Summary
हमने एक नया लॉस-ऑफ-फंक्शन दृष्टिकोण विकसित किया है जिसमें ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन और टोल 2 ट्रांसपोसन सिस्टम का उपयोग करके चूजे के भ्रूण में कृत्रिम माइक्रो-आरएनए अनुक्रमों का परिचय और जीनोमिक एकीकरण शामिल है। यह तकनीक विकास के दौरान जीन फ़ंक्शन के अध्ययन के लिए एक मजबूत और स्थिर जीन वध पद्धति प्रदान करती है।
Abstract
चिक रेटिना लंबे समय से विकासात्मक न्यूरोबायोलॉजी में एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली रही है, जिसमें इसके बड़े आकार, तेजी से विकास और विज़ुअलाइज़ेशन और प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए पहुंच सहित फायदे हैं। हालांकि, इसकी प्रमुख तकनीकी सीमा जीन फ़ंक्शन विश्लेषण के लिए मजबूत हानि-ऑफ-फ़ंक्शन दृष्टिकोण की कमी थी। यह प्रोटोकॉल विकासशील चूजा रेटिना में जीन साइलेंसिंग की एक पद्धति का वर्णन करता है जिसमें टोल 2 ट्रांसपोसन सिस्टम का उपयोग करके कृत्रिम माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति शामिल है। इस दृष्टिकोण में, एक टोल 2 ट्रांसपोसन प्लास्मिड जिसमें ईएमजीएफपी (एमराल्ड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) मार्कर और एक लक्ष्य जीन के खिलाफ कृत्रिम प्री-एमआरएनए अनुक्रमों के लिए एक अभिव्यक्ति कैसेट होता है, को भ्रूण के चिक रेटिना में एक टोल 2 ट्रांसपोसेस अभिव्यक्ति निर्माण के साथ ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा पेश किया जाता है। ट्रांसक्रिप्टेड रेटिना कोशिकाओं में, ट्रांसपोसेस ट्रांसपोसन वेक्टर से अभिव्यक्ति कैसेट के छांटने और मेजबान गुणसूत्रों में इसके एकीकरण को उत्प्रेरित करता है, जिससे एमआईआरएनए और ईएमजीएफपी प्रोटीन की स्थिर अभिव्यक्ति होती है। हमारे पिछले अध्ययन में, हमने प्रदर्शित किया है कि नेल की अभिव्यक्ति, एक ग्लाइकोप्रोटीन जो तंत्रिका विकास में कई कार्य करता है, इस तकनीक का उपयोग करके विकासशील चिक रेटिना में काफी दबाया जा सकता है। हमारे परिणाम बताते हैं कि यह पद्धति जीन अभिव्यक्ति के एक स्थिर और मजबूत दमन को प्रेरित करती है और इस प्रकार रेटिना विकास के अध्ययन के लिए एक कुशल हानि-ऑफ-फ़ंक्शन दृष्टिकोण प्रदान करती है।
Introduction
कशेरुक रेटिना तंत्रिका विकास का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली है। अपने परिधीय स्थान के बावजूद, रेटिना शारीरिक और विकासात्मक रूप से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का विस्तार है, और ऑप्टिक तंत्रिका, जिसमें रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं के अक्षतंतु होते हैं, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के भीतर एक पथ का प्रतिनिधित्व करते हैं। तंत्रिका विकास के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में चिक रेटिना के महत्वपूर्ण फायदे हैं: यह बड़ा है और तेजी से विकसित होता है; इसमें मानव रेटिना के लिए संरचनात्मक और कार्यात्मक समानताएं हैं; यह विज़ुअलाइज़ेशन और प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए अत्यधिक सुलभ है। तंत्रिका विकास के दौरान कोशिका प्रसार और भेदभाव, मॉर्फोजेनेसिस और अक्षतंतु मार्गदर्शन के आणविक तंत्र का चिकन रेटिना का उपयोग करके बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है।
विकासशील चूजा भ्रूण में कोशिकाओं में एक्टोपिक जीन पेश करने के लिए पिछले दो दशकों में ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। यह तकनीक विकासशील कोशिकाओं के लेबलिंग, सेल भाग्य अनुरेखण, और सेल माइग्रेशन और एक्सॉन ट्रैक्ट्स का पता लगाने के साथ-साथ जीन फ़ंक्शन के विवो विश्लेषण में एक्टोपिक जीन अभिव्यक्ति की अनुमति देती है। चूजा भ्रूण में कुशल अस्थानिक जीन अभिव्यक्ति के लिए ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन की स्थितियों को अच्छी तरह से स्थापित किया गया है 1,2,3.
इन फायदों के बावजूद, जीन फ़ंक्शन के अध्ययन के लिए एक स्थिर हानि-ऑफ-फ़ंक्शन तकनीक की कमी चूजे के भ्रूण की एक प्रमुख तकनीकी सीमा थी। जबकि चूजे के भ्रूण को छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (एसआईआरएनए) 4 या शॉर्ट हेयरपिन आरएनए (एसएचआरएनए) 5 के लिए अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ इलेक्ट्रोपोरेट किया जाता है, लक्षित जीन का वध दिखाया जाता है, उन दृष्टिकोणों में जीन दमन क्षणिक होता है क्योंकि कोशिकाओं द्वारा पेश किए गए आरएनए या डीएनए को खोने के बाद प्रभाव गायब हो जाते हैं। एक अधिक स्थिर जीन दमन आरसीएएस (आरइप्लीकेशन सीओम्पेटेंट एवियन सारकोमा-ल्यूकोसिस वायरस (एएसएलवी) लॉन्ग टर्मिनल रिपीट (एलटीआर) के साथ एसप्लिस स्वीकर्ता के साथ) रेट्रोवायरस सिस्टम6 द्वारा चूजे के भ्रूण में एसआईआरएनए वितरित करके प्राप्त किया जा सकता है। वायरल वेक्टर मेजबान जीनोम में एकीकृत होता है, और अस्थानिक जीन स्थिर रूप से व्यक्त किए जाते हैं। हालांकि, रेट्रोवायरस केवल सेल चक्र के माइटोटिक (एम) चरण के दौरान विभाजित कोशिकाओं के जीनोम में एकीकृत हो सकता है, जो विकास के चरणों और / या सेल प्रकारों पर एक सीमा लगा सकता है जिसके लिए इस हानि-ऑफ-फ़ंक्शन दृष्टिकोण को लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, आरसीएएस द्वारा ट्रांसजेन की अभिव्यक्ति ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन7 द्वारा प्रेरित की तुलना में धीमी और कम मजबूत दिखाई देती है।
ट्रांसपोसन आनुवंशिक तत्व हैं जो जीनोम पर एक स्थान से दूसरे स्थान पर जाते हैं। टोल 2 तत्व एचएटी ट्रांसपोसेबल तत्व परिवार का एक सदस्य है और इसमें एक आंतरिक जीन एन्कोडिंग एक ट्रांसपोसेस होता है जो टोल 2 तत्व8 की ट्रांसपोसन प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित करता है। जब एक प्लास्मिड वेक्टर जो एक जीन अभिव्यक्ति कैसेट को वहन करता है, जो टोल 2 तत्वों (क्रमशः 200 बीपी और 150 बीपी) के बाएं और दाएं सिरों के अनुक्रमों से घिरा होता है, को टोल 2 ट्रांसपोसेस अभिव्यक्ति निर्माण के साथ कशेरुक कोशिकाओं में पेश किया जाता है, तो अभिव्यक्ति कैसेट को प्लास्मिड से निकाला जाता है और मेजबान जीनोम में एकीकृत किया जाता है, जो एक्टोपिक जीन की एक स्थिर अभिव्यक्ति का समर्थन करता है (चित्रा 1; चित्र 1)।). यह दिखाया गया है कि टोल 2 ट्रांसपोसेबल तत्व विभिन्न कशेरुक प्रजातियों में जीन ट्रांसपोज़ेशन को बहुत कुशलता से प्रेरित कर सकता है, जिसमें जेब्राफिश9,10, मेंढक 11, चूजे12 और चूहे 13 शामिल हैं, और इस प्रकार ट्रांसजेनेसिस और सम्मिलन म्यूटेनेसिस का एक उपयोगी तरीका है। टोल 2 ट्रांसपोसन प्रणाली का उपयोग सीआरएनए के जीनोमिक एकीकरण द्वारा एक लक्ष्य जीन के सशर्त वध के लिए सफलतापूर्वक किया गया है जो लंबे समय तक डबल-फंसे आरएनए14 से संसाधित होता है।
यह प्रोटोकॉल चूजे के भ्रूण में एक हानि-ऑफ-फ़ंक्शन दृष्टिकोण का वर्णन करता है जिसमें टोल 2 ट्रांसपोसन सिस्टम15,16 द्वारा कृत्रिम माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) की शुरूआत शामिल है। इस दृष्टिकोण में, एक लक्ष्य जीन के खिलाफ ईएमजीएफपी (एमराल्ड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) मार्कर और कृत्रिम एमआईआरएनए के लिए एक अभिव्यक्ति कैसेट को टोल 2 ट्रांसपोसन वेक्टर में क्लोन किया जाता है। टोल 2 ट्रांसपोसन निर्माण को तब भ्रूण के चिक रेटिना में ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा टोल 2 ट्रांसपोसेस अभिव्यक्ति निर्माण के साथ पेश किया जाता है। ट्रांसक्रिप्टेड रेटिना कोशिकाओं में, ट्रांसपोसेस ट्रांसपोसन वेक्टर से अभिव्यक्ति कैसेट के छांटने और मेजबान गुणसूत्रों में इसके एकीकरण को उत्प्रेरित करता है, जिससे एमआईआरएनए और ईएमजीएफपी प्रोटीन की स्थिर अभिव्यक्ति होती है। हमारे पिछले अध्ययनों में, हमने विकासशील चिक रेटिना में मुख्य रूप से तंत्रिका तंत्र में व्यक्त एक बाह्य ग्लाइकोप्रोटीन नेल की अभिव्यक्ति को सफलतापूर्वक गिरा दिया (प्रतिनिधि परिणाम देखें)। हमारे परिणाम बताते हैं कि इस तकनीक द्वारा ओवो में स्थिर और कुशल जीन दमन प्राप्त किया जा सकता है।
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Protocol
1. एमआईआरएनए अभिव्यक्ति वैक्टर का निर्माण
नोट: एमआरएनए अभिव्यक्ति वैक्टर (चरण 1.1-1.3, 1.5-1.6.) के निर्माण की प्रक्रियाओं को एमआरएनए अभिव्यक्ति किट, ईएमजीएफपी के साथ ब्लॉक-आईटी पोल द्वितीय एमआईआर आरएनए अभिव्यक्ति किट के लिए अनुकूलित किया गया है, जैसा कि पहले15,16 वर्णित है। किट एमआरएनए अभिव्यक्ति (pcDNA6.2-GW/ EmGFP-miRNA), एक नियंत्रण वेक्टर (pcDNA6.2-GW/ EmGFP-miRNA-नकारात्मक नियंत्रण प्लास्मिड), सहायक अभिकर्मकों और MIRNA अभिव्यक्ति वैक्टर का उत्पादन करने के निर्देश (सामग्री की तालिका देखें) की अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किए गए अभिव्यक्ति वेक्टर प्रदान करता है।
- लक्ष्य जीन के खिलाफ प्री-एमआईआरएनए को एन्कोडिंग करने वाले एकल-फंसे डीएनए ऑलिगोस को डिजाइन करना: ऑनलाइन टूल, आरएनएआई डिजाइनर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके एकल-फंसे हुए डीएनए ऑलिगोस ("टॉप स्ट्रैंड" ऑलिगोस (लक्ष्य प्री-एमआईआरएनए) और "बॉटम स्ट्रैंड" ऑलिगोस (टॉप स्ट्रैंड ओलिगोस के पूरक)) डिजाइन करें। एकल-फंसे हुए ऑलिगोस (चित्रा 2 ए) की आवश्यक विशेषताओं और लक्ष्य अनुक्रमों के उदाहरण (चित्रा 2 बी) के लिए चित्रा 2 देखें।
नोट: यह अनुशंसा की जाती है कि किसी दिए गए लक्ष्य जीन के लिए 5-10 प्री-एमआरएनए अनुक्रम उत्पन्न किए जाएं और विट्रो ( चरण 1.4) में वध गतिविधियों के लिए जांच की जाए। - डबल-फंसे हुए ऑलिगो उत्पन्न करने के लिए शीर्ष और नीचे-स्ट्रैंड ऑलिगोस की एनीलिंग
- एक बाँझ 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में निम्नलिखित एनीलिंग प्रतिक्रिया (तालिका 1) सेट करें।
- प्रतिक्रिया मिश्रण को 4 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। प्रतिक्रिया मिश्रण को 5-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर ठंडा करने की अनुमति देकर डबल-फंसे हुए ऑलिगो उत्पन्न करने के लिए शीर्ष और नीचे-स्ट्रैंड ऑलिगोस को नष्ट करें। नमूने को संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें (~ 5 एस)।
नोट: एनाल्ड ऑलिगोस को कम से कम एक वर्ष के लिए गिरावट के बिना -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- डबल-स्ट्रैंडेड ऑलिगोस को माइआरएनए अभिव्यक्ति वेक्टर (पीसीडीएनए 6.2-जीडब्ल्यू / ईएमजीएफपी-एमआरएनए (एमआरएनए अभिव्यक्ति किट में प्रदान किया गया)) में क्लोन करना: निर्माता के मैनुअल17 के अनुसार, रैखिक माइआरएनए अभिव्यक्ति वेक्टर में व्यक्तिगत डबल-फंसे ऑलिगोस को क्लोन करें।
- वध प्रभावों का मूल्यांकन
नोट: यह अनुशंसा की जाती है कि ओवो में लागू होने से पहले विट्रो में जीन दमन दक्षता के लिए व्यक्तिगत एमआरएनए अनुक्रमों का परीक्षण किया जाए। लक्ष्य जीन को व्यक्त करने वाली सेल लाइन में एमआरएनए अभिव्यक्ति प्लास्मिड को स्थानांतरित करके दक्षता का परीक्षण किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, व्यक्तिगत एमआरएनए अभिव्यक्ति प्लास्मिड को लक्ष्य जीन के लिए एक अभिव्यक्ति निर्माण के साथ सेल लाइनों में सह-स्थानांतरित किया जा सकता है। प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले लक्ष्य जीन के लिए जो अपनी मूल अवस्था (जैसे, घुलनशील प्रोटीन) में झिल्ली-लंगर नहीं हैं, लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए एक क्षारीय फॉस्फेट (एपी) संलयन प्रोटीन का उपयोग किया जा सकता है। लक्ष्य प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले एक सीडीएनए अनुक्रम को एपी-टैग वैक्टर (एपीटैग -1- एपीटैग -5; सामग्री की तालिका देखें) में मानव प्लेसेंटल क्षारीय फॉस्फेट से फ्रेम में जोड़ा जा सकता है और कोशिकाओं18 में पेश किया जा सकता है। जब कल्चर कोशिकाओं (जैसे, HEK293T कोशिकाओं) में व्यक्त किया जाता है, तो एपी-टैग किए गए लक्ष्य प्रोटीन को संस्कृति मीडिया में उच्च स्तर पर स्रावित किया जाता है, और इस प्रकार माइआरएनए अनुक्रमों के प्रभाव का मूल्यांकन एमआरएनए-ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं के कल्चर मीडिया में एपी गतिविधि में कमी को मापकर किया जा सकता है (सबस्टेप 1.4.1-1.4.4)।- रात भर 24-वेल प्लेट (8 x 104 कोशिकाओं / वेल) में कोशिकाओं HEK293T कल्चर करें। क्षणिक रूप से कोशिकाओं को अलग-अलग एमआरएनए अभिव्यक्ति संरचनाओं के साथ एपी-टैग किए गए लक्ष्य प्रोटीन के अभिव्यक्ति प्लास्मिड के साथ स्थानांतरित किया जाता है। नियंत्रण के रूप में pcDNA6.2-GW/ EmGFP-miRNA-नकारात्मक नियंत्रण प्लास्मिड (MIRNA अभिव्यक्ति किट में प्रदान किया गया) का उपयोग करें। (यदि सेल लाइनें जो एपी-टैग किए गए लक्ष्य प्रोटीन को स्थिर रूप से व्यक्त करती हैं, का उपयोग किया जाता है, तो कोशिकाओं को केवल व्यक्तिगत एमआरएनए अभिव्यक्ति संरचनाओं के साथ स्थानांतरित करें।
नोट: अभिकर्मक के लिए एक पारंपरिक लिपोफेक्शन अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग किया जाता है। - अभिकर्मक के बाद वातानुकूलित माध्यम को 48-72 घंटे इकट्ठा करें और गर्मी 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में अंतर्जात एपी गतिविधि को निष्क्रिय कर देती है। 5 मिनट के लिए अधिकतम गति पर डेस्कटॉप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में स्पिनआउट मलबा।
- सतह पर तैरनेवाले को 10 mM HEPES, pH 7.0 के साथ बफर करें और इसे 0.45 μm फ़िल्टर के माध्यम से पारित करें।
- सतह पर तैरनेवाला का 100 μL (प्लेट रीडर में माप के लिए) या 500 μL (स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के लिए) लें और 2x AP सब्सट्रेट बफर (तालिका 2) की समान मात्रा जोड़ें। प्लेट रीडर या स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में ओडी405 को मापकर एपी गतिविधि की जांच करें।
नोट: यदि वातानुकूलित माध्यम की एपी गतिविधि सटीक माप के लिए बहुत अधिक है, तो इसे एचबीएएच बफर (हैंक्स का संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस), 0.5 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन, 20 एमएम एचईपीईएस (पीएच 7.0)) या एक अन्य बफर के साथ पतला करें जिसमें एक वाहक प्रोटीन होता है। फॉस्फेट युक्त बफर (जैसे, पीबीएस) का उपयोग न करें क्योंकि अकार्बनिक फॉस्फेट एपी के प्रतिस्पर्धी अवरोधक के रूप में कार्य करता है।
- रात भर 24-वेल प्लेट (8 x 104 कोशिकाओं / वेल) में कोशिकाओं HEK293T कल्चर करें। क्षणिक रूप से कोशिकाओं को अलग-अलग एमआरएनए अभिव्यक्ति संरचनाओं के साथ एपी-टैग किए गए लक्ष्य प्रोटीन के अभिव्यक्ति प्लास्मिड के साथ स्थानांतरित किया जाता है। नियंत्रण के रूप में pcDNA6.2-GW/ EmGFP-miRNA-नकारात्मक नियंत्रण प्लास्मिड (MIRNA अभिव्यक्ति किट में प्रदान किया गया) का उपयोग करें। (यदि सेल लाइनें जो एपी-टैग किए गए लक्ष्य प्रोटीन को स्थिर रूप से व्यक्त करती हैं, का उपयोग किया जाता है, तो कोशिकाओं को केवल व्यक्तिगत एमआरएनए अभिव्यक्ति संरचनाओं के साथ स्थानांतरित करें।
- माइआरएनए अनुक्रम की श्रृंखला।
नोट: एक ही लक्ष्य जीन के खिलाफ अलग-अलग एमआईआरएनए को चेन करके या एक ही एमआरएनए को दोहराकर वध प्रभाव को बढ़ाया जा सकता है। माइआरएनए अभिव्यक्ति वेक्टर कई पूर्व-एमआरएनए अनुक्रमों और उनके सह-सिस्ट्रोनिक अभिव्यक्ति17 की श्रृंखला का समर्थन करता है।- निर्माता के निर्देशों17 के अनुसार, दो अलग-अलग प्री-मिआरएनए अनुक्रमों (एक ही लक्ष्य जीन के खिलाफ) को चेन करें जो इन विट्रो परख (चरण 1.4) में उच्चतम वध गतिविधियों को दिखाते हैं।
- चरण 1.4 में वर्णित इन विट्रो परख ों का उपयोग करके श्रृंखलाबद्ध संरचनाओं की जीन दमन दक्षता का मूल्यांकन करें। यदि तीन या अधिक प्री-मिआरएनए अनुक्रम समान रूप से उच्च वध गतिविधियों को दिखाते हैं, तो दो अनुक्रमों के विभिन्न संयोजनों का परीक्षण करें और उन संयोजनों का उपयोग करें जो उच्चतम वध गतिविधि दिखाते हैं ( प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
- ईएमजीएफपी-प्री-मिआरएनए अभिव्यक्ति कैसेट को टोल 2 ट्रांसपोसन वेक्टर में स्थानांतरित करना।
नोट: EmGFP cDNA और दो पूर्व-MIRNA अनुक्रमों वाले अभिव्यक्ति कैसेट को Tol2 ट्रांसपोसन वेक्टर (pT2K-CAGGS वेक्टर, सामग्री की तालिका देखें) में स्थानांतरित किया जाता है। इसके लिए, अभिव्यक्ति कैसेट (सीएमवी प्रमोटर के 3 'छोर से लेकर माइआरएनए अभिव्यक्ति वेक्टर के एमआरएनए रिवर्स सीक्वेंसिंग प्राइमर साइट तक) को एक कृत्रिम प्रतिबंध एंजाइम साइट के साथ प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर-प्रवर्धित किया जाता है, और पीसीआर उत्पाद को टोल 2 ट्रांसपोसन वेक्टर में क्लोन किया जाता है। टोल 2 ट्रांसपोसन वेक्टर में सर्वव्यापी सीएजीजीएस प्रमोटर होता है, जो सम्मिलित अभिव्यक्ति कैसेट की अभिव्यक्ति को चलाता है। CAGGS प्रमोटर और अभिव्यक्ति कैसेट टोल 2 अनुक्रमों (चित्रा 1) से घिरे हुए हैं।- ईएमजीएफपी-प्री-मिआरएनए अभिव्यक्ति कैसेट का पीसीआर प्रवर्धन: तालिका 3 में वर्णित प्रतिक्रिया सेटअप और थर्मोसाइक्लिंग स्थितियों का पालन करें।
- जेल-शुद्ध पीसीआर उत्पाद (सी. 1.3 केबी) को प्रतिबंध एंजाइम-पचने वाले टोल 2 ट्रांसपोसन वेक्टर में मिलाएं। प्लाज्मिड को सक्षम ई कोलाई कोशिकाओं में इलेक्ट्रोपोरेट करें ( सामग्री की तालिका देखें) और पुनः संयोजक (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA संरचनाओं) का चयन करें।
- पारंपरिक मैक्सिप्रेप किट का उपयोग करके प्लास्मिड तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। क्रमशः प्रतिबंध मैपिंग द्वारा और पीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों का उपयोग करके प्लास्मिड की संरचना और अनुक्रम की जांच करें।
2. अंडे का भंडारण और इनक्यूबेशन
- स्थानीय खेतों या वाणिज्यिक विक्रेताओं से निषेचित सफेद लेगहॉर्न (गैलस गैलस) अंडे खरीदें।
नोट: अंडे को 12-16 डिग्री सेल्सियस या 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह पहले इनक्यूबेशन 1 सप्ताह तक इनक्यूबेशन के दौरान व्यवहार्यता के महत्वपूर्ण नुकसान या विकास में देरी के बिना रखा जा सकता है। - इनक्यूबेशन की शुरुआत की तारीख के साथ अंडे को लेबल करें और अंडे के शीर्ष पक्ष को चिह्नित करें (जहां भ्रूण स्थित होगा)। निषेचित अंडे को 38 डिग्री सेल्सियस पर क्षैतिज स्थिति में तब तक सेएं जब तक कि भ्रूण हैमबर्गर और हैमिल्टन (एचएच) चरण 10 (33-38 घंटे) -11 (40-45 घंटे) 19 तक नहीं पहुंच जाते।
3. ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन में
- ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए तैयारी
- 0.25% फास्ट ग्रीन समाधान की तैयारी: पीबीएस के 10 एमएल में 25 मिलीग्राम फास्ट ग्रीन एफसीएफ घोलें। 0.2 μm सिरिंज फ़िल्टर का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर करें। समाधान आरटी में संग्रहीत किया जा सकता है।
- डीएनए कॉकटेल: 2: 1 के अनुपात में अलग-अलग pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA प्लास्मिड (सबस्टेप 1.6.3) को Tol2 ट्रांसपोसेस अभिव्यक्ति प्लास्मिड (pCAGGS-T2TP वेक्टर; सामग्री की तालिका देखें) (5 μg / μL प्रत्येक) के साथ मिलाकर इंजेक्शन समाधान तैयार करें। इंजेक्शन क्षेत्र की कल्पना करने के लिए 0.25% तेज हरे रंग के घोल की 1/10 मात्रा जोड़ें।
नोट: इष्टतम डीएनए एकाग्रता संरचनाओं के आधार पर भिन्न हो सकती है। - माइक्रोइंजेक्शन उपकरण की स्थापना (चित्रा 3 ए, बी): माइक्रोइंजेक्शन उपकरण में निम्नलिखित शामिल हैं (सामग्री की तालिका देखें): हैमिल्टन सिरिंज, 18 ग्राम सुई (सुई की लंबाई = 2"), पीवीसी (पॉलीविनाइल क्लोराइड) टयूबिंग (2 सेमी लंबाई), माइक्रोपिपेट सुई (एक माइक्रोपिपेट पुलर के साथ ओमेगा डॉट फाइबर (1 मिमी ओ.डी. एक्स 0.75 मिमी आईडी) के साथ केशिका ट्यूबों को खींचकर बनाया जा सकता है)।
- भारी खनिज तेल के साथ एक हैमिल्टन सिरिंज भरें। सिरिंज में 18 ग्राम की सुई संलग्न करें और सिरिंज प्लंजर को दबाकर सुई के आंतरिक स्थान को तेल से भरें।
- सुई के अंत में 2 सेमी लंबी पीवीसी ट्यूबिंग का एक टुकड़ा संलग्न करें और तेल के साथ टयूबिंग भरें।
- टयूबिंग में एक खींची हुई माइक्रोपिपेट सुई संलग्न करें। माइक्रोपिपेट सुई की नोक को 10-20 μm व्यास में एक छोटा सा खोलने के लिए बारीक बल द्वारा तोड़ दें। पूरी सुई को तेल से भरें।
नोट: सिस्टम में किसी भी हवा के बुलबुले को फंसाने के लिए ध्यान नहीं रखा जाना चाहिए, क्योंकि वे डीएनए समाधान के प्रवाह को बाधित करेंगे।
- एक बाँझ पेट्री डिश पर रंगीन डीएनए कॉकटेल (सबस्टेप 3.1.2) के 5 μL डालें। विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, बाँझ पेट्री डिश पर डीएनए समाधान में माइक्रोपिपेट सुई की नोक रखें और धीरे-धीरे समाधान को सुई में खींचें।
- तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि दबाव सुई के अंदर और बाहर न हो जाए (इससे बचने के लिए कि हवा सुई में चली जाती है) और सुई की नोक को डीएनए समाधान से बाहर निकालें। इंजेक्शन तक एक छोटे बीकर में बाँझ पीबीएस में सुई की नोक को डुबोकर रखें।
- इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरण की स्थापना (चित्रा 3 ए, सी):
- एक माइक्रोमैनिपुलेटर पर इलेक्ट्रोड धारक के साथ प्लैटिनम इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी सेट करें। इलेक्ट्रोड की नोक के बीच की दूरी को 2 मिमी (चित्रा 3 सी, ई) तक समायोजित करें।
- इलेक्ट्रोड को केबल के साथ एक वर्ग तरंग पल्स जनरेटर से कनेक्ट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- डीएनए समाधान का माइक्रोइंजेक्शन (चित्रा 3 डी)।
- इनक्यूबेटर से एक चिकन अंडे को निकालें और 70% इथेनॉल में भिगोए गए टिशू पेपर से अंडे की सतह को पोंछ लें।
- 10 एमएल सिरिंज में 18 ग्राम सुई संलग्न करें। अंडे के कुंद छोर के माध्यम से सुई डालें, जर्दी को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए नीचे की ओर कोण (45 डिग्री) करें।
- अंडे से 2-3 एमएल एल्बुमिन निकालें। स्कॉच टेप के एक टुकड़े के साथ छेद को सील करें। पुष्टि करें कि भ्रूण और विटेलिन झिल्ली को प्रकाश के साथ अंडे को "कैंडिंग" करके खोल से अलग किया जाता है।
- भ्रूण को उजागर करने के लिए कैंची और बल का उपयोग करके अंडे के शीर्ष से अंडे के छिलके (2-3 सेमी व्यास सर्कल) का एक टुकड़ा निकालें। इलेक्ट्रोपोरेशन के दौरान भ्रूण को सूखने से रोकने के लिए किसी भी समय पांच से अधिक अंडे न दें।
नोट: यदि अंडे को क्रैक किए बिना खिड़की खोलना मुश्किल है, तो अंडे के छिलके के टुकड़े को हटाने से पहले अंडे के पूरे शीर्ष को सेलोटेप या स्कॉच टेप से कवर किया जा सकता है। - सुई की नोक को ऑप्टिक पुटिका में उसके समीपस्थ पक्ष से 45 डिग्री कोण पर डालें और डीएनए कॉकटेल को धीरे-धीरे निराशाजनक (या टैप िंग) करके इंजेक्ट करें जब तक कि नीले रंग का घोल लुमेन को भर न दे (चित्रा 3 डी)।
नोट: वैकल्पिक रूप से, डीएनए समाधान के इंजेक्शन के लिए एक दबाव माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग किया जा सकता है। - सुई को वापस लें और इसकी नोक को पीबीएस में वापस रखें।
- इलेक्ट्रोपोरेशन (चित्रा 3 ई)।
- इलेक्ट्रोपोरेटर के पल्स पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें: वोल्टेज: 15 वी, पल्स लंबाई: 50 एमएस, पल्स अंतराल: 950 एमएस, पल्स नंबर: 5
- भ्रूण के ऊपर विटेलिन झिल्ली पर एचबीएसएस की कुछ बूंदें जोड़ें। भ्रूण के पूर्वकाल-पीछे की धुरी के लंबवत, माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके एचबीएसएस में इलेक्ट्रोड को कम करें।
नोट: वैकल्पिक रूप से, यह प्रक्रिया एचबीएसएस को जोड़ने के बिना की जा सकती है, क्योंकि एल्बुमिन एक अच्छा विद्युत कंडक्टर है जो कुशल विद्युतीकरण की अनुमति देता है। - ऑप्टिक पुटिका के दोनों तरफ (पूर्ववर्ती (नाक) पक्ष और पीछे (अस्थायी) पक्ष पर इलेक्ट्रोड रखें (चित्रा 3 ई)। सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड भ्रूण या रक्त वाहिकाओं को नहीं छूते हैं। स्पंदित विद्युत क्षेत्र लागू करें।
- इलेक्ट्रोड को हटा दें और एल्ब्यूमिन के संचय से बचने के लिए पानी से लथपथ बाँझ कपास की कली के साथ इलेक्ट्रोड को धीरे से साफ करें।
- स्कॉच टेप के साथ खिड़की को सील करें और वांछित विकास चरण तक भ्रूण को फिर से इनक्यूबेट करें।
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Representative Results
नेल के खिलाफ कृत्रिम एमआईआरएनए की अभिव्यक्ति के लिए टोल 2 ट्रांसपोसन संरचनाओं का निर्माण
नेल (एनयूरल ईपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ)-एलआईके; जिसे नेल 2 के रूप में भी जाना जाता है) एक बाह्य ग्लाइकोप्रोटीन है। इसमें थ्रोम्बोस्पोंडिन -1 के साथ संरचनात्मक समानताएं हैं और मुख्य रूप से तंत्रिका तंत्र20,21 में व्यक्त की जाती हैं। हमने पहले प्रदर्शित किया है कि नेल रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं15 के भेदभाव और अस्तित्व को नियंत्रित करता है और रेटिना अक्षतंतु22,23,24 के लिए निरोधात्मक मार्गदर्शन संकेत के रूप में कार्य करता है। विकासशील चूजा रेटिना में, नेल अभिव्यक्ति एचएच 15 (भ्रूण दिवस (ई) 2.5) पर अनुमानित वर्णक उपकला में पाई जाती है। एचएच 20 (ई 3.5) में, नेल अभिव्यक्ति को नए विभेदित रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं में भी देखा जाता है। वर्णक उपकला और रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं में नेल की मजबूत अभिव्यक्ति कम से कम ई 1815 तक जारी रहती है।
रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं के विकास में नेल के कार्य की जांच करने के लिए, ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन और टोल 2 ट्रांसपोसन सिस्टम15,16 का उपयोग करके विकासशील रेटिना में कृत्रिम एमआईआरएनए पेश करके नेल जीन की अभिव्यक्ति को कम कर दिया गया था। सबसे पहले, एकल-फंसे हुए डीएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के जोड़े को ऑनलाइन आरएनएआई डिजाइनिंग टूल (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके चिकन नेल सीडीएनए (जेनबैंक परिग्रहण संख्या: NM_001030740.1) के प्रोटीन-कोडिंग क्षेत्र में 10 संभावित लक्ष्य अनुक्रमों के लिए डिज़ाइन किया गया था। ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जोड़े को एनाल्ड किया गया और व्यक्तिगत रूप से माइआरएनए अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन किया गया। फिर, अलग-अलग संरचनाओं को HEK293T कोशिकाओं में स्थानांतरित किया गया जो नेल-एपी को स्थिर रूप से व्यक्त करते हैं, और संस्कृति मीडिया में एपी गतिविधि को मापकर उनकी वध क्षमता का मूल्यांकन किया गया था। पीसीडीएनए 6.2-जीडब्ल्यू / ईएमजीएफपी-एमआईआरएनए-नकारात्मक नियंत्रण प्लास्मिड का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया गया था (चित्रा 4 ए)।
निर्माता के निर्देशों17 के अनुसार, तीन नेल प्री-मिआरएनए अनुक्रम जो उच्चतम नॉक डाउन प्रभाव दिखाते हैं, का चयन किया गया (क्रमशः चिकन नेल सीडीएनए के न्यूक्लियोटाइड 482-502, 910-930 और 2461-2481 के खिलाफ), और दो प्री-मिआरएनए अनुक्रमों को माइआरएनए अभिव्यक्ति वेक्टर (पीसीडीएनए 6.2-जीडब्ल्यू / ईएमजीएफपी -2 एक्स नेल प्री-मिआरएनए) में क्रमबद्ध रूप से क्लोन किया गया था। दो प्री-मिआरएनए और ईएमजीएफपी को एन्कोडिंग करने वाले अभिव्यक्ति कैसेट्स को पीसीआर द्वारा दोनों सिरों (5'-जीजीजीएएटीसीटीसीटीजीसीटीजीटीएएसीटीएजीएएसी-3' और 5'-सीसीजीएएटीटीसीसीटीसीटीसीएसीसीएसीएसी-3') पर एक कृत्रिम इकोआरआई साइट के साथ प्रवर्धित किया गया और पीटी2के-सीएजीजीएस-सीएजीजीएस-2एक्स नेल प्री-मिआरएनए में क्लोन किया गया। पीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों का उपयोग करके अभिव्यक्ति कैसेट के अनुक्रम की पुष्टि की गई थी। pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel प्री-MIRNA संरचनाओं को व्यक्तिगत रूप से Tol2 transposase अभिव्यक्ति वेक्टर (pCAGGS-T2TP) के साथ HEK293T कोशिकाओं में सह-स्थानांतरित किया गया था जो Nel-AP को स्थिर रूप से व्यक्त करते हैं, और संस्कृति मीडिया में एपी गतिविधियों को मापकर नेल-एपी अभिव्यक्ति पर निरोधात्मक प्रभाव का मूल्यांकन किया गया था। जैसा कि चित्रा 4 बी में दिखाया गया है, दो एमआरएनए अनुक्रमों की श्रृंखला द्वारा वध दक्षता में काफी वृद्धि हुई थी। नेल-एपी अभिव्यक्ति (90% से अधिक) का मजबूत दमन अभिकर्मक के कम से कम 13 दिनों बाद तक देखा गया था (चित्रा 4 बी)।
विकासशील चूजा रेटिना में नेल अभिव्यक्ति का स्थिर दमन
एक pT2K-CAGGS-EmGFP-2x नेल प्री-मिआरएनए निर्माण (जिसमें चिकन नेल सीडीएनए के न्यूक्लियोटाइड 482-502 और 2461-2481 के लिए लक्ष्य अनुक्रम शामिल हैं) को HH9-11 (चित्रा 3, चित्रा 5A) में ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा चूजे रेटिना के अस्थायी या नाक पक्ष में ट्रांसपोसेस अभिव्यक्ति वेक्टर (pCAGGS-T2TP) के साथ सह-स्थानांतरित किया गया था। अनुभाग ों को ई 4.5 या ई 8 रेटिना से तैयार किया गया था, और नेल अभिव्यक्ति पर प्रभाव का मूल्यांकन एंटी-नेल एंटीबॉडी22 का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा किया गया था। ई 4.5 पर, रेटिना वर्णक उपकला में नेल की अभिव्यक्ति ईएमजीएफपी व्यक्त करने वाली कोशिकाओं (चित्रा 5 बी-डी) में काफी कम हो गई थी। ई 8 में, रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं (चित्रा 5 ई-आई) में नेल अभिव्यक्ति में कमी भी स्पष्ट रूप से देखी गई थी। नेल अभिव्यक्ति का महत्वपूर्ण दमन कम से कम ई 18 तक जारी रहा (डेटा नहीं दिखाया गया)। नियंत्रण मिआरएनए की शुरूआत ने रेटिना में नेल अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं किया (चित्रा 5 जे-ओ)।
चित्र 1: ट्रांसपोसेज द्वारा टोल 2-एग्डेड सीडीएनए का ट्रांसपोज़ेशन। ईएमजीएफपी के लिए एक टोल 2-बगल वाले अभिव्यक्ति कैसेट के ट्रांसपोज़ेशन को दर्शाने वाला एक योजनाबद्ध और ट्रांसपोसेज द्वारा दो पूर्व-एमआरएनए अनुक्रमों (2x प्री-मिआरएनए) को श्रृंखलाबद्ध करना। जब अभिव्यक्ति कैसेट (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA निर्माण) वाले एक टोल 2 ट्रांसपोसन वेक्टर को टॉल 2 ट्रांसपोसेस अभिव्यक्ति निर्माण (pCAGGS-T2TP) के साथ कोशिकाओं में पेश किया जाता है, तो Tol2-बगल वाले अभिव्यक्ति कैसेट को वेक्टर से निकाला जाता है और ट्रांसपोसेस गतिविधि द्वारा मेजबान जीनोम में एकीकृत किया जाता है। ईएमजीएफपी और एमआईआरएनए की अभिव्यक्ति सर्वव्यापी प्रमोटर सीएजीजीएस द्वारा संचालित है। इस आंकड़े को नाकामोटो एट अल.15 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: इंजीनियर किए गए प्री-मिआरएनए की संरचना। (ए) डिजाइन किया गया प्री-मिआरएनए अनुक्रम मुराइन एमआईआर -155 अनुक्रम17 पर आधारित है। शीर्ष स्ट्रैंड ऑलिगो में (5' अंत से 3' अंत तक) एक चार-न्यूक्लियोटाइड ओवरहैंग (टीजीसीटी (नीला)), एंटीसेंस लक्ष्य अनुक्रम (21 न्यूक्लियोटाइड), टर्मिनल लूप अनुक्रम (लाल), और सेंस लक्ष्य अनुक्रम (19 न्यूक्लियोटाइड) शामिल हैं। एंटीसेंस लक्ष्य अनुक्रम परिपक्व एमआरएनए अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करता है। निचले स्ट्रैंड ऑलिगो में चार-न्यूक्लियोटाइड 5 'ओवरहैंग (सीसीटीजी (नीला)) और शीर्ष स्ट्रैंड ऑलिगो का रिवर्स पूरक अनुक्रम होता है, लेकिन 3 'अंत में चार-न्यूक्लियोटाइड ओवरहैंग का अभाव होता है (एजीसीए -3': टॉप-स्ट्रैंड ऑलिगो के 5'-टीजीसीटी का रिवर्स पूरक)। सेंस लक्ष्य अनुक्रम में लक्ष्य अनुक्रम के न्यूक्लियोटाइड 9 और 10 का अभाव होता है। एंटीसेंस लक्ष्य अनुक्रम में "अतिरिक्त" दो न्यूक्लियोटाइड परिपक्व माइआरएनए अणु की स्टेम-लूप संरचना में एक आंतरिक लूप बनाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप उच्च वध दर17 होती है। (बी) चिकन नेल के खिलाफ लक्ष्य अनुक्रम का एक उदाहरण। चिकन नेल जीन (जेनबैंक परिग्रहण संख्या NM_001030740.1, न्यूक्लियोटाइड 482-502) के लक्ष्य अनुक्रम के लिए शीर्ष और निचले स्ट्रैंड में सेंस और एंटीसेंस अनुक्रम दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: ओवो माइक्रोइंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन में। (ए) ओवो माइक्रोइंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए वर्कस्टेशन। (1) माइक्रोस्कोप का विच्छेदन। (2) इंजेक्शन उपकरण। (3) इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरण। (4) दोहरे हंसनेक माइक्रोस्कोप प्रकाशक। (5) इलेक्ट्रोपोरेटर। (बी) इंजेक्शन उपकरण। 18 ग्राम सुई (7) के साथ एक हैमिल्टन सिरिंज (6) पीवीसी ट्यूबिंग (8) और एक खींची गई माइक्रोपिपेट सुई (9) से जुड़ा हुआ है और एक माइक्रोमैनिपुलेटर (10) पर सेट किया गया है। उपकरण का आंतरिक स्थान भारी खनिज तेल से भरा है। (ग) इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरण। एक इलेक्ट्रोड धारक (12) के साथ प्लैटिनम इलेक्ट्रोड (11) का एक सेट एक माइक्रोमैनिपुलेटर (13) पर सेट किया जाता है। इलेक्ट्रोड केबल के साथ इलेक्ट्रोपोरेटर से जुड़े होते हैं (14). (डी) एचएच 10-11 पर ऑप्टिक पुटिका में डीएनए कॉकटेल समाधान का माइक्रोइंजेक्शन। खींची गई माइक्रोपिपेट सुई को इसके समीपस्थ पक्ष से ऑप्टिक पुटिका में डाला जाता है। तेज हरे (नीले) के साथ डीएनए कॉकटेल समाधान को ऑप्टिक पुटिका में इंजेक्ट किया जाता है जब तक कि डाई पूरे लुमेन को नहीं भर देती। (ई) ऑप्टिक पुटिका में इलेक्ट्रोपोरेशन। इलेक्ट्रोड को समानांतर में रखा जाता है (इलेक्ट्रोड के बीच की दूरी 2 मिमी है) और एक तरह से ताकि इंजेक्शन ऑप्टिक पुटिका इलेक्ट्रोड के बीच स्थित हो: एक इलेक्ट्रोड ऑप्टिक पुटिका की पूर्ववर्ती (नाक) सतह के पास स्थित है, और दूसरा हिंडब्रेन के स्तर पर भ्रूण के पीछे के हिस्से में है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: नेल जीन दमन दक्षता के लिए व्यक्तिगत या जंजीर वाले पूर्व-एमआरएनए अनुक्रमों का इन विट्रो मूल्यांकन। (ए) व्यक्तिगत प्री-एमआरएनए अनुक्रमों के प्रभाव ों को नष्ट करना। पांच प्रतिनिधि संरचनाओं के परिणाम (एंटीसेंस लक्ष्य अनुक्रम संबंधित न्यूक्लियोटाइड संख्या 482-502, 910-930, 1106-1126, 1663-1683, और 2461-2481 चिकन नेल सीडीएनए (जेनबैंक परिग्रहण संख्या: NM_001030740.1)) दिखाए गए हैं। व्यक्तिगत एमआरएनए अभिव्यक्ति निर्माण (pcDNA6.2-GW / EmGFP-Nel प्री-miRNA) को HEK293T कोशिकाओं में स्थानांतरित किया गया था जो स्थिर रूप से Nel-AP को व्यक्त करते हैं। पीसीडीएनए 6.2-जीडब्ल्यू/ईएमजीएफपी-एमआईआरएनए-नकारात्मक नियंत्रण प्लास्मिड का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया गया था। नेल-एपी की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन अभिकर्मक के 48-96 घंटे बाद संस्कृति मीडिया में एपी गतिविधियों को मापकर किया गया था। तीन नेल प्री-मिआरएनए अभिव्यक्ति संरचनाओं (न्यूक्लियोटाइड ्स 482-502, 910-930 और 2461-2481 के खिलाफ, क्रमशः) ने नेल अभिव्यक्ति के महत्वपूर्ण दमन को दिखाया। (बी) श्रृंखलाबद्ध पूर्व-एमआरएनए अनुक्रमों के प्रभाव ों का विनाश। तीन सबसे शक्तिशाली प्री-मिआरएनए अनुक्रमों में से दो (न्यूक्लियोटाइड 482-502, 910-930, और 2461-2481 के खिलाफ) को पीसीडीएनए 6.2-जीडब्ल्यू / ईएमजीएफपी-एमआईआर वेक्टर में क्रमबद्ध रूप से क्लोन किया गया था, और अभिव्यक्ति कैसेट (जिसमें दो प्री-एमआरएनए अनुक्रम और ईएमजीएफपी सीडीएनए शामिल हैं) को पीटी 2 के-सीएजीजीएस वेक्टर (पीटी 2 के-सीएजीजीएस-ईएमजीएफपी-2एक्स प्री-एमआरएनए) में स्थानांतरित कर दिया गया था। pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel प्री-MIRNA संरचनाओं को व्यक्तिगत रूप से Tol2 transposase (pCAGGS-T2TP) के लिए अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ HEK293T कोशिकाओं में सह-स्थानांतरित किया गया था जो नेल-एपी को स्थिर रूप से व्यक्त करते हैं, और नेल-एपी की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन अभिकर्मक के 2 से 13 दिनों तक संस्कृति मीडिया में एपी गतिविधियों को मापकर किया गया था। सभी तीन संयोजनों (482-502/910-930, 482-502/2461-2481, 910-930/2461-2481) ने बिना जंजीर वाले व्यक्तिगत पूर्व-एमआरएनए अनुक्रमों की तुलना में बढ़ी हुई दमन गतिविधियों को दिखाया। नेल-एपी अभिव्यक्ति का महत्वपूर्ण दमन दिन 2 से कम से कम 13 वें दिन तक देखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: माइआरएनए ट्रांसजेन के टोल 2 ट्रांसपोसन-मध्यस्थता एकीकरण द्वारा विकासशील चूजा रेटिना में नेल अभिव्यक्ति का स्थिर वध। एक टोल 2 ट्रांसपोसन निर्माण जिसमें दो नेल प्री-मिआरएनए अनुक्रमों और ईएमजीएफपी (पीटी 2के-सीएजीजीएस-ईएमजीएफपी-नेल प्री-मिआरएनए (482-502)-नेल प्री-मिआरएनए (2461-2481)) (ए-आई) या एक नियंत्रण निर्माण जो एक असंबंधित एमआरएनए और ईएमजीएफपी (जे-ओ) को व्यक्त करता है, को एक ट्रांसपोसेस अभिव्यक्ति वेक्टर (पीसीजीजीएस-टी 2 टी) के साथ सह-स्थानांतरित किया गया था। HH9-HH11 (E1.5) पर इलेक्ट्रोपोरेशन। रेटिना वर्गों को ई 4.5 (बी-डी, जे-एल) या ई 8 (ई-आई, एम-ओ) पर तैयार किया गया था, और एंटी-नेल एंटीबॉडी (लाल) का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा नेल जीन दमन की क्षमता की जांच की गई थी। चूंकि डीएनए को नकारात्मक रूप से चार्ज किया जाता है, इसलिए ट्रांसजेन को एनोड साइड पर ऊतक में इलेक्ट्रोपोरेट किया जाता है; इस प्रकार, रेटिना के केवल आधे हिस्से को ईएमजीएफपी (अभिकर्मक (टीएफ) पक्ष, हरा) के साथ लेबल किया गया था। (ए) ई 4.5 पर रेटिना के अस्थायी आधे हिस्से में ईएमजीएफपी मार्कर जीन की अभिव्यक्ति। ऑप्टिक फिशर (सफेद तीर) ट्रांसक्रिप्टेड और अनट्रांसक्रिप्टेड (नियंत्रण) पक्षों के बीच की सीमा का प्रतिनिधित्व करता है। (B-I) "विकासशील चूजा रेटिना में नेल अभिव्यक्ति का आरएनएआई वध". (B-D) ई 4.5 पर, रेटिना वर्णक उपकला (पीई) कोशिकाओं में नेल अभिव्यक्ति काफी कम हो जाती है (बी, डी) जो ईएमजीएफपी (सी, डी) को व्यक्त करती है। डी में नेल इम्यूनोस्टेनिंग और ईएमजीएफपी अभिव्यक्ति के पूरक पैटर्न पर ध्यान दें। एनआर, तंत्रिका रेटिना। (E-I) ई 8 में, रेटिना वर्णक उपकला और गैंग्लियन सेल परत (जीसीएल) में नेल अभिव्यक्ति (ई, जी) अभिकर्मक पक्ष (एफ, जी) पर कम हो जाती है। (एच, आई) क्रमशः ई में एक अभिकर्मक क्षेत्र और एक संबंधित नियंत्रण क्षेत्र (छोटे आयताकारों द्वारा इंगित) के उच्च आवर्धन दृश्य। (D, G) बाईं दो छवियों की विलय की गई छवियां। (J-O) नियंत्रण की अभिव्यक्ति एमआईआरएनए। नकारात्मक नियंत्रण निर्माण का परिचय ई 4.5 (जे-एल) या ई 8 (एम-ओ) रेटिना में नेल की अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं करता है। (एल, ओ) बाईं दो छवियों की विलय की गई छवियां। अभिकर्मक और नियंत्रण पक्षों के बीच की सीमा को C, F, K और N में एक बिंदीदार रेखा द्वारा इंगित किया गया है। स्केल बार, 50 μm. (A) और (B-I) को क्रमशः नाकामोटो, M. और नाकामोटो, C 16 और नाकामोटो एटअल.15 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| एनीलिंग प्रतिक्रिया सेटअप | |
| शीर्ष स्ट्रैंड ओलिगो (टीई बफर में 200 μM) | 5 μL (अंतिम एकाग्रता 50 μM) |
| नीचे स्ट्रैंड ओलिगो (टीई बफर में 200 μM) | 5 μL (अंतिम एकाग्रता 50 μM) |
| 10x ओलिगो एनीलिंग बफर * | 2 μL |
| DNase/RNase-मुक्त पानी * | 8 μL |
| कुल | 20 μL |
| * MIRNA अभिव्यक्ति किट में प्रदान किया गया ( सामग्री की तालिका देखें) | |
तालिका 1: एनीलिंग प्रतिक्रिया सेटअप
| 2x एपी सब्सट्रेट बफर | |
| 10 एम डायथेनॉलमाइन (पीएच 9.8) | 4 एमएल |
| 1 एम एमजीसीएल2 | 10 μL |
| एल-होमोआर्जिनिन | 45 मिलीग्राम |
| बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) | 10 मिलीग्राम |
| पी-नाइट्रोफेनिलफॉस्फेट | 63 मिलीग्राम |
| H2O | 20 एमएल की कुल मात्रा बनाने के लिए जोड़ें |
तालिका 2: 2x एपी सब्सट्रेट बफर। समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट में संग्रहीत किया जाना चाहिए और प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए क्योंकि पी-नाइट्रोफेनिलफॉस्फेट प्रकाश संवेदनशील है।
| प्रतिक्रिया सेटअप | |||
| ईएमजीएफपी-2एक्स प्री-मिआरएनए प्लास्मिड (धारा 1.5 से) या pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-नकारात्मक नियंत्रण प्लास्मिड* (0.1 μg/μL) |
1 μL | ||
| 10x PFU बफर | 5 μL | ||
| डीएनटीपी मिश्रण (डीएटीपी, डीसीटीपी, डीजीटीपी और डीटीटीपी के प्रत्येक 10 एमएम) | 1 μL | ||
| EmGFP फॉरवर्ड प्राइमर* (5'-GGCATGGACGAGCTGTACA-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| miRNA रिवर्स प्राइमर* (5'- CTCTAGATCAACCACTTTGT-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| पीएफयू डीएनए पोलीमरेज़ (5 यूनिट / | 0.5 μL | ||
| H2O | 40.5 μL | ||
| कुल मात्रा | 50 μL | ||
| * MIRNA अभिव्यक्ति किट में प्रदान किया गया। | |||
| थर्मोसाइक्लिंग की स्थिति | |||
| 94 °C | 5 मिनट | ||
| निम्नलिखित के 30 चक्र: | |||
| 94 °C | 45 s | ||
| 58 °C | 1 मिनट | ||
| 72 °C | 2 मिनट | ||
| 72 °C | 10 मिनट | ||
तालिका 3: प्रतिक्रिया सेटअप और थर्मोसाइक्लिंग स्थितियां।
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Discussion
यह प्रोटोकॉल ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन और टोल 2 ट्रांसपोसन सिस्टम का उपयोग करके कृत्रिम एमआईआरएनए की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति द्वारा विकासशील चिक रेटिना में जीन साइलेंसिंग के लिए एक विस्तृत मार्गदर्शिका प्रदान करता है।
इस तकनीक को सफलतापूर्वक करने में निम्नलिखित कारकों का महत्वपूर्ण महत्व है। सबसे पहले, एमआरएनए अनुक्रमों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो मजबूत वध प्रभाव डालने के लिए पुष्टि की जाती है। ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन में उन्हें लागू करने से पहले, इन विट्रो परख (चरण 1.4) में जीन दमन दक्षता के लिए व्यक्तिगत प्री-एमआरएनए अनुक्रमों का परीक्षण करें और दो पूर्व-एमआरएनए अनुक्रमों को श्रृंखला दें जो उच्चतम वध गतिविधियों (चरण 1.5) को दिखाते हैं। दूसरा, डीएनए समाधान के इंजेक्शन के लिए माइक्रोपिपेट सुई डालते समय ऑप्टिक पुटिका और आसपास के तंत्रिका ऊतकों को नुकसान नहीं पहुंचाना महत्वपूर्ण है। भ्रूण पर अत्यधिक क्षति भ्रूण विकृति और मृत्यु का कारण बन सकती है। ऊतक क्षति से बचने के लिए, माइक्रोपिपेट को ऑप्टिक पुटिका में सही अभिविन्यास में पेश करें। माइक्रोपिपेट सुई की छोटी और तेज युक्तियां ऑप्टिक पुटिका के प्रवेश को आसान बनाती हैं और परिणामस्वरूप ऊतक क्षति कम होती है। हालांकि, बहुत छोटी युक्तियों वाली सुइयों को डीएनए समाधान को लोड करने और जारी करने में कठिनाई होती है। यहां वर्णित अध्ययन में, 10-20 μm व्यास की नोक खोलने वाली सुइयों का उपयोग किया गया था। तीसरा, डीएनए समाधान के साथ पूरे ऑप्टिक पुटिका को भरना सुनिश्चित करें (जैसा कि तेजी से हरे रंग के प्रसार द्वारा कल्पना की गई है)। चौथा, ऑप्टिक पुटिका के वांछित क्षेत्र (जैसे, अस्थायी पक्ष, नाक पक्ष) में डीएनए को लक्षित करने के लिए इलेक्ट्रोड को इष्टतम स्थिति में रखें। नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए डीएनए अणु एनोड पक्ष की ओर बढ़ेंगे; इसलिए इलेक्ट्रोड का सटीक प्लेसमेंट और अभिविन्यास अंतिम परिणामों को गंभीर रूप से प्रभावित करता है। अंत में, इष्टतम डीएनए सांद्रता और इलेक्ट्रोपोरेशन मापदंडों का उपयोग करें।
यदि इलेक्ट्रोपोरेशन के 24 घंटे के बाद कोई फ्लोरोसेंट सिग्नल नहीं देखा जाता है, तो निम्नलिखित पर विचार किया जाना चाहिए: (1) पुष्टि करें कि इलेक्ट्रोपोरेटेड प्लास्मिड में सही अनुक्रम हैं। (2) व्यक्तिगत प्लास्मिड की एकाग्रता और शुद्धता को फिर से जांचें। (3) सुनिश्चित करें कि डीएनए समाधान ऑप्टिक पुटिका के लुमेन को भरता है और यह तंत्रिका ट्यूब में दूर नहीं फैलता है। (4) जांचें कि उपयोग किए गए इलेक्ट्रोपोरेशन पैरामीटर सही हैं। (5) जांचें कि इलेक्ट्रोड विटेलिन झिल्ली के संपर्क में हैं जबकि इलेक्ट्रिक पल्स लागू होते हैं।
इस प्रोटोकॉल में ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन और ट्रांसपोसन-मध्यस्थता जीन एकीकरण विधि का संयोजन कई अलग-अलग फायदे प्रदान करता है। सबसे पहले, यह एमआईआरएनए के स्थिर उत्पादन का समर्थन करता है और इस प्रकार लक्ष्य जीन का लगातार दमन करता है। चूजा रेटिना का विकास ई 1.5 से शुरू होता है और हैचिंग तक जारी रहता है (रेटिना गैंग्लियन कोशिकाएं ई 2 से ई 9 तक की अवधि में उत्पन्न होती हैं)। जीन फ़ंक्शन के हानि-ऑफ-फ़ंक्शन विश्लेषण के लिए, इस अवधि के दौरान कृत्रिम एमआईआरएनए की अभिव्यक्ति को स्थिर रूप से बनाए रखा जाना चाहिए। पारंपरिक अभिव्यक्ति वैक्टर का उपयोग करके आरएनएआई अनुक्रमों की अभिव्यक्ति आम तौर पर क्षणिक होती है क्योंकि अभिव्यक्ति निर्माण गुणसूत्रों में कुशलतापूर्वक एकीकृत होने में विफल रहता है। यहां वर्णित विधि में, हालांकि, अभिव्यक्ति कैसेट के क्रोमोसोमल एकीकरण को सह-इलेक्ट्रोपोरेटेड ट्रांसपोसेस की गतिविधि द्वारा मध्यस्थ किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप ट्रांसजेन की स्थिर अभिव्यक्ति होती है।
दूसरा, इस पद्धति में, एक ही सीएजीजीएस प्रमोटर कई एमआरएनए अनुक्रमों की सह-सिस्ट्रोनिक अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है और ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं में ईएमजीएफपी मार्कर को प्रेरित करता है, इस प्रकार प्रमोटर हस्तक्षेप के जोखिम को दरकिनार करता है, जो रेट्रोवायरल वैक्टर के साथ सामान्य जटिलताओं में से एक है जिसमें दो प्रमोटर दोहरे जीन अभिव्यक्ति25 प्राप्त करते हैं।
अंत में, प्रतिकृति-सक्षम रेट्रोवायरल वैक्टर के विपरीत, इस विधि द्वारा इलेक्ट्रोपोरेट किए गए ट्रांसजीन को पड़ोसी कोशिकाओं में स्थानांतरित नहीं किया जाता है। इसलिए, उचित प्रकार के इलेक्ट्रोड का उपयोग करके और उन्हें सही स्थिति में रखकर अभिकर्मक के क्षेत्र को अधिक सटीक रूप से नियंत्रित किया जा सकता है।
ऊपर वर्णित फायदों के बावजूद, वर्तमान विधि में सीमाएं भी हैं जो ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन में अंतर्निहित हैं। उदाहरण के लिए, अभिकर्मक और जीन दमन की दर भ्रूण के बीच भिन्न हो सकती है, और विश्लेषण के लिए अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में भ्रूण को स्थानांतरित करने की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, बाद के विकास चरणों (जैसे, ई 4-ई 5) में ओवो में भ्रूण रेटिना में इलेक्ट्रोपोरेशन में प्रयोगात्मक कठिनाइयां होती हैं क्योंकि आंखें उन चरणों में हृदय के करीब निकटता में स्थित होती हैं, जिससे इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद कार्डियक अरेस्ट का खतरा बढ़ जाता है।
यहां वर्णित प्रणाली विकासशील चिक रेटिना में तेजी से और मजबूत जीन दमन की अनुमति देती है। इस दृष्टिकोण को चिक भ्रूण के अन्य हिस्सों पर भी लागू किया जा सकता है, जिसमें तंत्रिका और गैर-तंत्रिका ऊतक शामिल हैं। इसलिए, हम उम्मीद करते हैं कि यह प्रणाली चूजे के विकास के आणविक तंत्र के स्पष्टीकरण में योगदान कर सकती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
pT2K-CAGGS और pCAGGS-T2TP वैक्टर क्रमशः योशिको ताकाहाशी (क्योटो विश्वविद्यालय, क्योटो, जापान) और कोइची कावाकामी (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जेनेटिक्स, मिशिमा, जापान) द्वारा प्रदान किए गए थे। हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पठन के लिए माइकल बर्बेरोग्लू को धन्यवाद देते हैं। इस काम को रॉयल सोसाइटी और जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (बीबीएसआरसी) (यूके) से एमएन को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
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