Summary
Hemos desarrollado un nuevo enfoque de pérdida de función que implica la introducción e integración genómica de secuencias artificiales de micro-ARN en embriones de pollo mediante el uso de electroporación in ovo y el sistema de transposones Tol2. Esta técnica proporciona una metodología de eliminación de genes robusta y estable para estudios de la función de los genes durante el desarrollo.
Abstract
La retina del pollo ha sido durante mucho tiempo un sistema modelo importante en la neurobiología del desarrollo, con ventajas que incluyen su gran tamaño, rápido desarrollo y accesibilidad para la visualización y las manipulaciones experimentales. Sin embargo, su principal limitación técnica ha sido la falta de enfoques sólidos de pérdida de función para los análisis de la función génica. Este protocolo describe una metodología de silenciamiento génico en la retina de un pollo en desarrollo que implica la expresión transgénica de microARN artificiales (miARN) mediante el uso del sistema de transposones Tol2. En este enfoque, se introduce en la retina embrionaria de un pollo un plásmido de transposón Tol2 que contiene un casete de expresión para el marcador EmGFP (proteína fluorescente verde esmeralda) y secuencias artificiales de pre-miRNA contra un gen diana con una construcción de expresión de transposasa Tol2 mediante electroporación in ovo . En las células retinianas transfectadas, la transposasa cataliza la escisión del casete de expresión del vector de transposones y su integración en los cromosomas del huésped, lo que conduce a la expresión estable de miARN y la proteína EmGFP. En nuestro estudio anterior, hemos demostrado que la expresión de Nel, una glicoproteína que ejerce múltiples funciones en el desarrollo neuronal, puede suprimirse significativamente en la retina del pollo en desarrollo mediante el uso de esta técnica. Nuestros resultados indican que esta metodología induce una supresión estable y robusta de la expresión génica y, por lo tanto, proporciona un enfoque eficiente de pérdida de función para estudios del desarrollo de la retina.
Introduction
La retina de los vertebrados es un importante sistema modelo para estudiar el desarrollo neuronal. A pesar de su ubicación periférica, la retina es anatómica y evolutivamente una extensión del sistema nervioso central, y el nervio óptico, que consiste en axones de células ganglionares de la retina, representa un tracto dentro del sistema nervioso central. La retina del pollito tiene ventajas significativas como sistema modelo para estudiar el mecanismo molecular del desarrollo neuronal: es grande y se desarrolla rápidamente; tiene similitudes estructurales y funcionales con la retina humana; Es muy accesible para la visualización y las manipulaciones experimentales. Los mecanismos moleculares de proliferación y diferenciación celular, morfogénesis y guía de axones durante el desarrollo neuronal se han estudiado ampliamente mediante el uso de la retina de pollo.
La electroporación in ovo se ha utilizado con éxito durante las últimas dos décadas para introducir genes ectópicos en las células del embrión de pollo en desarrollo. Esta técnica permite el marcaje de las células en desarrollo, el rastreo del destino celular y el rastreo de la migración celular y los tractos axónicos, así como la expresión génica ectópica para el análisis in vivo de la función génica. Las condiciones de electroporación in ovo para la expresión génica ectópica eficiente en embriones de pollo han sido bien establecidas 1,2,3.
A pesar de estas ventajas, la falta de una técnica estable de pérdida de función para el estudio de la función génica había sido una limitación técnica importante del embrión de pollo. Mientras que los embriones de pollo electroporados con pequeños ARN interferentes (siRNAs)4 o vectores de expresión de ARN de horquilla corta (shRNAs)5 muestran la eliminación del gen objetivo, la supresión génica en esos enfoques es transitoria porque los efectos desaparecen una vez que las células pierden los ARN o ADN introducidos. Se puede lograr una supresión génica más estable mediante la administración de siRNAs en embriones de pollo mediante un sistema de retrovirus RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor)6. El vector viral se integra en el genoma del huésped y los genes ectópicos se expresan de manera estable. Sin embargo, el retrovirus solo puede integrarse en el genoma de las células en división durante la fase mitótica (M) del ciclo celular, lo que puede imponer una limitación en las etapas de desarrollo y/o tipos de células para las que se puede aplicar este enfoque de pérdida de función. Además, la expresión de transgenes por RCAS parece más lenta y menos robusta que la inducida por electroporación in ovo 7.
Los transposones son elementos genéticos que se mueven de un lugar del genoma a otro. El elemento Tol2 es un miembro de la familia de elementos transponibles hAT y contiene un gen interno que codifica una transposasa que cataliza la reacción de transposón del elemento Tol28. Cuando un vector plásmido que lleva un casete de expresión génica flanqueado por las secuencias de los extremos izquierdo y derecho de los elementos Tol2 (200 pb y 150 pb, respectivamente) se introduce en células de vertebrados con una construcción de expresión de transposasa Tol2, el casete de expresión se extirpa del plásmido y se integra en el genoma del huésped, lo que favorece una expresión estable del gen ectópico (Figura 1). Se ha demostrado que el elemento transponible Tol2 puede inducir la transposición de genes de manera muy eficiente en diferentes especies de vertebrados, incluidos el pez cebra9,10, las ranas 11, los polluelos 12 y los ratones 13, y por lo tanto es un método útil de transgénesis y mutagénesis insercional. El sistema de transposones Tol2 se ha utilizado con éxito para la eliminación condicional de un gen diana mediante la integración genómica del siRNA que se procesa a partir de ARN bicatenariolargo 14.
Este protocolo describe un abordaje de pérdida de función en el embrión de pollo que implica la introducción de microRNAs artificiales (miRNAs) por el sistema de transposones Tol215,16. En este enfoque, se clona un casete de expresión para el marcador EmGFP (proteína fluorescente verde esmeralda) y miARN artificiales contra un gen diana en un vector de transposón Tol2. A continuación, la construcción del transposón Tol2 se introduce en la retina del pollito embrionario con una construcción de expresión de la transposasa Tol2 mediante electroporación in ovo. En las células retinianas transfectadas, la transposasa cataliza la escisión del casete de expresión del vector de transposones y su integración en los cromosomas del huésped, lo que conduce a la expresión estable de miARN y la proteína EmGFP. En nuestros estudios previos, logramos reducir la expresión de Nel, una glicoproteína extracelular que se expresa predominantemente en el sistema nervioso, en la retina del pollo en desarrollo (ver Resultados representativos). Nuestros resultados indican que se puede lograr una supresión génica estable y eficiente in ovo mediante esta técnica.
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Protocol
1. Construcción de vectores de expresión de miRNA
NOTA: Los procedimientos para construir vectores de expresión de miARN (pasos 1.1-1.3, 1.5-1.6.) están optimizados para el kit de expresión de miARN, kit de expresión de ARN miR Block-iT Pol II con EmGFP, como se describió anteriormente15,16. El kit proporciona el vector de expresión diseñado para permitir la expresión de miARN (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), un vector de control (plásmido de control pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativo), reactivos accesorios e instrucciones para producir vectores de expresión de miARN (ver Tabla de materiales)17.
- Diseño de oligonucleótidos de ADN monocatenario que codifican pre-miRNAs contra el gen diana: Diseño de oligonucleótidos de ADN monocatenario (oligonucleótidos de cadena superior (pre-miARN diana) y oligonucleótidos de "hebra inferior" (complementos de oligonucleótidos de hebra superior)) utilizando la herramienta en línea, RNAi Designer (ver Tabla de materiales). Consulte la Figura 2 para conocer las características requeridas de los oligonucleótidos monocatenarios (Figura 2A) y ejemplos de secuencias diana (Figura 2B).
NOTA: Se recomienda que se generen de 5 a 10 secuencias de pre-miARN para un gen diana determinado y que se examinen in vitro para detectar actividades de knockdown (paso 1.4). - Recocido de los oligonucleótidos de hebra superior e inferior para generar un oligonucleótido de doble cadena
- Configure la siguiente reacción de recocido (Tabla 1) en un tubo de microcentrífuga estéril de 0,5 ml.
- Incubar la mezcla de reacción a 95 °C durante 4 min. Recocine los oligonucleótidos de hebra superior e inferior para generar un oligonucleótido bicatenario permitiendo que la mezcla de reacción se enfríe a temperatura ambiente (RT) durante 5-10 min. Centrifugar la muestra brevemente (~5 s).
NOTA: Los oligonucleótidos recocidos pueden almacenarse a -20 °C sin degradación durante al menos un año.
- Clonación de los oligonucleótidos bicatenarios en el vector de expresión de miARN (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (proporcionado en el kit de expresión de miARN)): clonar oligonucleótidos bicatenarios individuales en el vector de expresión de miARN linealizado, de acuerdo con el manual del fabricante17.
- Evaluación de los efectos de derribo
NOTA: Se recomienda que las secuencias individuales de miARN se analicen in vitro para determinar la eficacia de la supresión génica antes de aplicarlas en ovo. La eficiencia de knockdown se puede probar mediante la transfección de plásmidos de expresión de miARN en una línea celular que exprese el gen diana. Alternativamente, los plásmidos de expresión de miARN individuales se pueden cotransfectar en líneas celulares con una construcción de expresión para el gen diana. En el caso de los genes diana que codifican proteínas que no están ancladas a la membrana en su estado nativo (por ejemplo, proteínas solubles), se puede utilizar una proteína de fusión de fosfatasa alcalina (AP) para monitorizar la expresión de la proteína diana. Una secuencia de ADNc que codifica la proteína diana puede fusionarse en el marco de la fosfatasa alcalina de la placenta humana en vectores de etiqueta AP (APtag-1- APtag-5; ver Tabla de Materiales) e introducirse en las células18. Cuando se expresa en células de cultivo (p. ej., células HEK293T), la proteína diana marcada con AP se secreta en niveles altos en los medios de cultivo y, por lo tanto, los efectos de eliminación de las secuencias de miARN pueden evaluarse midiendo la disminución de la actividad de AP en los medios de cultivo de células transfectadas con miARN (subpasos 1.4.1-1.4.4).- Cultive HEK293T células en una placa de 24 pocillos (8 x 10,4 células/pocillo) durante la noche. Transfectar transitoriamente las células con construcciones de expresión de miARN individuales con un plásmido de expresión de una proteína diana marcada con AP. Utilice el plásmido de control pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativo (incluido en el kit de expresión de miRNA) como control. (Si se utilizan líneas celulares que expresan de forma estable una proteína diana marcada con AP, transfecte las células solo con construcciones de expresión de miARN individuales).
NOTA: Se utiliza un reactivo de lipofección convencional (ver Tabla de Materiales) para la transfección. - Recoger el medio acondicionado 48-72 h después de la transfección e inactivar con calor la actividad endógena de AP en un baño de agua a 65 °C durante 5 min. Residuos de centrifugación en una microcentrífuga de escritorio a máxima velocidad durante 5 min.
- Tamponar el sobrenadante con 10 mM de HEPES, pH 7,0 y pasarlo por un filtro de 0,45 μm.
- Tome 100 μL (para la medición en un lector de placas) o 500 μL (para un espectrofotómetro) del sobrenadante y agregue una cantidad igual de tampón de sustrato AP 2x (Tabla 2). Compruebe la actividad del AP midiendo el diámetro exterior405 en un lector de placas o en un espectrofotómetro.
NOTA: Si la actividad PA del medio acondicionado es demasiado alta para una medición precisa, diluirla con tampón HBAH (solución salina equilibrada de Hanks (HBSS), 0,5 mg/ml de albúmina sérica bovina, 20 mM HEPES (pH 7,0)) u otro tampón que contenga una proteína transportadora. No utilice tampones que contengan fosfato (p. ej., PBS) porque el fosfato inorgánico actúa como un inhibidor competitivo de la PA.
- Cultive HEK293T células en una placa de 24 pocillos (8 x 10,4 células/pocillo) durante la noche. Transfectar transitoriamente las células con construcciones de expresión de miARN individuales con un plásmido de expresión de una proteína diana marcada con AP. Utilice el plásmido de control pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativo (incluido en el kit de expresión de miRNA) como control. (Si se utilizan líneas celulares que expresan de forma estable una proteína diana marcada con AP, transfecte las células solo con construcciones de expresión de miARN individuales).
- Encadenamiento de la secuencia de miARN
NOTA: Los efectos de derribo se pueden mejorar encadenando diferentes miARN contra el mismo gen diana o repitiendo el mismo miARN. El vector de expresión de miRNA soporta el encadenamiento de múltiples secuencias de pre-miRNA y su expresión co-cistrónica17.- Encadenar dos secuencias diferentes de pre-miARN (contra el mismo gen diana) que muestren las actividades de knockdown más altas en ensayos in vitro (paso 1.4), de acuerdo con las instrucciones del fabricante17.
- Evaluar la eficiencia de la supresión génica de las construcciones encadenadas mediante ensayos in vitro como se describe en el paso 1.4. Si tres o más secuencias de pre-miARN muestran actividades de derribo igualmente altas, pruebe diferentes combinaciones de dos secuencias y utilice las combinaciones que muestren la actividad de derribo más alta (consulte Resultados representativos).
- Transferencia del casete de expresión de EmGFP-pre-miRNA al vector de transposones Tol2
NOTA: El casete de expresión que contiene ADNc de EmGFP y dos secuencias de pre-miRNA se transfiere al vector de transposón Tol2 (vector pT2K-CAGGS, consulte la Tabla de materiales). Con este fin, el casete de expresión (que abarca desde el extremo 3' del promotor de CMV hasta el sitio del cebador de secuenciación inversa de miARN del vector de expresión de miARN) se amplifica por PCR utilizando cebadores con un sitio enzimático de restricción artificial, y el producto de PCR se clona en el vector de transposón Tol2. El vector de transposón Tol2 contiene el promotor CAGGS ubicuo, que impulsa la expresión del casete de expresión insertado. El promotor CAGGS y el casete de expresión están flanqueados por las secuencias Tol2 (Figura 1).- Amplificación por PCR del casete de expresión de EmGFP-pre-miRNA: Siga la configuración de la reacción y las condiciones de termociclado descritas en la Tabla 3.
- Ligue el producto de PCR purificado en gel (c. 1,3 kb) en el vector de transposón Tol2 digerido por enzima de restricción. Electroporar el plásmido en células competentes de E. coli (ver Tabla de Materiales) y seleccionar los recombinantes (construcciones de miARN pT2K-CAGGS-EmGFP-2x).
- Prepare el plásmido utilizando un kit de maxiprep convencional (consulte la tabla de materiales). Comprobar la estructura y la secuencia del plásmido mediante el mapeo de restricciones y mediante el uso de los cebadores utilizados para la PCR, respectivamente.
2. Almacenamiento e incubación de huevos
- Compre huevos fertilizados de Leghorn blanco (Gallus gallus) en granjas locales o vendedores comerciales.
NOTA: Los huevos pueden mantenerse a 12-16 °C o a 4 °C hasta 1 semana antes de la incubación sin pérdida significativa de viabilidad o retraso en el desarrollo durante la incubación. - Etiquete los huevos con la fecha de inicio de la incubación y marque la parte superior del huevo (donde se colocará el embrión). Incubar los óvulos fecundados en posición horizontal a 38 °C hasta que los embriones hayan alcanzado los estadios 10 (33-38 h) -11 (40-45 h)19.
3. Electroporación in ovo
- Preparación para la electroporación in ovo
- Preparación de solución verde rápida al 0,25%: Disolver 25 mg de FCF verde rápido en 10 ml de PBS. Filtre la solución con un filtro de jeringa de 0,2 μm. La solución se puede almacenar en RT.
- Cóctel de ADN: Preparar la solución inyectable mezclando los plásmidos de miARN pT2K-CAGGS-EmGFP-2x individuales (subpaso 1.6.3) con el plásmido de expresión de la transposasa Tol2 (vector pCAGGS-T2TP; ver Tabla de Materiales) (5 μg/μL cada uno) en una proporción de 2:1. Agregue 1/10 de volumen de solución verde rápida al 0,25% para visualizar el área inyectada.
NOTA: La concentración óptima de ADN puede variar dependiendo de las construcciones. - Configuración del aparato de microinyección (Figura 3A,B): El aparato de microinyección consta de lo siguiente (consulte la Tabla de materiales): jeringa Hamilton, aguja de 18 G (longitud de la aguja = 2"), tubo de PVC (cloruro de polivinilo) (2 cm de longitud), aguja de micropipeta (se puede hacer tirando de tubos capilares con fibra de punto omega (1 mm de diámetro exterior x 0,75 mm de diámetro interior) con un extractor de micropipetas).
- Llene una jeringa Hamilton con aceite mineral pesado. Coloque una aguja de 18 G en la jeringa y llene el espacio interior de la aguja con aceite presionando el émbolo de la jeringa.
- Coloque un trozo de tubo de PVC de 2 cm de largo en el extremo de la aguja y llene el tubo con el aceite.
- Coloque una aguja de micropipeta tirada en el tubo. Rompa la punta de la aguja de la micropipeta hasta un diámetro de 10-20 μm con pinzas finas para hacer una pequeña abertura. Llene toda la aguja con aceite.
NOTA: Se debe tener cuidado de no atrapar burbujas de aire en el sistema, ya que inhibirían el flujo de la solución de ADN.
- Coloque 5 μL del cóctel de ADN coloreado (subpaso 3.1.2) en una placa de Petri estéril. Bajo el microscopio de disección, coloque la punta de la aguja de la micropipeta en la solución de ADN en la placa de Petri estéril y extraiga lentamente la solución en la aguja.
- Espere hasta que la presión se equilibre dentro y fuera de la aguja (para evitar que entre aire en la aguja) y saque la punta de la aguja de la solución de ADN. Mantenga la punta de la aguja sumergida en PBS estéril en un vaso de precipitados pequeño hasta la inyección.
- Configuración del aparato de electroporación (Figura 3A, C):
- Coloque un par de electrodos de platino con un portaelectrodos en un micromanipulador. Ajuste el espacio entre la punta de los electrodos a 2 mm (Figura 3C,E).
- Conecte los electrodos a un generador de pulsos de onda cuadrada con cables (consulte la tabla de materiales).
- Microinyección de solución de ADN (Figura 3D)
- Retire un huevo de gallina de la incubadora y limpie la superficie del huevo con un papel de seda empapado en etanol al 70%.
- Coloque una aguja de 18 G en una jeringa de 10 ml. Inserte la aguja a través del extremo romo del huevo, inclinado hacia abajo (45 °) para evitar dañar la yema.
- Retire 2-3 ml de albúmina del huevo. Sella el agujero con un pedazo de cinta adhesiva. Confirme que el embrión y la membrana vitelina se desprenden de la cáscara "trasluz" el óvulo con luz.
- Retire un trozo de cáscara de huevo (círculo de 2-3 cm de diámetro) de la parte superior del huevo con unas tijeras y unas pinzas para exponer el embrión. No coloque más de cinco óvulos en una ventana a la vez para evitar que los embriones se sequen durante la electroporación.
NOTA: Si es difícil abrir una ventana sin romper el huevo, se puede cubrir toda la parte superior del huevo con cinta adhesiva o cinta adhesiva antes de quitar un trozo de cáscara de huevo. - Inserte la punta de la aguja en la vesícula óptica desde su lado proximal en un ángulo de 45° e inyecte el cóctel de ADN presionando lentamente (o golpeando) el émbolo hasta que la solución de color azul llene el lumen (Figura 3D).
NOTA: Alternativamente, se puede utilizar un sistema de microinyección a presión (ver Tabla de materiales) para la inyección de soluciones de ADN. - Retire la aguja y vuelva a colocar la punta en el PBS.
- Electroporación (Figura 3E)
- Ajuste los parámetros de pulso del electroporador de la siguiente manera: Voltaje: 15 V, Longitud del pulso: 50 ms, Intervalo de pulso: 950 ms, Número de pulso: 5
- Agregue unas gotas de HBSS en la membrana vitelina sobre el embrión. Bajar los electrodos en el HBSS utilizando el micromanipulador, perpendicular al eje antero-posterior del embrión.
NOTA: Alternativamente, este procedimiento se puede realizar sin agregar HBSS, ya que la albúmina es un buen conductor eléctrico que permite una electroporación eficiente. - Coloque los electrodos a ambos lados (lado anterior (nasal) y lado posterior (temporal)) de la vesícula óptica (Figura 3E). Asegúrese de que los electrodos no toquen el embrión ni los vasos sanguíneos. Aplica campos eléctricos pulsados.
- Retire los electrodos y limpie suavemente los electrodos con un bastoncillo de algodón estéril empapado en agua para evitar la acumulación de albúmina.
- Selle la ventana con cinta adhesiva y vuelva a incubar el embrión hasta la etapa de desarrollo deseada.
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Representative Results
Construcción de construcciones de transposones Tol2 para la expresión de miRNAs artificiales frente a Nel
El Nel (factor de crecimiento pidérmico Neural E(EGF)-Like; también conocido como Nell2) es una glicoproteína extracelular. Tiene similitudes estructurales con la trombospondina-1 y se expresa predominantemente en el sistema nervioso20,21. Hemos demostrado previamente que el Nel regula la diferenciación y la supervivencia de las células ganglionares de la retina15 y actúa como una señal de guía inhibitoria para los axones de la retina22,23,24. En la retina del pollo en desarrollo, la expresión de Nel se detecta en el epitelio pigmentario presunto en HH15 (día embrionario (E) 2.5). En HH20 (E3.5), también se observa la expresión de Nel en células ganglionares de la retina recién diferenciadas. La fuerte expresión de Nel en el epitelio pigmentario y en las células ganglionares de la retina continúa al menos hasta E1815.
Para examinar la función del Nel en el desarrollo de las células ganglionares de la retina, se redujo la expresión del gen Nel mediante la introducción de miRNAs artificiales en la retina en desarrollo utilizando electroporación in ovo y el sistema de transposones Tol215,16. En primer lugar, se diseñaron pares de oligonucleótidos de ADN monocatenario para 10 posibles secuencias diana en la región codificante de proteínas del ADNc Nel de pollo (número de acceso GenBank: NM_001030740.1) utilizando la herramienta de diseño de ARNi en línea (ver Tabla de materiales). Los pares de oligonucleótidos se recocieron y clonaron individualmente en el vector de expresión de miARN. A continuación, las construcciones individuales se transfectaron en células HEK293T que expresan Nel-AP de forma estable, y se evaluaron sus eficiencias de knockdown midiendo la actividad de AP en los medios de cultivo. Se utilizó como control el plásmido de control pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativo (Figura 4A).
Se seleccionaron tres secuencias de pre-miRNA de Nel que mostraron los efectos de knock down más altos (contra los nucleótidos 482-502, 910-930 y 2461-2481 del ADNc de Nel de pollo, respectivamente), y dos secuencias de pre-miRNA se clonaron en tándem en el vector de expresión de miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x Nel pre-miRNA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante17. Los casetes de expresión que codifican los dos pre-miRNA y EmGFP se amplificaron mediante PCR con un sitio EcoRI artificial en ambos extremos (5′-GGGAATTCTCTGGCTAACTAGAGAAC-3′ y 5′-CCGAATTCCCTCTAGATCAACCACT-3′) y se clonaron en el vector pT2K-CAGGS (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). La secuencia del casete de expresión se confirmó mediante el uso de los cebadores utilizados para la PCR. Las construcciones de pre-miARN de pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel se cotransfectaron individualmente con el vector de expresión de la transposasa Tol2 (pCAGGS-T2TP) en células HEK293T que expresan Nel-AP de manera estable, y se evaluaron los efectos inhibidores sobre la expresión de Nel-AP midiendo las actividades de AP en los medios de cultivo. Como se muestra en la Figura 4B, la eficiencia de la eliminación mejoró significativamente mediante el encadenamiento de dos secuencias de miARN. Se observó una supresión robusta de la expresión de Nel-AP (más del 90%) al menos hasta 13 días después de la transfección (Figura 4B).
Supresión estable de la expresión de Nel en la retina del pollito en desarrollo
Una construcción de pre-miARN pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel (que contiene secuencias diana para los nucleótidos 482-502 y 2461-2481 del ADNc Nel de pollo) se cotransfectó con el vector de expresión de transposasa (pCAGGS-T2TP) en el lado temporal o nasal de la retina del pollito mediante electroporación in ovo en HH9-11 (Figura 3, Figura 5A). Las secciones se prepararon a partir de retinas E4.5 o E8, y los efectos sobre la expresión de Nel se evaluaron mediante inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo anti-Nel22. En E4.5, la expresión de Nel en el epitelio pigmentario de la retina se redujo significativamente en las células que expresan EmGFP (Figura 5B-D). En E8, también se observaron claramente disminuciones en la expresión de Nel en las células ganglionares de la retina (Figura 5E-I). La supresión significativa de la expresión de Nel continuó al menos hasta E18 (datos no mostrados). La introducción de miRNA de control no afectó a la expresión de Nel en la retina (Figura 5J-O).
Figura 1: Transposición de ADNc flanqueados por Tol2 por transposasa. Un esquema que muestra la transposición de un casete de expresión flanqueado por Tol2 para EmGFP y encadenado dos secuencias de pre-miARN (2x pre-miARN) por transposasa. Cuando se introduce un vector de transposón Tol2 que contiene el casete de expresión (construcción de miARN pT2K-CAGGS-EmGFP-2x) en células con una construcción de expresión de transposasa Tol2 (pCAGGS-T2TP), el casete de expresión flanqueado por Tol2 se extirpa del vector y se integra en el genoma del huésped mediante la actividad de la transposasa. La expresión de EmGFP y miRNAs es impulsada por el promotor ubicuo CAGGS. Esta figura ha sido modificada a partir de Nakamoto et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estructura del pre-miRNA diseñado. (A) La secuencia de pre-miRNA diseñada se basa en la secuencia murina miR-15517. El oligonucleótido de la hebra superior contiene (desde el extremo 5' hasta el extremo 3') un saliente de cuatro nucleótidos (TGCT (azul)), una secuencia diana antisentido (21 nucleótidos), una secuencia de bucle terminal (rojo) y una secuencia diana de detección (19 nucleótidos). La secuencia diana antisentido representa la secuencia madura de miARN. El oligonucleótido inferior contiene un saliente de cuatro nucleótidos 5' (CCTG (azul)) y la secuencia inversa del complemento del oligonucleótido superior, pero carece del saliente de cuatro nucleótidos en el extremo 3' (AGCA-3': complemento inverso del 5'-TGCT del oligonucleótido superior). La secuencia diana de detección carece de los nucleótidos 9 y 10 de la secuencia diana. Los dos nucleótidos "extra" en la secuencia diana antisentido forman un bucle interno en la estructura stem-loop de la molécula madura de miARN, lo que da lugar a una mayor tasa de knockdown17. (B) Un ejemplo de secuencia diana contra el pollo Nel. Se muestran secuencias de sentido y antisentido en las hebras superior e inferior para una secuencia diana del gen Nel de pollo (número de acceso GenBank NM_001030740.1, nucleótidos 482-502). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Microinyección in ovo y electroporación. (A) Estación de trabajo para microinyección in ovo y electroporación. (1) Microscopio de disección. (2) Aparato de inyección. (3) Aparatos de electroporación. (4) Iluminador de microscopio de cuello de cisne dual. (5) Electroporador. B) Aparatos de inyección. Una jeringa Hamilton (6) con una aguja de 18 G (7) se conecta a un tubo de PVC (8) y a una aguja de micropipeta tirada (9) y se coloca en un micromanipulador (10). El espacio interior del aparato está lleno de aceite mineral pesado. C) Aparatos de electroporación. Un conjunto de electrodos de platino (11) con un portaelectrodos (12) se coloca en un micromanipulador (13). Los electrodos se conectan al electroporador con cables (14). (D) Microinyección de solución de cóctel de ADN en la vesícula óptica en HH 10-11. La aguja de micropipeta tirada se inserta en la vesícula óptica desde su lado proximal. Se inyecta una solución de cóctel de ADN con verde rápido (azul) en la vesícula óptica hasta que el tinte llena todo el lumen. (E) Electroporación en la vesícula óptica. Los electrodos se colocan en paralelo (la distancia entre los electrodos es de 2 mm) y de manera que la vesícula óptica inyectada se ubique entre los electrodos: un electrodo se encuentra cerca de la superficie anterior (nasal) de la vesícula óptica, y el otro está en la parte posterior del embrión a nivel del cerebro posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Evaluación in vitro de secuencias individuales o encadenadas de pre-miRNA para la eficiencia de la supresión del gen Nel. (A) Efectos de derribo de secuencias individuales de pre-miARN. Se muestran los resultados de cinco constructos representativos (secuencias diana antisentido correspondientes a los números de nucleótidos 482-502, 910-930, 1106-1126, 1663-1683 y 2461-2481 del ADNc de pollo Nel (número de acceso del GenBank: NM_001030740.1)). Las construcciones individuales de expresión de miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-Nel pre-miRNA) se transfectaron a células HEK293T que expresan Nel-AP de forma estable. Se utilizó como control el plásmido de control pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativo. La expresión de Nel-AP se evaluó midiendo las actividades de PA en los medios de cultivo 48-96 h después de la transfección. Tres construcciones de expresión de pre-miRNA de Nel (contra los nucleótidos 482-502, 910-930 y 2461-2481, respectivamente) mostraron una supresión significativa de la expresión de Nel. (B) Efectos de derribo de secuencias encadenadas de pre-miARN. Dos de las tres secuencias de pre-miARN más potentes (contra los nucleótidos 482-502, 910-930 y 2461-2481) se clonaron en tándem en el vector pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR, y el casete de expresión (que contiene las dos secuencias de pre-miARN y el ADNc de EmGFP) se transfirió al vector pT2K-CAGGS (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). Las construcciones de pre-miRNA pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel se cotransfectaron individualmente con vectores de expresión para la transposasa Tol2 (pCAGGS-T2TP) en células HEK293T que expresan Nel-AP de manera estable, y la expresión de Nel-AP se evaluó midiendo las actividades de AP en los medios de cultivo de 2 a 13 días después de la transfección. Las tres combinaciones (482-502/910-930, 482-502/2461-2481, 910-930/2461-2481) mostraron una mayor actividad de supresión en comparación con las secuencias individuales de pre-miARN no encadenadas. Se observó una supresión significativa de la expresión de Nel-AP desde el día 2 hasta al menos el día 13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Knockdown estable de la expresión de Nel en la retina del pollo en desarrollo mediante la integración mediada por el transposón Tol2 del transgén miRNA. Una construcción de transposón Tol2 que contenía un casete de expresión de dos secuencias de pre-miRNA de Nel y EmGFP (pT2K-CAGGS-EmGFP-Nel pre-miRNA (482-502)-Nel pre-miRNA (2461-2481)) (A-I) o una construcción de control que expresa un miRNA y EmGFP no relacionados (J-O) se cotransfectó con un vector de expresión de transposasa (pCAGGS-T2TP) en la mitad temporal o nasal de la vesícula óptica in ovo electroporación en HH9-HH11 (E1.5). Las secciones de retina se prepararon en E4.5 (B-D, J-L) o E8 (E-I, M-O), y las eficiencias de la supresión del gen Nel se examinaron mediante inmunohistoquímica utilizando anticuerpos anti-Nel (rojo). Dado que el ADN está cargado negativamente, los transgenes se electroporan en el tejido del lado del ánodo; por lo tanto, solo la mitad de la retina estaba marcada con EmGFP (lado de transfección [TF], verde). (A) Expresión del gen marcador EmGFP en la mitad temporal de la retina en E4.5. La fisura óptica (flecha blanca) representa el límite entre los lados transfectados y no transfectados (control). (B-I) Eliminación de ARNi de la expresión de Nel en la retina del pollo en desarrollo. (B-D) En E4.5, la expresión de Nel se reduce significativamente (B,D) en las células del epitelio pigmentario de la retina (EP) que expresan EmGFP (C,D). Obsérvese el patrón complementario de inmunotinción de Nel y expresión de EmGFP en D. NR: retina neural. (E-I) En E8, la expresión de Nel (E,G) en el epitelio pigmentario de la retina y en la capa de células ganglionares (GCL) disminuye en el lado de la transfección (F,G). (H, I) Vistas de mayor aumento de un área de transfección y un área de control correspondiente en E (indicadas por pequeños rectángulos), respectivamente. (D,G) Imágenes combinadas de las dos imágenes de la izquierda. (J-O) Expresión de miRNA de control. La introducción del constructo de control negativo no afecta a la expresión de Nel en la retina E4.5 (J-L) o E8 (M-O). (L,O) Imágenes combinadas de las dos imágenes de la izquierda. El límite entre los lados de transfección y control está indicado por una línea punteada en C, F, K y N. Las barras de escala, 50 μm. (A) y (B-I) han sido modificadas a partir de Nakamoto, M. y Nakamoto, C 16 y Nakamoto et al.15, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Configuración de la reacción de recocido | |
| Oligonucleótido de hebra superior (200 μM en tampón TE) | 5 μL (concentración final 50 μM) |
| Oligonucleótido de hebra inferior (200 μM en tampón TE) | 5 μL (concentración final 50 μM) |
| 10x tampón de recocido de oligo* | 2 μL |
| Agua libre de DNasa/RNasa* | 8 μL |
| Total | 20 μL |
| * Incluido en el kit de expresión de miARN (ver Tabla de materiales) | |
Tabla 1: Configuración de la reacción de recocido
| 2x tampón de sustrato AP | |
| 10 M Dietanolamina (pH 9,8) | 4 mL |
| 1 M MgCl2 | 10 μL |
| L-homoarginina | 45 mg |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | 10 mg |
| p-Nitrofenilfosfato | 63 mg |
| H2O | Añadir para completar un volumen total de 20 ml |
Tabla 2: 2x tampón de sustrato AP. La solución debe almacenarse en alícuotas a -20 °C y protegerse de la luz, ya que el p-nitrofenilfosfato es sensible a la luz.
| Configuración de la reacción | |||
| plásmido pre-miARN pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x (de la sección 1.5) o plásmido de control pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativo* (0,1 μg/μL) |
1 μL | ||
| 10x Búfer de Pfu | 5 μL | ||
| Mezcla de dNTP (10 mM de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) | 1 μL | ||
| Imprimación directa EmGFP* (5'-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| cebador inverso de miARN* (5'- CTCTAGATCAACCACTTTGT-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| ADN polimerasa de PFU (5 unidades/μL) | 0,5 μL | ||
| H2O | 40,5 μL | ||
| Volumen total | 50 μL | ||
| * Incluido en el kit de expresión de miARN. | |||
| Condiciones de termociclado | |||
| 94 °C | 5 minutos | ||
| 30 ciclos de lo siguiente: | |||
| 94 °C | 45 s | ||
| 58 °C | 1 minuto | ||
| 72 °C | 2 minutos | ||
| 72 °C | 10 minutos | ||
Tabla 3: Configuración de la reacción y condiciones de termociclado.
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Discussion
Este protocolo proporciona una guía detallada para el silenciamiento génico en la retina del pollo en desarrollo mediante la expresión transgénica de miRNAs artificiales utilizando electroporación in ovo y el sistema de transposones Tol2.
Los siguientes factores son de vital importancia para realizar esta técnica con éxito. En primer lugar, es fundamental utilizar secuencias de miARN que se haya confirmado que ejercen efectos de derribo sólidos. Antes de aplicarlos para la electroporación in ovo , pruebe las secuencias individuales de pre-miARN para determinar la eficiencia de la supresión génica en ensayos in vitro (paso 1.4) y encadene dos secuencias de pre-miARN que muestren las actividades de knockdown más altas (paso 1.5). En segundo lugar, es importante no dañar la vesícula óptica y los tejidos nerviosos circundantes al insertar la aguja de micropipeta para inyectar la solución de ADN. Un daño excesivo en los embriones podría provocar malformaciones embrionarias y la muerte. Para evitar daños tisulares, introduzca la micropipeta en la vesícula óptica en la orientación correcta. Las puntas más pequeñas y afiladas de la aguja de la micropipeta harían que la penetración de la vesícula óptica fuera más suave y provocarían menos daño tisular. Sin embargo, las agujas con puntas muy pequeñas tienen dificultades para cargar y liberar la solución de ADN. En el estudio aquí descrito, se utilizaron agujas con una abertura de punta de 10-20 μm de diámetro. En tercer lugar, asegúrese de llenar toda la vesícula óptica con la solución de ADN (como se visualiza por la propagación del verde rápido). En cuarto lugar, coloque los electrodos en las posiciones óptimas para apuntar al ADN en el área deseada de la vesícula óptica (por ejemplo, lado temporal, lado nasal). Las moléculas de ADN cargadas negativamente se moverán hacia el lado del ánodo; Por lo tanto, la colocación y orientación precisas de los electrodos afectan críticamente los resultados finales. Por último, utilice las concentraciones óptimas de ADN y los parámetros de electroporación.
Si no se observa ninguna señal fluorescente después de 24 h de electroporación, se debe considerar lo siguiente: (1) Confirmar que los plásmidos electroporados tienen secuencias correctas. (2) Vuelva a comprobar la concentración y la pureza de los plásmidos individuales. (3) Asegúrese de que la solución de ADN llene la luz de la vesícula óptica y no se difunda en el tubo neural. (4) Compruebe que los parámetros de electroporación utilizados son correctos. (5) Compruebe que los electrodos estén en contacto con la membrana vitelina mientras se aplican los pulsos eléctricos.
La combinación de electroporación in ovo y un método de integración génica mediado por transposones en este protocolo ofrece varias ventajas distintivas. En primer lugar, favorece la producción estable de miARN y, por tanto, la supresión persistente de los genes diana. El desarrollo de la retina del pollito comienza en E1.5 y continúa hasta la eclosión (las células ganglionares de la retina se producen durante el período de E2 a E9). Para el análisis de la pérdida de función de la función génica, la expresión de miARN artificiales debe mantenerse de manera estable durante este período. La expresión de secuencias de ARNi utilizando vectores de expresión convencionales es generalmente transitoria porque la construcción de expresión no se integra de manera eficiente en los cromosomas. Sin embargo, en el método descrito aquí, la integración cromosómica del casete de expresión está mediada por la actividad de la transposasa coelectroporada, lo que da lugar a una expresión estable de los transgenes.
En segundo lugar, en este método, el mismo promotor CAGGS induce la expresión co-cistrónica de múltiples secuencias de miARN y el marcador EmGFP en las células transfectadas, eludiendo así el riesgo de interferencia del promotor, que es una de las complicaciones comunes con los vectores retrovirales que contienen dos promotores para lograr la expresión génica dual25.
Finalmente, a diferencia de los vectores retrovirales competentes para la replicación, el transgén que se electropora por este método no se transfiere a las células vecinas. Por lo tanto, el área de transfección se puede controlar con mayor precisión utilizando los tipos apropiados de electrodos y colocándolos en las posiciones correctas.
A pesar de las ventajas descritas anteriormente, el método actual también tiene limitaciones que son inherentes a la electroporación in ovo . Por ejemplo, las tasas de transfección y supresión génica pueden variar entre embriones, y puede ser necesario transfectar un número relativamente grande de embriones para su análisis. Además, la electroporación en la retina embrionaria in ovo en etapas posteriores del desarrollo (p. ej., E4-E5) tiene dificultades experimentales porque los ojos están ubicados muy cerca del corazón en esas etapas, lo que aumenta el riesgo de paro cardíaco después de la electroporación.
El sistema descrito aquí permite una supresión génica rápida y robusta en la retina del pollo en desarrollo. Este enfoque también se puede aplicar a otras partes del embrión de pollo, incluidos los tejidos neurales y no neurales. Por lo tanto, esperamos que este sistema pueda contribuir a la elucidación de los mecanismos moleculares del desarrollo de los pollitos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los vectores pT2K-CAGGS y pCAGGS-T2TP fueron amablemente proporcionados por Yoshiko Takahashi (Universidad de Kioto, Kioto, Japón) y Koichi Kawakami (Instituto Nacional de Genética, Mishima, Japón), respectivamente. Agradecemos a Michael Berberoglu por su lectura crucial del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Royal Society y el Consejo de Investigación de Biotecnología y Ciencias Biológicas (BBSRC) (Reino Unido) a M.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
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