2。
    7. 如果在五次基于 micro-LED 阵列的除颤试验后心律失常仍在继续，请将尝试归类为不成功并开始备用除颤。
    8. 对于备用除颤，请使用 LED 1 和 LED 2，使用与微型 LED 阵列设置的相同定时参数。
      注意：由于心脏在整个实验期间都暴露于缺血和代谢应激中，因此即使使用备用除颤，心律失常的终止尝试也可能不成功。每当发生这种情况时，将灌注溶液更改为常规的Tyrode，让心脏恢复5至10分钟。当心电图恢复到窦性心律时，再次重复步骤2.4.3中的方案。
  5. 光学映射
    1. 用步骤2.1.5中制备的布比他汀溶液灌注心脏，并等待机械解耦发生。这是在心脏停止跳动时完成的，但心电图信号仍然可以测量。
      注意：将布比他汀溶液混合到上述浓度并保持心脏与该溶液灌注，在整个实验过程中保持心脏机械活动与电活动不耦合。
    2. 在朗根多夫灌注的气泡阱中快速推注 1 mL 电压染料 DI-4-ANBDQPQ（在步骤 2.1.4 中制备）。等待5至10分钟，让染料均匀地灌注心脏。
      注意：在没有记录时关闭红灯，避免染料的光漂白。如果记录的信噪比太小（采集的信号噪声太大），请重复步骤2.1.4和2.5.2。
    3. 将相机对焦到心脏表面，打开LED 3，然后施加1.27 mW mm-2 光功率。
    4. 关闭实验室灯并开始录制。通过将获得的信号的频率与记录的ECG的频率进行比较，确保正在获取光信号。这确保了获得的光信号纯粹与心脏的电活动有关。
      注意：由于染料发出的荧光非常周，因此光学映射是在暗室中进行的。这避免了来自任何其他光源的信号干扰。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

该协议允许使用LED 1和LED 2（图1）产生的光刺激脉冲诱导完整鼠心脏中的室性心律失常，频率f ind在25 Hz和35 Hz之间，脉冲持续时间Wind在2 ms和10 ms之间。请注意，这种快速光脉冲的目的不是捕捉心律，而是使心脏活动不平衡，从而产生不稳定的电波，从而促进心律失常。用光诱导心律失常比用电刺激诱导的优点是心电图中不会引起伪影，从而可以不受限制地对采集的信号进行后分析，甚至可以评估快速起搏期间心脏的电反应，这一事实还提供了在光除颤期间观察心脏行为的可能性。这在电感应或除颤方法中是不可能的。然而，如果使用的设置不允许使用外部高功率LED，例如，由于位置限制，可以在心脏上放置一个额外的起搏电极以诱发心律失常，如其他地方3，22，24所示。

一旦诱导颤动，心律失常必须持续至少 5 秒以确保其持续，然后开始基于微 LED 的除颤尝试。由于心律失常的主要参数，如基本周期长度或主频率、振幅和形态，都在不断变化，并且由于目前无法预测哪些光除颤参数提供最佳结果，因此了解频率、脉冲宽度、 光刺激面积和终止率。因此，测试了一系列不同频率f def，micro-LED数量和脉冲持续时间Wdef的实验，并提取N = 11只小鼠的成功率，如图3所示。

可以证明，持续时间为 1 至 20 毫秒的脉冲可以以不同的成功率进行除颤（图 3）。由于LIμLED 在每个光刺激脉冲期间保持恒定，如步骤2.4.6所述，并且三个micro-LED对9个的成功率明显较低，因此所呈现的结果表明，覆盖在心脏上的区域，micro-LED的数量以及施加的总辐射通量是实现除颤的关键因素。考虑到阵列上的每个微型LED都是朗伯光源，并且它们直接定位在心脏表面上，因此到组织的近似距离为零，可以假设使用单个微型LED时心脏上照明区域的辐照度轮廓相当于AμLED = 0.059 mm²， 如25 所示，用于扁平矩形 LED。此外，尽管一些光子可能从边缘横向离开micro-LED，但这些光子对总光强度的贡献被认为非常小，以至于它们的影响可以忽略不计。为了量化阵列的照射光，作者用商用功率计测量了micro-LED阵列的辐射通量，并计算了到达心脏的光强度，如 表1所示。从 表1 中还可以读出，辐射通量随着使用的micro-LED的数量而增加，但由于前面提到的照明轮廓含义，光强度保持不变。

有趣的是，还可以观察到，在除颤频率 f def = 18 Hz 和 f def = 20 Hz 时，W def = 1 ms（图 3a）和 W def = 20 ms（图 3d）的九个 LED 的成功率相对较高。考虑到诱发心律失常的平均频率为22.55±4.03 Hz，这一事实可能表明对于ChR2鼠心脏，起搏频率越接近心律失常频率，成功率显着增加。这在数值模拟26中也显示出来。然而，这不容易一概而论，因为复杂心律失常的主发频率在不断变化。为了说明这一点，图4显示了fdef = 14 Hz的两种不同的除颤尝试。 在图4a）中心电图段的开头，根据心电图信号的形态，显示了心室颤动（VF）。当micro-LED光刺激开始时，颤动变成更有序的模式，这更可能是室性心动过速（VT）。每当微型LED阵列关闭时，原始的混沌VF波就会再次接管。因此，心律失常不终止。尽管在此示例中，VF 不能使用给定参数终止，但它确实会受到干扰，并且可以更改为更规则的模式 （VT）。图 4b第 1 段显示 24 Hz 的主频率略有增加，直到光刺激开始并且 VF 在第 2 段中变成 VT，其中主频率降至 14 Hz。此外，图4c显示了一个VT，它可以用与图4a相同的f def端接，但用不同的W def端接。首先，micro-LED光刺激改变心律失常的形态，最终从第19个脉冲开始以1：1的起搏捕获终止它。这些结果可能意味着光除颤参数，例如Wdef，必须适应心律失常随时间变化的形态变化。导致这些结果的实验是在不使用布莱比他汀的情况下进行的，因为由此产生的动作电位持续时间（APD）的变化27。因此，在这些系列中没有进行光学映射。

使用红移电位染料进行另一组光学映射实验（步骤2.1.4）。使用高速相机进行光学映射可以观察窦性心律（图5）和复杂快速性心律失常期间心脏表面的传播激发波28。由于电位染料的分数变化非常低，因此使用数学编程语言对获得的视频进行后处理。提高光信号质量的第一步是使用标准偏差为 σ = 1 的高斯平滑滤波器去除噪声，然后使用转折频率 f高 = 0.1 Hz 和 f低 = 70 Hz 的带通滤波器。f高 音的阻带消除了信号中的缓慢变化，这些变化与位于3 Hz窦频率无关，而阻带f低 消除了相机捕获的高频噪声。需要注意的是，LED 1、LED 2 和微型 LED 阵列的蓝光发射都会导致串扰和光学映射中非常高的干扰信号。此外，观察到，如步骤1.2.3所述，即使是相机前的波长λ滤光片 ，也不会滤除蓝光的影响。这可能部分是由染料本身的激发反应引起的。因此，在选择光学映射的光学器件时要非常小心。对于视频分析的手段，必须忽略所有记录蓝光的帧，因此在许多情况下，在光刺激期间无法可视化心脏，正如另一项研究29中也提到的那样。

Figure 1
图 1：电气和光学设置示意图。 （a） LED 1 和 LED 2 提供用于诱导心律失常和备用除颤的蓝色光源。LED 3 用作红移染料 DI-4-ANBDQPQ 的激发光源。红光通过二向色镜DM照射到心脏。如文中所述，以深红色显示的发射光由高速摄像机通过发射滤光片记录。为简单起见，未显示 LED 2 和 ECG 电极。（b） 记录的心电图信号的一段以红色显示。深蓝色表示来自 LED 1 和 LED 2 的光脉冲，频率为 f ind = 35 Hz，Wind = 4 ms 用于诱导纤颤。完成光刺激后，可以立即观察到心室颤动（VF）。浅蓝色（f def = 16 Hz，Wdef = 20 ms）显示的基于微LED的光刺激成功终止心律失常。请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图2：心脏准备 。 （a）打开的小鼠胸部，显示完整的心脏和周围器官。（b）将心脏浸入冰冷的Tyrode溶液中以作进一步准备。（c） 小鼠心脏正确连接到钝针上。（d）小鼠心脏悬浮在泰罗德溶液中。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图 3：实验提取的成功率。使用三个、六个和九个 LED 在不同脉冲持续时间 W def 和频率 fdef 下对 30 个基于 microLED 的光刺激脉冲的成功率 N = 11。误差线显示标准误差为平均值 S.E.M. 请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图4：通过光刺激操纵心律 。 （a）非终止性心律失常的心电图记录片段。（b） 图 a所示的心电图谱图。段（1）的功率谱密度（PSD）显示主频率为24 Hz的心律失常。可以观察到，主频率下降到14 Hz。 段（3）不成功终止并恢复到心律失常行为，主频率为24 Hz。 （c）成功除颤尝试的心电图。（d） 面板 c中显示的成功终止频谱图。片段 （1） 显示室性心动过速 （VT），主频率为 23 Hz。 段 （2） 使用所示设置进行光刺激。片段 （3） 显示成功终止，导致基频为 3.5 Hz 的正常正弦节律和由此产生的谐波。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 5
图5：整个心脏的光学映射。 显示了正常窦性心律中心脏单次跳动期间荧光强度的变化。心脏朝向相机，以便可以看到右心室和左心室（右心室，左心室）。星号表示顶部显示的动作电位的像素。 请点击此处查看此图的大图。

微型发光二极管数量 照射面积 AμLED [mm2] 辐射通量 φ [mW] 光强度 LI [毫瓦 mm-2]
3 0.178 5.9 ± 0.47 33.11 ± 2.66
6 0.356 11.91 ± 0.84 33.42 ± 2.37
9 0.535 17.85 ± 0.61 33.39 ± 1.14

表 1：测量的微型 LED 阵列辐射通量和相应的光强度。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

成功治疗快速性心律失常是心脏治疗的关键。然而，心律失常发生、延续和终止的生物物理机制尚不完全清楚。因此，心脏研究旨在优化电击疗法，以更温和地终止心律失常，从而提高患者的生活质量28，29，30，31。低能量电方法有望显着减少严重的副作用，但仍可能诱发不必要的肌肉兴奋。心脏光遗传学可以克服这一限制，不仅提供组织温和的终止技术，而且还提供一个灵活的平台来研究完整小鼠心脏和细胞培养物中涡旋样激发波的心律失常特异性靶向控制32，33。

鉴于这一动机，设计并实施了强大的光刺激设置以及协议，两者都提供了高度适应性的光学系统，可以很容易地扩展到三维全景光学映射研究34。

可以证明，心律失常可以以不同的成功率成功终止，具体取决于为光刺激选择的参数，例如心脏上的照明区域。所提出的结果表明，增加照射表面会招募到临界数量的心肌细胞，通过传导阻滞熄灭混沌活性，如22所示。在这项研究中，光除颤所需的能量为 E = 10.69 ± 0.37 mJ（使用 9 个微型 LED、30 个脉冲和脉冲宽度 Wdef = 20 ms）。事实证明，这低于之前报道的 22，24，E 22 = 228.8 mJ 和 E24 = 153.6 mJ，其中更大的区域 22 或整个心脏24 分别被照亮。然而，与35所示的方法相比，其中用10个光除颤脉冲照亮一个界限清晰的图案区域，导致E35 = 1.8 mJ，本研究中的光除颤能量明显更高。与其他三种方法相比，所提出的方案无法达到超过90%的成功率。尽管光除颤能量较高，但性能降低的一个可能原因可能是没有考虑潜在心律失常的复杂性。关于35中提出的结果，其中通过照亮心脏上的一小块区域并同时测量心律失常的时空动力学来实现高终止率，所提出的方法当然可以通过考虑反馈控制来进一步改进，反馈控制根据心脏的当前状态以不同的微型LED照明模式做出响应。 此外，还表明，尽管目前的方法不能总是终止心律失常，但在光刺激期间，内在复合动力学会受到干扰，从而导致更有序的时间状态。如36所示，在处理单形性（更有序）和多形性（不太有序）心律失常时，终止率显着不同。因此，实现更好的除颤率的合乎逻辑的步骤可能是在VF发作期间影响心脏动力学，将心律失常转变为不太复杂的模式，并以另一组脉冲终止，以这种方式建立两步光刺激方法。

关于灌注方案，最关键的步骤是在正确提取和准备心脏以及正确调整光学映射光学元件中。涉及光学映射严格要求正确选择染料光谱、适当的激发光源和为相机29选择良好的滤光片。否则，记录的光信号可能太嘈杂，并且还可能包含光刺激与染料激发的串扰。因此，后续分析需要使用多个分析滤波器对信号进行后处理，并且图像平滑通常会导致信号恶化。

该协议中的另一个关键步骤是正确和精确地放置micro-LED阵列。由于micro-LED阵列和驱动器之间的互连引线非常细且灵活，因此有时很难确保每个实验的阵列位于心脏表面上大致相同的位置。为了便于定位并固定micro-LED阵列的采集位置，设计了一个支架并以3D形式打印，允许将阵列连接到显微操纵器上。这样可以更好地控制 Tyrode 解决方案中数组的移动。根据为微型LED阵列的互连引线选择的材料，可能不需要使用支架。

此外，该方案的另一个关键步骤是添加促心律失常药物，例如Pinacidil37。由于众所周知，几种化合物会改变心脏的生理反应，因此在分析和解释结果时应考虑这一点。就光学映射而言，所提出的协议使用布比他汀作为机械解耦器。这样做的好处是在录制过程中消除运动伪影，但也会延长APD27的时间。为了克服这个缺点，可以考虑在记录过程中分析运动跟踪的方法38，39.这样，心脏的正常生理状态就会得到保留，可以获得高质量的信号。

尽管证明所提出的方案可用于多点光除颤，但它仍然存在一些局限性。已经发现，在某些情况下，基于微LED的光刺激不能终止纤颤，而只能受到干扰，从而导致频率变化。一种假设是，心脏上蜿蜒的波浪只是从左心室移位，在心脏的其他部位再生。与诸如全局照明24等其他方法相比，由于心脏的覆盖范围较小，本方法提供了较低的成功率。不过，我们相信，通过适当的基于硬件的螺旋活动识别方法，提高终止成功率是可行的。

总之，所提出的光刺激系统为心律失常的多种心脏复律方法和操作研究建立了强大的实验工具。在该系统中学到的知识将用于研究和评估临床相关大型动物模型中新的潜在（光）除颤方案。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有声明任何利益冲突。

Acknowledgments

作者要感谢Marion Kunze和Tina Althaus在实验过程中的出色技术支持。导致结果的研究已获得欧洲共同体第七框架方案FP7/2007-2013的资助，资助协议号为HEALTH-F2-2009-241526。德国心血管研究中心、DZHK e.V.（MD28项目）、合作伙伴网站哥廷根、德国研究基金会CRC 1002（项目C03）和马克斯·普朗克学会也提供了支持。这项工作得到了德国研究基金会（DFG，批准号EXC 1086）资助的卓越集群BrainLinks-BrainTools的部分支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical Components
Blebbistatin TargetMol T6038 10 mM stock solution
BSA/Albumin Sigma-Aldrich A4919
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016 CaCl2
Carbogen Westfalen 50 l bottle
DI-4-ANBDQPQ AAT Bioquest 21499 Dye for Optical Mapping
Glucose Sigma-Aldrich D9434 C6H12O6
Heparin LEO Pharma Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription
Hydrochlorid Acid Merck 1.09057.1000 HCl, 1 M stock solution
Isoflurane CP Pharma 1 ml/ml, available only on prescription
Magnesium Chloride Merck 8.14733.0500 MgCl2
Monopotassium Phosphate Sigma-Aldrich 30407 KH2PO4
Pinacidil monohydrate Sigma-Aldrich P154-500mg 10 mM stock solution
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 KCl
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 NaHCO3
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 NaCl
Sodium Hydroxide Merck 1.09137.1000 NaOH, 1 M stock solution
Electrical Setup
Biopac MP150 Biopac Systems MP150WSW data acquisition and analysis system
Custom-built ECG, alternative ECG100C Biopac Systems ECG100C Electrocardiogram Amplifier
Custom-built water bath heater using heating cable RMS Heating System HK-5,0-12 Heating cable 120W
Hexagonal water bath
LED Driver Power supply Thorlabs KPS101 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube.
LEDD1B LED Driver Thorlabs LEDD1B T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current
MAP, ECG Electrode Hugo Sachs Elektronik BS4 73-0200 Mini-ECG Electrode for isoalted hearts
micro-LED Driver e.g. AFG Agilent Instruments A-2230 Arbitrary function generator (AFG)
Signal Generator Agilent Instruments A-2230 AFG
micro-LED Array Components
Epoxid glue Epoxy Technology EPO-TEK 353ND Two component epoxy
Fluoropolymer  Asahi Glass Co. Ltd. Cytop 809M Fluoropolymer with high transparency
Image reversal photoresist Merck KGaA AZ 5214E Image Reversal Resist for High Resolution
LED chip  Cree Inc. C460TR2227-S2100 Blue micro-LED
Photoresist Merck KGaA AZ 9260 Thick Positive Photoresists
Polyimide UBE Industries Ltd. U-Varnish S Polyimide Solution
Silicone NuSil Technology LLC MED-6215 Low viscosity silicone elastomer
Solvent free adhesive John P. Kummer GmbH Epo-Tek 301-2 Epoxy resin with low viscosity
Optical Mapping
Blue Filter Chroma Technology Corporation ET470/40x Blue excitation filter
Camera Photometrics Cascade 128+ High performance EMCCD Camera
Camera Objective Navitar DO-5095 Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras
Dichroic Mirror Semrock FF685-Di02-25x36 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter
Emmision Filter Semrock FF01-775/140-25 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter
Heatsink Advanced Thermal Solutions ATSEU-077A-C3-R0 Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware
LED 1 and LED 2 LED Engin Osram LZ4-00B208 High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3 Thorlabs M625L3 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA
Lenses LED Engin Osram LLNF-2T06-H LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Photodiode for power meter Thorlabs S120VC Standard Photodiode Power Sensor
Power Meter Thorlabs PM100D Compact Power and Energy Meter
Red Filter Semrock FF02-628/40-25 BrightLine® single-band bandpass filter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
  2. Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation. Circulation. 120 (6), 467-476 (2009).
  3. Luther, S., et al. Low-energy control of electrical turbulence in the heart. Nature. 475, 235-239 (2011).
  4. Pumir, A., et al. Wave emission from heterogeneities opens a way to controlling chaos in the heart. Physical Review Letters. 99, 208101 (2007).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  6. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  7. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  8. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7, 897-900 (2010).
  9. Natasha, G., et al. et al.Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch. New Biotechnology. 30 (5), 461-474 (2013).
  10. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  11. Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 28 (46), 11862-11870 (2008).
  12. Ahmad, A., Ashraf, S., Komai, S. Optogenetics applications for treating spinal cord injury. Asian Spine Journal. 9 (2), 299-305 (2015).
  13. Dieter, A., Keppeler, D., Moser, T. Towards the optical cochlear implant: Optogenetic approaches for hearing restoration. EMBO Molecular Medicine. 12 (4), e11618 (2020).
  14. Keppeler, D., et al. Multichannel optogenetic stimulation of the auditory pathway using microfabricated LED cochlear implants in rodents. Science Translational Medicine. 12 (553), eabb8086 (2020).
  15. Verhoefen, M. K., Bamann, C., Blöcher, R., Förster, U., Bamberg, E. The photocycle of channelrhodopsin-2: ultrafast reaction dynamics and subsequent reaction steps. ChemPhysChem. 11 (14), 3113-3122 (2010).
  16. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized tool for optogenetics based on an LED and an optical fiber interfaced by a silicon housing. 36th Annual Internation Conference IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Chicago, IL, , 5252-5255 (2014).
  17. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized 3 x 3 optical fiber array for optogenetics with integrated 460 nm light sources and flexible electrical interconnection. 28th IEEE Proceedigns. MEMS, Estoril, , 162-165 (2015).
  18. Diaz-Maue, L., Schwaerzle, M., Ruther, P., Luther, S., Richter, C. Follow the light - From low-energy defibrillation to multi-site photostimulation. 40thAnnual International Conference of IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Honolulu, HI, , 4832-4835 (2018).
  19. Zgierski-Johnston, C., et al. Cardiac pacing using transmural multi-LED probes in channelrhodopsin-expressing mouse hearts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , 51-61 (2020).
  20. mouser.de, LED Engin, [Online]. , Available: https://www.mouser.de/datasheet/2/228/5412893-LED_2520Engin_Datasheet_LuxiGen_LZ4-00B208- 1531969.pdf (2020).
  21. thorlabs.com, thorlabs, [Online]. , Available: https://www.thorlabs.com/_sd.cfm?fileName=25135-S01.pdf&partNumber=M625L3 (2020).
  22. Bruegmann, T., et al. Optogenetic defibrillation terminates ventricular arrhythmia in mouse hearts and human simulations. Journal of Clinical Investigation. 126 (10), 3894-3904 (2016).
  23. Richter, C., Christoph, J., Lehnart, S. E., Luther, S. Optogenetic light crafting tools for the control of cardiac arrhythmias. Methods in Molecular Biology. 1408, 293-302 (2016).
  24. Quiñonez Uribe, R. A., Luther, S., Diaz-Maue, L., Richter, C. Energy-reduced arrhythmia termination using global photostimulation in optogenetic murine hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1651), (2018).
  25. Moreno, I. LED irradiance pattern at short distances. Applied Optics. 59 (1), 190-195 (2020).
  26. Predicting unpinning success rates for a pinned spiral in an excitable medium. Behrend, A., Bittihn, P., Luther, S. Computing in Cardiology, Belfast, , 345-348 (2010).
  27. Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11 (464), (2020).
  28. Christoph, J., et al. Electromechanical vortex filaments during cardiac fibrillation. Nature. 555, 667-672 (2018).
  29. O'Shea, C. Cardiac optogenetics and optical mapping - Overcoming spectral congestion in all-optical cardiac electrophysiology. Frontiers in Physiology. 10 (182), (2019).
  30. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), e006692 (2018).
  31. Trayanova, N., Doshi, A. N., Prakosa, A. How personalized heart modeling can help treatment of lethal arrhythmias: A focus on ventricular tachycardia ablation strategies in post-infarction patients. Wiley Interdisciplinary Reviews in System Biology and Medicine. 12 (3), 1477 (2020).
  32. Bingen, B., et al. Light-induced termination of spiral wave arrhythmias by optogenetic engineering of atrial cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 104 (1), 194-205 (2014).
  33. Burton, R. A. B., et al. Optical control of excitation waves in cardiac tissue. Nature Photonics. 9 (12), 813-816 (2015).
  34. Dura, M., Schröder-Schetelig, J., Luther, S., Lehnart, S. E. Toward panoramic in situ mapping of action potential propagation in transgenic hearts to investigate initiation and therapeutic control of arrhythmias. Frontiers in Physiology. 5, 337 (2014).
  35. Crocini, C., et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Science Reports. 6 (35628), (2016).
  36. Nyns, E. C. A., et al. Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management. European Heart Journal. 38 (27), 2132-2136 (2017).
  37. Wilde, A. A. K+atp channel opening and arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 24 (4), 35-40 (1994).
  38. Christoph, J., Luther, S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1483), (2018).
  39. Christoph, J., Schröder-Schetelig, J., Luther, S. Electromechanical optical mapping. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130(B), 150-169 (2017).

Tags

医学，第 174 期，心脏光遗传学，光学映射，LED，DI-4-ANBDQPQ，布比他汀，通道视紫红质-2，ChR2
通过在小鼠心脏中应用光遗传学多位点光刺激进行高级心律管理
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diaz-Maue, L., Steinebach, J.,… More

Diaz-Maue, L., Steinebach, J., Schwaerzle, M., Luther, S., Ruther, P., Richter, C. Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts. J. Vis. Exp. (174), e62335, doi:10.3791/62335 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter