Summary
Vi har utviklet en ny tap-av-funksjon-tilnærming som involverer introduksjon og genomisk integrering av kunstige mikro-RNA-sekvenser i kyllingembryoer ved bruk i ovo-elektroporering og Tol2-transposonsystemet. Denne teknikken gir en robust og stabil genknockdown-metodikk for studier av genfunksjon under utvikling.
Abstract
Chick retina har lenge vært et viktig modellsystem i utviklingsnevrobiologi, med fordeler som inkluderer sin store størrelse, raske utvikling og tilgjengelighet for visualisering og eksperimentelle manipulasjoner. Den største tekniske begrensningen hadde imidlertid vært mangelen på robuste tap-av-funksjon-tilnærminger for genfunksjonsanalyser. Denne protokollen beskriver en metodikk for geninaktivering i den utviklende kyllingnetthinnen som involverer transgen ekspresjon av kunstige mikroRNA (miRNA) ved bruk av Tol2-transposonsystemet. I denne tilnærmingen blir et Tol2-transposonplasmid som inneholder en ekspresjonskassett for EmGFP-markøren (smaragdgrønt fluorescerende protein) og kunstige pre-miRNA-sekvenser mot et målgen introdusert i den embryonale kyllingnetthinnen med en Tol2-transposaseuttrykkskonstruksjon ved i ovo-elektroporering . I de transfekterte retinale cellene katalyserer transposasen eksisjonen av ekspresjonskassetten fra transposonvektoren og dens integrasjon i vertskromosomer, noe som fører til stabilt uttrykk for miRNA og EmGFP-proteinet. I vår tidligere studie har vi vist at uttrykket av Nel, et glykoprotein som utøver flere funksjoner i nevral utvikling, kan undertrykkes betydelig i den utviklende kyllingnetthinnen ved å bruke denne teknikken. Våre resultater indikerer at denne metodikken induserer en stabil og robust undertrykkelse av genuttrykk og dermed gir en effektiv tap-av-funksjon-tilnærming for studier av netthinneutvikling.
Introduction
Virveldyrets netthinne er et viktig modellsystem for å studere nevral utvikling. Til tross for sin perifere plassering er netthinnen anatomisk og utviklingsmessig en forlengelse av sentralnervesystemet, og optisk nerve, som består av axoner av retinale ganglionceller, representerer en kanal i sentralnervesystemet. Chick retina har betydelige fordeler som et modellsystem for å studere den molekylære mekanismen for nevral utvikling: Den er stor og utvikler seg raskt; den har strukturelle og funksjonelle likheter med den menneskelige netthinnen; Det er svært tilgjengelig for visualisering og eksperimentelle manipulasjoner. Molekylære mekanismer for celleproliferasjon og differensiering, morfogenese og aksonveiledning under nevral utvikling har blitt grundig studert ved bruk av kyllingnetthinnen.
I ovo har elektroporering blitt brukt i løpet av de siste to tiårene for å introdusere ektopiske gener i celler i det utviklende kyllingembryoet. Denne teknikken tillater merking av utviklingsceller, sporing av celleskjebne og sporing av cellemigrasjon og aksonkanaler, samt ektopisk genuttrykk for in vivo-analyse av genfunksjon. Betingelsene for in ovo elektroporering for effektiv ektopisk genekspresjon i kyllingembryoer har vært godt etablert 1,2,3.
Til tross for disse fordelene hadde mangelen på en stabil tap-av-funksjon-teknikk for studier av genfunksjon vært en stor teknisk begrensning for kyllingembryoet. Mens kyllingembryoer elektroporert med små forstyrrende RNA (siRNAer)4 eller ekspresjonsvektorer for korte hårnåls-RNA (shRNA)5 viser nedslag av det målrettede genet, er genundertrykkelse i disse tilnærmingene forbigående fordi effektene forsvinner når cellene mister de introduserte RNAene eller DNAene. En mer stabil genundertrykkelse kan oppnås ved å levere siRNA til kyllingembryoer ved hjelp av et RCAS (R-eplikasjon Competent Avian sarkom-leukosevirus (ASLV) long terminal repeat (LTR) med en Splice acceptor) retrovirussystem 6. Den virale vektoren integreres i vertsgenomet, og ektopiske gener uttrykkes stabilt. Imidlertid kan retroviruset bare integreres i genomet av delende celler under den mitotiske (M) fasen av cellesyklusen, noe som kan pålegge en begrensning på utviklingsstadiene og / eller celletypene som denne tap-av-funksjon-tilnærmingen kan brukes på. I tillegg virker ekspresjon av transgener av RCAS langsommere og mindre robust enn det som induseres av i ovo elektroporering7.
Transposoner er genetiske elementer som beveger seg fra ett sted på genomet til et annet. Tol2-elementet er medlem av hAT-transponerbar elementfamilie og inneholder et internt gen som koder for en transposase som katalyserer transposonreaksjonen til Tol2-elementet8. Når en plasmidvektor som bærer en genuttrykkskassett flankert av sekvensene av venstre og høyre ende av Tol2-elementene (henholdsvis 200 bp og 150 bp) blir introdusert i virveldyrceller med en Tol2-transposaseekspresjonskonstruksjon, blir ekspresjonskassetten skåret ut fra plasmidet og integrert i vertsgenomet, som støtter et stabilt uttrykk av ektopisk gen (figur 1). Det har vist seg at det transponerbare elementet Tol2 kan indusere gentransposisjon svært effektivt hos forskjellige virveldyrarter, inkludert sebrafisk9,10, frosker 11, kyllinger 12 og mus 13, og er dermed en nyttig metode for transgenese og innsettingsmutagenese. Tol2-transposonsystemet har blitt brukt til betinget knockdown av et målgen ved genomisk integrasjon av siRNA som behandles fra langt dobbeltstrenget RNA14.
Denne protokollen beskriver en tap-av-funksjon-tilnærming i kyllingembryoet som involverer innføring av kunstige mikroRNA (miRNA) av Tol2-transposonsystemet15,16. I denne tilnærmingen klones en ekspresjonskassett for EmGFP-markøren (smaragdgrønt fluorescerende protein) og kunstige miRNA mot et målgen til en Tol2-transposonvektor. Tol2 transposon-konstruksjonen blir deretter introdusert i den embryonale chick retina med en Tol2 transposase ekspresjonskonstruksjon ved i ovo elektroporering. I de transfekterte retinale cellene katalyserer transposasen eksisjonen av ekspresjonskassetten fra transposonvektoren og dens integrasjon i vertskromosomer, noe som fører til stabilt uttrykk for miRNA og EmGFP-proteinet. I våre tidligere studier slo vi vellykket ned uttrykket av Nel, et ekstracellulært glykoprotein hovedsakelig uttrykt i nervesystemet, i den utviklende kyllingretina (se representative resultater). Våre resultater tyder på at stabil og effektiv gensuppresjon kan oppnås i ovo ved denne teknikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konstruksjon av miRNA-ekspresjonsvektorer
MERK: Prosedyrene for konstruksjon av miRNA-ekspresjonsvektorer (trinn 1.1-1.3, 1.5-1.6.) er optimalisert for miRNA-uttrykkssettet, Block-iT Pol II miR RNA-uttrykkssett med EmGFP, som tidligere beskrevet15,16. Settet inneholder ekspresjonsvektoren designet for å tillate miRNA-ekspresjon (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), en kontrollvektor (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativt kontrollplasmid), tilbehørsreagenser og instruksjoner for å produsere miRNA-ekspresjonsvektorer (se materialfortegnelse)17.
- Designe enkeltstrengede DNA-oligoer som koder for pre-miRNA mot målgenet: Design enkeltstrengede DNA-oligoer ("toppstreng" oligoer (målpre-miRNAer) og "bunnstreng" oligoer (komplement av toppstrengoligoer)) ved hjelp av det elektroniske verktøyet, RNAi Designer (se materialfortegnelse). Se figur 2 for de nødvendige egenskapene til de enkeltstrengede oligoene (figur 2A) og eksempler på målsekvenser (figur 2B).
MERK: Det anbefales at 5-10 pre-miRNA-sekvenser genereres for et gitt målgen og screenes for knockdown-aktiviteter in vitro (trinn 1.4). - Annealing av topp- og bunnstrengoligoene for å generere en dobbeltstrenget oligo
- Sett opp følgende glødningsreaksjon (tabell 1) i et sterilt 0,5 ml mikrosentrifugerør.
- Inkuber reaksjonsblandingen ved 95 °C i 4 minutter. Anneal topp- og bunnstrengoligoene for å generere en dobbeltstrenget oligo ved å la reaksjonsblandingen avkjøles til romtemperatur (RT) i 5-10 minutter. Sentrifuger prøven kort (~5 s).
MERK: Glødet oligos kan lagres ved -20 ° C uten nedbrytning i minst ett år.
- Kloning av dobbeltstrengede oligoer i miRNA-ekspresjonsvektoren (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (Leveres i miRNA-ekspresjonssettet)): Klon individuelle dobbeltstrengede oligoer inn i den lineariserte miRNA-ekspresjonsvektoren, i henhold til produsentens håndbok17.
- Evaluering av knockdown-effekter
MERK: Det anbefales at individuelle miRNA-sekvenser testes for genundertrykkelseseffektivitet in vitro før de brukes i ovo. Knockdown-effektiviteten kan testes ved å transfektere miRNA-ekspresjonsplasmider til en cellelinje som uttrykker målgenet. Alternativt kan individuelle miRNA-ekspresjonsplasmider overføres til cellelinjer med en ekspresjonskonstruksjon for målgenet. For målgener som koder for proteiner som ikke er membranforankret i sin opprinnelige tilstand (f.eks. Oppløselige proteiner), kan et alkalisk fosfatase (AP) fusjonsprotein brukes til å overvåke uttrykket av målproteinet. En cDNA-sekvens som koder for målproteinet kan smeltes i ramme til human placental alkalisk fosfatase i AP-tag-vektorer (APtag-1- APtag-5; se materialtabell) og introduseres i celler18. Når det uttrykkes i kulturceller (f.eks. HEK293T celler), utskilles det AP-merkede målproteinet på høye nivåer i kulturmedier, og dermed kan knockdown-effekter av miRNA-sekvenser evalueres ved å måle reduksjonen i AP-aktivitet i kulturmediet til miRNA-transfekterte celler (undertrinn 1.4.1-1.4.4).- Kultur HEK293T celler i en 24-brønns plate (8 x 104 celler / brønn) over natten. Transfeksjon av cellene med individuelle miRNA-ekspresjonskonstruksjoner med et ekspresjonsplasmid av et AP-merket målprotein. Bruk pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativt kontrollplasmid (gitt i miRNA-ekspresjonssettet) som en kontroll. (Hvis cellelinjer som stabilt uttrykker et AP-merket målprotein brukes, transfekt cellene bare med individuelle miRNA-uttrykkskonstruksjoner.)
MERK: Et konvensjonelt lipofeksjonsreagens (se materialfortegnelse) brukes til transfeksjon. - Samle det kondisjonerte mediet 48-72 timer etter transfeksjonen og varmen, inaktiver den endogene AP-aktiviteten i et 65 ° C vannbad i 5 minutter. Spinout rusk i en stasjonær mikrosentrifuge ved maksimal hastighet i 5 minutter.
- Bufr supernatanten med 10 mM HEPES, pH 7,0 og før den gjennom et 0,45 μm filter.
- Ta 100 μL (for måling i en plateleser) eller 500 μL (for et spektrofotometer) av supernatanten og legg til en lik mengde 2x AP-substratbuffer (tabell 2). Kontroller AP-aktiviteten ved å måle OD405 i en plateleser eller et spektrofotometer.
MERK: Hvis AP-aktiviteten til det kondisjonerte mediet er for høy for nøyaktig måling, fortynn den med HBAH-buffer (Hanks balansert saltløsning (HBSS), 0,5 mg / ml bovint serumalbumin, 20 mM HEPES (pH 7,0)) eller en annen buffer som inneholder et bærerprotein. Ikke bruk fosfatholdige buffere (f.eks. PBS) fordi uorganisk fosfat virker som en kompetitiv hemmer av AP.
- Kultur HEK293T celler i en 24-brønns plate (8 x 104 celler / brønn) over natten. Transfeksjon av cellene med individuelle miRNA-ekspresjonskonstruksjoner med et ekspresjonsplasmid av et AP-merket målprotein. Bruk pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativt kontrollplasmid (gitt i miRNA-ekspresjonssettet) som en kontroll. (Hvis cellelinjer som stabilt uttrykker et AP-merket målprotein brukes, transfekt cellene bare med individuelle miRNA-uttrykkskonstruksjoner.)
- Kjetting av miRNA-sekvens
MERK: Knockdown-effekter kan forbedres ved å kjede forskjellige miRNA mot samme målgen eller gjenta det samme miRNA. MiRNA-ekspresjonsvektoren støtter kjetting av flere pre-miRNA-sekvenser og deres co-cistronic uttrykk17.- Kjede to forskjellige pre-miRNA-sekvenser (mot samme målgen) som viser høyeste knockdown-aktiviteter i in vitro-analyser (trinn 1.4), i henhold til produsentens instruksjoner17.
- Evaluere genundertrykkelseseffektiviteten til de kjedede konstruksjonene ved hjelp av in vitro-analyser som beskrevet i trinn 1.4. Hvis tre eller flere pre-miRNA-sekvenser viser lignende høye knockdown-aktiviteter, test forskjellige kombinasjoner av to sekvenser og bruk kombinasjonene som viser den høyeste knockdown-aktiviteten (se Representative resultater).
- Overføre EmGFP-pre-miRNA-ekspresjonskassetten til Tol2-transposonvektoren
MERK: Uttrykkskassetten som inneholder EmGFP cDNA og to pre-miRNA-sekvenser overføres til Tol2-transposonvektoren (pT2K-CAGGS-vektor, se materialfortegnelse). For dette formål blir uttrykkskassetten (som omfatter fra 3'-enden av CMV-promotoren til miRNA-reverssekvenseringsprimerstedet til miRNA-ekspresjonsvektoren) PCR-forsterket ved bruk av primere med et kunstig restriksjonsenzymsted, og PCR-produktet klones inn i Tol2-transposonvektoren. Tol2 transposonvektoren inneholder den allestedsnærværende CAGGS-promotoren, som driver uttrykket til den innsatte uttrykkskassetten. CAGGS-promotoren og uttrykkskassetten er flankert av Tol2-sekvensene (figur 1).- PCR-amplifikasjon av EmGFP-pre-miRNA-ekspresjonskassetten: Følg reaksjonsoppsettet og termosyklusforholdene beskrevet i tabell 3.
- Liger det gelrensede PCR-produktet (ca. 1,3 kb) inn i restriksjonsenzymfordøyd Tol2 transposonvektor. Elektroporer plasmidet til kompetente E. coli-celler (se materialfortegnelse) og velg rekombinantene (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA-konstruksjoner).
- Forbered plasmidet ved å bruke et konvensjonelt maxiprep-sett (se materialfortegnelse). Kontroller strukturen og sekvensen av plasmidet ved henholdsvis restriksjonskartlegging og ved å bruke primerne som brukes til PCR.
2. Egglagring og inkubering
- Kjøp befruktede hvite leghorn (Gallus gallus) egg fra lokale gårder eller kommersielle leverandører.
MERK: Egg kan oppbevares ved 12-16 °C eller ved 4 °C i opptil 1 uke før inkubering uten betydelig tap av levedyktighet eller forsinkelse i utvikling under inkubasjon. - Merk eggene med startdato for inkubasjon og merk oversiden av egget (hvor embryoet skal plasseres). Inkuber befruktede egg i horisontal stilling ved 38 °C til embryoene har nådd Hamburger og Hamilton (HH) trinn 10 (33-38 timer) -11 (40-45 timer) 19.
3. I ovo elektroporering
- Forberedelse for in ovo elektroporering
- Fremstilling av 0,25% rask grønn løsning: Løs opp 25 mg Fast Green FCF i 10 ml PBS. Filtrer oppløsningen med et 0,2 μm sprøytefilter. Løsningen kan lagres hos RT.
- DNA-cocktail: Forbered injeksjonsoppløsningen ved å blande de individuelle pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA-plasmidene (subtrinn 1.6.3) med Tol2-transposaseuttrykksplasmidet (pCAGGS-T2TP-vektoren; se materialtabellen) (5 μg / μL hver) i forholdet 2: 1. Legg til 1/10 volum på 0,25% rask grønn løsning for å visualisere det injiserte området.
MERK: Den optimale DNA-konsentrasjonen kan variere avhengig av konstruksjonene. - Oppsett av mikroinjeksjonsapparatet (figur 3A,B): Mikroinjeksjonsapparatet består av følgende (se materialfortegnelse): Hamilton sprøyte, 18 G kanyle (nållengde = 2"), PVC (polyvinylklorid) slange (2 cm lengde), mikropipette nål (kan lages ved å trekke kapillærrør med omega dot fiber (1 mm O.D. X 0.75 mm I.D) med en mikropipettetrekker).
- Fyll en Hamilton sprøyte med tung mineralolje. Fest en 18 G kanyle til sprøyten og fyll det indre rommet av nålen med olje ved å trykke inn sprøytestempelet.
- Fest et stykke 2 cm langt PVC-slange til enden av nålen og fyll slangen med oljen.
- Fest en trukket mikropipettekanyle til slangen. Brekk av spissen av mikropipettenålen til en diameter på 10-20 μm med fintang for å lage en liten åpning. Fyll hele kanylen med olje.
MERK: Forsiktighet bør utvises for ikke å fange opp luftbobler i systemet, da de vil hemme strømmen av DNA-oppløsningen.
- Legg 5 μL av den fargede DNA-cocktailen (undertrinn 3.1.2) på en steril petriskål. Under dissekeringsmikroskopet plasserer du spissen av mikropipettnålen inn i DNA-oppløsningen på den sterile petriskålen og trekker oppløsningen langsomt inn i nålen.
- Vent til trykket balanserer på innsiden og utsiden av nålen (for å unngå at luft går inn i nålen) og ta spissen av nålen ut av DNA-oppløsningen. Hold spissen av nålen nedsenket i steril PBS i et lite beger til injeksjon.
- Oppsett av elektroporasjonsapparatet (figur 3A, C):
- Sett et par platinaelektroder med en elektrodeholder på en mikromanipulator. Juster avstanden mellom tuppen av elektrodene til 2 mm (figur 3C,E).
- Koble elektrodene til en firkantbølgepulsgenerator med kabler (se materialfortegnelse).
- Mikroinjeksjon av DNA-oppløsning (figur 3D)
- Fjern et kyllingegg fra inkubatoren og tørk overflaten av egget med et silkepapir gjennomvåt i 70% etanol.
- Fest en 18 G kanyle til en 10 ml sprøyte. Stikk nålen gjennom den butte enden av egget, vinklet nedover (45°) for å unngå å skade eggeplommen.
- Trekk ut 2-3 ml albumin fra egget. Forsegl hullet med et stykke skotsk tape. Bekreft at embryoet og vitellinemembranen er løsnet fra skallet ved å "candling" egget med lys.
- Fjern et stykke eggeskall (2-3 cm diameter sirkel) fra toppen av egget ved hjelp av saks og tang for å avsløre embryoet. Ikke vindu mer enn fem egg til enhver tid for å forhindre uttørking av embryoer under elektroporering.
MERK: Hvis det er vanskelig å åpne et vindu uten å knekke egget, kan hele toppen av egget dekkes med Sellotape eller Scotch tape før du fjerner et stykke eggeskall. - Stikk spissen av nålen inn i den optiske vesikkelen fra dens proksimale side i en 45° vinkel og injiser DNA-cocktailen ved sakte å trykke ned (eller banke på) stempelet til den blåfargede oppløsningen fyller lumen (figur 3D).
MERK: Alternativt kan et trykkmikroinjeksjonssystem (se materialtabell) brukes til injeksjon av DNA-løsninger. - Trekk kanylen ut og sett spissen tilbake i PBS.
- Elektroporering (figur 3E)
- Still inn pulsparametrene til elektroporatoren som følger: Spenning: 15 V, Pulslengde: 50 ms, Pulsintervall: 950 ms, Pulstall: 5
- Legg til noen dråper HBSS på vitellinemembranen over embryoet. Senk elektrodene inn i HBSS ved hjelp av mikromanipulatoren, vinkelrett på embryoets fremre-bakre akse.
MERK: Alternativt kan denne prosedyren gjøres uten å legge til HBSS, da albumin er en god elektrisk leder som muliggjør effektiv elektroporering. - Plasser elektrodene på hver side (fremre (nasale) side og bakre (temporale) side) av optisk vesikkel (figur 3E). Forsikre deg om at elektrodene ikke berører embryoet eller blodårene. Påfør pulserende elektriske felt.
- Fjern elektrodene og rengjør elektrodene forsiktig med en vannfuktet steril bomullspinne for å unngå akkumulering av albumin.
- Forsegl vinduet med Scotch tape og re-inkubere embryoet til ønsket utviklingsstadium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konstruksjon av Tol2 transposon konstruksjoner for uttrykk av kunstige miRNA mot Nel
Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; også kjent som Nell2) er et ekstracellulært glykoprotein. Det har strukturelle likheter med trombospondin-1 og uttrykkes hovedsakelig i nervesystemet20,21. Vi har tidligere vist at Nel regulerer differensiering og overlevelse av retinale ganglionceller15 og fungerer som et hemmende veiledningssignal for retinale aksoner22,23,24. I den utviklende kyllingnetthinnen påvises Nel-uttrykk i det presumptive pigmentepitelet ved HH15 (embryonal dag (E) 2.5). Ved HH20 (E3.5) observeres også Nel-uttrykk i nylig differensierte retinale ganglionceller. Sterkt uttrykk av Nel i pigmentepitel og retinale ganglionceller fortsetter i hvert fall til E1815.
For å undersøke funksjonen til Nel i utviklingen av retinale ganglionceller, ble ekspresjon av Nel-genet slått ned ved å introdusere kunstige miRNA i den utviklende retina ved hjelp av ovo-elektroporering og Tol2-transposonsystemet15,16. For det første ble par enkeltstrengede DNA-oligonukleotider designet for 10 potensielle målsekvenser i den proteinkodende regionen av kyllingen Nel cDNA (GenBank tiltredelsesnummer: NM_001030740.1) ved å bruke det elektroniske RNAi-designverktøyet (se materialfortegnelse). Oligonukleotidparene ble glødet og individuelt klonet inn i miRNA-ekspresjonsvektoren. Deretter ble individuelle konstruksjoner transfektet til HEK293T celler som stabilt uttrykker Nel-AP, og deres knockdown-effektivitet ble evaluert ved å måle AP-aktivitet i kulturmediene. Det pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative kontrollplasmidet ble brukt som kontroll (figur 4A).
Tre Nel pre-miRNA-sekvenser som viste høyeste knock down-effekter ble valgt (mot nukleotider 482-502, 910-930 og 2461-2481 av kylling Nel cDNA, henholdsvis), og to pre-miRNA-sekvenser ble tandemly klonet inn i miRNA-ekspresjonsvektoren (pcDNA6.2-GW / EmGFP-2x Nel pre-miRNA), i henhold til produsentens instruksjoner17. Uttrykkskassetter som koder for de to pre-miRNA og EmGFP ble forsterket av PCR med et kunstig EcoRI-sted i begge ender (5'-GGGAATTCTCTGGCTAACTAGAGAAC-3' og 5'-CCGAATTCCCTCTAGATCAACCACT-3') og klonet inn i pT2K-CAGGS-vektoren (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). Sekvensen av uttrykkskassetten ble bekreftet ved å bruke primerne som ble brukt til PCR. pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA-konstruksjoner ble individuelt transfektet med Tol2-transposase-ekspresjonsvektoren (pCAGGS-T2TP) til HEK293T celler som stabilt uttrykker Nel-AP, og hemmende effekter på Nel-AP-uttrykk ble evaluert ved å måle AP-aktivitetene i kulturmediene. Som vist i figur 4B ble knockdown-effektiviteten betydelig forbedret ved kjeding av to miRNA-sekvenser. Robust undertrykkelse av Nel-AP-uttrykk (mer enn 90 %) ble observert minst inntil 13 dager etter transfeksjon (figur 4B).
Stabil undertrykkelse av Nel-uttrykk i den utviklende kyllingnetthinnen
En pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA-konstruksjon (som inneholder målsekvenser for nukleotider 482-502 og 2461-2481 av kyllingen Nel cDNA) ble co-transfektert med transposaseekspresjonsvektoren (pCAGGS-T2TP) til den temporale eller nasale siden av kyllingnetthinnen ved in ovo-elektroporering ved HH9-11 (figur 3, figur 5A). Snitt ble fremstilt fra E4.5 eller E8 retinae, og effekter på Nel-ekspresjon ble evaluert ved immunhistokjemi ved bruk av anti-Nel-antistoff22. Ved E4.5 ble ekspresjonen av Nel i retinalpigmentepitelet signifikant redusert i EmGFP-uttrykkende celler (figur 5B-D). Ved E8 ble reduksjoner i Nel-uttrykk også tydelig observert i retinale ganglionceller (figur 5E-I). Betydelig undertrykkelse av Nel-uttrykk fortsatte i hvert fall til E18 (data ikke vist). Innføringen av kontroll-miRNA påvirket ikke Nel-uttrykket i netthinnen (figur 5J-O).
Figur 1: Transposisjon av Tol2-flankerte cDNA ved transposase. Et skjema som viser transposisjon av en Tol2-flankert ekspresjonskassett for EmGFP og lenket to pre-miRNA-sekvenser (2x pre-miRNA) ved transposase. Når en Tol2 transposonvektor som inneholder ekspresjonskassetten (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA-konstruksjon) blir introdusert i celler med en Tol2 transposase-ekspresjonskonstruksjon (pCAGGS-T2TP), blir Tol2-flankert ekspresjonskassett skåret ut fra vektoren og integrert i vertsgenomet ved transposaseaktiviteten. Ekspresjon av EmGFP og miRNA drives av den allestedsnærværende promotoren CAGGS. Denne figuren er modifisert fra Nakamoto et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Struktur av det konstruerte pre-miRNA. (A) Den designede pre-miRNA-sekvensen er basert på murine miR-155-sekvensen17. Toppstrengoligo inneholder (fra 5'-enden til 3'-enden) et fire-nukleotidoverheng (TGCT (blå)), antisense-målsekvens (21 nukleotider), terminal sløyfesekvens (rød) og sensemålsekvens (19 nukleotider). Antisense-målsekvensen representerer den modne miRNA-sekvensen. Bunnstrengoligo inneholder et fire-nukleotid 5' overheng (CCTG (blå)) og omvendt komplementsekvens av toppstrengoligoen, men mangler fire-nukleotidoverhenget i 3'-enden (AGCA-3': omvendt komplement av 5'-TGCT av toppstrengoligo). Sensemålsekvensen mangler nukleotider 9 og 10 i målsekvensen. De "ekstra" to nukleotidene i antisense-målsekvensen danner en intern sløyfe i stamsløyfestrukturen til det modne miRNA-molekylet, noe som resulterer i en høyere knockdown-hastighet17. (B) Et eksempel på målsekvens mot kylling Nel. Sanse- og antisensesekvenser i topp- og bunnstrengene for en målsekvens av kyllingens Nel-gen (GenBank tiltredelsesnummer NM_001030740.1, nukleotider 482-502) er vist. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: I ovo mikroinjeksjon og elektroporering. (A) Arbeidsstasjon for in ovo mikroinjeksjon og elektroporering. (1) Dissekere mikroskop. (2) Injeksjonsapparat. (3) Elektroporeringsapparat. (4) Dual gooseneck mikroskop belysning. (5) Elektroporator. (B) Injeksjonsapparat. En Hamilton-sprøyte (6) med en 18 G kanyle (7) er koblet til PVC-slangen (8) og til en trukket mikropipettkanyle (9) og satt på en mikromanipulator (10). Apparatets indre rom er fylt med tung mineralolje. (C) Elektroporeringsapparat. Et sett platinaelektroder (11) med elektrodeholder (12) settes på en mikromanipulator (13). Elektrodene er koblet til elektroporatoren med kabler (14). (D) Mikroinjeksjon av DNA-cocktailoppløsning i optisk vesikkel ved HH 10-11. Den trukne mikropipettenålen settes inn i den optiske vesikkelen fra dens proksimale side. DNA-cocktailløsning med rask grønn (blå) injiseres i optisk vesikkel til fargestoffet fyller hele lumen. (E) Elektroporering i optisk vesikkel. Elektroder er plassert parallelt (Avstanden mellom elektrodene er 2 mm) og på en måte slik at den injiserte optiske vesikkelen er plassert mellom elektrodene: En elektrode ligger nær den fremre (nasale) overflaten av den optiske vesiklet, og den andre er i den bakre delen av embryoet på bakveiens nivå. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: In vitro evaluering av individuelle eller kjedede pre-miRNA-sekvenser for Nel-genundertrykkelseseffektivitet. (A) Knockdown-effekter av individuelle pre-miRNA-sekvenser. Resultater fra fem representative konstruksjoner (Antisense-målsekvenser tilsvarende nukleotidtall 482-502, 910-930, 1106-1126, 1663-1683 og 2461-2481 av kylling Nel cDNA (GenBank tiltredelsesnummer: NM_001030740.1)) er vist. Individuelle miRNA-ekspresjonskonstruksjoner (pcDNA6.2-GW/EmGFP-Nel pre-miRNA) ble transfektert til HEK293T celler som stabilt uttrykker Nel-AP. PCDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativt kontrollplasmid ble brukt som kontroll. Ekspresjon av Nel-AP ble evaluert ved å måle AP-aktivitetene i kulturmediene 48-96 timer etter transfeksjon. Tre Nel pre-miRNA-ekspresjonskonstruksjoner (mot henholdsvis nukleotider 482-502, 910-930 og 2461-2481) viste signifikant undertrykkelse av Nel-uttrykk. (B) Knockdown-effekter av kjedede pre-miRNA-sekvenser. To av de tre mest potente pre-miRNA-sekvensene (mot nukleotider 482-502, 910-930 og 2461-2481) ble tandemt klonet inn i pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-vektoren, og ekspresjonskassetten (som inneholdt de to pre-miRNA-sekvensene og EmGFP cDNA) ble overført til pT2K-CAGGS-vektoren (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA-konstruksjonene ble individuelt co-transfektet med ekspresjonsvektorer for Tol2-transposase (pCAGGS-T2TP) til HEK293T celler som stabilt uttrykker Nel-AP, og ekspresjon av Nel-AP ble evaluert ved å måle AP-aktivitetene i kulturmediene fra 2 til 13 dager etter transfeksjon. Alle tre kombinasjonene (482-502/910-930, 482-502/2461-2481, 910-930/2461-2481) viste forbedrede undertrykkelsesaktiviteter sammenlignet med ikke-kjedede individuelle pre-miRNA-sekvenser. Signifikant suppresjon av Nel-AP-uttrykk ble observert fra dag 2 til minst dag 13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Stabil knockdown av Nel-uttrykk i den utviklende kyllingretina ved Tol2 transposonmediert integrasjon av miRNA-transgen. En Tol2 transposonkonstruksjon som inneholder en ekspresjonskassett av to Nel pre-miRNA-sekvenser og EmGFP (pT2K-CAGGS-EmGFP-Nel pre-miRNA (482-502)-Nel pre-miRNA (2461-2481)) (A-I) eller en kontrollkonstruksjon som uttrykker et ikke-relatert miRNA og EmGFP (J-O) ble co-transfektert med en transposase ekspresjonsvektor (pCAGGS-T2TP) til den temporale eller nasale halvdelen av optisk vesikkel av i ovo elektroporering ved HH9-HH11 (E1.5). Netthinnesnitt ble fremstilt ved E4,5 (B-D, J-L) eller E8 (E-I, M-O), og effekten av Nel-gensuppresjon ble undersøkt med immunhistokjemi med anti-Nel-antistoff (rødt). Siden DNA er negativt ladet, blir transgenene elektroporert inn i vevet på anodesiden; Dermed ble bare halvparten av netthinnen merket med EmGFP (transfeksjon (TF) side, grønn). (A) Ekspresjon av EmGFP-markørgenet i den temporale halvdelen av netthinnen ved E4.5. Den optiske sprekken (hvit pil) representerer grensen mellom transfekterte og utransfekterte (kontroll) sider. (B-I) RNAi knockdown av Nel-uttrykk i den utviklende kyllingnetthinnen. (VG Nett) Ved E4.5 reduseres Nel-ekspresjon signifikant (B,D) i celler fra retinalpigmentepitel (PE) som uttrykker EmGFP (C,D). Legg merke til det komplementære mønsteret av Nel-immunfarging og EmGFP-uttrykk i D. NR, nevrale netthinner. (E-I) Ved E8 reduseres Nel-ekspresjon (E,G) i retinalpigmentepitelet og ganglioncellelaget (GCL) på transfeksjonssiden (F,G). (H, I) Høyere forstørrelse av henholdsvis et transfeksjonsområde og et tilsvarende kontrollområde i E (indikert med små rektangler). (D,G) Sammenslåtte bilder av de to venstre bildene. (VG Nett) Uttrykk for kontroll miRNA. Innføring av den negative kontrollkonstruksjonen påvirker ikke uttrykket av Nel i E4.5 (J-L) eller E8 (M-O) retina. (L,O) Sammenslåtte bilder av de to venstre bildene. Grensen mellom transfeksjons- og kontrollsider er indikert med en stiplet linje i C, F, K og N. Skalastenger, 50 μm. (A) og (B-I) er modifisert fra henholdsvis Nakamoto, M. & Nakamoto, C 16 og Nakamoto etal.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Annealing reaksjon oppsett | |
| Toppstrengoligo (200 μM i TE-buffer) | 5 μL (endelig konsentrasjon 50 μM) |
| Oligo med bunnstreng (200 μM i TE-buffer) | 5 μL (endelig konsentrasjon 50 μM) |
| 10x Oligo glødningsbuffer* | 2 μL |
| DNase/RNase-fritt vann* | 8 μL |
| Total | 20 μL |
| * Leveres i miRNA-uttrykkssettet (se Materialfortegnelse) | |
Tabell 1: Oppsett av glødningsreaksjon
| 2x AP-substratbuffer | |
| 10 m dietanolamin (pH 9,8) | 4 ml |
| 1 M MgCl2 | 10 μL |
| L-homoarginin | 45 mg |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 10 mg |
| p-nitrofenylfosfat | 63 mg |
| H2O | Legg til for å utgjøre et totalt volum på 20 ml |
Tabell 2: 2x AP-substratbuffer. Oppløsningen skal oppbevares i alikoter ved -20 °C og beskyttes mot lys da p-nitrofenylfosfat er lysfølsomt.
| Oppsett av reaksjoner | |||
| pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x pre-miRNA-plasmid (fra seksjon 1.5) eller pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativt kontrollplasmid* (0,1 μg/μL) |
1 μL | ||
| 10x Pfu-buffer | 5 μL | ||
| dNTP-blanding (10 mM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP) | 1 μL | ||
| EmGFP forward primer* (5'-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| miRNA omvendt primer* (5'- CTCTAGATCAACCACTTTGT-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| Pfu DNA-polymerase (5 enheter/μL) | 0,5 μL | ||
| H2O | 40,5 μL | ||
| Totalt volum | 50 μL | ||
| * Leveres i miRNA-uttrykkssettet. | |||
| Termosykling forhold | |||
| 94 °C | 5 min | ||
| 30 sykluser av følgende: | |||
| 94 °C | 45 s | ||
| 58 °C | 1 min | ||
| 72 °C | 2 min | ||
| 72 °C | 10 min | ||
Tabell 3: Reaksjonsoppsett og termosyklingsbetingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gir en detaljert veiledning til geninaktivering i den utviklende kyllingnetthinnen ved transgen ekspresjon av kunstige miRNA ved bruk av ovo-elektroporering og Tol2-transposonsystemet.
Følgende faktorer er av avgjørende betydning for å utføre denne teknikken vellykket. For det første er det kritisk å bruke miRNA-sekvenser som er bekreftet for å utøve robuste knockdown-effekter. Før du bruker dem til ovo-elektroporering, test individuelle pre-miRNA-sekvenser for genundertrykkelseseffektivitet i in vitro-analyser (trinn 1.4) og kjede to pre-miRNA-sekvenser som viser de høyeste knockdown-aktivitetene (trinn 1.5). For det andre er det viktig å ikke skade den optiske vesikkelen og omkringliggende nervevev når mikropipettkanylen settes inn for injeksjon av DNA-oppløsningen. Overdreven skade på embryoer kan føre til embryonal misdannelse og død. For å unngå vevskader, introduser mikropipetten i optisk vesikkel i riktig retning. Mindre og skarpere spisser av mikropipettnålen vil gjøre penetrasjonen av den optiske vesikkelen jevnere og resultere i mindre vevskader. Imidlertid har nåler med svært små tips problemer med å laste og frigjøre DNA-løsningen. I studien beskrevet her ble det brukt nåler med en spissåpning på 10-20 μm diameter. For det tredje, sørg for å fylle hele optisk vesikkel med DNA-løsningen (som visualisert ved spredning av rask grønn). For det fjerde, plasser elektrodene i de optimale posisjonene for å målrette DNA i ønsket område av optisk vesikkel (f.eks. Temporal side, nasal side). Negativt ladede DNA-molekyler vil bevege seg mot anodesiden; Derfor påvirker den nøyaktige plasseringen og orienteringen av elektrodene kritisk de endelige resultatene. Til slutt, bruk de optimale DNA-konsentrasjonene og elektroporasjonsparametrene.
Hvis det ikke observeres fluorescerende signal etter 24 timers elektroporering, bør følgende vurderes: (1) Bekreft at de elektroporerte plasmidene har riktige sekvenser. (2) Kontroller konsentrasjonen og renheten av individuelle plasmider på nytt. (3) Forsikre deg om at DNA-løsningen fyller lumen i optisk vesikkel, og at den ikke diffunderer bort i nevrale røret. (4) Kontroller at elektroporasjonsparametrene som brukes, er riktige. (5) Kontroller at elektrodene er i kontakt med vitellinemembranen mens de elektriske pulsene påføres.
Kombinasjonen av in ovo-elektroporering og en transposonmediert genintegrasjonsmetode i denne protokollen gir flere forskjellige fordeler. For det første støtter den stabil produksjon av miRNA og dermed vedvarende undertrykkelse av målgener. Utviklingen av chick retina starter ved E1.5 og fortsetter til klekking (Retinal ganglionceller produseres i perioden fra E2 til E9). Ved funksjonstapsanalyse av genfunksjon bør ekspresjon av kunstige miRNA opprettholdes stabilt i denne perioden. Ekspresjon av RNAi-sekvenser ved bruk av konvensjonelle ekspresjonsvektorer er generelt forbigående fordi uttrykkskonstruksjonen ikke integreres effektivt i kromosomer. I metoden beskrevet her formidles imidlertid kromosomal integrasjon av ekspresjonskassetten av aktiviteten til ko-elektroporert transposase, noe som resulterer i stabilt uttrykk for transgenene.
For det andre, i denne metoden, induserer den samme CAGGS-promotoren co-cistronic ekspresjon av flere miRNA-sekvenser og EmGFP-markøren i transfekterte celler, og omgår dermed risikoen for promotorinterferens, som er en av de vanlige komplikasjonene med retrovirale vektorer som inneholder to promotorer for å oppnå dobbeltgenuttrykk25.
Til slutt, i motsetning til replikasjonskompetente retrovirale vektorer, overføres ikke transgenet som er elektroporert ved denne metoden til naboceller. Derfor kan transfeksjonsområdet styres mer presist ved å bruke passende typer elektroder og ved å plassere dem i de riktige posisjonene.
Til tross for fordelene beskrevet ovenfor, har den nåværende metoden også begrensninger som er iboende i ovo elektroporering. For eksempel kan frekvensen av transfeksjon og genundertrykkelse variere mellom embryoer, og et relativt stort antall embryoer må kanskje transfeksjoneres for analyse. I tillegg har elektroporering i den embryonale netthinnen i ovo i senere utviklingsstadier (f.eks. E4-E5) eksperimentelle vanskeligheter fordi øynene ligger i nærheten av hjertet på disse stadiene, noe som øker risikoen for hjertestans etter elektroporering.
Systemet beskrevet her tillater rask og robust genundertrykkelse i den utviklende kyllingnetthinnen. Denne tilnærmingen kan også brukes på andre deler av kyllingembryoet, inkludert nevrale og ikke-nevrale vev. Vi forventer derfor at dette systemet kan bidra til å belyse molekylære mekanismer for kyllingutvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
pT2K-CAGGS- og pCAGGS-T2TP-vektorene ble levert av henholdsvis Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Kyoto, Japan) og Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Mishima, Japan). Vi takker Michael Berberoglu for hans avgjørende lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Royal Society and Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (UK) til M.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
- Funahashi, J., et al. Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity. Development, Growth & Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).
- Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. In ovo electroporation methods in chick embryos. Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).
- Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development, Growth & Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces. Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Gene. 338 (1), 93-98 (2004).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).
- Kawakami, K., Noda, T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).
- Hou, X., et al. Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA. Development, Growth & Differentiation. 53, 69-75 (2011).
- Nakamoto, C., et al. Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development. Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).
- Nakamoto, M., Nakamoto, C. iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. Mao, C. -A. 8, Springer. 91-108 (2020).
- BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&title=BLOCK-iT&trade (2021).
- Flanagan, J. G., et al. Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos. Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. I. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).
- Jiang, Y., et al. In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel. Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).
- Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions. Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).
- Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue. Development. 146 (4), (2019).
- Yee, J. K., et al. Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).
