Summary
פיתחנו גישה חדשנית של אובדן תפקוד הכוללת החדרה ואינטגרציה גנומית של רצפי מיקרו-רנ"א מלאכותיים לעוברי אפרוחים באמצעות אלקטרופורציה ומערכת טרנספוזון Tol2. טכניקה זו מספקת מתודולוגיית פירוק גנים חזקה ויציבה לחקר תפקוד גנים במהלך ההתפתחות.
Abstract
רשתית האפרוחים היא כבר מזמן מערכת מודל חשובה בנוירוביולוגיה התפתחותית, עם יתרונות הכוללים את גודלה הגדול, התפתחותה המהירה ונגישותה להדמיה ולמניפולציות ניסיוניות. עם זאת, המגבלה הטכנית העיקרית שלה הייתה היעדר גישות חזקות לאובדן תפקוד עבור ניתוח תפקודי גנים. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה של השתקת גנים ברשתית האפרוחים המתפתחת הכוללת ביטוי מהונדס של מיקרו-רנ"א מלאכותי (miRNAs) באמצעות מערכת טרנספוזון Tol2. בגישה זו, פלסמיד טרנספוזון Tol2 המכיל קלטת ביטוי לסמן EmGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק אמרלד) ורצפי קדם-miRNA מלאכותיים כנגד גן מטרה מוכנס לרשתית האפרוח העוברי עם מבנה ביטוי טרנספוזאז Tol2 על ידי באלקטרופורציה של אובו . בתאי הרשתית הנגועים, הטרנספוזואז מזרז את כריתת קלטת הביטוי מווקטור הטרנספוזון ושילובה בכרומוזומי המאכסן, מה שמוביל לביטוי יציב של miRNA וחלבון EmGFP. במחקר הקודם שלנו, הראינו כי הביטוי של Nel, גליקופרוטאין המפעיל פונקציות מרובות בהתפתחות עצבית, יכול להיות מדוכא באופן משמעותי ברשתית אפרוח מתפתחת באמצעות טכניקה זו. התוצאות שלנו מצביעות על כך שמתודולוגיה זו גורמת לדיכוי יציב וחזק של ביטוי גנים ובכך מספקת גישה יעילה של אובדן תפקוד למחקרים על התפתחות הרשתית.
Introduction
רשתית בעלי החוליות היא מערכת מודל חשובה לחקר התפתחות עצבית. למרות מיקומה ההיקפי, הרשתית היא שלוחה אנטומית והתפתחותית של מערכת העצבים המרכזית, ועצב הראייה, המורכב מאקסונים של תאי גנגליון ברשתית, מייצג מערכת בתוך מערכת העצבים המרכזית. לרשתית האפרוחים יתרונות משמעותיים כמערכת מודל לחקר המנגנון המולקולרי של ההתפתחות העצבית: היא גדולה ומתפתחת במהירות; יש לו דמיון מבני ופונקציונלי לרשתית האנושית; הוא נגיש מאוד עבור ויזואליזציה ומניפולציות ניסיוניות. מנגנונים מולקולריים של התרבות תאים והתמיינותם, מורפוגנזה והנחיית אקסונים במהלך ההתפתחות העצבית נחקרו בהרחבה באמצעות רשתית העוף.
בשני העשורים האחרונים נעשה שימוש מוצלח באלקטרופורציה כדי להחדיר גנים חוץ רחמיים לתאים בעובר האפרוח המתפתח. טכניקה זו מאפשרת תיוג של תאים מתפתחים, מעקב אחר גורל התא ומעקב אחר נדידת תאים ודרכי אקסונים, כמו גם ביטוי גנים חוץ רחמי לניתוח in vivo של תפקוד גנים. התנאים של אלקטרופורציה לביטוי גנים חוץ רחמי יעיל בעוברי אפרוחים נקבעו היטב 1,2,3.
למרות יתרונות אלה, היעדר טכניקת אובדן תפקוד יציבה למחקרים על תפקוד גנים היה מגבלה טכנית משמעותית של עובר האפרוח. בעוד שעוברי אפרוחים שהתחשמלו באמצעות רנ"א מפריע קטן (siRNAs)4 או וקטורי ביטוי לרנ"א קצר סיכת שיער (shRNAs)5 מראים הפלה של גן המטרה, דיכוי גנים בגישות אלה הוא חולף מכיוון שההשפעות נעלמות ברגע שהתאים מאבדים את הרנ"א או הדנ"א שהוכנסו. דיכוי גנים יציב יותר יכול להיות מושג על ידי העברת siRNA לעוברי אפרוחים על ידי RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor) retrovirussystem 6. הווקטור הנגיפי משתלב בגנום המארח, והגנים החוץ-רחמיים באים לידי ביטוי יציב. עם זאת, הרטרו-וירוס יכול להשתלב בגנום של תאים מתחלקים רק בשלב המיטוטי (M) של מחזור התא, מה שעשוי להטיל מגבלה על שלבי ההתפתחות ו / או סוגי התאים שעבורם ניתן ליישם גישה זו של אובדן תפקוד. בנוסף, ביטוי טרנסגנים על ידי RCAS נראה איטי יותר ופחות חזק מזה המושרה על ידי אלקטרופורציה7.
טרנספוזונים הם אלמנטים גנטיים הנעים ממקום אחד בגנום למשנהו. אלמנט Tol2 הוא חבר במשפחת האלמנטים הניתנים לטרנספוזון hAT ומכיל גן פנימי המקודד טרנספוזאז המזרז את תגובת הטרנספוזוןשל אלמנט Tol2 8. כאשר וקטור פלסמיד הנושא קלטת ביטוי גנים שמשני צדדיה רצפים של הקצה השמאלי והימני של יסודות Tol2 (200 bp ו-150 bp, בהתאמה) מוכנס לתאי חוליות עם מבנה ביטוי טרנספוזאז Tol2, קלטת הביטוי נכרתת מהפלסמיד ומשולבת בגנום המארח, אשר תומך בביטוי יציב של הגן החוץ רחמי (איור 1). הוכח כי היסוד הטרנספוזי Tol2 יכול לגרום לטרנספוזיציה גנטית ביעילות רבה במינים שונים של בעלי חוליות, כולל דגי זברה9,10, צפרדעים 11, אפרוחים 12 ועכברים 13, ולכן הוא שיטה שימושית של טרנסגנזה ומוטגנזה החדרתית. מערכת הטרנספוזון Tol2 שימשה בהצלחה להפלה מותנית של גן מטרה על ידי אינטגרציה גנומית של siRNA המעובד מ-RNA דו-גדילי ארוך14.
פרוטוקול זה מתאר גישת אובדן תפקוד בעובר אפרוח הכוללת החדרת מיקרו-רנ"א מלאכותי (miRNAs) על ידי מערכת טרנספוזון Tol215,16. בגישה זו, קלטת ביטוי עבור סמן EmGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק אמרלד) ו- miRNA מלאכותי כנגד גן מטרה משובטת לווקטור טרנספוזון Tol2. לאחר מכן מכניסים את מבנה הטרנספוזון Tol2 לרשתית הגוזל העוברי עם מבנה ביטוי טרנספוזון Tol2 על ידי באלקטרופורציה של אובו. בתאי הרשתית הנגועים, הטרנספוזואז מזרז את כריתת קלטת הביטוי מווקטור הטרנספוזון ושילובה בכרומוזומי המאכסן, מה שמוביל לביטוי יציב של miRNA וחלבון EmGFP. במחקרים הקודמים שלנו, הצלחנו להפיל את הביטוי של Nel, גליקופרוטאין חוץ-תאי המתבטא בעיקר במערכת העצבים, ברשתית האפרוח המתפתחת (ראו תוצאות מייצגות). התוצאות שלנו מצביעות על כך שניתן להשיג דיכוי גנים יציב ויעיל באמצעות טכניקה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בניית וקטורי ביטוי miRNA
הערה: ההליכים לבניית וקטורי ביטוי miRNA (שלבים 1.1-1.3, 1.5-1.6.) ממוטבים עבור ערכת ביטוי miRNA, ערכת ביטוי miR של Block-iT Pol II miR עם EmGFP, כפי שתואר קודם לכן15,16. הערכה מספקת את וקטור הביטוי שנועד לאפשר ביטוי miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), וקטור בקרה (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), ריאגנטים נלווים והוראות לייצור וקטורי ביטוי miRNA (ראה טבלת חומרים)17.
- תכנון אוליגוס DNA חד-גדילי המקודד קדם-miRNA כנגד גן המטרה: תכנון אוליגוס DNA חד-גדילי (אוליגוס "גדיל עליון" (אוליגוס "קדם-miRNA מטרה") ואוליגוס "גדיל תחתון" (משלים של אוליגוס גדיל עליון)) באמצעות הכלי המקוון RNAi Designer (ראה טבלת חומרים). ראו איור 2 עבור המאפיינים הנדרשים של אוליגוס חד-גדילי (איור 2A) ודוגמאות של רצפי מטרה (איור 2B).
הערה: מומלץ ליצור 5-10 רצפי קדם-miRNA עבור גן מטרה נתון ולבצע סינון עבור פעילויות knockdown in vitro (שלב 1.4). - חישול האוליגוס העליון והתחתון ליצירת אוליגו דו-גדילי
- הגדר את תגובת החישול הבאה (טבלה 1) בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 0.5 מ"ל.
- יש לדגור על תערובת התגובה בטמפרטורה של 95°C למשך 4 דקות. אנאל את האוליגוס הגדיל העליון והתחתון כדי ליצור אוליגו דו-גדילי על ידי מתן אפשרות לתערובת התגובה להתקרר לטמפרטורת החדר (RT) למשך 5-10 דקות. צנטריפוגה את הדגימה בקצרה (~ 5 שניות).
הערה: ניתן לאחסן את האוליגוס המחושלים בטמפרטורה של -20°C ללא התפרקות למשך שנה לפחות.
- שיבוט האוליגוס הדו-גדילי לווקטור ביטוי miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (מסופק בערכת ביטוי miRNA)): שיבוט אוליגוס דו-גדילי בודדים לווקטור ביטוי miRNA ליניארי, על פי מדריך היצרן17.
- הערכה של השפעות דפיקה
הערה: מומלץ לבדוק רצפי miRNA בודדים ליעילות דיכוי גנים במבחנה לפני שהם מיושמים באובו. ניתן לבדוק את יעילות ההדבקה על ידי הדבקת פלסמידים של ביטוי miRNA לקו תאים המבטא את גן המטרה. לחלופין, פלסמידים בודדים של ביטוי miRNA יכולים להיות מועתקים לשורות תאים עם מבנה ביטוי עבור גן המטרה. עבור גני מטרה המקודדים חלבונים שאינם מעוגנים בקרום במצבם הטבעי (למשל, חלבונים מסיסים), חלבון היתוך אלקליין פוספטאז (AP) יכול לשמש לניטור הביטוי של חלבון המטרה. רצף cDNA המקודד את חלבון המטרה יכול להתיך במסגרת לפוספטאז אלקליין שליה אנושי בווקטורים של תגי AP (APtag-1- APtag-5; ראו טבלת חומרים) ולהחדיר אותו לתאים18. כאשר הוא מבוטא בתאי תרבית (למשל, תאי HEK293T), חלבון המטרה המתויג ב-AP מופרש ברמות גבוהות לאמצעי התרבית, וכך ניתן להעריך את ההשפעות של רצפי miRNA על ידי מדידת הירידה בפעילות AP במצע התרבית של תאים נגועים ב-miRNA (תת-שלבים 1.4.1-1.4.4).- תרבית HEK293T תאים בצלחת של 24 בארות (8 x 104 תאים / באר) למשך הלילה. העבר את התאים באופן זמני עם מבני ביטוי miRNA בודדים עם פלסמיד ביטוי של חלבון מטרה המתויג AP. השתמש בפלסמיד הבקרה השלילי pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (המסופק בערכת ביטוי miRNA) כבקרה. (אם נעשה שימוש בקווי תאים המבטאים ביציבות חלבון מטרה המתויג AP, יש להדביק את התאים רק באמצעות מבני ביטוי miRNA בודדים).
הערה: מגיב lipofection קונבנציונאלי (ראה טבלה של חומרים) משמש transfection. - יש לאסוף את התווך המותנה 48-72 שעות לאחר הטרנספקציה ולנטרל בחום את פעילות AP האנדוגנית באמבט מים של 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. פסולת ספין-אאוט במיקרו-צנטריפוגה שולחנית במהירות מרבית למשך 5 דקות.
- אגרו את הסופרנאטנט עם 10 mM HEPES, pH 7.0 והעבירו אותו דרך מסנן 0.45 מיקרומטר.
- קח 100 μL (למדידה בקורא לוחות) או 500 μL (עבור ספקטרופוטומטר) של supernatant והוסף כמות שווה של 2x מאגר מצע AP (טבלה 2). בדוק את פעילות נקודת הגישה על-ידי מדידת OD405 בקורא לוחות או בספקטרופוטומטר.
הערה: אם פעילות AP של התווך המותנה גבוהה מדי למדידה מדויקת, דללו אותו עם חיץ HBAH (תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS), אלבומין בסרום בקר 0.5 מ"ג/מ"ל, HEPES של 20 מילימטר (pH 7.0)) או חיץ אחר המכיל חלבון נשא. אין להשתמש במאגרים המכילים פוספט (לדוגמה, PBS) מכיוון שפוספט אנאורגני פועל כמעכב תחרותי של AP.
- תרבית HEK293T תאים בצלחת של 24 בארות (8 x 104 תאים / באר) למשך הלילה. העבר את התאים באופן זמני עם מבני ביטוי miRNA בודדים עם פלסמיד ביטוי של חלבון מטרה המתויג AP. השתמש בפלסמיד הבקרה השלילי pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (המסופק בערכת ביטוי miRNA) כבקרה. (אם נעשה שימוש בקווי תאים המבטאים ביציבות חלבון מטרה המתויג AP, יש להדביק את התאים רק באמצעות מבני ביטוי miRNA בודדים).
- שרשור של רצף miRNA
הערה: ניתן לשפר את אפקט ההפלה על ידי שרשור miRNA שונים כנגד אותו גן מטרה או חזרה על אותו miRNA. וקטור ביטוי miRNA תומך בשרשור של רצפי קדם-miRNA מרובים ובביטוי הקו-ציסטרוני שלהם17.- שרשרו שני רצפי קדם-miRNA שונים (כנגד אותו גן מטרה) המראים את פעילות הפליטה הגבוהה ביותר במבחני מבחנה (שלב 1.4), בהתאם להוראות היצרן17.
- להעריך את יעילות דיכוי הגנים של המבנים המשורשרים באמצעות בדיקות חוץ גופיות כמתואר בשלב 1.4. אם שלושה רצפי קדם-miRNA או יותר מראים פעילויות נוק-דאון גבוהות באופן דומה, בדוק שילובים שונים של שני רצפים והשתמש בשילובים המראים את פעילות הדפיקה הגבוהה ביותר (ראה תוצאות מייצגות).
- העברת קלטת הביטוי EmGFP-pre-miRNA לווקטור טרנספוזון Tol2
הערה: קלטת הביטוי המכילה את EmGFP cDNA ושני רצפי pre-miRNA מועברת לווקטור טרנספוזון Tol2 (וקטור pT2K-CAGGS, ראה טבלת חומרים). לשם כך, קלטת הביטוי (המקיפה מקצה 3' של מקדם CMV לאתר פריימר הריצוף ההפוך miRNA של וקטור ביטוי miRNA) מוגברת באמצעות פריימרים עם אתר אנזים הגבלה מלאכותי, ומוצר ה- PCR משובט לווקטור טרנספוזון Tol2. וקטור הטרנספוזון Tol2 מכיל את מקדם CAGGS שנמצא בכל מקום, המניע את הביטוי של קלטת הביטוי שהוכנסה. מקדם CAGGS וקלטת הביטוי מוקפים ברצפי Tol2 (איור 1).- הגברה PCR של קלטת ביטוי EmGFP-pre-miRNA: עקוב אחר הגדרת התגובה ותנאי התרמו-מחזור המתוארים בטבלה 3.
- חברו את מוצר ה-PCR המטוהר בג'ל (כ-1.3 קילו-בתים) לווקטור טרנספוזון Tol2 המעוכל באנזים הגבלה. אלקטרופורציה של הפלסמיד לתאי E. coli מתאימים (ראה טבלת חומרים) ובחר את הרקומביננטים (מבני pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA).
- הכינו את הפלסמיד באמצעות ערכת maxiprep קונבנציונלית (ראו טבלת חומרים). בדוק את המבנה והרצף של הפלסמיד על ידי מיפוי הגבלה ועל ידי שימוש בפריימרים המשמשים ל- PCR, בהתאמה.
2. אחסון ביצים ודגירה
- רכשו ביצים מופרות של לגהורן לבן (Gallus gallus) מחוות מקומיות או מספקים מסחריים.
הערה: ביצים ניתן לשמור ב 12-16 ° C או ב 4 ° C עד שבוע לפני הדגירה ללא אובדן משמעותי של כדאיות או עיכוב בפיתוח במהלך הדגירה. - תייגו את הביציות עם תאריך תחילת הדגירה וסמנו את הצד העליון של הביצית (היכן ימוקם העובר). לדגור על ביציות מופרות במצב אופקי ב 38 ° C עד העוברים הגיעו המבורגר והמילטון (HH) שלבים 10 (33-38 שעות) -11 (40-45 שעות)19.
3. באלקטרופורציה
- הכנה לאלקטרופורציה
- הכנת תמיסה ירוקה מהירה 0.25%: ממיסים 25 מ"ג FCF ירוק מהיר ב-10 מ"ל PBS. סנן את התמיסה באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. ניתן לאחסן את הפתרון ב- RT.
- קוקטייל DNA: הכינו את תמיסת ההזרקה על ידי ערבוב פלסמידים בודדים pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA (תת-שלב 1.6.3) עם פלסמיד ביטוי טרנספוזאז Tol2 (וקטור pCAGGS-T2TP; ראו טבלת חומרים) (5 מיקרוגרם/μL כל אחד) ביחס של 2:1. הוסף נפח 1/10 של תמיסה ירוקה מהירה 0.25% כדי להמחיש את האזור המוזרק.
הערה: ריכוז הדנ"א האופטימלי עשוי להשתנות בהתאם למבנים. - הגדרת מנגנון המיקרו-הזרקה (איור 3A,B): מנגנון המיקרו-הזרקה מורכב מהדברים הבאים (ראו טבלת חומרים): מזרק המילטון, מחט 18 גרם (אורך מחט = 2 אינץ'), צינורות PVC (פוליוויניל כלוריד) (אורך 2 ס"מ), מחט מיקרופיפטה (ניתן לבצע על ידי משיכת צינורות נימים עם סיבי אומגה נקודה (1 מ"מ O.D. X 0.75 מ"מ I.D) עם מושך מיקרופיפטה).
- ממלאים מזרק המילטון בשמן מינרלי כבד. חבר מחט 18 גרם למזרק ומלא את החלל הפנימי של המחט בשמן על ידי לחיצה על בוכנת המזרק.
- חברו חתיכה של צינור PVC באורך 2 ס"מ לקצה המחט ומלאו את הצינור בשמן.
- חבר מחט מיקרופיפטה משוכה לצינור. נתקו את קצה מחט המיקרופיפטה לקוטר של 10-20 מיקרומטר על ידי מלקחיים עדינים ליצירת פתח קטן. ממלאים את המחט כולה בשמן.
הערה: יש להקפיד לא ללכוד בועות אוויר במערכת, מכיוון שהן יעכבו את זרימת תמיסת ה- DNA.
- שים 5 μL של קוקטייל DNA צבעוני (substep 3.1.2) על צלחת פטרי סטרילי. תחת המיקרוסקופ המנתח, מניחים את קצה מחט המיקרופיפטה בתמיסת הדנ"א על צלחת הפטרי הסטרילית ומושכים לאט את התמיסה לתוך המחט.
- חכו עד שהלחץ יתאזן בתוך המחט ומחוצה לה (כדי למנוע כניסת אוויר למחט) והוציאו את קצה המחט מתמיסת הדנ"א. שמור את קצה המחט שקוע PBS סטרילי בכד קטן עד הזרקה.
- הגדרת מכשיר האלקטרופורציה (איור 3A,C):
- הגדר זוג אלקטרודות פלטינה עם מחזיק אלקטרודות על מיקרומניפולטור. התאימו את המרווח בין קצה האלקטרודות ל-2 מ"מ (איור 3C,E).
- חבר את האלקטרודות למחולל פולסי גל מרובע באמצעות כבלים (ראה טבלת חומרים).
- מיקרו-הזרקה של תמיסת דנ"א (איור 3D)
- מוציאים ביצת תרנגולת מהאינקובטור ומנגבים את פני הביצה בנייר טישו ספוג באתנול 70%.
- חבר מחט 18 גרם למזרק 10 מ"ל. הכניסו את המחט דרך הקצה הקהה של הביצה, בזווית כלפי מטה (45°) כדי למנוע פגיעה בחלמון.
- למשוך 2-3 מ"ל של אלבומין מן הביצה. אטמו את החור עם חתיכת סקוטש טייפ. אשרו כי העובר והקרום הוויטליני מנותקים מהקליפה על ידי "קשירת" הביצית באור.
- מוציאים חתיכת קליפת ביצה (עיגול בקוטר 2-3 ס"מ) מראש הביצה בעזרת מספריים ומלקחיים כדי לחשוף את העובר. אין לשלוח יותר מחמש ביציות בכל זמן נתון כדי למנוע התייבשות של עוברים במהלך התחשמלות.
הערה: אם קשה לפתוח חלון מבלי לפצח את הביצה, ניתן לכסות את כל החלק העליון של הביצה בסרט סלוטאפה או סקוטש לפני הסרת חתיכת קליפת ביצה. - הכניסו את קצה המחט לשלפוחית האופטית מצדה הפרוקסימלי בזווית של 45°, והזריקו את קוקטייל הדנ"א על-ידי לחיצה איטית (או הקשה על) הבוכנה עד שתמיסה בצבע כחול תמלא את הלומן (איור 3D).
הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במערכת מיקרו-הזרקת לחץ (ראה טבלת חומרים) להזרקת תמיסות DNA. - משוך את המחט והחזיר את קצהו ל- PBS.
- אלקטרופורציה (איור 3E)
- הגדר פרמטרי פולס של האלקטרופורטור כדלקמן: מתח: 15 V, אורך פולס: 50 מטר/שניה, מרווח פעימה: 950 מטר/שניה, מספר פולס: 5
- הוסיפו כמה טיפות של HBSS על קרום ויטלין מעל העובר. הורידו את האלקטרודות לתוך HBSS באמצעות המיקרומניפולטור, בניצב לציר הקדמי-אחורי של העובר.
הערה: לחלופין, הליך זה יכול להיעשות מבלי להוסיף HBSS, שכן אלבומין הוא מוליך חשמלי טוב המאפשר אלקטרופורציה יעילה. - מקמו את האלקטרודות משני הצדדים (הצד הקדמי (האף) והצד האחורי (הרקתי) של שלפוחית הראייה (איור 3E). ודא שהאלקטרודות אינן נוגעות בעובר או בכלי הדם. החל שדות חשמליים פועמים.
- הסר את האלקטרודות ונקה בעדינות את האלקטרודות עם ניצן צמר גפן סטרילי ספוג מים כדי למנוע הצטברות אלבומין.
- אוטמים את החלון עם סקוטש טייפ ודגורים מחדש על העובר עד לשלב ההתפתחותי הרצוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניית מבני טרנספוזון Tol2 לביטוי miRNA מלאכותי כנגד Nel
Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; ידוע גם בשם Nell2) הוא גליקופרוטאין חוץ-תאי. יש לו דמיון מבני עם thrombospondin-1 והוא בא לידי ביטוי בעיקר במערכת העצבים20,21. הוכחנו בעבר כי Nel מווסת התמיינות והישרדות של תאי גנגליון רשתית15 ופועל כרמז מנחה מעכב עבור אקסונים ברשתית22,23,24. ברשתית האפרוח המתפתחת, ביטוי Nel מזוהה באפיתל הפיגמנט המשוער ב- HH15 (יום עוברי (E) 2.5). ב- HH20 (E3.5), ביטוי Nel נצפה גם בתאי גנגליון רשתית ממוינים חדשים. ביטוי חזק של Nel בפיגמנט אפיתל ותאי גנגליון רשתית נמשך לפחות עד E1815.
כדי לבחון את תפקודו של Nel בהתפתחות תאי גנגליון ברשתית, הופל ביטוי הגן Nel על ידי החדרת miRNA מלאכותיים לרשתית המתפתחת באמצעות אלקטרופורציה של אובו ומערכת טרנספוזון Tol215,16. ראשית, זוגות של אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים של דנ"א תוכננו עבור 10 רצפי מטרה פוטנציאליים באזור קידוד החלבונים של cDNA Nel עוף (מספר הצטרפות GenBank: NM_001030740.1) באמצעות כלי העיצוב המקוון RNAi (ראה טבלת חומרים). זוגות האוליגונוקלאוטידים חושלו ושוכפלו בנפרד לווקטור ביטוי miRNA. לאחר מכן, מבנים בודדים הועתקו לתאי HEK293T המבטאים ביציבות את Nel-AP, ויעילות ההפלות שלהם הוערכה על ידי מדידת פעילות AP במדיה התרבית. פלסמיד הבקרה השלילי pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA שימש כבקרה (איור 4A).
נבחרו שלושה רצפי קדם-miRNA של Nel שהראו את השפעות הפליטה הגבוהות ביותר (כנגד נוקלאוטידים 482-502, 910-930 ו-2461-2481 של cDNA של עוף Nel cDNA, בהתאמה), ושני רצפי קדם-miRNA שובטו במקביל לווקטור ביטוי miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x Nel pre-miRNA), בהתאם להוראות היצרן17. קלטות הביטוי המקודדות את שני pre-miRNA ו- EmGFP הוגברו על ידי PCR עם אתר EcoRI מלאכותי בשני הקצוות (5′-GGGAATTCTCTGGCTAACTAGAGAAC-3′ ו- 5′-CCGAATTCCCTCTAGATCAACCACT-3′) ושוכפלו לווקטור pT2K-CAGGS (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). רצף קלטת הביטוי אושר על ידי שימוש בפריימרים המשמשים ל- PCR. מבני pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA הודבקו בנפרד עם וקטור ביטוי טרנספוזאז Tol2 (pCAGGS-T2TP) לתאי HEK293T המבטאים ביציבות Nel-AP, והשפעות מעכבות על ביטוי Nel-AP הוערכו על ידי מדידת פעילויות AP במדיה התרבותית. כפי שניתן לראות באיור 4B, יעילות הפליטה שופרה באופן משמעותי על-ידי שרשור של שני רצפי miRNA. דיכוי חזק של ביטוי Nel-AP (יותר מ-90%) נצפה לפחות עד 13 יום לאחר הטרנספקציה (איור 4B).
דיכוי יציב של ביטוי Nel ברשתית האפרוח המתפתחת
מבנה pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA (המכיל רצפי מטרה לנוקלאוטידים 482-502 ו-2461-2481 של cDNA Nel עוף) הודבק יחד עם וקטור ביטוי הטרנספוזאז (pCAGGS-T2TP) לצד הרקתי או האפי של רשתית הגוזל באמצעות אלקטרופורציה ב-HH9-11 (איור 3, איור 5A). מקטעים הוכנו מרשתית E4.5 או E8, וההשפעות על ביטוי Nel הוערכו על ידי אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדן אנטי-נל22. ב-E4.5, הביטוי של Nel באפיתל פיגמנט הרשתית הופחת באופן משמעותי בתאים המבטאים EmGFP (איור 5B-D). ב-E8 נצפו בבירור ירידות בביטוי Nel גם בתאי גנגליון ברשתית (איור 5E-I). דיכוי משמעותי של ביטוי Nel נמשך לפחות עד E18 (הנתונים לא מוצגים). החדרת miRNA הבקרה לא השפיעה על ביטוי Nel ברשתית (איור 5J-O).
איור 1: טרנספוזיציה של cDNA מצדדי Tol2 על-ידי טרנספוזאז. סכמטי המראה טרנספוזיציה של קלטת ביטוי Tol2-אגפים עבור EmGFP ושרשרתם שני רצפי pre-miRNA (2x pre-miRNA) על ידי טרנספוזאז. כאשר וקטור טרנספוזון Tol2 המכיל את קלטת הביטוי (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA construct) מוכנס לתאים בעלי מבנה ביטוי טרנספוזאז Tol2 (pCAGGS-T2TP), קלטת הביטוי Tol2-handed מוצאת מהווקטור ומשולבת בגנום המארח על ידי פעילות הטרנספוזאז. ביטוי של EmGFP ו- miRNA מונע על ידי המקדם CAGGS שנמצא בכל מקום. נתון זה שונה מ Nakamoto et al.15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מבנה הקדם-miRNA המהונדס. (A) רצף הקדם-miRNA המתוכנן מבוסס על רצף miR-155 מורין17. אוליגו הגדיל העליון מכיל (מקצה ה-5' עד קצה ה-3') רצף של ארבעה נוקלאוטידים (TGCT (כחול)), רצף מטרות אנטיסנס (21 נוקלאוטידים), רצף לולאה טרמינלית (אדום) ורצף מטרות חישה (19 נוקלאוטידים). רצף המטרה של האנטיסנס מייצג את רצף ה-miRNA הבוגר. אוליגו הגדיל התחתון מכיל רצף של ארבעה נוקלאוטידים 5' (CCTG (כחול)) ואת רצף המשלים ההפוך של אוליגו הגדיל העליון, אך חסר את הרצף של ארבעה נוקלאוטידים בקצה 3' (AGCA-3': השלמה הפוכה של 5'-TGCT של אוליגו הגדיל העליון). רצף המטרה של החישה חסר נוקלאוטידים 9 ו-10 של רצף המטרה. שני הנוקלאוטידים ה"נוספים" ברצף המטרה של האנטיסנס יוצרים לולאה פנימית במבנה לולאת הגזע של מולקולת ה-miRNA הבוגרת, מה שמביא לשיעור הפלות גבוה יותר17. (B) דוגמה לרצף מטרות כנגד עוף נל. מוצגים רצפי חישה ואנטיסנס בגדילים העליונים והתחתונים עבור רצף מטרה של הגן Nel עוף (GenBank accession number NM_001030740.1, nucleotides 482-502). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: במיקרו-הזרקה ובאלקטרופורציה. (A) תחנת עבודה למיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה. (1) מיקרוסקופ נתיחה. (2) מכשיר הזרקה. (3) מכשיר אלקטרופורציה. (4) מאיר מיקרוסקופ צוואר אווז כפול. (5) אלקטרופורטור. (B) מנגנון הזרקה. מזרק המילטון (6) עם מחט 18 גרם (7) מחובר לצינורות PVC (8) ולמחט מיקרופיפטה משוכה (9) ומונח על מיקרומניפולטור (10). החלל הפנימי של המנגנון מלא בשמן מינרלי כבד. (ג) מכשיר אלקטרופורציה. קבוצה של אלקטרודות פלטינה (11) עם מחזיק אלקטרודה (12) נקבעים על מיקרומניפולטור (13). האלקטרודות מחוברות לאלקטרופורטור באמצעות כבלים (14). (D) מיקרו-הזרקה של תמיסת קוקטייל DNA לשלפוחית האופטית ב-HH 10-11. מחט המיקרופיפטה המשוכה מוחדרת לשלפוחית האופטית מצידה הפרוקסימלי. תמיסת קוקטייל DNA עם ירוק מהיר (כחול) מוזרק לתוך שלפוחית הראייה עד שהצבע ממלא את הלומן כולו. (E) אלקטרופורציה לתוך שלפוחית הראייה. האלקטרודות ממוקמות במקביל (המרחק בין האלקטרודות הוא 2 מ"מ) ובאופן כך שהשלפוחית האופטית המוזרקת ממוקמת בין האלקטרודות: אלקטרודה אחת ממוקמת בסמוך לפני השטח הקדמיים (האף) של שלפוחית הראייה, והשנייה נמצאת בחלק האחורי של העובר ברמת המוח האחורי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הערכה חוץ גופית של רצפי קדם-miRNA בודדים או משורשרים עבור יעילות דיכוי גנים של Nel. (A) השפעות דפיקה של רצפי קדם-miRNA בודדים. תוצאות של חמישה מבנים מייצגים (רצפי מטרה של אנטיסנס המתאימים לנוקלאוטידים מספרים 482-502, 910-930, 1106-1126, 1663-1683 ו-2461-2481 של cDNA של עוף Nel (מספר הצטרפות GenBank: NM_001030740.1)) מוצגות. מבני ביטוי miRNA בודדים (pcDNA6.2-GW/EmGFP-Nel pre-miRNA) הודבקו לתאי HEK293T המבטאים ביציבות את Nel-AP. פלסמיד הבקרה השלילי pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA שימש כבקרה. הביטוי של Nel-AP הוערך על ידי מדידת פעילויות AP בתקשורת התרבות 48-96 שעות לאחר הטרנספקציה. שלושה מבני ביטוי קדם-miRNA של Nel (כנגד נוקלאוטידים 482-502, 910-930 ו-2461-2481, בהתאמה) הראו דיכוי משמעותי של ביטוי Nel. (B) השפעות דפיקה של רצפי קדם-miRNA בשרשרת. שניים משלושת רצפי קדם-miRNA החזקים ביותר (כנגד נוקלאוטידים 482-502, 910-930 ו-2461-2481) שובטו במקביל לווקטור pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR, וקלטת הביטוי (המכילה את שני רצפי קדם-miRNA ו-EmGFP cDNA) הועברה לווקטור pT2K-CAGGS (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). מבני pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA הודבקו בנפרד עם וקטורי ביטוי עבור טרנספוזאז Tol2 (pCAGGS-T2TP) לתאי HEK293T המבטאים ביציבות את Nel-AP, והביטוי של Nel-AP הוערך על ידי מדידת פעילויות AP במדיה התרבית בין 2 ל-13 ימים לאחר ההדבקה. כל שלושת הצירופים (482-502/910-930, 482-502/2461-2481, 910-930/2461-2481) הראו פעילויות דיכוי משופרות בהשוואה לרצפי קדם-miRNA בודדים ללא מעצורים. דיכוי משמעותי של ביטוי Nel-AP נצפה מהיום השני עד היום ה-13 לפחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הפלה יציבה של ביטוי Nel ברשתית האפרוח המתפתחת על-ידי שילוב בתיווך טרנספוזון Tol2 של טרנסגן miRNA. מבנה טרנספוזון Tol2 המכיל קלטת ביטוי של שני רצפי Nel pre-miRNA ו-EmGFP (pT2K-CAGGS-EmGFP-Nel pre-miRNA (482-502)-Nel pre-miRNA (2461-2481)) (A-I) או מבנה בקרה המבטא miRNA לא קשור ו-EmGFP (J-O) הודבק יחד עם וקטור ביטוי טרנספוזאז (pCAGGS-T2TP) לתוך החצי הרקתי או האפי של שלפוחית הראייה על ידי in ovo אלקטרופורציה ב-HH9-HH11 (E1.5). מקטעי הרשתית הוכנו ב-E4.5 (B-D, J-L) או E8 (E-I, M-O), ויעילות דיכוי הגן Nel נבדקה על ידי אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים אנטי-נל (אדום). מכיוון שהדנ"א טעון שלילית, הטרנסגנים מתחשמלים לתוך הרקמה בצד האנודה; לפיכך, רק מחצית מהרשתית סומנה עם צד EmGFP (טרנספקציה (TF), ירוק). (A) ביטוי של גן סמן EmGFP במחצית הרקתית של הרשתית ב-E4.5. הסדק האופטי (חץ לבן) מייצג את הגבול בין צד נגוע לצד לא נגוע (בקרה). (ב-ט) הפלת RNAi של ביטוי Nel ברשתית האפרוח המתפתחת. (ב-ד) ב- E4.5, ביטוי Nel מופחת באופן משמעותי (B,D) בתאי אפיתל פיגמנט ברשתית (PE) המבטאים EmGFP (C,D). שימו לב לדפוס המשלים של Nel immunostaining וביטוי EmGFP ב-D. NR, רשתית עצבית. (ה-י) ב- E8, ביטוי Nel (E,G) באפיתל פיגמנט הרשתית ובשכבת תאי הגנגליון (GCL) יורד בצד הטרנספקציה (F,G). (ח, ט) תצוגות הגדלה גבוהות יותר של אזור טרנספקציה ואזור בקרה מתאים ב- E (מסומן על-ידי מלבנים קטנים), בהתאמה. (ד,ז) תמונות ממוזגות של שתי התמונות השמאליות. (י-ו) ביטוי שליטה miRNA. הצגת מבנה הבקרה השלילית אינה משפיעה על ביטוי Nel ברשתית E4.5 (J-L) או E8 (M-O). (יב,א) תמונות ממוזגות של שתי התמונות השמאליות. הגבול בין צדדי הטרנספקציה והבקרה מסומן על ידי קו מקווקו ב- C, F, K ו- N. פסי קנה מידה, 50 מיקרומטר. (A) ו- (B-I) שונו מ- Nakamoto, M. & Nakamoto, C 16 ו- Nakamoto etal.15, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| הגדרת תגובת חישול | |
| אוליגו גדיל עליון (200 מיקרומטר במאגר TE) | 5 μL (ריכוז סופי 50 μM) |
| אוליגו גדיל תחתון (200 מיקרומטר במאגר TE) | 5 μL (ריכוז סופי 50 μM) |
| 10x חיץ חישול אוליגו* | 2 μL |
| מים ללא DNase/RNase* | 8 מיקרוליטר |
| סך | 20 מיקרוליטר |
| * מסופק בערכת ביטוי miRNA (ראה טבלת חומרים) | |
טבלה 1: הגדרת תגובת חישול
| 2x מאגר מצע AP | |
| 10 מטר Diethanolamine (pH 9.8) | 4 מ"ל |
| 1 מטר MgCl2 | 10 מיקרוליטר |
| ל-הומוארגינין | 45 מ"ג |
| אלבומין בסרום בקר (BSA) | 10 מ"ג |
| p-Nitrophenylphosphate | 63 מ"ג |
| ח2O | הוסף כדי להשלים נפח כולל של 20 מ"ל |
טבלה 2: מאגר מצע AP כפול. הפתרון צריך להיות מאוחסן aliquots ב -20 °C ולהיות מוגן מפני אור כמו p-nitrophenylphosphate הוא רגיש לאור.
| הגדרת תגובה | |||
| pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x pre-miRNA plasmid (מסעיף 1.5) או pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-פלסמיד בקרה שלילי* (0.1 מיקרוגרם/μL) |
1 μL | ||
| 10x מאגר Pfu | 5 מיקרוליטר | ||
| תערובת dNTP (10 מילימטר כל אחד של dATP, dCTP, dGTP ו-dTTP) | 1 μL | ||
| פריימר קדמי EmGFP* (5'-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3'; 10 מיקרומטר) | 1 μL | ||
| פריימר הפוך miRNA* (5'- CTCTAGATCAACCACTTTGT-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| Pfu DNA פולימראז (5 יחידות/μL) | 0.5 מיקרוליטר | ||
| ח2O | 40.5 מיקרוליטר | ||
| עוצמת קול כוללת | 50 מיקרוליטר | ||
| * מסופק בערכת ביטוי miRNA. | |||
| תנאי תרמו-מחזור | |||
| 94°C | 5 דקות | ||
| 30 מחזורים של הבאים: | |||
| 94°C | 45 שניות | ||
| 58°C | 1 דקות | ||
| 72 °C | 2 דקות | ||
| 72 °C | 10 דק' | ||
טבלה 3: מערך התגובה ותנאי התרמו-מחזור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מספק מדריך מפורט להשתקת גנים ברשתית האפרוחים המתפתחת על ידי ביטוי מהונדס של miRNA מלאכותי באמצעות אלקטרופורציה ומערכת טרנספוזון Tol2.
הגורמים הבאים הם בעלי חשיבות קריטית בביצוע טכניקה זו בהצלחה. ראשית, קריטי להשתמש ברצפי miRNA שאושרו כבעלי השפעות חזקות של הפלה. לפני החלתם עבור אלקטרופורציה באובו , בדוק רצפי קדם-miRNA בודדים עבור יעילות דיכוי גנים במבחני מבחנה (שלב 1.4) ושרשר שני רצפי קדם-miRNA המראים את פעילויות ההפלה הגבוהות ביותר (שלב 1.5). שנית, חשוב לא לפגוע בשלפוחית האופטית וברקמות העצבים הסובבות אותה בעת החדרת מחט המיקרופיפטה להזרקת תמיסת הדנ"א. נזק מוגזם לעוברים עלול להוביל למום עוברי ולמוות. כדי למנוע נזק לרקמות, להציג את micropipette לתוך שלפוחית אופטית בכיוון הנכון. קצוות קטנים וחדים יותר של מחט המיקרופיפטה יהפכו את החדירה של שלפוחית הראייה לחלקה יותר ויביאו לפחות נזק לרקמות. עם זאת, מחטים עם קצוות קטנים מאוד מתקשות לטעון ולשחרר את תמיסת ה- DNA. במחקר המתואר כאן, נעשה שימוש במחטים עם פתח קצה בקוטר 10-20 מיקרומטר. שלישית, הקפידו למלא את כל השלפוחית האופטית בתמיסת DNA (כפי שניתן לראות בהתפשטות של ירוק מהיר). רביעית, מקם את האלקטרודות במיקומים האופטימליים כדי לכוון את הדנ"א לאזור הרצוי של שלפוחית הראייה (למשל, הצד הרקתי, צד האף). מולקולות דנ"א בעלות מטען שלילי ינועו לכיוון צד האנודה; לכן המיקום והכיוון המדויק של האלקטרודות משפיעים באופן קריטי על התוצאות הסופיות. לבסוף, השתמש בריכוזי ה- DNA האופטימליים ובפרמטרים של אלקטרופורציה.
אם לא נצפה אות פלואורסצנטי לאחר 24 שעות של התחשמלות, יש לקחת בחשבון את הדברים הבאים: (1) ודא שלפלסמידים המחושמלים יש רצפים נכונים. (2) לבדוק מחדש את הריכוז והטוהר של פלסמידים בודדים. (3) ודא שתמיסת הדנ"א ממלאת את הלומן של שלפוחית הראייה והיא אינה מתפזרת לתוך הצינור העצבי. (4) בדוק את פרמטרי האלקטרופורציה שבהם נעשה שימוש נכונים. (5) לבדוק שהאלקטרודות באות במגע עם קרום הוויטלין בזמן הפעלת הפולסים החשמליים.
השילוב של אלקטרופורציה פנימית ושיטת אינטגרציה גנטית בתיווך טרנספוזון בפרוטוקול זה מציע מספר יתרונות ברורים. ראשית, הוא תומך בייצור יציב של miRNA ובכך בדיכוי מתמשך של גני מטרה. התפתחות רשתית הגוזל מתחילה ב-E1.5 ונמשכת עד לבקיעה (תאי גנגליון רשתית מיוצרים בתקופה שבין E2 ל-E9). לצורך ניתוח אובדן תפקוד של תפקוד גנים, ביטוי של miRNA מלאכותי צריך להישמר ביציבות במהלך תקופה זו. ביטוי רצפי RNAi באמצעות וקטורי ביטוי קונבנציונליים הוא בדרך כלל ארעי מכיוון שמבנה הביטוי אינו מצליח להשתלב ביעילות בכרומוזומים. בשיטה המתוארת כאן, לעומת זאת, אינטגרציה כרומוזומלית של קלטת הביטוי מתווכת על ידי פעילות של טרנספוזאז קו-אלקטרופורייט, המביא לביטוי יציב של הטרנסגנים.
שנית, בשיטה זו, אותו מקדם CAGGS גורם לביטוי קו-ציסטרוני של רצפי miRNA מרובים וסמן EmGFP בתאים נגועים, ובכך עוקף את הסיכון להפרעות מקדם, שהוא אחד הסיבוכים הנפוצים עם וקטורים רטרו-ויראליים המכילים שני מקדמים להשגת ביטוי גנים כפול25.
לבסוף, בניגוד לווקטורים רטרו-ויראליים בעלי יכולת שכפול, הטרנסגן המתחשמל בשיטה זו אינו מועבר לתאים שכנים. לכן, אזור הטרנספקציה יכול להיות נשלט בצורה מדויקת יותר באמצעות סוגים מתאימים של אלקטרודות ועל ידי הצבתם במיקומים הנכונים.
למרות היתרונות שתוארו לעיל, לשיטה הנוכחית יש גם מגבלות הטבועות באלקטרופורציה . לדוגמה, שיעורי הטרנספקציה ודיכוי הגנים עשויים להשתנות בין עוברים, וייתכן שיהיה צורך להדביק מספר גדול יחסית של עוברים לצורך ניתוח. בנוסף, אלקטרופורציה לתוך הרשתית העוברית בשלבים התפתחותיים מאוחרים יותר (למשל, E4-E5) יש קשיים ניסיוניים כי העיניים ממוקמות קרוב ללב בשלבים אלה, מה שמגביר את הסיכון לדום לב לאחר אלקטרופורציה.
המערכת המתוארת כאן מאפשרת דיכוי גנים מהיר וחזק ברשתית האפרוחים המתפתחת. גישה זו יכולה להיות מיושמת גם על חלקים אחרים של עובר האפרוח, כולל רקמות עצביות ולא עצביות. לכן, אנו מצפים שמערכת זו תוכל לתרום להבהרת המנגנונים המולקולריים של התפתחות האפרוחים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
הווקטורים pT2K-CAGGS ו-pCAGGS-T2TP סופקו באדיבות על ידי יושיקו טקהאשי (אוניברסיטת קיוטו, קיוטו, יפן) וקואיצ'י קוואקאמי (המכון הלאומי לגנטיקה, מישימה, יפן), בהתאמה. אנו מודים למיכאל ברברוגלו על קריאתו המכרעת של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהחברה המלכותית ומועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה (BBSRC) (בריטניה) ל- M.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
- Funahashi, J., et al. Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity. Development, Growth & Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).
- Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. In ovo electroporation methods in chick embryos. Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).
- Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development, Growth & Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces. Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Gene. 338 (1), 93-98 (2004).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).
- Kawakami, K., Noda, T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).
- Hou, X., et al. Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA. Development, Growth & Differentiation. 53, 69-75 (2011).
- Nakamoto, C., et al. Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development. Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).
- Nakamoto, M., Nakamoto, C. iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. Mao, C. -A. 8, Springer. 91-108 (2020).
- BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&title=BLOCK-iT&trade (2021).
- Flanagan, J. G., et al. Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos. Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. I. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).
- Jiang, Y., et al. In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel. Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).
- Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions. Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).
- Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue. Development. 146 (4), (2019).
- Yee, J. K., et al. Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).
