Summary
We hebben een nieuwe benadering van functieverlies ontwikkeld die de introductie en genomische integratie van kunstmatige micro-RNA-sequenties in kuikenembryo's omvat door gebruik te maken van ovo-elektroporatie en het Tol2-transposonsysteem. Deze techniek biedt een robuuste en stabiele gen knockdown methodologie voor studies van de genfunctie tijdens de ontwikkeling.
Abstract
Het netvlies van het kuiken is al lang een belangrijk modelsysteem in de ontwikkelingsneurobiologie, met voordelen zoals de grote omvang, snelle ontwikkeling en toegankelijkheid voor visualisatie en experimentele manipulaties. De belangrijkste technische beperking was echter het gebrek aan robuuste benaderingen van functieverlies voor genfunctieanalyses. Dit protocol beschrijft een methodologie van gen-uitschakeling in het zich ontwikkelende netvlies van kuikens waarbij transgene expressie van kunstmatige microRNA's (miRNA's) plaatsvindt met behulp van het Tol2-transposonsysteem. In deze benadering wordt een Tol2-transposonplasmide dat een expressiecassette bevat voor de EmGFP-marker (smaragdgroen fluorescerend eiwit) en kunstmatige pre-miRNA-sequenties tegen een doelgen in het embryonale netvlies van het kuiken ingebracht met een Tol2-transposase-expressieconstruct door in ovo-elektroporatie . In de getransfecteerde retinale cellen katalyseert de transposase de excisie van de expressiecassette van de transposonvector en de integratie ervan in gastheerchromosomen, wat leidt tot de stabiele expressie van miRNA's en het EmGFP-eiwit. In onze vorige studie hebben we aangetoond dat de expressie van Nel, een glycoproteïne dat meerdere functies uitoefent in de neurale ontwikkeling, aanzienlijk kan worden onderdrukt in het zich ontwikkelende netvlies van het kuiken door deze techniek te gebruiken. Onze resultaten geven aan dat deze methodologie een stabiele en robuuste onderdrukking van genexpressie induceert en dus een efficiënte benadering van functieverlies biedt voor studies naar retinale ontwikkeling.
Introduction
Het netvlies van gewervelde dieren is een belangrijk modelsysteem voor het bestuderen van neurale ontwikkeling. Ondanks de perifere locatie is het netvlies anatomisch en ontwikkelingsgericht een uitbreiding van het centrale zenuwstelsel, en de oogzenuw, die bestaat uit axonen van retinale ganglioncellen, vertegenwoordigt een kanaal in het centrale zenuwstelsel. Het netvlies van het kuiken heeft aanzienlijke voordelen als een modelsysteem om het moleculaire mechanisme van neurale ontwikkeling te bestuderen: het is groot en ontwikkelt zich snel; het heeft structurele en functionele overeenkomsten met het menselijk netvlies; Het is zeer toegankelijk voor visualisatie en experimentele manipulaties. Moleculaire mechanismen van celproliferatie en -differentiatie, morfogenese en axonbegeleiding tijdens neurale ontwikkeling zijn uitgebreid bestudeerd met behulp van het netvlies van de kip.
Bij ovo is elektroporatie de afgelopen twee decennia met succes gebruikt om ectopische genen in cellen in het zich ontwikkelende kuikenembryo te introduceren. Deze techniek maakt het mogelijk om ontwikkelende cellen te labelen, het lot van cellen te traceren en celmigratie en axonkanalen te traceren, evenals ectopische genexpressie voor in vivo analyse van de genfunctie. De voorwaarden voor in ovo-elektroporatie voor efficiënte ectopische genexpressie in kuikenembryo's zijn goed vastgesteld 1,2,3.
Ondanks deze voordelen was het ontbreken van een stabiele techniek voor functieverlies voor studies van de genfunctie een belangrijke technische beperking van het kuikenembryo. Terwijl kuikenembryo's geëlektropoeerd met kleine interfererende RNA's (siRNA's)4 of expressievectoren voor korte haarspeld-RNA's (shRNA's)5 knockdown van het beoogde gen vertonen, is genonderdrukking in die benaderingen van voorbijgaande aard omdat de effecten verdwijnen zodra cellen de geïntroduceerde RNA's of DNA's verliezen. Een stabielere genonderdrukking kan worden bereikt door siRNA's in kuikenembryo's af te leveren door een RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor) retrovirussystem 6. De virale vector integreert in het gastheergenoom en de ectopische genen worden stabiel tot expressie gebracht. Het retrovirus kan echter alleen in het genoom van delende cellen integreren tijdens de mitotische (M) fase van de celcyclus, wat een beperking kan opleggen aan de ontwikkelingsstadia en/of celtypen waarvoor deze functieverliesbenadering kan worden toegepast. Bovendien lijkt de expressie van transgenen door RCAS langzamer en minder robuust dan die geïnduceerd door in ovo-elektroporatie 7.
Transposons zijn genetische elementen die van de ene locatie op het genoom naar de andere gaan. Het Tol2-element is een lid van de hAT-transponeerbare elementenfamilie en bevat een intern gen dat codeert voor een transposase dat de transposonreactie van het Tol2-element8 katalyseert. Wanneer een plasmidevector met een genexpressiecassette geflankeerd door de sequenties van het linker- en rechteruiteinde van de Tol2-elementen (respectievelijk 200 bp en 150 bp) wordt ingebracht in gewervelde cellen met een Tol2-transposase-expressieconstruct, wordt de expressiecassette uit het plasmide gesneden en geïntegreerd in het gastheergenoom, dat een stabiele expressie van het ectopische gen ondersteunt (figuur 1). Het is aangetoond dat het Tol2-transponeerbare element zeer efficiënt gentranspositie kan induceren bij verschillende gewervelde soorten, waaronder zebravissen9,10, kikkers 11, kuikens 12 en muizen 13, en dus een nuttige methode is voor transgenese en insertionele mutagenese. Het Tol2-transposonsysteem is met succes gebruikt voor voorwaardelijke knockdown van een doelgen door genomische integratie van siRNA dat wordt verwerkt uit lang dubbelstrengs RNA14.
Dit protocol beschrijft een verlies-van-functie benadering in het kuikenembryo waarbij kunstmatige microRNA's (miRNA's) worden geïntroduceerd door het Tol2 transposon systeem15,16. In deze benadering wordt een expressiecassette voor de EmGFP (smaragdgroen fluorescerend eiwit) marker en kunstmatige miRNA's tegen een doelgen gekloond in een Tol2 transposon vector. Het Tol2-transposonconstruct wordt vervolgens in het embryonale netvlies van het kuiken ingebracht met een Tol2-transposase-expressieconstruct door in ovo-elektroporatie. In de getransfecteerde retinale cellen katalyseert de transposase de excisie van de expressiecassette van de transposonvector en de integratie ervan in gastheerchromosomen, wat leidt tot de stabiele expressie van miRNA's en het EmGFP-eiwit. In onze eerdere studies hebben we met succes de expressie van Nel, een extracellulair glycoproteïne dat voornamelijk tot expressie komt in het zenuwstelsel, in het zich ontwikkelende netvlies van het kuiken neergehaald (zie Representatieve resultaten). Onze resultaten geven aan dat stabiele en efficiënte genonderdrukking kan worden bereikt in ovo door deze techniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Constructie van miRNA-expressievectoren
OPMERKING: De procedures voor het construeren van miRNA-expressievectoren (stappen 1.1-1.3, 1.5-1.6.) zijn geoptimaliseerd voor de miRNA-expressiekit, Block-iT Pol II miR RNA-expressiekit met EmGFP, zoals eerder beschreven15,16. De kit biedt de expressievector die is ontworpen om miRNA-expressie (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), een controlevector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatief controleplasmide), accessoire reagentia en instructies voor het produceren van miRNA-expressievectoren mogelijk te maken (zie materiaaltabel)17.
- Het ontwerpen van enkelstrengs DNA-oligo's die coderen voor pre-miRNA's tegen het doelgen: Ontwerp enkelstrengs DNA-oligo's ("bovenste streng" oligo's (doel pre-miRNA's) en "onderste streng" oligo's (complementen van bovenste streng oligo's)) met behulp van de online tool, RNAi Designer (zie tabel met materialen). Zie figuur 2 voor de vereiste kenmerken van de enkelstrengs oligo's (figuur 2A) en voorbeelden van doelsequenties (figuur 2B).
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 5-10 pre-miRNA-sequenties te genereren voor een bepaald doelgen en te screenen op knockdown-activiteiten in vitro (stap 1.4). - Gloeien van de boven- en onderstrengs oligo's om een dubbelstrengs oligo te genereren
- Zet de volgende gloeireactie (tabel 1) op in een steriele microcentrifugebuis van 0,5 ml.
- Incubeer het reactiemengsel bij 95 °C gedurende 4 min. Gloei de boven- en onderstreng oligo's om een dubbelstrengs oligo te genereren door het reactiemengsel gedurende 5-10 minuten te laten afkoelen tot kamertemperatuur (RT). Centrifugeer het monster kort (~5 s).
OPMERKING: De gegloeide oligo's kunnen worden bewaard bij -20 °C zonder afbraak gedurende ten minste een jaar.
- Klonen van de dubbelstrengs oligo's in de miRNA-expressievector (pcDNA6.2-GW / EmGFP-miRNA (geleverd in de miRNA-expressiekit)): Kloon individuele dubbelstrengs oligo's in de gelineariseerde miRNA-expressievector, volgens de handleiding van de fabrikant17.
- Evaluatie van knockdown-effecten
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om individuele miRNA-sequenties in vitro te testen op genonderdrukkingsefficiëntie voordat ze in ovo worden toegepast. Knockdown-efficiëntie kan worden getest door miRNA-expressieplasmiden te transfecteren in een cellijn die het doelgen tot expressie brengt. Als alternatief kunnen individuele miRNA-expressieplasmiden worden gecotransfecteerd in cellijnen met een expressieconstruct voor het doelgen. Voor doelgenen die coderen voor eiwitten die niet in hun oorspronkelijke toestand zijn verankerd (bijv. Oplosbare eiwitten), kan een alkalisch fosfatase (AP) fusie-eiwit worden gebruikt voor het monitoren van de expressie van het doeleiwit. Een cDNA-sequentie die codeert voor het doeleiwit kan in frame worden gefuseerd met menselijke placentale alkalische fosfatase in AP-tagvectoren (APtag-1- APtag-5; zie tabel met materialen) en worden ingebracht in cellen18. Wanneer het tot expressie wordt gebracht in kweekcellen (bijv. HEK293T cellen), wordt het AP-gelabelde doeleiwit op hoge niveaus uitgescheiden in kweekmedia, en dus kunnen knockdown-effecten van miRNA-sequenties worden geëvalueerd door de afname van AP-activiteit in de kweekmedia van miRNA-getransfecteerde cellen te meten (substappen 1.4.1-1.4.4).- Kweek HEK293T cellen in een 24-well plaat (8 x 104 cellen/put) 's nachts. Transfecteer de cellen tijdelijk met individuele miRNA-expressieconstructen met een expressieplasmide van een AP-gelabeld doeleiwit. Gebruik het pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatieve controleplasmide (meegeleverd in de miRNA-expressiekit) als controle. (Als cellijnen worden gebruikt die stabiel een AP-gelabeld doeleiwit tot expressie brengen, transfecteer de cellen dan alleen met individuele miRNA-expressieconstructen.)
OPMERKING: Een conventioneel lipofectiereagens (zie materiaaltabel) wordt gebruikt voor transfectie. - Verzamel het geconditioneerde medium 48-72 h na de transfectie en de warmte inactiveer de endogene AP-activiteit in een waterbad van 65 °C gedurende 5 minuten. Spinout vuil in een desktop microcentrifuge op maximale snelheid gedurende 5 minuten.
- Buffer het supernatant met 10 mM HEPES, pH 7,0 en laat het door een filter van 0,45 μm lopen.
- Neem 100 μL (voor meting in een plaatlezer) of 500 μL (voor een spectrofotometer) van het supernatant en voeg een gelijke hoeveelheid 2x AP-substraatbuffer toe (tabel 2). Controleer de AP-activiteit door OD405 te meten in een plaatlezer of een spectrofotometer.
OPMERKING: Als de AP-activiteit van het geconditioneerde medium te hoog is voor nauwkeurige meting, verdun het dan met HBAH-buffer (Hanks' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), 0,5 mg / ml runderserumalbumine, 20 mM HEPES (pH 7,0)) of een andere buffer die een dragereiwit bevat. Gebruik geen fosfaathoudende buffers (bijv. PBS) omdat anorganisch fosfaat werkt als een competitieve remmer van AP.
- Kweek HEK293T cellen in een 24-well plaat (8 x 104 cellen/put) 's nachts. Transfecteer de cellen tijdelijk met individuele miRNA-expressieconstructen met een expressieplasmide van een AP-gelabeld doeleiwit. Gebruik het pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatieve controleplasmide (meegeleverd in de miRNA-expressiekit) als controle. (Als cellijnen worden gebruikt die stabiel een AP-gelabeld doeleiwit tot expressie brengen, transfecteer de cellen dan alleen met individuele miRNA-expressieconstructen.)
- Ketening van miRNA-sequentie
OPMERKING: Knockdown-effecten kunnen worden versterkt door verschillende miRNA's tegen hetzelfde doelgen te ketenen of hetzelfde miRNA te herhalen. De miRNA-expressievector ondersteunt de ketening van meerdere pre-miRNA-sequenties en hun co-cistronische expressie17.- Keten twee verschillende pre-miRNA-sequenties (tegen hetzelfde doelgen) die de hoogste knockdown-activiteiten vertonen in in vitro assays (stap 1.4), volgens de instructies van de fabrikant17.
- Evalueer de genonderdrukkingsefficiëntie van de geketende constructen met behulp van in vitro assays zoals beschreven in stap 1.4. Als drie of meer pre-miRNA-sequenties vergelijkbare hoge knockdown-activiteiten vertonen, test dan verschillende combinaties van twee sequenties en gebruik de combinaties die de hoogste knockdown-activiteit vertonen (zie Representatieve resultaten).
- Overbrengen van de EmGFP-pre-miRNA expressie cassette naar de Tol2 transposon vector
OPMERKING: De expressiecassette met EmGFP cDNA en twee pre-miRNA-sequenties wordt overgebracht naar de Tol2-transposonvector (pT2K-CAGGS-vector, zie materiaaltabel). Hiertoe wordt de expressiecassette (die loopt van het 3'-uiteinde van de CMV-promotor tot de miRNA-reverse sequencingprimerplaats van de miRNA-expressievector) PCR-versterkt met behulp van primers met een kunstmatige restrictie-enzymplaats en wordt het PCR-product gekloond in de Tol2-transposonvector. De Tol2-transposonvector bevat de alomtegenwoordige CAGGS-promotor, die de expressie van de ingevoegde expressiecassette aandrijft. De CAGGS-promotor en de expressiecassette worden geflankeerd door de Tol2-sequenties (figuur 1).- PCR-versterking van de EmGFP-pre-miRNA-expressiecassette: Volg de reactie-instelling en de thermocyclisomstandigheden beschreven in tabel 3.
- Ligate het gel-gezuiverde PCR-product (ca. 1,3 kb) in de restrictie-enzym-verteerde Tol2-transposonvector. Elektropoer het plasmide in competente E. coli-cellen (zie tabel met materialen) en selecteer de recombinanten (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA-constructen).
- Bereid het plasmide voor met behulp van een conventionele maxiprep-kit (zie materiaaltabel). Controleer de structuur en volgorde van het plasmide door respectievelijk restrictiemapping en door de primers te gebruiken die voor de PCR worden gebruikt.
2. Opslag en incubatie van eieren
- Koop bevruchte White Leghorn (Gallus gallus) eieren van lokale boerderijen of commerciële verkopers.
OPMERKING: Eieren mogen tot 1 week voorafgaand aan de incubatie bij 12-16 °C of bij 4 °C worden bewaard zonder significant verlies van levensvatbaarheid of vertraging in de ontwikkeling tijdens de incubatie. - Label de eieren met de begindatum van de incubatie en markeer de bovenkant van het ei (waar het embryo zal worden geplaatst). Incubeer bevruchte eieren in een horizontale positie bij 38 °C totdat de embryo's de Hamburger en Hamilton (HH) stadia 10 (33-38 uur) -11 (40-45 uur) hebben bereikt.
3. Bij ovo elektroporatie
- Voorbereiding voor in ovo elektroporatie
- Bereiding van 0,25% snelle groene oplossing: Los 25 mg Fast Green FCF op in 10 ml PBS. Filtreer de oplossing met een spuitfilter van 0,2 μm. De oplossing kan worden opgeslagen bij RT.
- DNA-cocktail: Bereid de injectieoplossing door de afzonderlijke pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA-plasmiden (substap 1.6.3) te mengen met het Tol2-transposase-expressieplasmide (pCAGGS-T2TP-vector; zie materiaaltabel) (elk 5 μg/μL) in de verhouding 2:1. Voeg 1/10 volume van 0,25% snelle groene oplossing toe om het geïnjecteerde gebied te visualiseren.
OPMERKING: De optimale DNA-concentratie kan variëren afhankelijk van de constructen. - Het instellen van het micro-injectieapparaat (figuur 3A,B): Het micro-injectieapparaat bestaat uit het volgende (zie materiaaltabel): Hamilton-spuit, naald van 18 G (naaldlengte = 2"), PVC-buis (polyvinylchloride) (lengte van 2 cm), micropipettenaald (kan worden gemaakt door capillaire buizen met omega-puntvezel (1 mm O.D. X 0,75 mm I.D.) te trekken met een micropipettrekker).
- Vul een Hamilton spuit met zware minerale olie. Bevestig een naald van 18 G aan de spuit en vul de binnenruimte van de naald met olie door de zuiger van de spuit in te drukken.
- Bevestig een stuk 2 cm lange PVC-slang aan het uiteinde van de naald en vul de slang met de olie.
- Bevestig een getrokken micropipetnaald aan de slang. Breek de punt van de micropipetnaald af tot een diameter van 10-20 μm met een fijne tang om een kleine opening te maken. Vul de hele naald met olie.
OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat er geen luchtbellen in het systeem worden gevangen, omdat deze de stroom van de DNA-oplossing zouden remmen.
- Doe 5 μL van de gekleurde DNA-cocktail (substap 3.1.2) op een steriele petrischaal. Plaats onder de ontleedmicroscoop de punt van de micropipetnaald in de DNA-oplossing op de steriele petrischaal en trek de oplossing langzaam in de naald.
- Wacht tot de druk binnen en buiten de naald in evenwicht is (om te voorkomen dat er lucht in de naald gaat) en haal de punt van de naald uit de DNA-oplossing. Houd de punt van de naald ondergedompeld in steriele PBS in een klein bekerglas totdat het wordt geïnjecteerd.
- Installatie van het elektroporatieapparaat (figuur 3A,C):
- Plaats een paar platina elektroden met een elektrodehouder op een micromanipulator. Stel de afstand tussen de punt van de elektroden in op 2 mm (figuur 3C,E).
- Sluit de elektroden met kabels aan op een blokgolfpulsgenerator (zie materiaaltabel).
- Micro-injectie van DNA-oplossing (figuur 3D)
- Haal een kippenei uit de broedmachine en veeg het oppervlak van het ei af met een vloeipapier gedrenkt in 70% ethanol.
- Bevestig een naald van 18 G aan een spuit van 10 ml. Steek de naald door het stompe uiteinde van het ei, schuin naar beneden (45°) om beschadiging van de dooier te voorkomen.
- Trek 2-3 ml albumine uit het ei. Dicht het gat af met een stuk Scotch tape. Bevestig dat het embryo en het vitellinemembraan van de schaal zijn losgemaakt door het ei met licht te "candlen".
- Verwijder een stuk eierschaal (cirkel met een diameter van 2-3 cm) van de bovenkant van het ei met een schaar en een tang om het embryo bloot te leggen. Venster niet meer dan vijf eieren tegelijk om uitdroging van embryo's tijdens elektroporatie te voorkomen.
OPMERKING: Als het moeilijk is om een raam te openen zonder het ei te kraken, kan de hele bovenkant van het ei worden bedekt met Sellotape of Scotch tape voordat een stuk eierschaal wordt verwijderd. - Steek de punt van de naald vanaf de proximale zijde in het optische blaasje in een hoek van 45° en injecteer de DNA-cocktail door de zuiger langzaam in te drukken (of erop te tikken) totdat de blauwgekleurde oplossing het lumen vult (figuur 3D).
OPMERKING: Als alternatief kan een drukmicro-injectiesysteem (zie materiaaltabel) worden gebruikt voor de injectie van DNA-oplossingen. - Trek de naald terug en plaats de punt terug in PBS.
- Elektroporatie (figuur 3E)
- Stel de pulsparameters van de elektroporator als volgt in: Spanning: 15 V, Pulslengte: 50 ms, Pulsinterval: 950 ms, Pulsgetal: 5
- Voeg een paar druppels HBSS toe aan het vitellinemembraan over het embryo. Laat de elektroden in de HBSS zakken met behulp van de micromanipulator, loodrecht op de voorste-achterste as van het embryo.
OPMERKING: Als alternatief kan deze procedure worden uitgevoerd zonder HBSS toe te voegen, omdat albumine een goede elektrische geleider is die efficiënte elektroporatie mogelijk maakt. - Plaats de elektroden aan weerszijden (voorste (nasale) zijde en achterste (temporele) zijde) van het optische blaasje (figuur 3E). Zorg ervoor dat de elektroden het embryo of de bloedvaten niet raken. Pas gepulseerde elektrische velden toe.
- Verwijder de elektroden en reinig de elektroden voorzichtig met een in water gedrenkt steriel wattenstaafje om de ophoping van albumine te voorkomen.
- Sluit het venster af met Scotch tape en incubeer het embryo opnieuw tot het gewenste ontwikkelingsstadium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Constructie van Tol2 transposon constructen voor expressie van kunstmatige miRNA's tegen Nel
Nel (Neural Epidermale groeifactor (EGF)-Like; ook bekend als Nell2) is een extracellulair glycoproteïne. Het heeft structurele overeenkomsten met trombospondin-1 en komt voornamelijk tot expressie in het zenuwstelsel20,21. We hebben eerder aangetoond dat Nel de differentiatie en overleving van retinale ganglioncellenreguleert 15 en fungeert als een remmende geleidingscue voor retinale axonen22,23,24. In het zich ontwikkelende netvlies van het kuiken wordt Nel-expressie gedetecteerd in het vermoedelijke pigmentepitheel bij HH15 (embryonale dag (E) 2,5). Bij HH20 (E3.5) wordt nelexpressie ook waargenomen in nieuw gedifferentieerde retinale ganglioncellen. Sterke expressie van Nel in het pigmentepitheel en retinale ganglioncellen gaat minstens door tot E1815.
Om de functie van Nel in de ontwikkeling van retinale ganglioncellen te onderzoeken, werd de expressie van het Nel-gen uitgeschakeld door kunstmatige miRNA's in het zich ontwikkelende netvlies te introduceren met behulp van ovo-elektroporatie en het Tol2-transposonsysteem15,16. Ten eerste werden paren enkelstrengs DNA-oligonucleotiden ontworpen voor 10 potentiële doelsequenties in het eiwitcoderende gebied van de kip Nel cDNA (GenBank-toetredingsnummer: NM_001030740.1) met behulp van de online RNAi-ontwerptool (zie materiaaltabel). De oligonucleotideparen werden gegloeid en individueel gekloond in de miRNA-expressievector. Vervolgens werden individuele constructen getransfecteerd in HEK293T cellen die stabiel Nel-AP tot expressie brengen, en hun knockdown-efficiëntie werd geëvalueerd door AP-activiteit in de kweekmedia te meten. Het pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatieve controleplasmide werd gebruikt als controle (figuur 4A).
Drie Nel pre-miRNA-sequenties die de hoogste knock-downeffecten vertoonden, werden geselecteerd (tegen nucleotiden 482-502, 910-930 en 2461-2481 van kip Nel cDNA, respectievelijk), en twee pre-miRNA-sequenties werden tegelijkertijd gekloond in de miRNA-expressievector (pcDNA6.2-GW / EmGFP-2x Nel pre-miRNA), volgens de instructies van de fabrikant17. De expressiecassettes die coderen voor de twee pre-miRNA en EmGFP werden versterkt door PCR met een kunstmatige EcoRI-site aan beide uiteinden (5′-GGGAATTCTCTGGCTAACTAGAGAAC-3′ en 5′-CCGAATTCTCTAGATCAACCACT-3′) en gekloond in de pT2K-CAGGS-vector (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). De volgorde van de expressiecassette werd bevestigd door de primers te gebruiken die voor de PCR werden gebruikt. pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA-constructen werden individueel gecotransfecteerd met de Tol2-transposase-expressievector (pCAGGS-T2TP) in HEK293T cellen die stabiel Nel-AP tot expressie brengen, en remmende effecten op Nel-AP-expressie werden geëvalueerd door de AP-activiteiten in de kweekmedia te meten. Zoals te zien is in figuur 4B, werd de knockdown-efficiëntie aanzienlijk verbeterd door de ketening van twee miRNA-sequenties. Robuuste onderdrukking van Nel-AP-expressie (meer dan 90%) werd waargenomen tot ten minste 13 dagen na transfectie (figuur 4B).
Stabiele onderdrukking van Nel-expressie in het zich ontwikkelende netvlies van het kuiken
Een pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA construct (met target sequenties voor nucleotiden 482-502 en 2461-2481 van de kip Nel cDNA) werd samen met de transposase expressie vector (pCAGGS-T2TP) in de temporale of nasale zijde van het kuiken netvlies getransfecteerd door in ovo elektroporatie bij HH9-11 (Figuur 3, Figuur 5A). Secties werden bereid uit E4.5 of E8 retinae, en effecten op Nel-expressie werden geëvalueerd door immunohistochemie met behulp van anti-Nel-antilichaam22. Bij E4.5 was de expressie van Nel in het retinale pigmentepitheel significant verminderd in EmGFP-expressiecellen (figuur 5B-D). Bij E8 werden ook afnames in Nel-expressie duidelijk waargenomen in retinale ganglioncellen (figuur 5E-I). Significante onderdrukking van Nel-expressie ging ten minste door tot E18 (gegevens niet getoond). De introductie van controle-miRNA had geen invloed op de Nel-expressie in het netvlies (figuur 5J-O).
Figuur 1: Transpositie van Tol2-geflankeerde cDNA's door transposase. Een schema met transpositie van een Tol2-geflankeerde expressiecassette voor EmGFP en geketende twee pre-miRNA-sequenties (2x pre-miRNA) door transposase. Wanneer een Tol2-transposonvector met de expressiecassette (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA-construct) in cellen wordt ingebracht met een Tol2-transposase-expressieconstruct (pCAGGS-T2TP), wordt de Tol2-geflankeerde expressiecassette uit de vector weggesneden en door de transposase-activiteit in het gastheergenoom geïntegreerd. Expressie van EmGFP en miRNA's wordt aangedreven door de alomtegenwoordige promotor CAGGS. Dit cijfer is aangepast van Nakamoto et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Structuur van het gemanipuleerde pre-miRNA. (A) De ontworpen pre-miRNA-sequentie is gebaseerd op de muriene miR-155-sequentie17. De bovenste streng oligo bevat (van het 5' uiteinde tot het 3' uiteinde) een vier-nucleotide overhang (TGCT (blauw)), antisense target sequence (21 nucleotiden), terminal loop sequence (rood) en sense target sequence (19 nucleotiden). De antisense-doelsequentie vertegenwoordigt de volwassen miRNA-sequentie. De onderste streng oligo bevat een vier-nucleotide 5' overhang (CCTG (blauw)) en de omgekeerde complementsequentie van de bovenste streng oligo, maar mist de vier-nucleotide overhang aan het 3' uiteinde (AGCA-3': omgekeerde complement van 5'-TGCT van de bovenste streng oligo). De zintuigdoelsequentie mist nucleotiden 9 en 10 van de doelsequentie. De "extra" twee nucleotiden in de antisense-doelsequentie vormen een interne lus in de stamlusstructuur van het volwassen miRNA-molecuul, wat resulteert in een hogere knockdown-snelheid17. (B) Een voorbeeld van doelsequentie tegen kip Nel. Sense- en antisense-sequenties in de bovenste en onderste strengen voor een doelsequentie van het kippen-Nel-gen (GenBank-toetredingsnummer NM_001030740.1, nucleotiden 482-502) worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: In ovo microinjectie en elektroporatie. (A) Werkstation voor in ovo microinjectie en elektroporatie. (1) Ontleedmicroscoop. (2) Injectieapparatuur. (3) Elektroporatieapparatuur. (4) Dubbele zwanenhals microscoop illuminator. (5) Elektroporator. (B) Injectieapparatuur. Een Hamilton-spuit (6) met een naald van 18 G (7) wordt aangesloten op een PVC-buis (8) en op een getrokken micropipetnaald (9) en op een micromanipulator (10) geplaatst. De binnenruimte van het apparaat is gevuld met zware minerale olie. (C) Elektroporatieapparatuur. Een set platina-elektroden (11) met een elektrodehouder (12) wordt op een micromanipulator (13) geplaatst. De elektroden zijn met kabels verbonden met de elektroporator (14). (D) Microinjectie van DNA-cocktailoplossing in het optische blaasje bij HH 10-11. De getrokken micropipettenaald wordt vanaf de proximale zijde in het optische blaasje ingebracht. DNA-cocktailoplossing met snel groen (blauw) wordt in het optische blaasje geïnjecteerd totdat de kleurstof het hele lumen vult. (E) Elektroporatie in het optische blaasje. Elektroden worden parallel geplaatst (de afstand tussen de elektroden is 2 mm) en op een zodanige manier dat het geïnjecteerde optische blaasje zich tussen de elektroden bevindt: de ene elektrode bevindt zich in de buurt van het voorste (neusale) oppervlak van het optische blaasje en de andere bevindt zich in het achterste deel van het embryo ter hoogte van de achterhersenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: In vitro evaluatie van individuele of geketende pre-miRNA sequenties voor Nel genonderdrukking efficiëntie. (A) Knockdown-effecten van individuele pre-miRNA-sequenties. Resultaten van vijf representatieve constructen (Antisense target sequences corresponderende nucleotide nummers 482-502, 910-930, 1106-1126, 1663-1683 en 2461-2481 van kip Nel cDNA (GenBank toetredingsnummer: NM_001030740.1)) worden getoond. Individuele miRNA-expressieconstructen (pcDNA6.2-GW/EmGFP-Nel pre-miRNA) werden getransfecteerd in HEK293T cellen die stabiel Nel-AP tot expressie brengen. Het pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatieve controleplasmide werd gebruikt als controle. Expressie van Nel-AP werd geëvalueerd door de AP-activiteiten in de kweekmedia 48-96 h na transfectie te meten. Drie Nel pre-miRNA expressieconstructen (tegen respectievelijk nucleotiden 482-502, 910-930 en 2461-2481) vertoonden een significante onderdrukking van Nel-expressie. (B) Knockdown-effecten van geketende pre-miRNA-sequenties. Twee van de drie krachtigste pre-miRNA-sequenties (tegen nucleotiden 482-502, 910-930 en 2461-2481) werden gelijktijdig gekloond in de pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-vector en de expressiecassette (met de twee pre-miRNA-sequenties en EmGFP cDNA) werd overgebracht naar de pT2K-CAGGS-vector (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). De pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA-constructen werden individueel gecotransfecteerd met expressievectoren voor Tol2-transposase (pCAGGS-T2TP) in HEK293T cellen die stabiel Nel-AP tot expressie brengen, en de expressie van Nel-AP werd geëvalueerd door de AP-activiteiten in de kweekmedia te meten van 2 tot 13 dagen na transfectie. Alle drie de combinaties (482-502/910-930, 482-502/2461-2481, 910-930/2461-2481) vertoonden verbeterde onderdrukkingsactiviteiten in vergelijking met niet-geketende individuele pre-miRNA-sequenties. Significante onderdrukking van Nel-AP-expressie werd waargenomen van dag 2 tot ten minste dag 13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Stabiele knockdown van Nel-expressie in het zich ontwikkelende netvlies van het kuiken door Tol2 transposon-gemedieerde integratie van miRNA-transgen. Een Tol2-transposonconstruct met een expressiecassette van twee Nel pre-miRNA-sequenties en EmGFP (pT2K-CAGGS-EmGFP-Nel pre-miRNA (482-502)-Nel pre-miRNA (2461-2481)) (A-I) of een controleconstruct dat een niet-gerelateerd miRNA en EmGFP (J-O) tot expressie brengt, werd samen met een transposase-expressievector (pCAGGS-T2TP) in de temporale of nasale helft van het optische blaasje getransfecteerd door in ovo elektroporatie bij HH9-HH11 (E1.5). Retinale secties werden bereid bij E4,5 (B-D, J-L) of E8 (E-I, M-O) en de efficiëntie van Nel-genonderdrukking werd onderzocht door immunohistochemie met behulp van anti-Nel-antilichaam (rood). Omdat DNA negatief geladen is, worden de transgenen geëlektropoeerd in het weefsel aan de anodezijde; zo werd slechts de helft van het netvlies gelabeld met EmGFP (transfectie (TF) zijde, groen). (A) Expressie van het EmGFP-markergen in de temporale helft van het netvlies bij E4.5. De optische spleet (witte pijl) vertegenwoordigt de grens tussen getransfecteerde en niet-getransfecteerde (controle) zijden. (B-I) RNAi knockdown van Nel expressie in het zich ontwikkelende kuiken netvlies. (B-D) Bij E4.5 is de Nel-expressie significant verminderd (B,D) in retinale pigmentepitheel (PE) cellen die EmGFP (C,D) tot expressie brengen. Let op het complementaire patroon van Nel-immunostaining en EmGFP-expressie in D. NR, neuraal netvlies. (E-I) Bij E8 is de Nel-expressie (E,G) in het retinale pigmentepitheel en de ganglioncellaag (GCL) aan de transfectiezijde (F,G) afgenomen. (H, I) Hogere vergrotingsweergaven van respectievelijk een transfectiegebied en een overeenkomstig controlegebied in E (aangegeven door kleine rechthoeken). (D,G) Samengevoegde afbeeldingen van de linker twee afbeeldingen. (J-O) Expressie van controle miRNA. Introductie van het negatieve controleconstruct heeft geen invloed op de expressie van Nel in het netvlies van E4,5 (J-L) of E8 (M-O). (L,O) Samengevoegde afbeeldingen van de linker twee afbeeldingen. De grens tussen transfectie en controlezijden wordt aangegeven door een stippellijn in C, F, K en N. Schaalbalken, 50 μm. (A) en (B-I) zijn gewijzigd van respectievelijk Nakamoto, M. & Nakamoto, C 16 en Nakamoto etal.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Opstelling van de gloeireactie | |
| Bovenste streng oligo (200 μM in TE-buffer) | 5 μL (eindconcentratie 50 μM) |
| Onderste streng oligo (200 μM in TE-buffer) | 5 μL (eindconcentratie 50 μM) |
| 10x Oligo gloeibuffer* | 2 μL |
| DNase/RNase-vrij water* | 8 μL |
| Totaal | 20 μL |
| * Geleverd in de miRNA-expressiekit (zie materiaaltabel) | |
Tabel 1: Opstelling gloeireactie
| 2x AP substraat buffer | |
| 10 M Diethanolamine (pH 9,8) | 4 ml |
| 1 M MgCl2 | 10 μL |
| L-Homoarginine | 45 mg |
| Runderserumalbumine (BSA) | 10 mg |
| p-nitrofenylfosfaat | 63 mg |
| H2O | Voeg toe om een totaal volume van 20 ml te maken |
Tabel 2: 2x AP substraatbuffer. De oplossing moet worden bewaard in aliquots bij -20 °C en worden beschermd tegen licht omdat p-nitrofenylfosfaat lichtgevoelig is.
| Reactie instellen | |||
| pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x pre-miRNA plasmide (uit rubriek 1.5) of pcDNA6,2-GW/EmGFP-miRNA-negatief controleplasmide* (0,1 μg/μL) |
1 μL | ||
| 10x Pfu buffer | 5 μL | ||
| dNTP-mix (10 mM elk van dATP, dCTP, dGTP en dTTP) | 1 μL | ||
| EmGFP voorwaartse primer* (5'-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| miRNA reverse primer* (5'- CTCTAGATCAACCACTTTGT-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| Pfu DNA polymerase (5 eenheden/μL) | 0,5 μL | ||
| H2O | 40,5 μL | ||
| Totaal volume | 50 μL | ||
| * Geleverd in de miRNA-expressiekit. | |||
| Thermocycling condities | |||
| 94 °C | 5 min | ||
| 30 cycli van het volgende: | |||
| 94 °C | 45 s | ||
| 58 °C | 1 min | ||
| 72 °C | 2 min | ||
| 72 °C | 10 min | ||
Tabel 3: Reactie-instelling en de thermocyclisomstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol biedt een gedetailleerde gids voor gen-uitschakeling in het zich ontwikkelende netvlies van kuikens door transgene expressie van kunstmatige miRNA's met behulp van ovo-elektroporatie en het Tol2-transposonsysteem.
De volgende factoren zijn van cruciaal belang bij het succesvol uitvoeren van deze techniek. Ten eerste is het van cruciaal belang om miRNA-sequenties te gebruiken waarvan is bevestigd dat ze robuuste knockdown-effecten uitoefenen. Voordat u ze toepast voor in ovo-elektroporatie , test u individuele pre-miRNA-sequenties op genonderdrukkingsefficiëntie in in vitro assays (stap 1.4) en ketent u twee pre-miRNA-sequenties die de hoogste knockdown-activiteiten vertonen (stap 1.5). Ten tweede is het belangrijk om het optische blaasje en de omliggende zenuwweefsels niet te beschadigen bij het inbrengen van de micropipetnaald voor injectie van de DNA-oplossing. Overmatige schade aan embryo's kan leiden tot embryonale misvorming en de dood. Om weefselbeschadigingen te voorkomen, brengt u de micropipette in de juiste richting in het optische blaasje in. Kleinere en scherpere uiteinden van de micropipetnaald zouden de penetratie van het optische blaasje soepeler maken en resulteren in minder weefselschade. Naalden met zeer kleine uiteinden hebben echter moeite met het laden en vrijgeven van de DNA-oplossing. In de hier beschreven studie werden naalden gebruikt met een tipopening met een diameter van 10-20 μm. Ten derde, zorg ervoor dat je het hele optische blaasje vult met de DNA-oplossing (zoals gevisualiseerd door de verspreiding van snel groen). Ten vierde, plaats de elektroden in de optimale posities om DNA's in het gewenste gebied van het optische blaasje te richten (bijv. Temporale zijde, nasale zijde). Negatief geladen DNA-moleculen bewegen naar de anodezijde; daarom heeft de precieze plaatsing en oriëntatie van de elektroden een kritische invloed op de uiteindelijke resultaten. Gebruik ten slotte de optimale DNA-concentraties en elektroporatieparameters.
Als er na 24 uur elektroporatie geen fluorescerend signaal wordt waargenomen, moet het volgende worden overwogen: (1) Bevestig dat de geëlektroporeerde plasmiden de juiste sequenties hebben. (2) Controleer de concentratie en zuiverheid van afzonderlijke plasmiden opnieuw. (3) Zorg ervoor dat de DNA-oplossing het lumen van het optische blaasje vult en niet wegdiffundeert in de neurale buis. (4) Controleer of de gebruikte elektroporatieparameters correct zijn. (5) Controleer of de elektroden in contact zijn met het vitellinemembraan terwijl de elektrische pulsen worden toegepast.
De combinatie van in ovo elektroporatie en een transposon-gemedieerde genintegratiemethode in dit protocol biedt verschillende duidelijke voordelen. Ten eerste ondersteunt het de stabiele productie van miRNA's en dus aanhoudende onderdrukking van doelgenen. De ontwikkeling van het netvlies van het kuiken begint bij E1,5 en gaat door tot het uitkomen (retinale ganglioncellen worden geproduceerd in de periode van E2 tot E9). Voor analyse van functieverlies van de genfunctie moet de expressie van kunstmatige miRNA's gedurende deze periode stabiel worden gehandhaafd. Expressie van RNAi-sequenties met behulp van conventionele expressievectoren is over het algemeen van voorbijgaande aard omdat het expressieconstruct niet efficiënt in chromosomen kan worden geïntegreerd. In de hier beschreven methode wordt de chromosomale integratie van de expressiecassette echter gemedieerd door de activiteit van co-geëlektroporeerd transposase, wat resulteert in een stabiele expressie van de transgenen.
Ten tweede induceert dezelfde CAGGS-promotor in deze methode co-cistronische expressie van meerdere miRNA-sequenties en de EmGFP-marker in getransfecteerde cellen, waardoor het risico van promotorinterferentie wordt omzeild, wat een van de meest voorkomende complicaties is met retrovirale vectoren die twee promotors bevatten om dubbele genexpressiete bereiken 25.
Ten slotte wordt, in tegenstelling tot replicatie-competente retrovirale vectoren, het transgen dat door deze methode wordt geëlektropoleerd, niet overgedragen aan naburige cellen. Daarom kan het transfectiegebied nauwkeuriger worden geregeld door de juiste soorten elektroden te gebruiken en deze in de juiste posities te plaatsen.
Ondanks de hierboven beschreven voordelen heeft de huidige methode ook beperkingen die inherent zijn aan ovo-elektroporatie . De snelheid van transfectie en genonderdrukking kan bijvoorbeeld variëren tussen embryo's en een relatief groot aantal embryo's moet mogelijk worden getransfecteerd voor analyse. Bovendien heeft elektroporatie in het embryonale netvlies in ovo in latere ontwikkelingsstadia (bijv. E4-E5) experimentele problemen omdat de ogen zich in die stadia dicht bij het hart bevinden, wat het risico op hartstilstand na elektroporatie verhoogt.
Het hier beschreven systeem maakt snelle en robuuste genonderdrukking in het zich ontwikkelende netvlies van het kuiken mogelijk. Deze aanpak kan ook worden toegepast op andere delen van het kuikenembryo, waaronder de neurale en niet-neurale weefsels. We verwachten daarom dat dit systeem kan bijdragen aan de opheldering van moleculaire mechanismen van kuikenontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De pT2K-CAGGS en pCAGGS-T2TP vectoren werden vriendelijk geleverd door respectievelijk Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Kyoto, Japan) en Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Mishima, Japan). We danken Michael Berberoglu voor zijn cruciale lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Royal Society and Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (UK) aan M.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
- Funahashi, J., et al. Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity. Development, Growth & Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).
- Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. In ovo electroporation methods in chick embryos. Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).
- Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development, Growth & Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces. Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Gene. 338 (1), 93-98 (2004).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).
- Kawakami, K., Noda, T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).
- Hou, X., et al. Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA. Development, Growth & Differentiation. 53, 69-75 (2011).
- Nakamoto, C., et al. Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development. Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).
- Nakamoto, M., Nakamoto, C. iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. Mao, C. -A. 8, Springer. 91-108 (2020).
- BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&title=BLOCK-iT&trade (2021).
- Flanagan, J. G., et al. Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos. Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. I. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).
- Jiang, Y., et al. In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel. Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).
- Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions. Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).
- Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue. Development. 146 (4), (2019).
- Yee, J. K., et al. Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).
