Summary
우리는 ovo electroporation 및 Tol2 transposon 시스템을 사용하여 병아리 배아에 인공 마이크로 RNA 서열을 도입하고 게놈 통합하는 새로운 기능 상실 접근 방식을 개발했습니다. 이 기술은 개발 중 유전자 기능 연구를 위한 강력하고 안정적인 유전자 녹다운 방법론을 제공합니다.
Abstract
병아리 망막은 오랫동안 발달 신경 생물학에서 중요한 모델 시스템이었으며 큰 크기, 빠른 발달, 시각화 및 실험 조작을 위한 접근성 등의 장점이 있습니다. 그러나 주요 기술적 한계는 유전자 기능 분석을 위한 강력한 기능 상실 접근법이 없다는 것이었습니다. 이 프로토콜은 Tol2 트랜스포존 시스템을 사용하여 인공 microRNA(miRNA)의 형질전환 발현을 포함하는 발달 중인 병아리 망막에서 유전자 침묵 방법론을 설명합니다. 이 접근법에서, EmGFP(에메랄드 그린 형광 단백질) 마커에 대한 발현 카세트와 표적 유전자에 대한 인공 pre-miRNA 서열을 포함하는 Tol2 트랜스포존 플라스미드는 난소 전기천공에 의해 Tol2 트랜스포사제 발현 구조체와 함께 배아 병아리 망막에 도입됩니다. 형질감염된 망막 세포에서 전이효소는 트랜스포존 벡터에서 발현 카세트의 절제와 숙주 염색체로의 통합을 촉매하여 miRNA 및 EmGFP 단백질의 안정적인 발현을 유도합니다. 이전 연구에서 우리는 이 기술을 사용하여 신경 발달에서 여러 기능을 발휘하는 당단백질인 Nel의 발현이 발달 중인 병아리 망막에서 크게 억제될 수 있음을 입증했습니다. 우리의 결과는 이 방법론이 유전자 발현의 안정적이고 강력한 억제를 유도하여 망막 발달 연구를 위한 효율적인 기능 상실 접근법을 제공한다는 것을 나타냅니다.
Introduction
척추동물 망막은 신경 발달을 연구하기 위한 중요한 모델 시스템입니다. 말초 위치에도 불구하고 망막은 해부학적으로나 발달적으로 중추 신경계의 확장이며, 망막 신경절 세포의 축삭으로 구성된 시신경은 중추 신경계 내의 관을 나타냅니다. 병아리 망막은 신경 발달의 분자 메커니즘을 연구하는 모델 시스템으로서 상당한 이점을 가지고 있습니다. 그것은 인간 망막과 구조적 및 기능적 유사성을 가지고 있습니다. 시각화 및 실험적 조작을 위해 접근성이 높습니다. 신경 발달 중 세포 증식 및 분화, 형태 형성 및 축삭 유도의 분자 메커니즘은 닭 망막을 사용하여 광범위하게 연구되었습니다.
난소에서 전기천공법은 발달 중인 병아리 배아의 세포에 이소성 유전자를 도입하기 위해 지난 20년 동안 성공적으로 사용되었습니다. 이 기술은 발달 중인 세포의 표지, 세포 운명 추적, 세포 이동 및 축삭관 추적, 유전자 기능의 생체 내 분석을 위한 이소성 유전자 발현을 가능하게 합니다. 병아리 배아에서 효율적인 이소성 유전자 발현을 위한 난소 전기천공법의 조건은 잘 확립되어 있다 1,2,3.
이러한 장점에도 불구하고 유전자 기능 연구를 위한 안정적인 기능 상실 기술의 부족은 병아리 배아의 주요 기술적 한계였습니다. 작은 간섭 RNA(siRNA)4 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)5 에 대한 발현 벡터로 전기천공된 병아리 배아는 표적 유전자의 녹다운을 나타내는 반면, 세포가 도입된 RNA 또는 DNA를 잃으면 효과가 사라지기 때문에 이러한 접근 방식에서 유전자 억제는 일시적입니다. 보다 안정적인 유전자 억제는 RCAS(Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus(ASLV) long terminal repeat) with a Splice acceptor) 레트로바이러스 시스템에 의해 siRNA를 병아리 배아에 전달함으로써 달성될 수 있다6. 바이러스 벡터는 숙주 게놈에 통합되고 이소성 유전자는 안정적으로 발현됩니다. 그러나 레트로바이러스는 세포 주기의 유사분열(M) 단계 동안에만 분열하는 세포의 게놈에 통합될 수 있으며, 이는 이러한 기능 상실 접근법을 적용할 수 있는 발달 단계 및/또는 세포 유형에 제한을 가할 수 있습니다. 또한, RCAS에 의한 이식유전자의 발현은 ovo전기천공법(ovo)전기천공법( ovo electroporation)에 의해 유도된 것보다 느리고 덜 견고하게 나타난다7.
트랜스포존은 게놈의 한 위치에서 다른 위치로 이동하는 유전적 요소입니다. Tol2 요소는 hAT 전치 가능한 요소 패밀리의 구성원이며, Tol2 요소8의 트랜스포존 반응을 촉매하는 트랜스포사제를 코딩하는 내부 유전자를 함유한다. Tol2 요소(각각 200 bp 및 150 bp)의 좌측 및 우측 말단의 서열에 의해 측면 배치된 유전자 발현 카세트를 운반하는 플라스미드 벡터가 Tol2 전이효소 발현 구조체를 갖는 척추동물 세포 내로 도입될 때, 발현 카세트는 플라스미드로부터 절제되어 이소성 유전자의 안정적인 발현을 지원하는 숙주 게놈 내로 통합된다(도 1). Tol2 전치 요소는 제브라피쉬9,10, 개구리 11, 병아리12 및 생쥐 13을 포함한 다양한 척추동물 종에서 유전자 전이를 매우 효율적으로 유도할 수 있는 것으로 나타났으며, 따라서 형질전환 및 삽입 돌연변이 유발에 유용한 방법입니다. Tol2 트랜스포존 시스템은 긴 이중 가닥 RNA14에서 처리되는 siRNA의 게놈 통합에 의한 표적 유전자의 조건부 녹다운에 성공적으로 사용되었습니다.
이 프로토콜은 Tol2 트랜스포존 시스템15,16에 의한 인공 마이크로RNA(miRNA)의 도입을 포함하는 병아리 배아에서의 기능 상실 접근법을 설명한다. 이 접근법에서는 표적 유전자에 대한 EmGFP(에메랄드 그린 형광 단백질) 마커 및 인공 miRNA에 대한 발현 카세트를 Tol2 트랜스포존 벡터에 클로닝합니다. 이어서, Tol2 트랜스포존 구축물은 난소 전기천공에 의해 Tol2 트랜스포사제 발현 구축물과 함께 배아 병아리 망막 내로 도입된다. 형질감염된 망막 세포에서 전이효소는 트랜스포존 벡터에서 발현 카세트의 절제와 숙주 염색체로의 통합을 촉매하여 miRNA 및 EmGFP 단백질의 안정적인 발현을 유도합니다. 우리의 이전 연구에서, 우리는 발달중인 병아리 망막에서 신경계에서 주로 발현되는 세포 외 당 단백질 인 Nel의 발현을 성공적으로 무너 뜨 렸습니다 (대표 결과 참조). 우리의 결과는 이 기술에 의해 ovo에서 안정적이고 효율적인 유전자 억제가 달성될 수 있음을 나타냅니다.
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Protocol
1. miRNA 발현 벡터의 구축
참고: miRNA 발현 벡터를 구성하는 절차(단계 1.1-1.3, 1.5-1.6.)는 앞서 설명한 바와 같이 miRNA 발현 키트인 EmGFP를 사용한 Block-iT Pol II miR RNA 발현 키트에 최적화되어 있습니다(15,16). 이 키트는 miRNA 발현(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), 대조군 벡터(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-음성 대조군 플라스미드), 보조 시약 및 miRNA 발현 벡터를 생산하기 위한 지침을 제공하도록 설계된 발현 벡터를 제공합니다(재료 표 참조)17.
- 표적 유전자에 대해 pre-miRNA를 암호화하는 단일 가닥 DNA 올리고 설계: 온라인 도구인 RNAi Designer(재료 표 참조)를 사용하여 단일 가닥 DNA 올리고("상단 가닥" 올리고(표적 pre-miRNA) 및 "하단 가닥" 올리고(상단 가닥 올리고의 보완))를 설계합니다. 단일 가닥 올리고의 필수 기능(그림 2A)과 표적 서열의 예(그림 2B)에 대해서는 그림 2를 참조하십시오.
참고: 주어진 표적 유전자에 대해 5-10개의 pre-miRNA 서열을 생성하고 시험관 내에서 녹다운 활성을 스크리닝하는 것이 좋습니다(단계 1.4). - 상단 및 하단 가닥 올리고를 어닐링하여 이중 가닥 올리고를 생성합니다.
- 멸균된 0.5mL 미세원심분리기 튜브에 다음 어닐링 반응물(표 1)을 설정합니다.
- 반응 혼합물을 95°C에서 4분 동안 인큐베이션한다. 상부- 및 하부-가닥 올리고를 어닐링하여 반응 혼합물을 5-10분 동안 실온(RT)으로 냉각시킴으로써 이중 가닥 올리고를 생성한다. 샘플을 짧게(~5초) 원심분리합니다.
참고: 어닐링된 올리고는 분해 없이 -20°C에서 최소 1년 동안 보관할 수 있습니다.
- 이중가닥 올리고를 miRNA 발현 벡터 내로 클로닝(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (Provided in the miRNA expression kit)): 제조사 매뉴얼에 따라 개별적인 이중가닥 올리고를 선형화된 miRNA 발현 벡터 내로 클로닝한다17.
- 넉다운 효과 평가
참고: 개별 miRNA 염기서열은 ovo에 적용하기 전에 시험관 내에서 유전자 억제 효율에 대해 테스트하는 것이 좋습니다. 녹다운 효율은 miRNA 발현 플라스미드를 표적 유전자를 발현하는 세포주에 형질감염시켜 테스트할 수 있습니다. 별법으로, 개별적인 miRNA 발현 플라스미드는 표적 유전자에 대한 발현 구축물을 갖는 세포주 내로 공동-형질감염될 수 있다. 본래 상태에서 막-고정되지 않은 단백질을 코딩하는 표적 유전자 (예를 들어, 가용성 단백질)의 경우, 알칼리성 포스파타제 (AP) 융합 단백질을 표적 단백질의 발현을 모니터링하기 위해 사용할 수 있다. 표적 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 AP-태그 벡터(APtag-1-APtag-5; 재료 표 참조)에서 인간 태반 알칼리성 포스파타제에 프레임으로 융합되어 세포 내로 도입될 수 있다(18). 배양 세포(예를 들어, HEK293T 세포)에서 발현될 때, AP-태깅된 표적 단백질은 배양 배지 내로 높은 수준으로 분비되고, 따라서 miRNA-형질감염된 세포의 배양 배지에서 AP 활성의 감소를 측정함으로써 miRNA 서열의 녹다운 효과를 평가할 수 있다(하위단계 1.4.1-1.4.4).- 하룻밤 동안 24웰 플레이트(8 x 104 cells/well)에서 HEK293T 세포를 배양합니다. 개별 miRNA 발현 구축물을 AP-태그된 표적 단백질의 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염시킵니다. pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-음성 대조군 플라스미드(miRNA 발현 키트에 제공됨)를 대조군으로 사용합니다. (AP 태그가 부착된 표적 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 사용하는 경우 개별 miRNA 발현 구조체로만 세포를 transfection합니다.)
참고: 기존의 리포펙션 시약( 재료 표 참조)이 형질감염에 사용됩니다. - 형질주입 후 48-72시간 동안 컨디셔닝된 배지를 수집하고, 내인성 AP 활성을 65°C 수조에서 5분 동안 열 불활성화시킨다. 데스크탑 미세 원심분리기에서 5분 동안 최대 속도로 회전하는 파편.
- 상청액을 10mM HEPES, pH 7.0으로 완충하고 0.45μm 필터에 통과시킵니다.
- 100 μL(플레이트 리더에서 측정용) 또는 500 μL(분광광도계에서)의 상층액을 취하고 동일한 양의 2x AP 기질 버퍼를 추가합니다(표 2). 플레이트 리더 또는 분광 광도계에서 OD405 를 측정하여 AP 활동을 확인하십시오.
참고: 컨디셔닝 배지의 AP 활성이 너무 높아 정확한 측정이 불가능한 경우 HBAH 완충액(행크스 균형 염 용액(HBSS), 0.5mg/mL 소 혈청 알부민, 20mM HEPES(pH 7.0)) 또는 운반체 단백질이 포함된 다른 완충액. 인산염 함유 완충액(예: PBS)은 무기 인산염이 AP의 경쟁적 억제제로 작용하므로 사용하지 마십시오.
- 하룻밤 동안 24웰 플레이트(8 x 104 cells/well)에서 HEK293T 세포를 배양합니다. 개별 miRNA 발현 구축물을 AP-태그된 표적 단백질의 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염시킵니다. pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-음성 대조군 플라스미드(miRNA 발현 키트에 제공됨)를 대조군으로 사용합니다. (AP 태그가 부착된 표적 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 사용하는 경우 개별 miRNA 발현 구조체로만 세포를 transfection합니다.)
- miRNA 염기서열의 연쇄
참고: 녹다운 효과는 동일한 표적 유전자에 대해 서로 다른 miRNA를 연결하거나 동일한 miRNA를 반복하여 향상시킬 수 있습니다. miRNA 발현 벡터는 다수의 pre-miRNA 서열 및 이들의 코-시스트로닉 발현(co-cistronic expression)의 연쇄를 지지한다17.- 제조사의 지시에 따라 시험관 내 분석(단계 1.4)에서 가장 높은 녹다운 활성을 보이는 두 개의 상이한 pre-miRNA 서열(동일한 표적 유전자에 대해)을 사슬로 묶는다17.
- 단계 1.4에 기재된 바와 같이 시험관내 검정을 사용하여 사슬화된 구축물의 유전자 억제 효율을 평가한다. 3개 이상의 pre-miRNA 염기서열이 유사하게 높은 녹다운 활성을 나타내는 경우, 두 염기서열의 상이한 조합을 테스트하고 가장 높은 녹다운 활성을 나타내는 조합을 사용하십시오( 대표 결과 참조).
- EmGFP-pre-miRNA 발현 카세트를 Tol2 트랜스포존 벡터로 전달
참고: EmGFP cDNA와 2개의 pre-miRNA 서열을 포함하는 발현 카세트는 Tol2 트랜스포존 벡터(pT2K-CAGGS 벡터, 재료 표 참조)로 전달됩니다. 이를 위해, 발현 카세트(CMV 프로모터의 3' 말단부터 miRNA 발현 벡터의 miRNA 역염기서열 분석 프라이머 부위까지 포함)를 인공 제한효소 부위를 갖는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하고, PCR 산물을 Tol2 트랜스포존 벡터에 클로닝한다. Tol2 트랜스포존 벡터는 삽입된 발현 카세트의 발현을 구동하는 유비쿼터스 CAGGS 프로모터를 포함합니다. CAGGS 프로모터와 발현 카세트는 Tol2 서열 옆에 있습니다(그림 1).- EmGFP-pre-miRNA 발현 카세트의 PCR 증폭: 표 3에 설명된 반응 설정 및 열순환 조건을 따릅니다.
- 겔 정제된 PCR 산물(c. 1.3 kb)을 제한 효소 분해 Tol2 트랜스포존 벡터에 합자합니다. 플라스미드를 적격한 대장균 세포에 전기천사하고( 재료 표 참조) 재조합체(pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA 구성물)를 선택합니다.
- 통상적인 maxiprep 키트를 사용하여 플라스미드를 준비한다( 재료 표 참조). 플라스미드의 구조와 서열을 각각 PCR에 사용된 프라이머를 이용하여 제한효소 맵핑을 통해 확인하였다.
2. 계란 저장 및 배양
- 수정된 화이트 레그혼(Gallus gallus) 알은 지역 농장이나 상업 공급업체에서 구입하십시오.
참고: 계란은 생존력의 현저한 손실이나 배양 중 발달 지연 없이 배양 전 최대 1주일 동안 12-16°C 또는 4°C에서 보관할 수 있습니다. - 알에 배양 시작 날짜를 표시하고 알의 윗면(배아가 위치할 위치)을 표시하십시오. 배아가 햄버거와 해밀턴(HH) 단계 10(33-38시간)-11(40-45시간)19에 도달할 때까지 38°C에서 수평 위치에서 수정란을 배양합니다.
3. ovo electroporation에서
- oovo electroporation에서 준비
- 0.25% 패스트 그린 용액의 제조: 25mg의 패스트 그린 FCF를 10mL의 PBS에 녹입니다. 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 여과합니다. 솔루션은 RT에 저장할 수 있습니다.
- DNA 칵테일: 개별 pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA 플라스미드(하위 단계 1.6.3)와 Tol2 트랜스포이즈효소 발현 플라스미드(pCAGGS-T2TP 벡터, 재료 표 참조)(각각 5μg/μL)를 2:1의 비율로 혼합하여 주입 용액을 준비합니다. 주입 된 영역을 시각화하기 위해 0.25 % 빠른 녹색 용액의 1/10 부피를 추가하십시오.
참고: 최적의 DNA 농도는 구축물에 따라 달라질 수 있습니다. - 미세주입 장치 설정(그림 3A,B): 미세주입 장치는 다음으로 구성됩니다(재료 표 참조): 해밀턴 주사기, 18G 바늘(바늘 길이 = 2"), PVC(폴리염화비닐) 튜브(길이 2cm), 마이크로피펫 바늘(마이크로피펫 풀러로 오메가 도트 섬유(1mm OD X 0.75mm ID)가 있는 모세관을 당겨 만들 수 있음).
- 해밀턴 주사기에 중광유를 채웁니다. 주사기에 18G 바늘을 부착하고 주사기 플런저를 눌러 바늘 내부 공간을 기름으로 채웁니다.
- 바늘 끝에 2cm 길이의 PVC 튜브를 부착하고 튜브에 오일을 채웁니다.
- 당겨진 마이크로피펫 바늘을 튜브에 부착합니다. 미세 집게로 마이크로 피펫 바늘의 끝을 직경 10-20 μm로 떼어 내고 작은 구멍을 만듭니다. 바늘 전체에 기름을 채 웁니다.
알림: DNA 용액의 흐름을 방해할 수 있으므로 시스템에 기포가 가두지 않도록 주의해야 합니다.
- 착색 된 DNA 칵테일 (하위 단계 3.1.2)의 5 μL를 멸균 된 페트리 접시에 넣는다. 해부 현미경 아래에서 마이크로피펫 바늘의 끝을 멸균 페트리 접시의 DNA 용액에 넣고 용액을 천천히 바늘에 넣습니다.
- 압력이 바늘 내부와 외부가 평형을 이룰 때까지 기다렸다가 (공기가 바늘로 들어가는 것을 방지하기 위해) 바늘 끝을 DNA 용액에서 꺼냅니다. 주사 때까지 바늘 끝을 작은 비커의 멸균 PBS에 담그십시오.
- 전기 천공 장치 설정(그림 3A,C):
- 마이크로 매니퓰레이터에 전극 홀더가있는 한 쌍의 백금 전극을 설정하십시오. 전극 끝 사이의 간격을 2mm로 조정합니다(그림 3C,E).
- 전극을 케이블로 구형파 펄스 발생기에 연결합니다( 재료 표 참조).
- DNA 용액의 미세주입(그림 3D)
- 인큐베이터에서 닭고기 달걀을 꺼내 70 % 에탄올에 담근 티슈 페이퍼로 달걀 표면을 닦으십시오.
- 18G 바늘을 10mL 주사기에 연결합니다. 노른자가 손상되지 않도록 아래쪽(45°)으로 기울어진 계란의 뭉툭한 끝을 통해 바늘을 삽입합니다.
- 계란에서 알부민 2-3mL를 빼냅니다. 스카치 테이프로 구멍을 막습니다. 배아와 vitelline 막이 빛으로 난자를 "candling"하여 껍질에서 분리되었는지 확인하십시오.
- 가위와 집게를 사용하여 달걀 상단에서 달걀 껍질 조각(직경 2-3cm 원)을 제거하여 배아를 노출시킵니다. 전기천공 중 배아가 마르는 것을 방지하기 위해 한 번에 5개 이상의 알을 낳지 마십시오.
알림: 달걀을 깨지 않고 창문을 열기 어려운 경우 달걀 껍질을 제거하기 전에 달걀 상단 전체를 셀로테이프나 스카치 테이프로 덮을 수 있습니다. - 바늘 끝을 근위부에서 시전체에 45° 각도로 삽입하고 파란색 용액이 내강을 채울 때까지 플런저를 천천히 누르거나(또는 두드려) DNA 칵테일을 주입합니다(그림 3D).
참고: 또는 압력 미세주입 시스템( 재료 표 참조)을 DNA 용액 주입에 사용할 수 있습니다. - 바늘을 빼고 끝을 PBS에 다시 넣습니다.
- 전기천공법(그림 3E)
- electroporator의 펄스 파라미터를 다음과 같이 설정합니다: 전압: 15 V, 펄스 길이: 50 밀리초, 펄스 간격: 950 밀리초, 펄스 수: 5
- 배아 위의 vitelline 막에 HBSS 몇 방울을 추가합니다. 배아의 전후방 축에 수직 인 미세 조작기를 사용하여 전극을 HBSS로 내립니다.
참고: 또는 알부민은 효율적인 전기천공을 가능하게 하는 우수한 전기 전도체이기 때문에 HBSS를 추가하지 않고 이 절차를 수행할 수 있습니다. - 전극을 시신경의 양쪽(전방(비강) 측면 및 후방(측두))에 배치합니다(그림 3E). 전극이 배아나 혈관에 닿지 않도록 하십시오. 펄스 전기장을 적용합니다.
- 전극을 제거하고 알부민이 축적되지 않도록 물에 적신 멸균 면봉으로 전극을 부드럽게 청소하십시오.
- 스카치 테이프로 창을 밀봉하고 원하는 발달 단계까지 배아를 다시 배양하십시오.
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Representative Results
Nel에 대한 인공 miRNA의 발현을 위한 Tol2 트랜스포존 구조의 구성
넬(Nénural Epidermal growth factor(EGF)-Like; Nell2라고도 함)은 세포외 당단백질이다. 그것은 thrombospondin-1과 구조적 유사성을 가지고 있으며 주로 신경계에서 발현됩니다20,21. 우리는 이전에 Nel이 망막 신경절 세포15의 분화와 생존을 조절하고 망막 축삭22,23,24에 대한 억제 유도 신호로 작용한다는 것을 입증했습니다. 발달중인 병아리 망막에서, Nel 발현은 HH15 (배아 일 (E) 2.5)의 추정 색소 상피에서 검출된다. HH20 (E3.5)에서, Nel 발현은 또한 새로 분화된 망막 신경절 세포에서 관찰된다. 색소 상피 및 망막 신경절 세포에서 Nel의 강력한 발현은 적어도 E1815까지 계속됩니다.
망막 신경절 세포의 발달에서 Nel의 기능을 조사하기 위해, 난소 전기천공(ovo electroporation) 및 Tol2 트랜스포존 시스템(transposon system)을 사용하여 발달 중인 망막에 인공 miRNA를 도입함으로써 Nel 유전자의 발현을 녹다운시켰다15,16. 먼저, 온라인 RNAi 설계 도구를 사용하여 닭 Nel cDNA(GenBank 수탁 번호: NM_001030740.1)의 단백질 코딩 영역에서 10개의 잠재적 표적 서열에 대해 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 쌍을 설계했습니다(재료 표 참조). 올리고뉴클레오티드 쌍을 어닐링하고 miRNA 발현 벡터에 개별적으로 클로닝했습니다. 이어서, 개별 구축물을 Nel-AP를 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포로 형질감염시키고, 배양 배지에서 AP 활성을 측정하여 이들의 녹다운 효율을 평가하였다. pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA 음성 대조군 플라스미드를 대조군으로 사용했습니다(그림 4A).
가장 높은 knock down 효과를 보인 3개의 Nel pre-miRNA 염기서열을 선택하고(각각 chicken Nel cDNA의 뉴클레오티드 482-502, 910-930 및 2461-2481에 대해), 2개의 pre-miRNA 염기서열을 제조사의 지침에 따라 miRNA 발현 벡터(pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x Nel pre-miRNA)에 탠덤 클로닝하였다17. 2개의 pre-miRNA와 EmGFP를 암호화하는 발현 카세트는 양쪽 말단에 인공 EcoRI 부위(5′-GGGAATTCTCTGGCTAACTAGAGAAC-3′ 및 5′-CCGAATTCCCTCTAGATCAACCACT-3′)를 사용하여 PCR에 의해 증폭되고 pT2K-CAGGS 벡터(pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA)에 클로닝되었습니다. 발현 카세트의 서열은 PCR에 사용된 프라이머를 이용하여 확인하였다. pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA constructs를 Tol2 transposase 발현 벡터(pCAGGS-T2TP)와 개별적으로 Nel-AP를 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포에 co-transfection시키고, 배양액에서 AP 활성을 측정하여 Nel-AP 발현에 대한 억제 효과를 평가하였다. 도 4B에 나타낸 바와 같이, 녹다운 효율은 2개의 miRNA 서열의 연쇄화에 의해 상당히 향상되었다. Nel-AP 발현의 강력한 억제 (90% 초과)는 형질감염 후 적어도 13일까지 관찰되었다 (도 4B).
발달 중인 병아리 망막에서 Nel 발현의 안정적인 억제
pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA 구조체(닭 Nel cDNA의 뉴클레오티드 482-502 및 2461-2481에 대한 표적 서열 포함)를 트랜스포사제 발현 벡터(pCAGGS-T2TP)와 함께 HH9-11에서 난소 전기천공에 의해 병아리 망막의 측두엽 또는 비강 측으로 공동 형질감염시켰습니다(그림 3, 그림 5A). 절편을 E4.5 또는 E8 망막으로부터 제조하고, Nel 발현에 대한 효과를 항-Nel 항체22를 사용하여 면역조직화학에 의해 평가하였다. E4.5에서, 망막 색소 상피에서의 Nel의 발현은 EmGFP 발현 세포에서 유의하게 감소되었다 (도 5B-D). E8에서, Nel 발현의 감소는 또한 망막 신경절 세포에서 명확하게 관찰되었다 (도 5E-I). Nel 발현의 유의한 억제는 적어도 E18까지 지속되었다 (데이터는 나타내지 않음). 대조군 miRNA의 도입은 망막에서 Nel 발현에 영향을 미치지 않았습니다(그림 5J-O).
그림 1: 전치효소에 의한 Tol2-측면 cDNA의 전위. EmGFP에 대한 Tol2 측면 발현 카세트와 전이효소에 의한 2개의 pre-miRNA 서열(2x pre-miRNA)의 전치를 보여주는 개략도. 발현 카세트(pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA 구조체)를 포함하는 Tol2 트랜스포존 벡터가 Tol2 트랜스포사제 발현 구조체(pCAGGS-T2TP)를 갖는 세포 내로 도입되면, Tol2-측면 발현 카세트는 벡터로부터 절제되어 트랜스포사제 활성에 의해 숙주 게놈 내로 통합된다. EmGFP 및 miRNA의 발현은 유비쿼터스 프로모터 CAGGS에 의해 구동됩니다. 이 수치는 Nakamoto et al.15에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 조작된 pre-miRNA의 구조 . (A) 설계된 pre-miRNA 서열은 murine miR-155 서열17을 기반으로 합니다. 상부 가닥 올리고는 (5' 말단에서 3' 말단까지) 4-뉴클레오티드 돌출부(TGCT(청색)), 안티센스 표적 서열(21개 뉴클레오티드), 말단 루프 서열(적색) 및 센스 표적 서열(19개 뉴클레오티드)을 함유한다. 안티센스 표적 서열은 성숙한 miRNA 서열을 나타낸다. 하단 가닥 올리고는 4-뉴클레오티드 5' 오버행(CCTG(청색))과 상부 가닥 올리고의 역상보체 서열을 포함하지만, 3' 말단에 4-뉴클레오티드 돌출부가 결여되어 있다(AGCA-3': 상부 가닥 올리고의 5'-TGCT의 역보체). 센스 타겟 서열에는 표적 서열의 뉴클레오티드 9 및 10이 결여되어 있다. 안티센스 표적 서열 내의 "추가" 2개의 뉴클레오티드는 성숙한 miRNA 분자의 줄기-루프 구조에서 내부 루프를 형성하며, 이는 더 높은 녹다운 속도를 초래한다17. (B) 치킨넬에 대한 표적 서열의 예. 닭 넬 유전자의 표적 서열에 대한 상부 및 하부 가닥의 센스 및 안티센스 서열(GenBank 수탁번호 NM_001030740.1, 뉴클레오티드 482-502)이 나타나 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: ovo 미세주입 및 전기천공법에서. (A) ovo 미세 주입 및 전기 천공을 위한 워크스테이션. (1) 현미경 해부. (2) 주입 장치. (3) 전기 천공 장치. (4) 듀얼 구즈넥 현미경 조명기. (5) 전기 공급기. (B) 주입 장치. 18G 바늘(7)이 있는 해밀턴 주사기(6)를 PVC 튜브(8)와 당겨진 마이크로피펫 바늘(9)에 연결하고 미세 조작기(10)에 설정합니다. 장치의 내부 공간은 중질 미네랄 오일로 채워져 있습니다. (C) 전기 천공 장치. 전극 홀더(12)가 있는 백금 전극(11) 세트가 마이크로매니퓰레이터(13)에 설정됩니다. 전극은 케이블(14)로 전기 천공기에 연결됩니다. (D) HH 10-11에서 시신경에 DNA 칵테일 용액을 미세주입합니다. 당겨진 마이크로피펫 바늘은 근위부에서 시낭으로 삽입됩니다. 염료가 전체 내강을 채울 때까지 빠른 녹색(파란색)의 DNA 칵테일 용액을 시신경에 주입합니다. (E) 시신경 소포로의 전기 천공. 전극은 평행하게 배치되고 (전극 사이의 거리는 2mm) 주입 된 시신경이 전극 사이에 위치하도록 배치됩니다 : 하나의 전극은 시신경의 전방 (비강) 표면 근처에 위치하고, 다른 하나는 후뇌 수준의 배아의 뒤쪽 부분에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: Nel 유전자 억제 효율에 대한 개별 또는 사슬형 pre-miRNA 서열의 시험관 내 평가. (A) 개별 pre-miRNA 서열의 녹다운 효과. 닭의 5가지 대표적인 작제물(뉴클레오티드 번호 482-502, 910-930, 1106-1126, 1663-1683, 및 2461-2481에 대응하는 안티센스 표적 서열(GenBank accession number: NM_001030740.1))의 결과가 나타나 있다. 개별 miRNA 발현 구조체(pcDNA6.2-GW/EmGFP-Nel pre-miRNA)를 Nel-AP를 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포로 형질감염시켰습니다. pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-음성 대조군 플라스미드를 대조군으로 사용하였다. Nel-AP의 발현은 형질감염 후 48-96시간 배양액에서 AP 활성을 측정하여 평가하였다. 3개의 Nel pre-miRNA 발현 구축물(각각 뉴클레오티드 482-502, 910-930 및 2461-2481에 대해)은 Nel 발현의 현저한 억제를 나타내었다. (B) 연쇄된 pre-miRNA 서열의 녹다운 효과. 가장 강력한 pre-miRNA 서열 3개 중 2개(뉴클레오티드 482-502, 910-930 및 2461-2481에 대해)를 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR 벡터에 탠덤 클로닝하고, 발현 카세트(2개의 pre-miRNA 서열 및 EmGFP cDNA 포함)를 pT2K-CAGGS 벡터(pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA)로 옮겼습니다. pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA 구축물을 Tol2 transposase(pCAGGS-T2TP)에 대한 발현 벡터와 개별적으로 Nel-AP를 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포에 공동형질감염시키고, 형질감염 후 2일에서 13일까지 배양 배지에서 AP 활성을 측정하여 Nel-AP의 발현을 평가하였다. 세 가지 조합(482-502/910-930, 482-502/2461-2481, 910-930/2461-2481) 모두 사슬에 묶이지 않은 개별 pre-miRNA 서열에 비해 향상된 억제 활성을 보였다. Nel-AP 발현의 유의한 억제는 2일째부터 적어도 13일째까지 관찰되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: miRNA 이식유전자의 Tol2 트랜스포존 매개 통합에 의한 발달 중인 병아리 망막에서 Nel 발현의 안정적인 녹다운. 2개의 Nel pre-miRNA 서열 및 EmGFP의 발현 카세트를 포함하는 Tol2 트랜스포존 구조체(pT2K-CAGGS-EmGFP-Nel pre-miRNA (482-502)-Nel pre-miRNA (2461-2481)) (A-I) 또는 관련 없는 miRNA 및 EmGFP(J-O)를 발현하는 대조군 구조체를 transposase 발현 벡터(pCAGGS-T2TP)와 함께 ovo에서 시신경의 측두엽 또는 비강 절반으로 공동 형질감염시켰다 HH9-HH11(E1.5)에서의 전기천공법. 망막 절편을 E4.5(B-D, J-L) 또는 E8(E-I, M-O)에서 준비하고, 항-Nel 항체(빨간색)를 사용한 면역조직화학에 의해 Nel 유전자 억제의 효율을 조사하였다. DNA는 음전하를 띠기 때문에 이식 유전자는 양극 측의 조직으로 전기천공됩니다. 따라서 망막의 절반만이 EmGFP(형질감염(TF) 측, 녹색)로 표지되었습니다. (A) E4.5에서 망막의 측두엽에서 EmGFP 마커 유전자의 발현. 시신경 균열(흰색 화살표)은 형질주입된 측면과 형질주입되지 않은(대조군) 측면 사이의 경계를 나타냅니다. (나-I) 발달 중인 병아리 망막에서 Nel 발현의 RNAi 녹다운. (B-D) E4.5에서 Nel 발현은 EmGFP(C,D)를 발현하는 망막 색소 상피(PE) 세포에서 유의하게 감소합니다(B,D). D에서 Nel 면역염색 및 EmGFP 발현의 상보적 패턴에 주목하십시오. NR, 신경 망막. (에-아이) E8에서, 망막 색소 상피 및 신경절 세포층 (GCL)에서의 Nel 발현 (E, G)은 형질 감염 측 (F, G)에서 감소한다. (H, 나) 형질주입 영역과 E의 대응하는 제어 영역의 더 높은 배율도(각각 작은 직사각형으로 표시됨). (D,G) 왼쪽 두 이미지의 병합된 이미지입니다. (조) 대조군 miRNA의 발현. 음성 대조군 구조체의 도입은 E4.5 (J-L) 또는 E8 (M-O) 망막에서 Nel의 발현에 영향을 미치지 않는다. (L,O) 왼쪽 두 이미지의 병합된 이미지입니다. 형질주입 측면과 대조군 측면 사이의 경계는 C, F, K, 및 N. 스케일 바, 50 μm의 점선으로 표시된다. (A) 및 (B-I)는 각각 Nakamoto, M. & Nakamoto, C 16 및 Nakamoto etal.15로부터 변형되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 어닐링 반응 설정 | |
| 탑 스트랜드 올리고(TE 버퍼 중 200μM) | 5 μL (최종 농도 50 μM) |
| 하단 가닥 올리고(TE 완충액 중 200μM) | 5 μL (최종 농도 50 μM) |
| 10x 올리고 어닐링 버퍼* | 2 마이크로리터 |
| DNase/RNase가 없는 물* | 8 μL |
| 합계 | 20 마이크로리터 |
| * miRNA 발현 키트에 제공됨( 재료 표 참조) | |
표 1: 어닐링 반응 설정
| 2x AP 기판 버퍼 | |
| 10M 디에탄올아민(pH 9.8) | 4 밀리리터 |
| 1 M MgCl2 | 10 μL |
| L-호모아르기닌 | 45의 mg의 |
| 소 혈청 알부민(BSA) | 10의 mg의 |
| p-니트로페닐포스페이트 | 63의 mg의 |
| H2O | 총 부피 20mL를 만들기 위해 추가합니다 |
표 2: 2x AP 기판 버퍼. 용액은 -20°C에서 분취량으로 보관해야 하며 p-니트로페닐포스페이트는 빛에 민감하므로 빛으로부터 보호해야 합니다.
| 반응 설정 | |||
| pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x pre-miRNA 플라스미드(섹션 1.5에서) 또는 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-음성 대조군 플라스미드*(0.1μg/μL) |
1 μL | ||
| 10x Pfu 버퍼 | 5 μL | ||
| dNTP 믹스(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 10mM) | 1 μL | ||
| EmGFP 정방향 프라이머*(5'-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3'; 10μM) | 1 μL | ||
| miRNA 역방향 프라이머*(5'- CTCTAGATCAACCACTTTGT-3'; 10μM) | 1 μL | ||
| Pfu DNA 중합효소(5단위/μL) | 0.5 μL | ||
| H2O | 40.5 μL | ||
| 총 볼륨 | 50 μL | ||
| * miRNA 발현 키트에 제공됩니다. | |||
| 열순환 조건 | |||
| 섭씨 94도 | 5 분 | ||
| 다음의 30주기: | |||
| 섭씨 94도 | 45초 | ||
| 섭씨 58도 | 1 분 | ||
| 섭씨 72도 | 2 분 | ||
| 섭씨 72도 | 10 분 | ||
표 3: 반응 설정 및 열순환 조건.
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Discussion
이 프로토콜은 ovo electroporation 및 Tol2 transposon 시스템에서 사용하는 인공 miRNA의 형질전환 발현에 의해 발달 중인 병아리 망막의 유전자 침묵에 대한 자세한 가이드를 제공합니다.
이 기술을 성공적으로 수행하는 데 중요한 요소는 다음과 같습니다. 첫째, 강력한 녹다운 효과를 발휘하는 것으로 확인된 miRNA 염기서열을 사용하는 것이 중요합니다. 생체 내 전기천공에 적용하기 전에 시험관 내 분석(단계 1.4)에서 유전자 억제 효율에 대해 개별 pre-miRNA 서열을 테스트하고 가장 높은 녹다운 활성을 나타내는 두 개의 pre-miRNA 서열을 연결합니다(단계 1.5). 둘째, DNA 용액 주입을 위해 마이크로피펫 바늘을 삽입할 때 시신경 소포와 주변 신경 조직을 손상시키지 않는 것이 중요합니다. 배아에 대한 과도한 손상은 배아 기형과 사망으로 이어질 수 있습니다. 조직 손상을 방지하려면 마이크로피펫을 올바른 방향으로 시신경에 삽입하십시오. 마이크로피펫 바늘의 더 작고 날카로운 끝은 시소포의 침투를 더 부드럽게 만들고 조직 손상을 줄입니다. 그러나 팁이 매우 작은 바늘은 DNA 용액을 넣고 방출하는 데 어려움이 있습니다. 여기에 설명된 연구에서는 직경 10-20μm의 팁 개구부를 가진 바늘이 사용되었습니다. 셋째, 전체 시낭을 DNA 용액으로 채워야 합니다(빠른 녹색의 확산으로 시각화됨). 넷째, 시신경의 원하는 영역(예: 측두엽, 비강측)에 DNA를 표적으로 삼을 수 있는 최적의 위치에 전극을 배치합니다. 음전하를 띤 DNA 분자는 양극 쪽으로 이동합니다. 따라서 전극의 정확한 배치와 방향은 최종 결과에 결정적인 영향을 미칩니다. 마지막으로, 최적의 DNA 농도와 전기천공 파라미터를 사용합니다.
전기천공 24시간 후에도 형광 신호가 관찰되지 않으면 다음 사항을 고려해야 합니다: (1) 전기천공된 플라스미드의 염기서열이 올바른지 확인합니다. (2) 개별 플라스미드의 농도와 순도를 다시 확인합니다. (3) DNA 용액이 시신경의 내강을 채우고 신경관으로 확산되지 않는지 확인하십시오. (4) 사용된 전기천공 매개변수가 올바른지 확인합니다. (5) 전기 펄스가 가해지는 동안 전극이 바이텔린 멤브레인과 접촉하는지 확인합니다.
이 프로토콜에서 난소 전기천공과 트랜스포존 매개 유전자 통합 방법의 조합은 몇 가지 뚜렷한 이점을 제공합니다. 첫째, miRNA의 안정적인 생산을 지원하여 표적 유전자의 지속적인 억제를 지원합니다. 병아리 망막의 발달은 E1.5에서 시작하여 부화할 때까지 계속됩니다(망막 신경절 세포는 E2에서 E9까지의 기간에 걸쳐 생성됨). 유전자 기능의 기능 상실 분석을 위해서는 이 기간 동안 인공 miRNA의 발현이 안정적으로 유지되어야 합니다. 통상적인 발현 벡터를 사용하는 RNAi 서열의 발현은 발현 구축물이 염색체 내로 효율적으로 통합되지 못하기 때문에 일반적으로 일시적이다. 그러나, 여기에 기술된 방법에서, 발현 카세트의 염색체 통합은 공동-전기천공된 트랜스포이즈아제의 활성에 의해 매개되고, 이는 도입유전자의 안정한 발현을 초래한다.
둘째, 이 방법에서 동일한 CAGGS 프로모터가 형질감염된 세포에서 다중 miRNA 서열 및 EmGFP 마커의 코-시스트로닉 발현을 유도하여 이중 유전자 발현을 달성하기 위해 2개의 프로모터를 포함하는 레트로바이러스 벡터의 일반적인 합병증 중 하나인 프로모터 간섭의 위험을 우회합니다25.
마지막으로, 복제 능력이 있는 레트로바이러스 벡터와 달리, 이 방법에 의해 전기천공된 이식유전자는 이웃 세포로 전달되지 않습니다. 그러므로, 형질주입 영역은 적절한 유형의 전극을 사용하고 이들을 올바른 위치에 배치함으로써 보다 정밀하게 제어될 수 있다.
상술한 장점들에도 불구하고, 현재의 방법은 또한 ovo electroporation에 내재된 한계를 가지고 있다. 예를 들어, 형질주입 및 유전자 억제 속도는 배아마다 다를 수 있고, 비교적 많은 수의 배아가 분석을 위해 형질감염될 필요가 있을 수 있다. 또한, 후기 발달 단계(예: E4-E5)에서 ovo의 배아 망막으로의 전기천공은 눈이 해당 단계에서 심장에 매우 근접하여 전기천공 후 심정지의 위험을 증가시키기 때문에 실험적 어려움이 있습니다.
여기에 설명된 시스템은 발달 중인 병아리 망막에서 빠르고 강력한 유전자 억제를 가능하게 합니다. 이 접근법은 신경 및 비신경 조직을 포함한 병아리 배아의 다른 부분에도 적용될 수 있습니다. 따라서 우리는 이 시스템이 병아리 발달의 분자 메커니즘의 해명에 기여할 수 있을 것으로 기대합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
pT2K-CAGGS 및 pCAGGS-T2TP 벡터는 각각 Yoshiko Takahashi(Kyoto University, Kyoto, Japan)와 Koichi Kawakami(National Institute of Genetics, Mishima, Japan)에 의해 친절하게 제공되었습니다. 원고를 비판적으로 읽어준 Michael Berberoglu에게 감사드립니다. 이 연구는 왕립 학회와 생명 공학 및 생물 과학 연구위원회 (BBSRC) (영국)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
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