Summary
Abbiamo sviluppato un nuovo approccio di perdita di funzione che prevede l'introduzione e l'integrazione genomica di sequenze di micro-RNA artificiali in embrioni di pulcino utilizzando l'elettroporazione in ovo e il sistema di trasposoni Tol2. Questa tecnica fornisce una metodologia di knockdown genico robusta e stabile per gli studi sulla funzione genica durante lo sviluppo.
Abstract
La retina del pulcino è stata a lungo un importante sistema modello nella neurobiologia dello sviluppo, con vantaggi tra cui le sue grandi dimensioni, il rapido sviluppo e l'accessibilità per la visualizzazione e le manipolazioni sperimentali. Tuttavia, il suo principale limite tecnico era la mancanza di solidi approcci di perdita di funzione per le analisi della funzione genica. Questo protocollo descrive una metodologia di silenziamento genico nella retina del pulcino in via di sviluppo che coinvolge l'espressione transgenica di microRNA artificiali (miRNA) utilizzando il sistema di trasposoni Tol2. In questo approccio, un plasmide trasposone Tol2 che contiene una cassetta di espressione per il marcatore EmGFP (proteina fluorescente verde smeraldo) e sequenze pre-miRNA artificiali contro un gene bersaglio viene introdotto nella retina embrionale del pulcino con un costrutto di espressione della trasposasi Tol2 mediante elettroporazione in ovo . Nelle cellule retiniche trasfettate, la trasposasi catalizza l'escissione della cassetta di espressione dal vettore trasposone e la sua integrazione nei cromosomi dell'ospite, portando all'espressione stabile dei miRNA e della proteina EmGFP. Nel nostro studio precedente, abbiamo dimostrato che l'espressione di Nel, una glicoproteina che esercita molteplici funzioni nello sviluppo neurale, può essere significativamente soppressa nella retina del pulcino in via di sviluppo utilizzando questa tecnica. I nostri risultati indicano che questa metodologia induce una soppressione stabile e robusta dell'espressione genica e quindi fornisce un approccio efficiente alla perdita di funzione per gli studi sullo sviluppo della retina.
Introduction
La retina dei vertebrati è un importante sistema modello per lo studio dello sviluppo neurale. Nonostante la sua posizione periferica, la retina è anatomicamente e dal punto di vista dello sviluppo un'estensione del sistema nervoso centrale e il nervo ottico, costituito da assoni di cellule gangliari retiniche, rappresenta un tratto all'interno del sistema nervoso centrale. La retina del pulcino presenta vantaggi significativi come sistema modello per studiare il meccanismo molecolare dello sviluppo neurale: è grande e si sviluppa rapidamente; presenta somiglianze strutturali e funzionali con la retina umana; È altamente accessibile per la visualizzazione e le manipolazioni sperimentali. I meccanismi molecolari della proliferazione e della differenziazione cellulare, della morfogenesi e della guida degli assoni durante lo sviluppo neurale sono stati ampiamente studiati utilizzando la retina di pollo.
Nell'ovo, l'elettroporazione è stata utilizzata con successo negli ultimi due decenni per introdurre geni ectopici nelle cellule dell'embrione di pulcino in via di sviluppo. Questa tecnica consente la marcatura delle cellule in via di sviluppo, il tracciamento del destino cellulare e il tracciamento della migrazione cellulare e dei tratti assonici, nonché l'espressione genica ectopica per l'analisi in vivo della funzione genica. Le condizioni dell'elettroporazione in ovo per un'efficiente espressione genica ectopica negli embrioni di pulcino sono state ben stabilite 1,2,3.
Nonostante questi vantaggi, la mancanza di una tecnica stabile di perdita di funzione per gli studi sulla funzione genica era stata una delle principali limitazioni tecniche dell'embrione di pulcino. Mentre gli embrioni di pulcino elettropostati con piccoli RNA interferenti (siRNAs)4 o vettori di espressione per RNA a forcina corta (shRNAs)5 mostrano knockdown del gene bersaglio, la soppressione genica in questi approcci è transitoria perché gli effetti scompaiono una volta che le cellule perdono gli RNA o i DNA introdotti. Una soppressione genica più stabile può essere ottenuta somministrando siRNA negli embrioni di pulcino mediante un sistema di retrovirus RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) con un accettore di plice S)6. Il vettore virale si integra nel genoma dell'ospite e i geni ectopici sono espressi in modo stabile. Tuttavia, il retrovirus può integrarsi nel genoma delle cellule in divisione solo durante la fase mitotica (M) del ciclo cellulare, il che può imporre una limitazione agli stadi di sviluppo e/o ai tipi di cellule per i quali questo approccio di perdita di funzione può essere applicato. Inoltre, l'espressione dei transgeni da parte di RCAS appare più lenta e meno robusta di quella indotta dall'elettroporazione in ovo 7.
I trasposoni sono elementi genetici che si spostano da una posizione all'altra del genoma. L'elemento Tol2 è un membro della famiglia degli elementi trasponibili hAT e contiene un gene interno che codifica per una trasposasi che catalizza la reazione del trasposone dell'elemento Tol28. Quando un vettore plasmidico che trasporta una cassetta di espressione genica affiancata dalle sequenze delle estremità sinistra e destra degli elementi Tol2 (200 bp e 150 bp, rispettivamente) viene introdotto in cellule di vertebrati con un costrutto di espressione della trasposasi Tol2, la cassetta di espressione viene asportata dal plasmide e integrata nel genoma dell'ospite, che supporta un'espressione stabile del gene ectopico (Figura 1). È stato dimostrato che l'elemento trasponibile Tol2 può indurre la trasposizione genica in modo molto efficiente in diverse specie di vertebrati, tra cui il pesce zebra9,10, le rane 11, i pulcini12 e i topi 13, ed è quindi un utile metodo di transgenesi e mutagenesi inserzionale. Il sistema di trasposoni Tol2 è stato utilizzato con successo per il knockdown condizionale di un gene bersaglio mediante integrazione genomica di siRNA che viene processato da RNA14 a doppio filamento lungo.
Questo protocollo descrive un approccio di perdita di funzione nell'embrione di pulcino che prevede l'introduzione di microRNA artificiali (miRNA) da parte del sistema di trasposone Tol215,16. In questo approccio, una cassetta di espressione per il marcatore EmGFP (proteina fluorescente verde smeraldo) e miRNA artificiali contro un gene bersaglio viene clonata in un vettore di trasposone Tol2. Il costrutto del trasposone Tol2 viene quindi introdotto nella retina embrionale del pulcino con un costrutto di espressione della trasposasi Tol2 mediante elettroporazione in ovo. Nelle cellule retiniche trasfettate, la trasposasi catalizza l'escissione della cassetta di espressione dal vettore trasposone e la sua integrazione nei cromosomi dell'ospite, portando all'espressione stabile dei miRNA e della proteina EmGFP. Nei nostri studi precedenti, abbiamo abbattuto con successo l'espressione di Nel, una glicoproteina extracellulare espressa prevalentemente nel sistema nervoso, nella retina del pulcino in via di sviluppo (vedi Risultati rappresentativi). I nostri risultati indicano che la soppressione genica stabile ed efficiente può essere ottenuta in ovo con questa tecnica.
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Protocol
1. Costruzione di vettori di espressione dei miRNA
NOTA: Le procedure per la costruzione di vettori di espressione di miRNA (passaggi 1.1-1.3, 1.5-1.6.) sono ottimizzate per il kit di espressione di miRNA, kit di espressione di miRNA Block-iT Pol II miR con EmGFP, come descritto in precedenza15,16. Il kit fornisce il vettore di espressione progettato per consentire l'espressione di miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), un vettore di controllo (plasmide di controllo pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativo), reagenti accessori e istruzioni per produrre vettori di espressione di miRNA (vedere Tabella dei materiali)17.
- Progettazione di oligo di DNA a singolo filamento che codificano pre-miRNA contro il gene bersaglio: Progettazione di oligo di DNA a singolo filamento (oligo a "filamento superiore" (pre-miRNA bersaglio) e oligo a "filamento inferiore" (complementi di oligo a filamento superiore)) utilizzando lo strumento online RNAi Designer (vedere Tabella dei materiali). Vedere la Figura 2 per le caratteristiche richieste degli oligo a singolo filamento (Figura 2A) ed esempi di sequenze bersaglio (Figura 2B).
NOTA: Si raccomanda di generare 5-10 sequenze di pre-miRNA per un dato gene bersaglio e di sottoporle a screening per le attività di knockdown in vitro (fase 1.4). - Ricottura degli oligo del filamento superiore e inferiore per generare un oligo a doppio filamento
- Impostare la seguente reazione di ricottura (Tabella 1) in una provetta sterile per microcentrifuga da 0,5 mL.
- Incubare la miscela di reazione a 95 °C per 4 min. Ricottura degli oligo del filamento superiore e inferiore per generare un oligo a doppio filamento lasciando raffreddare la miscela di reazione a temperatura ambiente (RT) per 5-10 minuti. Centrifugare brevemente il campione (~5 s).
NOTA: Gli oligo ricotto possono essere conservati a -20 °C senza degradazione per almeno un anno.
- Clonazione degli oligo a doppio filamento nel vettore di espressione del miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (fornito nel kit di espressione del miRNA)): clonare singoli oligo a doppio filamento nel vettore di espressione del miRNA linearizzato, secondo il manuale del produttore17.
- Valutazione degli effetti knockdown
NOTA: Si raccomanda di testare le singole sequenze di miRNA per l'efficienza di soppressione genica in vitro prima di essere applicate in ovo. L'efficienza di knockdown può essere testata trasfettando i plasmidi di espressione dei miRNA in una linea cellulare che esprime il gene bersaglio. In alternativa, i singoli plasmidi di espressione dei miRNA possono essere co-trasfettati in linee cellulari con un costrutto di espressione per il gene bersaglio. Per i geni bersaglio che codificano proteine che non sono ancorate alla membrana nel loro stato nativo (ad esempio, proteine solubili), una proteina di fusione della fosfatasi alcalina (AP) può essere utilizzata per monitorare l'espressione della proteina bersaglio. Una sequenza di cDNA che codifica per la proteina bersaglio può essere fusa in frame con la fosfatasi alcalina placentare umana in vettori AP-tag (APtag-1- APtag-5; vedi Tabella dei materiali) e introdotta nelle cellule18. Quando espressa in cellule di coltura (ad esempio, cellule HEK293T), la proteina bersaglio marcata con AP viene secreta ad alti livelli nei terreni di coltura, e quindi gli effetti di knockdown delle sequenze di miRNA possono essere valutati misurando la diminuzione dell'attività di AP nei terreni di coltura di cellule trasfettate con miRNA (sottopassaggi 1.4.1-1.4.4).- Coltura HEK293T cellule in una piastra da 24 pozzetti (8 x 104 cellule/pozzetto) per una notte. Trasfettare transitoriamente le cellule con singoli costrutti di espressione di miRNA con un plasmide di espressione di una proteina bersaglio marcata con AP. Utilizzare il plasmide di controllo pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativo (fornito nel kit di espressione del miRNA) come controllo. (Se vengono utilizzate linee cellulari che esprimono stabilmente una proteina bersaglio marcata con AP, trasfettare le cellule solo con singoli costrutti di espressione di miRNA.)
NOTA: Per la trasfezione viene utilizzato un reagente di lipofezione convenzionale (vedere la tabella dei materiali). - Raccogliere il terreno condizionato 48-72 h dopo la trasfezione e inattivare a caldo l'attività endogena dell'AP in un bagno d'acqua a 65 °C per 5 min. Spinout dei detriti in una microcentrifuga da tavolo alla massima velocità per 5 min.
- Tamponare il surnatante con HEPES 10 mM, pH 7,0 e farlo passare attraverso un filtro da 0,45 μm.
- Prelevare 100 μL (per la misurazione in un lettore di piastre) o 500 μL (per uno spettrofotometro) del surnatante e aggiungere una quantità uguale di 2 tamponi di substrato AP (Tabella 2). Controllare l'attività dell'AP misurando OD405 in un lettore di piastre o in uno spettrofotometro.
NOTA: Se l'attività AP del terreno condizionato è troppo elevata per una misurazione accurata, diluirlo con tampone HBAH (soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS), albumina sierica bovina 0,5 mg/mL, HEPES 20 mM (pH 7,0)) o un altro tampone contenente una proteina trasportatrice. Non utilizzare tamponi contenenti fosfato (ad es. PBS) perché il fosfato inorganico agisce come inibitore competitivo dell'AP.
- Coltura HEK293T cellule in una piastra da 24 pozzetti (8 x 104 cellule/pozzetto) per una notte. Trasfettare transitoriamente le cellule con singoli costrutti di espressione di miRNA con un plasmide di espressione di una proteina bersaglio marcata con AP. Utilizzare il plasmide di controllo pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativo (fornito nel kit di espressione del miRNA) come controllo. (Se vengono utilizzate linee cellulari che esprimono stabilmente una proteina bersaglio marcata con AP, trasfettare le cellule solo con singoli costrutti di espressione di miRNA.)
- Concatenamento della sequenza di miRNA
NOTA: Gli effetti di knockdown possono essere potenziati concatenando diversi miRNA contro lo stesso gene bersaglio o ripetendo lo stesso miRNA. Il vettore di espressione dei miRNA supporta il concatenamento di più sequenze di pre-miRNA e la loro espressione co-cistronica17.- Concatenare due diverse sequenze di pre-miRNA (contro lo stesso gene bersaglio) che mostrano le più elevate attività di knockdown nei saggi in vitro (fase 1.4), secondo le istruzioni del produttore17.
- Valutare l'efficienza di soppressione genica dei costrutti concatenati utilizzando saggi in vitro come descritto nel passaggio 1.4. Se tre o più sequenze di pre-miRNA mostrano attività di knockdown altrettanto elevate, testare diverse combinazioni di due sequenze e utilizzare le combinazioni che mostrano la più alta attività di knockdown (vedere Risultati rappresentativi).
- Trasferimento della cassetta di espressione EmGFP-pre-miRNA al vettore del trasposone Tol2
NOTA: La cassetta di espressione contenente il cDNA EmGFP e due sequenze di pre-miRNA viene trasferita nel vettore del trasposone Tol2 (vettore pT2K-CAGGS, vedi Tabella dei materiali). A tal fine, la cassetta di espressione (che comprende dall'estremità 3' del promotore del CMV al sito del primer di sequenziamento inverso del miRNA del vettore di espressione del miRNA) viene amplificata mediante PCR utilizzando primer con un sito enzimatico di restrizione artificiale e il prodotto della PCR viene clonato nel vettore del trasposone Tol2. Il vettore trasposone Tol2 contiene l'onnipresente promotore CAGGS, che guida l'espressione della cassetta di espressione inserita. Il promotore CAGGS e la cassetta di espressione sono affiancati dalle sequenze Tol2 (Figura 1).- Amplificazione PCR della cassetta di espressione EmGFP-pre-miRNA: Seguire la configurazione della reazione e le condizioni di ciclo termico descritte nella Tabella 3.
- Legare il prodotto della PCR purificata con gel (circa 1,3 kb) nel vettore del trasposone Tol2 digerito dall'enzima di restrizione. Elettroporare il plasmide in cellule competenti di E. coli (vedi Tabella dei materiali) e selezionare i ricombinanti (costrutti di miRNA pT2K-CAGGS-EmGFP-2x).
- Preparare il plasmide utilizzando un kit maxiprep convenzionale (vedere la tabella dei materiali). Controllare la struttura e la sequenza del plasmide mediante mappatura di restrizione e utilizzando i primer utilizzati per la PCR, rispettivamente.
2. Conservazione e incubazione delle uova
- Acquista uova di Livorno bianco (Gallus gallus) fecondate da fattorie locali o venditori commerciali.
NOTA: Le uova possono essere conservate a 12-16 °C o a 4 °C fino a 1 settimana prima dell'incubazione senza perdita significativa di vitalità o ritardo nello sviluppo durante l'incubazione. - Etichettare le uova con la data di inizio dell'incubazione e segnare il lato superiore dell'uovo (dove verrà posizionato l'embrione). Incubare gli ovuli fecondati in posizione orizzontale a 38 °C fino a quando gli embrioni non hanno raggiunto gli stadi 10 (33-38 h) -11 (40-45 h)19.
3. Elettroporazione in ovo
- Preparazione per l'elettroporazione in ovo
- Preparazione della soluzione fast green allo 0,25%: Sciogliere 25 mg di Fast Green FCF in 10 mL di PBS. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro per siringa da 0,2 μm. La soluzione può essere conservata presso RT.
- Cocktail di DNA: preparare la soluzione iniettabile mescolando i singoli plasmidi di miRNA pT2K-CAGGS-EmGFP-2x (sottofase 1.6.3) con il plasmide di espressione della trasposasi Tol2 (vettore pCAGGS-T2TP; vedere la tabella dei materiali) (5 μg/μL ciascuno) in un rapporto di 2:1. Aggiungere 1/10 di volume di soluzione verde veloce allo 0,25% per visualizzare l'area iniettata.
NOTA: La concentrazione ottimale di DNA può variare a seconda dei costrutti. - Installazione dell'apparecchio per microiniezione (Figura 3A,B): L'apparecchio per microiniezione è costituito dai seguenti elementi (vedere la tabella dei materiali): siringa Hamilton, ago da 18 G (lunghezza dell'ago = 2"), tubo in PVC (cloruro di polivinile) (lunghezza 2 cm), ago per micropipetta (può essere realizzato tirando tubi capillari con fibra omega dot (1 mm O.D. X 0,75 mm I.D) con un estrattore per micropipette).
- Riempire una siringa Hamilton con olio minerale pesante. Collegare un ago da 18 G alla siringa e riempire lo spazio interno dell'ago con olio premendo lo stantuffo della siringa.
- Attacca un pezzo di tubo in PVC lungo 2 cm all'estremità dell'ago e riempi il tubo con l'olio.
- Collegare un ago per micropipetta tirato al tubo. Rompere la punta dell'ago della micropipetta fino a un diametro di 10-20 μm con una pinza sottile per creare una piccola apertura. Riempi l'intero ago con olio.
NOTA: Bisogna fare attenzione a non intrappolare bolle d'aria nel sistema, in quanto inibirebbero il flusso della soluzione di DNA.
- Mettere 5 μL del cocktail di DNA colorato (sottofase 3.1.2) su una capsula di Petri sterile. Sotto il microscopio da dissezione, posizionare la punta dell'ago della micropipetta nella soluzione di DNA sulla piastra di Petri sterile e aspirare lentamente la soluzione nell'ago.
- Attendere che la pressione si equilibri all'interno e all'esterno dell'ago (per evitare che l'aria entri nell'ago) ed estrarre la punta dell'ago dalla soluzione di DNA. Tenere la punta dell'ago immersa in PBS sterile in un piccolo becher fino all'iniezione.
- Installazione dell'apparecchio per l'elettroporazione (Figura 3A,C):
- Posizionare una coppia di elettrodi in platino con un portaelettrodo su un micromanipolatore. Regolare la distanza tra la punta degli elettrodi a 2 mm (Figura 3C,E).
- Collegare gli elettrodi a un generatore di impulsi a onda quadra con cavi (vedi Tabella dei materiali).
- Microiniezione di soluzione di DNA (Figura 3D)
- Togliete un uovo di gallina dall'incubatrice e pulite la superficie dell'uovo con un fazzoletto imbevuto di etanolo al 70%.
- Collegare un ago da 18 G a una siringa da 10 ml. Inserire l'ago attraverso l'estremità smussata dell'uovo, inclinato verso il basso (45°) per evitare di danneggiare il tuorlo.
- Prelevare 2-3 ml di albumina dall'uovo. Sigilla il foro con un pezzo di nastro adesivo. Verificare che l'embrione e la membrana vitellina si siano staccati dal guscio "incandando" l'uovo con la luce.
- Rimuovere un pezzo di guscio d'uovo (cerchio di 2-3 cm di diametro) dalla parte superiore dell'uovo usando forbici e pinze per esporre l'embrione. Non finestrare più di cinque ovuli alla volta per evitare che gli embrioni si secchino durante l'elettroporazione.
NOTA: Se è difficile aprire una finestra senza rompere l'uovo, l'intera parte superiore dell'uovo può essere coperta con nastro adesivo o scotch prima di rimuovere un pezzo di guscio d'uovo. - Inserire la punta dell'ago nella vescicola ottica dal lato prossimale con un angolo di 45° e iniettare il cocktail di DNA premendo lentamente (o picchiettando) lo stantuffo fino a quando la soluzione di colore blu riempie il lume (Figura 3D).
NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un sistema di microiniezione a pressione (vedi Tabella dei materiali) per l'iniezione di soluzioni di DNA. - Estrarre l'ago e riposizionare la punta nel PBS.
- Elettroporazione (Figura 3E)
- Impostare i parametri dell'impulso dell'elettroporatore come segue: Tensione: 15 V, Lunghezza dell'impulso: 50 ms, Intervallo dell'impulso: 950 ms, Numero di impulsi: 5
- Aggiungere alcune gocce di HBSS sulla membrana vitellina sopra l'embrione. Abbassare gli elettrodi nell'HBSS utilizzando il micromanipolatore, perpendicolare all'asse antero-posteriore dell'embrione.
NOTA: In alternativa, questa procedura può essere eseguita senza l'aggiunta di HBSS, poiché l'albumina è un buon conduttore elettrico che consente un'elettroporazione efficiente. - Posizionare gli elettrodi su entrambi i lati (lato anteriore (nasale) e lato posteriore (temporale)) della vescicola ottica (Figura 3E). Assicurarsi che gli elettrodi non tocchino l'embrione o i vasi sanguigni. Applicare campi elettrici pulsati.
- Rimuovere gli elettrodi e pulirli delicatamente con un batuffolo di cotone sterile imbevuto d'acqua per evitare l'accumulo di albumina.
- Sigillare la finestra con dello scotch e reincubare l'embrione fino allo stadio di sviluppo desiderato.
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Representative Results
Costruzione di costrutti di trasposoni Tol2 per l'espressione di miRNA artificiali contro Nel
Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; noto anche come Nell2) è una glicoproteina extracellulare. Ha somiglianze strutturali con la trombospondina-1 ed è prevalentemente espressa nel sistema nervoso20,21. Abbiamo precedentemente dimostrato che Nel regola la differenziazione e la sopravvivenza delle cellule gangliari retiniche15 e agisce come un segnale di guida inibitorio per gli assoni retinici22,23,24. Nella retina del pulcino in via di sviluppo, l'espressione di Nel è rilevata nel presunto epitelio pigmentato a HH15 (giorno embrionale (E) 2,5). A HH20 (E3.5), l'espressione di Nel è stata osservata anche nelle cellule gangliari retiniche recentemente differenziate. La forte espressione di Nel nell'epitelio pigmentato e nelle cellule gangliari retiniche continua almeno fino a E1815.
Per esaminare la funzione di Nel nello sviluppo delle cellule gangliari retiniche, l'espressione del gene Nel è stata abbattuta introducendo miRNA artificiali nella retina in via di sviluppo utilizzando l'elettroporazione in ovo e il sistema di trasposoni Tol215,16. In primo luogo, coppie di oligonucleotidi di DNA a singolo filamento sono state progettate per 10 potenziali sequenze bersaglio nella regione codificante per proteine del cDNA Nel del pollo (numero di adesione GenBank: NM_001030740.1) utilizzando lo strumento di progettazione RNAi online (vedi Tabella dei materiali). Le coppie di oligonucleotidi sono state ricotto e clonate individualmente nel vettore di espressione dei miRNA. Quindi, i singoli costrutti sono stati trasfettati in cellule HEK293T che esprimono stabilmente Nel-AP e le loro efficienze di knockdown sono state valutate misurando l'attività di AP nei terreni di coltura. Come controllo è stato utilizzato il plasmide di controllo pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativo (Figura 4A).
Sono state selezionate tre sequenze di pre-miRNA Nel che hanno mostrato i più alti effetti di knock down (contro i nucleotidi 482-502, 910-930 e 2461-2481 del cDNA Nel pollo, rispettivamente), e due sequenze pre-miRNA sono state clonate in tandem nel vettore di espressione del miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x Nel pre-miRNA), secondo le istruzioni del produttore17. Le cassette di espressione che codificano i due pre-miRNA ed EmGFP sono state amplificate mediante PCR con un sito EcoRI artificiale su entrambe le estremità (5′-GGGAATTCTCTGGCTAACTAGAGAAC-3′ e 5′-CCGAATTCCCTCTAGATCAACCACT-3′) e clonate nel vettore pT2K-CAGGS (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). La sequenza della cassetta di espressione è stata confermata utilizzando i primer utilizzati per la PCR. I costrutti di pre-miRNA di pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel sono stati co-trasfettati individualmente con il vettore di espressione della trasposasi Tol2 (pCAGGS-T2TP) in cellule HEK293T che esprimono stabilmente Nel-AP e gli effetti inibitori sull'espressione di Nel-AP sono stati valutati misurando le attività di AP nei terreni di coltura. Come mostrato nella Figura 4B, l'efficienza di knockdown è stata significativamente migliorata dal concatenamento di due sequenze di miRNA. Una robusta soppressione dell'espressione di Nel-AP (oltre il 90%) è stata osservata almeno fino a 13 giorni dopo la trasfezione (Figura 4B).
Soppressione stabile dell'espressione di Nel nella retina del pulcino in via di sviluppo
Un costrutto di pre-miRNA Nel pT2K-CAGGS-EmGFP-2x (contenente sequenze bersaglio per i nucleotidi 482-502 e 2461-2481 del cDNA Nel di pollo) è stato co-trasfettato con il vettore di espressione della trasposasi (pCAGGS-T2TP) nel lato temporale o nasale della retina del pulcino mediante elettroporazione in ovo a HH9-11 (Figura 3, Figura 5A). Le sezioni sono state preparate dalle retine E4.5 o E8 e gli effetti sull'espressione del Nel sono stati valutati mediante immunoistochimica utilizzando l'anticorpo anti-Nel22. A E4.5, l'espressione di Nel nell'epitelio pigmentato retinico è risultata significativamente ridotta nelle cellule che esprimono EmGFP (Figura 5B-D). A E8, le diminuzioni dell'espressione del Nel sono state chiaramente osservate anche nelle cellule gangliari retiniche (Figura 5E-I). La significativa soppressione dell'espressione di Nel è continuata almeno fino all'E18 (dati non mostrati). L'introduzione del miRNA di controllo non ha influenzato l'espressione del Nel nella retina (Figura 5J-O).
Figura 1: Trasposizione di cDNA fiancheggiati da Tol2 mediante trasposasi. Uno schema che mostra la trasposizione di una cassetta di espressione fiancheggiata da Tol2 per EmGFP e due sequenze di pre-miRNA concatenate (2x pre-miRNA) mediante trasposasi. Quando un vettore di trasposone Tol2 contenente la cassetta di espressione (costrutto di miRNA pT2K-CAGGS-EmGFP-2x) viene introdotto in cellule con un costrutto di espressione della trasposasi Tol2 (pCAGGS-T2TP), la cassetta di espressione fiancheggiata da Tol2 viene asportata dal vettore e integrata nel genoma ospite dall'attività di trasposasi. L'espressione di EmGFP e miRNA è guidata dall'onnipresente promotore CAGGS. Questa cifra è stata modificata da Nakamoto et al.15. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Struttura del pre-miRNA ingegnerizzato. (A) La sequenza di pre-miRNA progettata si basa sulla sequenza murina miR-15517. L'oligo del filamento superiore contiene (dall'estremità 5' all'estremità 3') una sporgenza di quattro nucleotidi (TGCT (blu)), una sequenza bersaglio antisenso (21 nucleotidi), una sequenza ad anello terminale (rosso) e una sequenza bersaglio senso (19 nucleotidi). La sequenza bersaglio antisenso rappresenta la sequenza di miRNA matura. L'oligo del filamento inferiore contiene una sporgenza di 5' a quattro nucleotidi (CCTG (blu)) e la sequenza del complemento inverso dell'oligo del filamento superiore, ma manca della sporgenza a quattro nucleotidi all'estremità 3' (AGCA-3': complemento inverso di 5'-TGCT dell'oligo a filamento superiore). La sequenza bersaglio senso manca dei nucleotidi 9 e 10 della sequenza bersaglio. I due nucleotidi "extra" nella sequenza bersaglio antisenso formano un anello interno nella struttura stem-loop della molecola di miRNA matura, che si traduce in un tasso di knockdown più elevato17. (B) Un esempio di sequenza bersaglio contro il pollo Nel. Vengono mostrate le sequenze senso e antisenso nei filamenti superiore e inferiore per una sequenza bersaglio del gene Nel del pollo (numero di adesione GenBank NM_001030740.1, nucleotidi 482-502). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Microiniezione ed elettroporazione in ovo. (A) Postazione di lavoro per microiniezione ed elettroporazione in ovo. (1) Microscopio da dissezione. (2) Apparecchio di iniezione. (3) Apparecchi per elettroporazione. (4) Doppio illuminatore per microscopio a collo d'oca. (5) Elettroporatore. (B) Apparecchio per iniezione. Una siringa Hamilton (6) con un ago da 18 G (7) viene collegata a un tubo in PVC (8) e a un ago per micropipetta tirato (9) e posizionata su un micromanipolatore (10). Lo spazio interno dell'apparecchio è riempito con olio minerale pesante. (C) Apparecchi per elettroporazione. Un set di elettrodi in platino (11) con un portaelettrodo (12) è montato su un micromanipolatore (13). Gli elettrodi sono collegati all'elettroporatore con cavi (14). (D) Microiniezione di soluzione cocktail di DNA nella vescicola ottica a HH 10-11. L'ago della micropipetta viene inserito nella vescicola ottica dal suo lato prossimale. La soluzione cocktail di DNA con verde veloce (blu) viene iniettata nella vescicola ottica fino a quando il colorante riempie l'intero lume. (E) Elettroporazione nella vescicola ottica. Gli elettrodi sono posizionati in parallelo (la distanza tra gli elettrodi è di 2 mm) e in modo che la vescicola ottica iniettata si trovi tra gli elettrodi: un elettrodo si trova vicino alla superficie anteriore (nasale) della vescicola ottica e l'altro è nella parte posteriore dell'embrione a livello del rombencefalo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Valutazione in vitro di sequenze di pre-miRNA singole o concatenate per l'efficienza di soppressione del gene Nel. (A) Effetti knockdown di singole sequenze di pre-miRNA. Vengono mostrati i risultati di cinque costrutti rappresentativi (sequenze bersaglio antisenso corrispondenti numeri nucleotidici 482-502, 910-930, 1106-1126, 1663-1683 e 2461-2481 di pollo Nel cDNA (numero di adesione GenBank: NM_001030740.1)). I singoli costrutti di espressione dei miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-Nel pre-miRNA) sono stati trasfettati in cellule HEK293T che esprimono stabilmente Nel-AP. Come controllo è stato utilizzato il plasmide di controllo pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativo. L'espressione di Nel-AP è stata valutata misurando le attività di AP nei terreni di coltura 48-96 ore dopo la trasfezione. Tre costrutti di espressione del pre-miRNA Nel (contro i nucleotidi 482-502, 910-930 e 2461-2481, rispettivamente) hanno mostrato una significativa soppressione dell'espressione di Nel. (B) Effetti knockdown di sequenze di pre-miRNA concatenate. Due delle tre sequenze di pre-miRNA più potenti (contro i nucleotidi 482-502, 910-930 e 2461-2481) sono state clonate in tandem nel vettore pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR e la cassetta di espressione (contenente le due sequenze di pre-miRNA e il cDNA EmGFP) è stata trasferita al vettore pT2K-CAGGS (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). I costrutti pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA sono stati co-trasfettati individualmente con vettori di espressione per la trasposasi Tol2 (pCAGGS-T2TP) in cellule HEK293T che esprimono stabilmente Nel-AP e l'espressione di Nel-AP è stata valutata misurando le attività di AP nei terreni di coltura da 2 a 13 giorni dopo la trasfezione. Tutte e tre le combinazioni (482-502/910-930, 482-502/2461-2481, 910-930/2461-2481) hanno mostrato una maggiore attività di soppressione rispetto alle singole sequenze di pre-miRNA non concatenate. Una significativa soppressione dell'espressione di Nel-AP è stata osservata dal giorno 2 ad almeno il giorno 13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Knockdown stabile dell'espressione di Nel nella retina del pulcino in via di sviluppo mediante l'integrazione mediata dal trasposone Tol2 del transgene miRNA. Un costrutto di trasposone Tol2 contenente una cassetta di espressione di due sequenze di pre-miRNA Nel e EmGFP (pT2K-CAGGS-EmGFP-Nel pre-miRNA (482-502)-Nel pre-miRNA (2461-2481)) (A-I) o un costrutto di controllo che esprime un miRNA e EmGFP non correlati (J-O) è stato co-trasfettato con un vettore di espressione della trasposasi (pCAGGS-T2TP) nella metà temporale o nasale della vescicola ottica da in ovo elettroporazione a HH9-HH11 (E1.5). Le sezioni retiniche sono state preparate a E4.5 (B-D, J-L) o E8 (E-I, M-O) e l'efficienza della soppressione del gene Nel è stata esaminata mediante immunoistochimica utilizzando l'anticorpo anti-Nel (rosso). Poiché il DNA è caricato negativamente, i transgeni vengono elettropolati nel tessuto sul lato dell'anodo; quindi, solo metà della retina è stata marcata con EmGFP (lato trasfezione (TF), verde). (A) Espressione del gene marcatore EmGFP nella metà temporale della retina a E4.5. La fessura ottica (freccia bianca) rappresenta il confine tra i lati trasfettati e non trasfettati (controllo). (B-I) Knockdown dell'RNAi dell'espressione di Nel nella retina del pulcino in via di sviluppo. (B-D) A E4.5, l'espressione di Nel è significativamente ridotta (B,D) nelle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (PE) che esprimono EmGFP (C,D). Si noti il pattern complementare dell'immunocolorazione Nel e dell'espressione di EmGFP in D. NR, retina neurale. (E-I) A E8, l'espressione di Nel (E,G) nell'epitelio pigmentato retinico e nello strato di cellule gangliari (GCL) è diminuita sul lato della trasfezione (F,G). (H, I) Viste di ingrandimento più elevato di un'area di trasfezione e di un'area di controllo corrispondente in E (indicata da piccoli rettangoli), rispettivamente. (D,G) Immagini unite delle due immagini di sinistra. (J-O) Espressione di miRNA di controllo. L'introduzione del costrutto di controllo negativo non influenza l'espressione di Nel nella retina E4.5 (J-L) o E8 (M-O). (L,O) Immagini unite delle due immagini di sinistra. Il confine tra i lati di trasfezione e di controllo è indicato da una linea tratteggiata in C, F, K e N. Le barre della scala, 50 μm. (A) e (B-I) sono state modificate rispettivamente da Nakamoto, M. e Nakamoto, C 16 e Nakamoto et al.15. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Impostazione della reazione di ricottura | |
| Oligo del filamento superiore (200 μM in tampone TE) | 5 μL (Concentrazione finale 50 μM) |
| Oligo del filamento inferiore (200 μM in tampone TE) | 5 μL (Concentrazione finale 50 μM) |
| 10x Tampone di ricottura Oligo* | 2 μL |
| Acqua priva di DNasi/RNasi* | 8 μL |
| Totale | 20 μL |
| * Fornito nel kit di espressione dei miRNA (vedi Tabella dei materiali) | |
Tabella 1: Impostazione della reazione di ricottura
| 2 buffer di substrato AP | |
| 10 M Dietanolammina (pH 9,8) | 4 mL |
| 1 M MgCl2 | 10 μL |
| L-Omoarginina | magnesio 45 |
| Albumina sierica bovina (BSA) | magnesio 10 |
| p-Nitrofenilfosfato | magnesio 63 |
| H2O | Aggiungere per un volume totale di 20 mL |
Tabella 2: 2 buffer di substrato AP. La soluzione deve essere conservata in aliquote a -20 °C ed essere protetta dalla luce poiché il p-nitrofenilfosfato è sensibile alla luce.
| Impostazione della reazione | |||
| Plasmide pre-miRNA pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x (dalla Sezione 1.5) o plasmide di controllo negativo pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativo* (0,1 μg/μL) |
1 μL | ||
| 10x tampone Pfu | 5 μL | ||
| Miscela di dNTP (10 mM ciascuno di dATP, dCTP, dGTP e dTTP) | 1 μL | ||
| Primer in avanti EmGFP* (5'-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| primer inverso miRNA* (5'- CTCTAGATCAACCACTTTGT-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| Pfu DNA polimerasi (5 unità/μL) | 0,5 μL | ||
| H2O | 40,5 μL | ||
| Volume totale | 50 μL | ||
| * Fornito nel kit di espressione dei miRNA. | |||
| Condizioni di ciclo termico | |||
| 94 °C | 5 minuti | ||
| 30 cicli dei seguenti: | |||
| 94 °C | 45 secondi | ||
| 58 °C | 1 minuto | ||
| 72 °C | 2 minuti | ||
| 72 °C | 10 minuti | ||
Tabella 3: Impostazione della reazione e condizioni di ciclo termico.
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Discussion
Questo protocollo fornisce una guida dettagliata al silenziamento genico nella retina del pulcino in via di sviluppo mediante l'espressione transgenica di miRNA artificiali utilizzando l'elettroporazione in ovo e il sistema di trasposone Tol2.
I seguenti fattori sono di fondamentale importanza per eseguire con successo questa tecnica. In primo luogo, è fondamentale utilizzare sequenze di miRNA che hanno dimostrato di esercitare robusti effetti di knockdown. Prima di applicarli per l'elettroporazione in ovo , testare singole sequenze di pre-miRNA per l'efficienza di soppressione genica in saggi in vitro (fase 1.4) e concatenare due sequenze di pre-miRNA che mostrano le più elevate attività di knockdown (fase 1.5). In secondo luogo, è importante non danneggiare la vescicola ottica e i tessuti nervosi circostanti quando si inserisce l'ago della micropipetta per l'iniezione della soluzione di DNA. Un danno eccessivo sugli embrioni potrebbe portare a malformazioni embrionali e morte. Per evitare danni ai tessuti, introdurre la micropipetta nella vescicola ottica con l'orientamento corretto. Le punte più piccole e affilate dell'ago della micropipetta renderebbero più fluida la penetrazione della vescicola ottica e comporterebbero meno danni ai tessuti. Tuttavia, gli aghi con punte molto piccole hanno difficoltà a caricare e rilasciare la soluzione di DNA. Nello studio qui descritto, sono stati utilizzati aghi con un'apertura della punta di 10-20 μm di diametro. In terzo luogo, assicurati di riempire l'intera vescicola ottica con la soluzione di DNA (come visualizzato dalla diffusione del verde veloce). In quarto luogo, posizionare gli elettrodi nelle posizioni ottimali per indirizzare i DNA nell'area desiderata della vescicola ottica (ad esempio, lato temporale, lato nasale). Le molecole di DNA caricate negativamente si sposteranno verso il lato dell'anodo; Pertanto, il posizionamento e l'orientamento precisi degli elettrodi influiscono in modo critico sui risultati finali. Infine, utilizzare le concentrazioni ottimali di DNA e i parametri di elettroporazione.
Se non si osserva alcun segnale fluorescente dopo 24 ore di elettroporazione, è necessario considerare quanto segue: (1) Confermare che i plasmidi elettroporati abbiano sequenze corrette. (2) Ricontrollare la concentrazione e la purezza dei singoli plasmidi. (3) Assicurarsi che la soluzione di DNA riempia il lume della vescicola ottica e non si diffonda nel tubo neurale. (4) Verificare che i parametri di elettroporazione utilizzati siano corretti. (5) Verificare che gli elettrodi siano a contatto con la membrana vitellina durante l'applicazione degli impulsi elettrici.
La combinazione dell'elettroporazione in ovo e di un metodo di integrazione genica mediato da trasposoni in questo protocollo offre diversi vantaggi distinti. In primo luogo, supporta la produzione stabile di miRNA e quindi la soppressione persistente dei geni bersaglio. Lo sviluppo della retina del pulcino inizia a E1.5 e continua fino alla schiusa (le cellule gangliari retiniche sono prodotte nel periodo da E2 a E9). Per l'analisi della perdita di funzione del gene, l'espressione dei miRNA artificiali deve essere mantenuta stabilmente durante questo periodo. L'espressione di sequenze di RNAi utilizzando vettori di espressione convenzionali è generalmente transitoria perché il costrutto di espressione non riesce ad essere integrato in modo efficiente nei cromosomi. Nel metodo qui descritto, tuttavia, l'integrazione cromosomica della cassetta di espressione è mediata dall'attività della trasposasi co-elettroporosa, che si traduce in un'espressione stabile dei transgeni.
In secondo luogo, in questo metodo, lo stesso promotore CAGGS induce l'espressione co-cistronica di più sequenze di miRNA e del marcatore EmGFP nelle cellule trasfettate, aggirando così il rischio di interferenza del promotore, che è una delle complicanze comuni con i vettori retrovirali contenenti due promotori per raggiungere la doppia espressione genica25.
Infine, a differenza dei vettori retrovirali competenti per la replicazione, il transgene che viene elettroporato con questo metodo non viene trasferito alle cellule vicine. Pertanto, l'area di trasfezione può essere controllata in modo più preciso utilizzando i tipi appropriati di elettrodi e posizionandoli nelle posizioni corrette.
Nonostante i vantaggi sopra descritti, il metodo attuale presenta anche dei limiti inerenti all'elettroporazione ovo . Ad esempio, i tassi di trasfezione e soppressione genica possono variare da embrione a embrione e può essere necessario trasfettare un numero relativamente elevato di embrioni per l'analisi. Inoltre, l'elettroporazione nella retina embrionale in ovo nelle fasi di sviluppo successive (ad esempio, E4-E5) presenta difficoltà sperimentali perché gli occhi si trovano in prossimità del cuore in quelle fasi, il che aumenta il rischio di arresto cardiaco dopo l'elettroporazione.
Il sistema qui descritto consente una rapida e robusta soppressione genica nella retina del pulcino in via di sviluppo. Questo approccio può essere applicato anche ad altre parti dell'embrione di pulcino, compresi i tessuti neurali e non neurali. Ci aspettiamo, quindi, che questo sistema possa contribuire alla delucidazione dei meccanismi molecolari dello sviluppo dei pulcini.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
I vettori pT2K-CAGGS e pCAGGS-T2TP sono stati gentilmente forniti rispettivamente da Yoshiko Takahashi (Università di Kyoto, Kyoto, Giappone) e Koichi Kawakami (Istituto Nazionale di Genetica, Mishima, Giappone). Ringraziamo Michael Berberoglu per la sua lettura cruciale del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Royal Society e del Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (Regno Unito) a M.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
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