Summary
Wir haben einen neuartigen Loss-of-Function-Ansatz entwickelt, der die Einführung und genomische Integration künstlicher Mikro-RNA-Sequenzen in Kükenembryonen unter Verwendung der In-ovo-Elektroporation und des Tol2-Transposon-Systems beinhaltet. Diese Technik bietet eine robuste und stabile Gen-Knockdown-Methode für Studien der Genfunktion während der Entwicklung.
Abstract
Die Netzhaut von Küken ist seit langem ein wichtiges Modellsystem in der Entwicklungsneurobiologie, mit Vorteilen wie ihrer Größe, ihrer schnellen Entwicklung und ihrer Zugänglichkeit für Visualisierungen und experimentelle Manipulationen. Seine größte technische Einschränkung war jedoch das Fehlen robuster Loss-of-Function-Ansätze für Genfunktionsanalysen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode des Gen-Silencings in der sich entwickelnden Netzhaut von Küken, die die transgene Expression künstlicher microRNAs (miRNAs) unter Verwendung des Tol2-Transposon-Systems beinhaltet. Bei diesem Ansatz wird ein Tol2-Transposon-Plasmid, das eine Expressionskassette für den EmGFP-Marker (smaragdgrün fluoreszierendes Protein) und künstliche prä-miRNA-Sequenzen gegen ein Zielgen enthält, mit einem Tol2-Transposase-Expressionskonstrukt durch In-ovo-Elektroporation in die embryonale Kükennetzhaut eingeführt. In den transfizierten Netzhautzellen katalysiert die Transposase die Exzision der Expressionskassette aus dem Transposon-Vektor und deren Integration in die Wirtschromosomen, was zu einer stabilen Expression von miRNAs und des EmGFP-Proteins führt. In unserer früheren Studie haben wir gezeigt, dass die Expression von Nel, einem Glykoprotein, das mehrere Funktionen in der neuronalen Entwicklung ausübt, durch diese Technik in der sich entwickelnden Netzhaut von Küken signifikant unterdrückt werden kann. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Methodik eine stabile und robuste Unterdrückung der Genexpression induziert und somit einen effizienten Loss-of-Function-Ansatz für Studien zur Netzhautentwicklung bietet.
Introduction
Die Netzhaut von Wirbeltieren ist ein wichtiges Modellsystem für die Erforschung der neuronalen Entwicklung. Trotz ihrer peripheren Lage ist die Netzhaut anatomisch und entwicklungsbedingt eine Erweiterung des zentralen Nervensystems, und der Sehnerv, der aus Axonen retinaler Ganglienzellen besteht, stellt einen Trakt innerhalb des zentralen Nervensystems dar. Die Netzhaut von Küken hat als Modellsystem zur Untersuchung des molekularen Mechanismus der neuronalen Entwicklung erhebliche Vorteile: Sie ist groß und entwickelt sich schnell; Es hat strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten mit der menschlichen Netzhaut; Es ist für Visualisierungen und experimentelle Manipulationen leicht zugänglich. Molekulare Mechanismen der Zellproliferation und -differenzierung, der Morphogenese und der Axonführung während der neuronalen Entwicklung wurden mit Hilfe der Hühnerretina umfassend untersucht.
Die In-ovo-Elektroporation wurde in den letzten zwei Jahrzehnten erfolgreich eingesetzt, um ektopische Gene in Zellen des sich entwickelnden Kükenembryos einzuschleusen. Diese Technik ermöglicht die Markierung von sich entwickelnden Zellen, die Verfolgung des Zellschicksals und die Rückverfolgung von Zellmigration und Axonbahnen sowie die ektopische Genexpression für die In-vivo-Analyse der Genfunktion. Die Bedingungen der in ovo Elektroporation für eine effiziente ektopische Genexpression in Kükenembryonen sind gut etabliert 1,2,3.
Trotz dieser Vorteile war das Fehlen einer stabilen Loss-of-Function-Technik für die Untersuchung der Genfunktion eine wesentliche technische Einschränkung des Kükenembryos. Während Kükenembryonen, die mit kleinen interferierenden RNAs (siRNAs)4 oder Expressionsvektoren für kurze Haarnadel-RNAs (shRNAs)5 elektroporiert wurden, einen Knockdown des Zielgens zeigen, ist die Gensuppression bei diesen Ansätzen vorübergehend, da die Effekte verschwinden, sobald die Zellen die eingeführten RNAs oder DNAs verlieren. Eine stabilere Gensuppression kann durch die Verabreichung von siRNAs in Kükenembryonen durch ein RCAS-Retrovirussystem (R eplication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a S pliceacceptor) erreicht werden6. Der virale Vektor integriert sich in das Wirtsgenom und die ektopischen Gene werden stabil exprimiert. Das Retrovirus kann sich jedoch nur während der mitotischen (M)-Phase des Zellzyklus in das Genom sich teilender Zellen integrieren, was die Entwicklungsstadien und/oder Zelltypen, für die dieser Loss-of-Function-Ansatz angewendet werden kann, einschränken kann. Darüber hinaus scheint die Expression von Transgenen durch RCAS langsamer und weniger robust zu sein als diejenige, die durch In-ovo-Elektroporation induziert wird7.
Transposons sind genetische Elemente, die sich von einer Stelle im Genom zu einer anderen bewegen. Das Tol2-Element ist ein Mitglied der Familie der hAT-transponierbaren Elemente und enthält ein internes Gen, das für eine Transposase kodiert, die die Transposon-Reaktion des Tol2-Elements8 katalysiert. Wenn ein Plasmidvektor, der eine Genexpressionskassette trägt, die von den Sequenzen des linken und rechten Endes der Tol2-Elemente (200 bp bzw. 150 bp) flankiert wird, mit einem Tol2-Transposase-Expressionskonstrukt in Wirbeltierzellen eingeführt wird, wird die Expressionskassette aus dem Plasmid herausgeschnitten und in das Wirtsgenom integriert, das eine stabile Expression des ektopischen Gens unterstützt (Abbildung 1). Es wurde gezeigt, dass das transponierbare Element Tol2 die Gentransposition in verschiedenen Wirbeltierarten, einschließlich Zebrafisch 9,10, Frösche 11, Küken12 und Mäuse13, sehr effizient induzieren kann und somit eine nützliche Methode der Transgenese und Insertionsmutagenese ist. Das Tol2-Transposon-System wurde erfolgreich für den konditionalen Knockdown eines Zielgens durch genomische Integration von siRNA eingesetzt, die aus langer doppelsträngiger RNA14 prozessiert wird.
Dieses Protokoll beschreibt einen Loss-of-Function-Ansatz im Kükenembryo, bei dem künstliche microRNAs (miRNAs) durch das Tol2-Transposon-System eingeführt werden15,16. Bei diesem Ansatz wird eine Expressionskassette für den EmGFP-Marker (smaragdgrün fluoreszierendes Protein) und künstliche miRNAs gegen ein Zielgen in einen Tol2-Transposon-Vektor kloniert. Das Tol2-Transposon-Konstrukt wird dann mit einem Tol2-Transposase-Expressionskonstrukt durch In-ovo-Elektroporation in die embryonale Kükennetzhaut eingeführt. In den transfizierten Netzhautzellen katalysiert die Transposase die Exzision der Expressionskassette aus dem Transposon-Vektor und deren Integration in die Wirtschromosomen, was zu einer stabilen Expression von miRNAs und des EmGFP-Proteins führt. In unseren früheren Studien ist es uns gelungen, die Expression von Nel, einem extrazellulären Glykoprotein, das hauptsächlich im Nervensystem exprimiert wird, in der sich entwickelnden Netzhaut von Küken zu reduzieren (siehe Repräsentative Ergebnisse). Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass mit dieser Technik eine stabile und effiziente Gensuppression in ovo erreicht werden kann.
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Protocol
1. Konstruktion von miRNA-Expressionsvektoren
ANMERKUNG: Die Verfahren zur Konstruktion von miRNA-Expressionsvektoren (Schritte 1.1-1.3, 1.5-1.6.) sind für das miRNA-Expressionskit Block-iT Pol II miR RNA-Expressionskit mit EmGFP optimiert, wie zuvorbeschrieben 15,16. Das Kit enthält den Expressionsvektor, der die miRNA-Expression ermöglicht (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), einen Kontrollvektor (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatives Kontrollplasmid), akzessorische Reagenzien und Anweisungen zur Herstellung von miRNA-Expressionsvektoren (siehe Materialtabelle)17.
- Design von einzelsträngigen DNA-Oligos, die für prä-miRNAs gegen das Zielgen kodieren: Entwerfen Sie einzelsträngige DNA-Oligos ("Top-Strand"-Oligos (Ziel-Prä-miRNAs) und "Bottom-Strand"-Oligos (Komplemente von Top-Strang-Oligos)) mit dem Online-Tool RNAi Designer (siehe Materialtabelle). Abbildung 2 zeigt die erforderlichen Eigenschaften der einzelsträngigen Oligos (Abbildung 2A) und Beispiele für Zielsequenzen (Abbildung 2B).
HINWEIS: Es wird empfohlen, 5-10 prä-miRNA-Sequenzen für ein bestimmtes Zielgen zu generieren und in vitro auf Knockdown-Aktivitäten zu untersuchen (Schritt 1.4). - Tempern der Ober- und Unterstrangoligos zur Erzeugung eines doppelsträngigen Oligos
- Stellen Sie die folgende Glühreaktion (Tabelle 1) in einem sterilen 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ein.
- Das Reaktionsgemisch wird bei 95 °C für 4 min inkubiert. Glühen Sie die Ober- und Unterstrangoligos, um ein doppelsträngiges Oligo zu erzeugen, indem Sie das Reaktionsgemisch 5-10 Minuten lang auf Raumtemperatur (RT) abkühlen lassen. Die Probe kurz zentrifugieren (~5 s).
HINWEIS: Die geglühten Oligos können bei -20 °C ohne Degradation mindestens ein Jahr lang gelagert werden.
- Klonierung der doppelsträngigen Oligos in den miRNA-Expressionsvektor (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (im miRNA-Expressionskit enthalten)): Klonieren einzelner doppelsträngiger Oligos in den linearisierten miRNA-Expressionsvektor gemäß dem Herstellerhandbuch17.
- Bewertung von Knockdown-Effekten
HINWEIS: Es wird empfohlen, einzelne miRNA-Sequenzen in vitro auf ihre Gensuppressionseffizienz zu testen, bevor sie in ovo angewendet werden. Die Knockdown-Effizienz kann getestet werden, indem miRNA-Expressionsplasmide in eine Zelllinie transfiziert werden, die das Zielgen exprimiert. Alternativ können einzelne miRNA-Expressionsplasmide in Zelllinien mit einem Expressionskonstrukt für das Zielgen co-transfiziert werden. Für Zielgene, die Proteine kodieren, die in ihrem nativen Zustand nicht membranverankert sind (z. B. lösliche Proteine), kann ein alkalisches Phosphatase (AP)-Fusionsprotein zur Überwachung der Expression des Zielproteins verwendet werden. Eine cDNA-Sequenz, die für das Zielprotein kodiert, kann in AP-Tag-Vektoren (APtag-1- APtag-5; siehe Materialtabelle) mit der humanen plazentaren alkalischen Phosphatase fusioniert und in Zellen eingebrachtwerden 18. Bei der Expression in Kulturzellen (z. B. HEK293T Zellen) wird das AP-markierte Zielprotein in hohen Mengen in Kulturmedien sezerniert, so dass Knockdown-Effekte von miRNA-Sequenzen durch Messung der Abnahme der AP-Aktivität in den Kulturmedien von miRNA-transfizierten Zellen (Unterschritte 1.4.1-1.4.4) bewertet werden können.- Kultur HEK293T Zellen in einer 24-Well-Platte (8 x 104 Zellen/Well) über Nacht. Transient werden die Zellen mit individuellen miRNA-Expressionskonstrukten mit einem Expressionsplasmid eines AP-markierten Zielproteins transfektiert. Verwenden Sie das pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative Kontrollplasmid (im miRNA-Expressionskit enthalten) als Kontrolle. (Wenn Zelllinien verwendet werden, die stabil ein AP-markiertes Zielprotein exprimieren, transfektieren Sie die Zellen nur mit individuellen miRNA-Expressionskonstrukten.)
HINWEIS: Für die Transfektion wird ein herkömmliches Lipofektionsreagenz (siehe Materialtabelle) verwendet. - Das konditionierte Medium 48-72 h nach der Transfektion auffangen und die endogene AP-Aktivität in einem 65 °C warmen Wasserbad für 5 min inaktivieren. Schleudern von Schmutz in einer Desktop-Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 5 Minuten.
- Puffern Sie den Überstand mit 10 mM HEPES, pH 7,0 und leiten Sie ihn durch einen 0,45 μm-Filter.
- Nehmen Sie 100 μl (für die Messung in einem Plattenlesegerät) oder 500 μl (für ein Spektralphotometer) des Überstandes und fügen Sie eine gleiche Menge 2x AP-Substratpuffer hinzu (Tabelle 2). Überprüfen Sie die AP-Aktivität, indem Sie OD405 in einem Plattenlesegerät oder einem Spektralphotometer messen.
HINWEIS: Wenn die AP-Aktivität des konditionierten Mediums für eine genaue Messung zu hoch ist, verdünnen Sie es mit HBAH-Puffer (Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin, 20 mM HEPES (pH 7,0)) oder einem anderen Puffer, der ein Trägerprotein enthält. Verwenden Sie keine phosphathaltigen Puffer (z. B. PBS), da anorganisches Phosphat als kompetitiver Inhibitor von AP wirkt.
- Kultur HEK293T Zellen in einer 24-Well-Platte (8 x 104 Zellen/Well) über Nacht. Transient werden die Zellen mit individuellen miRNA-Expressionskonstrukten mit einem Expressionsplasmid eines AP-markierten Zielproteins transfektiert. Verwenden Sie das pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative Kontrollplasmid (im miRNA-Expressionskit enthalten) als Kontrolle. (Wenn Zelllinien verwendet werden, die stabil ein AP-markiertes Zielprotein exprimieren, transfektieren Sie die Zellen nur mit individuellen miRNA-Expressionskonstrukten.)
- Verkettung der miRNA-Sequenz
HINWEIS: Knockdown-Effekte können verstärkt werden, indem verschiedene miRNAs gegen dasselbe Zielgen verkettet oder dieselbe miRNA wiederholt werden. Der miRNA-Expressionsvektor unterstützt die Verkettung mehrerer prä-miRNA-Sequenzen und deren co-cistronische Expression17.- Verketten Sie zwei verschiedene prä-miRNA-Sequenzen (gegen dasselbe Zielgen), die in In-vitro-Assays die höchsten Knockdown-Aktivitäten aufweisen (Schritt 1.4), gemäß den Anweisungen des Herstellers17.
- Bewerten Sie die Gensuppressionseffizienz der verketteten Konstrukte mit Hilfe von In-vitro-Assays , wie in Schritt 1.4 beschrieben. Wenn drei oder mehr prä-miRNA-Sequenzen ähnlich hohe Knockdown-Aktivitäten aufweisen, testen Sie verschiedene Kombinationen von zwei Sequenzen und verwenden Sie die Kombinationen, die die höchste Knockdown-Aktivität aufweisen (siehe Repräsentative Ergebnisse).
- Übertragung der EmGFP-pre-miRNA-Expressionskassette auf den Tol2-Transposon-Vektor
HINWEIS: Die Expressionskassette mit EmGFP-cDNA und zwei prä-miRNA-Sequenzen wird in den Tol2-Transposon-Vektor (pT2K-CAGGS-Vektor, siehe Materialtabelle) überführt. Zu diesem Zweck wird die Expressionskassette (die vom 3'-Ende des CMV-Promotors bis zur miRNA-Reverse-Sequencing-Primerstelle des miRNA-Expressionsvektors reicht) unter Verwendung von Primern mit einer künstlichen Restriktionsenzymstelle PCR-amplifiziert, und das PCR-Produkt wird in den Tol2-Transposon-Vektor kloniert. Der Tol2-Transposon-Vektor enthält den ubiquitären CAGGS-Promotor, der die Expression der eingefügten Expressionskassette steuert. Der CAGGS-Promotor und die Expressionskassette werden von den Tol2-Sequenzen flankiert (Abbildung 1).- PCR-Amplifikation der EmGFP-prä-miRNA-Expressionskassette: Befolgen Sie den Reaktionsaufbau und die in Tabelle 3 beschriebenen Thermozyklenbedingungen.
- Ligatieren Sie das gelgereinigte PCR-Produkt (ca. 1,3 kb) in den Restriktionsenzym-verdauten Tol2-Transposon-Vektor. Elektropolieren Sie das Plasmid in kompetente E. coli-Zellen (siehe Materialtabelle) und wählen Sie die Rekombinanten (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA-Konstrukte) aus.
- Bereiten Sie das Plasmid mit einem herkömmlichen Maxiprep-Kit vor (siehe Materialtabelle). Überprüfen Sie die Struktur und Sequenz des Plasmids durch Restriktionskartierung bzw. durch Verwendung der für die PCR verwendeten Primer.
2. Lagerung und Bebrütung der Eier
- Kaufen Sie befruchtete Eier des Weißen Leghorns (Gallus gallus) von lokalen Bauernhöfen oder kommerziellen Anbietern.
HINWEIS: Eier können bis zu 1 Woche vor der Inkubation bei 12-16 °C oder bei 4 °C aufbewahrt werden, ohne dass es zu einem signifikanten Verlust der Lebensfähigkeit oder einer Verzögerung der Entwicklung während der Inkubation kommt. - Beschriften Sie die Eier mit dem Startdatum der Inkubation und markieren Sie die Oberseite der Eizelle (wo der Embryo positioniert wird). Befruchtete Eizellen werden in horizontaler Position bei 38 °C bebrütet, bis die Embryonen die Stadien 10 (33-38 h) -11 (40-45 h)19 erreicht haben.
3. In-ovo-Elektroporation
- Vorbereitung für die In-ovo-Elektroporation
- Herstellung einer 0,25%igen schnellen grünen Lösung: 25 mg Fast Green FCF in 10 ml PBS auflösen. Die Lösung wird mit einem 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter filtriert. Die Lösung kann bei RT gespeichert werden.
- DNA-Cocktail: Bereiten Sie die Injektionslösung vor, indem Sie die einzelnen pT2K-CAGGS-EmGFP-2x-miRNA-Plasmide (Unterschritt 1.6.3) mit dem Tol2-Transposase-Expressionsplasmid (pCAGGS-T2TP-Vektor; siehe Materialtabelle) (je 5 μg/μl) im Verhältnis 2:1 mischen. Fügen Sie 1/10 Volumen einer 0,25%igen schnellen grünen Lösung hinzu, um den injizierten Bereich zu visualisieren.
HINWEIS: Die optimale DNA-Konzentration kann je nach Konstrukt variieren. - Aufbau des Mikroinjektionsgeräts (Abbildung 3A,B): Das Mikroinjektionsgerät besteht aus Folgendem (siehe Materialtabelle): Hamilton-Spritze, 18-G-Nadel (Nadellänge = 2"), PVC-Schlauch (Polyvinylchlorid) (2 cm Länge), Mikropipettennadel (Kann durch Ziehen von Kapillarröhrchen mit Omega-Punktfaser (1 mm Außendurchmesser x 0,75 mm Innendurchmesser) mit einem Mikropipettenzieher hergestellt werden).
- Füllen Sie eine Hamilton-Spritze mit schwerem Mineralöl. Befestigen Sie eine 18-G-Nadel an der Spritze und füllen Sie den Innenraum der Nadel mit Öl, indem Sie den Spritzenkolben drücken.
- Befestigen Sie ein Stück 2 cm langen PVC-Schlauch am Ende der Nadel und füllen Sie den Schlauch mit dem Öl.
- Befestigen Sie eine gezogene Mikropipettennadel am Schlauch. Brechen Sie die Spitze der Mikropipettennadel mit einer feinen Pinzette auf einen Durchmesser von 10-20 μm ab, um eine kleine Öffnung zu machen. Füllen Sie die gesamte Nadel mit Öl.
HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass keine Luftblasen im System eingeschlossen werden, da diese den Fluss der DNA-Lösung behindern würden.
- 5 μl des farbigen DNA-Cocktails (Unterschritt 3.1.2) auf eine sterile Petrischale geben. Stecken Sie unter dem Präpariermikroskop die Spitze der Mikropipettennadel in die DNA-Lösung auf der sterilen Petrischale und ziehen Sie die Lösung langsam in die Nadel.
- Warten Sie, bis sich der Druck innerhalb und außerhalb der Nadel ausgleicht (um zu vermeiden, dass Luft in die Nadel gelangt) und nehmen Sie die Spitze der Nadel aus der DNA-Lösung. Halten Sie die Spitze der Nadel bis zur Injektion in steriles PBS in einem kleinen Becherglas.
- Aufbau der Elektroporationsapparatur (Abbildung 3A,C):
- Setzen Sie ein Paar Platinelektroden mit einem Elektrodenhalter auf einen Mikromanipulator. Stellen Sie den Abstand zwischen den Spitzen der Elektroden auf 2 mm ein (Abbildung 3C,E).
- Verbinden Sie die Elektroden mit Kabeln mit einem Rechteckimpulsgenerator (siehe Materialtabelle).
- Mikroinjektion von DNA-Lösung (Abbildung 3D)
- Nehmen Sie ein Hühnerei aus dem Inkubator und wischen Sie die Oberfläche des Eis mit einem in 70%igem Ethanol getränkten Seidenpapier ab.
- Befestigen Sie eine 18-g-Nadel an einer 10-ml-Spritze. Stechen Sie die Nadel schräg nach unten (45°) durch das stumpfe Ende des Eies, um das Eigelb nicht zu beschädigen.
- Entnehmen Sie 2-3 ml Albumin aus dem Ei. Verschließe das Loch mit einem Stück Tesafilm. Vergewissern Sie sich, dass sich der Embryo und die Vitellinmembran von der Schale lösen, indem Sie die Eizelle mit Licht "benetzen".
- Entfernen Sie ein Stück Eierschale (Kreis mit einem Durchmesser von 2-3 cm) mit einer Schere und einer Pinzette von der Oberseite des Eies, um den Embryo freizulegen. Nicht mehr als fünf Eizellen gleichzeitig öffnen, um das Austrocknen der Embryonen während der Elektroporation zu verhindern.
HINWEIS: Wenn es schwierig ist, ein Fenster zu öffnen, ohne das Ei zu zerbrechen, kann die gesamte Oberseite des Eies mit Klebeband oder Tesafilm abgedeckt werden, bevor ein Stück Eierschale entfernt wird. - Führen Sie die Spitze der Nadel von ihrer proximalen Seite in einem Winkel von 45° in das optische Vesikel ein und injizieren Sie den DNA-Cocktail, indem Sie den Kolben langsam drücken (oder darauf klopfen), bis die blau gefärbte Lösung das Lumen ausfüllt (Abbildung 3D).
HINWEIS: Alternativ kann für die Injektion von DNA-Lösungen ein Druck-Mikroinjektionssystem (siehe Materialtabelle) verwendet werden. - Ziehen Sie die Nadel zurück und setzen Sie ihre Spitze wieder in PBS ein.
- Elektroporation (Abbildung 3E)
- Stellen Sie die Impulsparameter des Elektroporators wie folgt ein: Spannung: 15 V, Impulslänge: 50 ms, Impulsintervall: 950 ms, Impulszahl: 5
- Geben Sie ein paar Tropfen HBSS auf die Vitellinmembran über dem Embryo. Senken Sie die Elektroden mit dem Mikromanipulator senkrecht zur vorderen und hinteren Achse des Embryos in das HBSS ab.
HINWEIS: Alternativ kann dieses Verfahren ohne Zugabe von HBSS durchgeführt werden, da Albumin ein guter elektrischer Leiter ist, der eine effiziente Elektroporation ermöglicht. - Platzieren Sie die Elektroden auf beiden Seiten (vordere (nasale) und hintere (temporale) Seite) des Sehblasens (Abbildung 3E). Achten Sie darauf, dass die Elektroden den Embryo oder die Blutgefäße nicht berühren. Wenden Sie gepulste elektrische Felder an.
- Entfernen Sie die Elektroden und reinigen Sie die Elektroden vorsichtig mit einem wassergetränkten, sterilen Wattestäbchen, um die Ansammlung von Albumin zu vermeiden.
- Versiegeln Sie das Fenster mit Tesafilm und inkubieren Sie den Embryo bis zum gewünschten Entwicklungsstadium.
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Representative Results
Aufbau von Tol2-Transposon-Konstrukten zur Expression künstlicher miRNAs gegen Nel
Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; auch bekannt als Nell2) ist ein extrazelluläres Glykoprotein. Es weist strukturelle Ähnlichkeiten mit Thrombospondin-1 auf und wird überwiegend im Nervensystem exprimiert20,21. Wir haben bereits gezeigt, dass Nel die Differenzierung und das Überleben von retinalen Ganglienzellenreguliert 15 und als hemmender Leithinweis für retinale Axone fungiert22,23,24. In der sich entwickelnden Netzhaut der Küken wird die Nel-Expression im mutmaßlichen Pigmentepithel bei HH15 (Embryonaltag (E) 2,5) nachgewiesen. Bei HH20 (E3.5) wird die Nel-Expression auch in neu differenzierten retinalen Ganglienzellen beobachtet. Die starke Expression von Nel im Pigmentepithel und in retinalen Ganglienzellen hält mindestens bis E18an 15.
Um die Funktion von Nel bei der Entwicklung von retinalen Ganglienzellen zu untersuchen, wurde die Expression des Nel-Gens durch Einbringen künstlicher miRNAs in die sich entwickelnde Netzhaut unter Verwendung von In-ovo-Elektroporation und dem Tol2-Transposon-System unterdrückt15,16. Zunächst wurden Paare von einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden für 10 potenzielle Zielsequenzen in der proteinkodierenden Region der Hühner-Nel-cDNA (GenBank-Zugangsnummer: NM_001030740.1) unter Verwendung des Online-RNAi-Design-Tools (siehe Materialtabelle) entworfen. Die Oligonukleotidpaare wurden geannealisiert und einzeln in den miRNA-Expressionsvektor kloniert. Anschließend wurden einzelne Konstrukte in HEK293T Zellen transfiziert, die stabil Nel-AP exprimieren, und ihre Knockdown-Effizienz wurde durch Messung der AP-Aktivität in den Nährmedien bewertet. Als Kontrolle wurde das pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative Kontrollplasmid verwendet (Abbildung 4A).
Es wurden drei Nel-prä-miRNA-Sequenzen ausgewählt, die die höchsten Knock-Down-Effekte zeigten (gegen die Nukleotide 482-502, 910-930 bzw. 2461-2481 der Hühner-Nel-cDNA), und zwei prä-miRNA-Sequenzen wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers tandemweise in den miRNA-Expressionsvektor (pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x Nel prä-miRNA) kloniert17. Die Expressionskassetten, die für die beiden prä-miRNA und EmGFP kodieren, wurden mittels PCR mit einer künstlichen EcoRI-Stelle an beiden Enden (5′-GGGAATTCTCTGGCTAACTAGAGAAC-3′ und 5′-CCGAATTCCCTCTAGATCAACCACT-3′) amplifiziert und in den pT2K-CAGGS-Vektor (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA) kloniert. Die Sequenz der Expressionskassette wurde unter Verwendung der für die PCR verwendeten Primer bestätigt. pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel-prä-miRNA-Konstrukte wurden einzeln mit dem Tol2-Transposase-Expressionsvektor (pCAGGS-T2TP) in HEK293T Zellen transfiziert, die Nel-AP stabil exprimieren, und die inhibitorischen Effekte auf die Nel-AP-Expression wurden durch Messung der AP-Aktivitäten in den Nährmedien untersucht. Wie in Abbildung 4B gezeigt, wurde die Knockdown-Effizienz durch die Verkettung von zwei miRNA-Sequenzen signifikant erhöht. Eine robuste Unterdrückung der Nel-AP-Expression (mehr als 90%) wurde mindestens bis 13 Tage nach der Transfektion beobachtet (Abbildung 4B).
Stabile Unterdrückung der Nel-Expression in der sich entwickelnden Netzhaut von Küken
Ein pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel prä-miRNA-Konstrukt (mit Zielsequenzen für die Nukleotide 482-502 und 2461-2481 der Hühner-Nel-cDNA) wurde mit dem Transposase-Expressionsvektor (pCAGGS-T2TP) durch In-ovo-Elektroporation bei HH9-11 in die temporale oder nasale Seite der Kükennetzhaut transfiziert (Abbildung 3, Abbildung 5A). Die Schnitte wurden aus E4.5- oder E8-Netzhäuten hergestellt, und die Auswirkungen auf die Nel-Expression wurden immunhistochemisch unter Verwendung von Anti-Nel-Antikörpern22 untersucht. Bei E4.5 war die Expression von Nel im retinalen Pigmentepithel in EmGFP-exprimierenden Zellen signifikant reduziert (Abbildung 5B-D). Bei E8 wurde auch in retinalen Ganglienzellen eine Abnahme der Nel-Expression deutlich beobachtet (Abbildung 5E-I). Die signifikante Unterdrückung der Nel-Expression hielt mindestens bis E18 an (Daten nicht gezeigt). Die Einführung von Kontroll-miRNA hatte keinen Einfluss auf die Nel-Expression in der Netzhaut (Abbildung 5J-O).
Abbildung 1: Transposition von Tol2-flankierten cDNAs durch Transposase. Eine schematische Darstellung der Transposition einer Tol2-flankierten Expressionskassette für EmGFP und der Verkettung von zwei prä-miRNA-Sequenzen (2x prä-miRNA) durch Transposase. Wenn ein Tol2-Transposon-Vektor, der die Expressionskassette (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA-Konstrukt) enthält, in Zellen mit einem Tol2-Transposase-Expressionskonstrukt (pCAGGS-T2TP) eingeführt wird, wird die Tol2-flankierte Expressionskassette aus dem Vektor herausgeschnitten und durch die Transposaseaktivität in das Wirtsgenom integriert. Die Expression von EmGFP und miRNAs wird durch den ubiquitären Promotor CAGGS gesteuert. Diese Zahl wurde von Nakamoto et al.15 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Struktur der modifizierten prä-miRNA . (A) Die entworfene prä-miRNA-Sequenz basiert auf der murinen miR-155-Sequenz17. Das obere Strangoligo enthält (vom 5'-Ende bis zum 3'-Ende) einen Vier-Nukleotid-Überhang (TGCT (blau)), eine Antisense-Zielsequenz (21 Nukleotide), eine terminale Schleifensequenz (rot) und eine Sense-Zielsequenz (19 Nukleotide). Die Antisense-Zielsequenz stellt die reife miRNA-Sequenz dar. Das untere Strangoligo enthält einen 5'-Überhang mit vier Nukleotiden (CCTG (blau)) und die umgekehrte Komplementsequenz des oberen Strangoligos, aber es fehlt der Vier-Nukleotid-Überhang am 3'-Ende (AGCA-3': umgekehrtes Komplement der 5'-TGCT des Oberstrangoligos). Der Sense-Zielsequenz fehlen die Nukleotide 9 und 10 der Zielsequenz. Die "zusätzlichen" zwei Nukleotide in der Antisense-Zielsequenz bilden eine interne Schleife in der Stammschleifenstruktur des reifen miRNA-Moleküls, was zu einer höheren Knockdown-Rate führt17. (B) Ein Beispiel für eine Zielsequenz gegen Huhn Nel. Gezeigt werden Sense- und Antisense-Sequenzen im oberen und unteren Strang für eine Zielsequenz des Hühner-Nel-Gens (GenBank-Zugangsnummer NM_001030740.1, Nukleotide 482-502). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: In-ovo-Mikroinjektion und Elektroporation. (A) Arbeitsplatz für In-ovo-Mikroinjektion und Elektroporation. (1) Sezierendes Mikroskop. (2) Injektionsgeräte. (3) Elektroporationsapparate. (4) Doppelter Schwanenhals-Mikroskop-Illuminator. (5) Elektroporator. (B) Injektionsgeräte. Eine Hamilton-Spritze (6) mit einer 18-G-Nadel (7) wird mit einem PVC-Schlauch (8) und einer gezogenen Mikropipettennadel (9) verbunden und auf einen Mikromanipulator (10) gesetzt. Der Innenraum des Apparates ist mit schwerem Mineralöl gefüllt. (C) Elektroporationsapparate. Ein Satz von Platinelektroden (11) mit einem Elektrodenhalter (12) wird auf einen Mikromanipulator (13) aufgesetzt. Die Elektroden sind mit Kabeln (14) mit dem Elektroporator verbunden. (D) Mikroinjektion einer DNA-Cocktaillösung in das optische Vesikel bei HH 10-11. Die gezogene Mikropipettennadel wird von ihrer proximalen Seite in das optische Vesikel eingeführt. DNA-Cocktaillösung mit schnellem Grün (blau) wird in das optische Vesikel injiziert, bis der Farbstoff das gesamte Lumen ausfüllt. (E) Elektroporation in das optische Vesikel. Die Elektroden werden parallel platziert (der Abstand zwischen den Elektroden beträgt 2 mm) und so, dass sich das injizierte optische Vesikel zwischen den Elektroden befindet: Eine Elektrode befindet sich in der Nähe der vorderen (nasalen) Oberfläche des Sehvesikels, die andere befindet sich im hinteren Teil des Embryos auf Höhe des Hinterhirns. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: In-vitro-Evaluierung einzelner oder verketteter prä-miRNA-Sequenzen auf die Effizienz der Nel-Gensuppression. (A) Knockdown-Effekte einzelner prä-miRNA-Sequenzen. Die Ergebnisse von fünf repräsentativen Konstrukten (Antisense-Zielsequenzen, die den Nukleotidnummern 482-502, 910-930, 1106-1126, 1663-1683 und 2461-2481 der Hühner-Nel-cDNA entsprechen (GenBank-Zugangsnummer: NM_001030740.1)) werden gezeigt. Einzelne miRNA-Expressionskonstrukte (pcDNA6.2-GW/EmGFP-Nel prä-miRNA) wurden in HEK293T Zellen transfiziert, die stabil Nel-AP exprimieren. Als Kontrolle wurde das pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative Kontrollplasmid verwendet. Die Expression von Nel-AP wurde durch Messung der AP-Aktivitäten in den Nährmedien 48-96 h nach der Transfektion bewertet. Drei Nel-prä-miRNA-Expressionskonstrukte (gegen die Nukleotide 482-502, 910-930 bzw. 2461-2481) zeigten eine signifikante Unterdrückung der Nel-Expression. (B) Knockdown-Effekte von verketteten prä-miRNA-Sequenzen. Zwei der drei potentesten prä-miRNA-Sequenzen (gegen die Nukleotide 482-502, 910-930 und 2461-2481) wurden tandemweise in den pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Vektor kloniert, und die Expressionskassette (mit den beiden prä-miRNA-Sequenzen und EmGFP cDNA) wurde auf den pT2K-CAGGS-Vektor (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA) übertragen. Die pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel prä-miRNA-Konstrukte wurden einzeln mit Expressionsvektoren für Tol2-Transposase (pCAGGS-T2TP) in HEK293T Zellen co-transfiziert, die stabil Nel-AP exprimieren, und die Expression von Nel-AP wurde durch Messung der AP-Aktivitäten in den Nährmedien von 2 bis 13 Tagen nach der Transfektion bewertet. Alle drei Kombinationen (482-502/910-930, 482-502/2461-2481, 910-930/2461-2481) zeigten im Vergleich zu unverketteten einzelnen prä-miRNA-Sequenzen eine erhöhte Suppressionsaktivität. Eine signifikante Unterdrückung der Nel-AP-Expression wurde von Tag 2 bis mindestens Tag 13 beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Stabiler Knockdown der Nel-Expression in der sich entwickelnden Küken-Retina durch Tol2-Transposon-vermittelte Integration des miRNA-Transgens. Ein Tol2-Transposon-Konstrukt, das eine Expressionskassette mit zwei Nel-prä-miRNA-Sequenzen und EmGFP (pT2K-CAGGS-EmGFP-Nel prä-miRNA (482-502)-Nel prä-miRNA (2461-2481)) (A-I) enthält, oder ein Kontrollkonstrukt, das eine nicht verwandte miRNA und EmGFP (J-O) exprimiert, wurde mit einem Transposase-Expressionsvektor (pCAGGS-T2TP) in die temporale oder nasale Hälfte des optischen Vesikels co-transfiziert Elektroporation bei HH9-HH11 (E1.5). Netzhautschnitte wurden bei E4,5 (B-D, J-L) oder E8 (E-I, M-O) hergestellt und die Wirksamkeit der Nel-Gensuppression mittels Immunhistochemie mit Anti-Nel-Antikörpern (rot) untersucht. Da die DNA negativ geladen ist, werden die Transgene auf der Anodenseite in das Gewebe elektroporiert; so war nur die Hälfte der Netzhaut mit EmGFP markiert (Transfektion (TF)-Seite, grün). (A) Expression des EmGFP-Markergens in der temporalen Hälfte der Netzhaut bei E4.5. Die optische Fissur (weißer Pfeil) stellt die Grenze zwischen transfizierten und nicht transfizierten (Kontroll-)Seiten dar. (B-I) RNAi-Knockdown der Nel-Expression in der sich entwickelnden Kükennetzhaut. (B-D) Bei E4.5 ist die Nel-Expression in retinalen Pigmentepithelzellen (PE), die EmGFP (C,D) exprimieren, signifikant reduziert (B,D). Man beachte das komplementäre Muster der Nel-Immunfärbung und der EmGFP-Expression in D. NR, neuronale Netzhaut. (E-I) Bei E8 ist die Nel-Expression (E,G) im retinalen Pigmentepithel und in der Ganglienzellschicht (GCL) auf der Transfektionsseite (F,G) vermindert. (H, I) Höhere Vergrößerung eines Transfektionsbereichs bzw. eines entsprechenden Kontrollbereichs in E (gekennzeichnet durch kleine Rechtecke). (D,G) Die Bilder der beiden linken Bilder wurden zusammengeführt. (J-O) Expression der Kontroll-miRNA. Die Einführung des Negativkontrollkonstrukts hat keinen Einfluss auf die Expression von Nel in der Netzhaut E4.5 (J-L) oder E8 (M-O). (L,O) Die Bilder der beiden linken Bilder wurden zusammengeführt. Die Grenze zwischen Transfektions- und Kontrollseite ist durch eine gestrichelte Linie in C, F, K und N gekennzeichnet. Maßstabsbalken, 50 μm. (A) und (B-I) wurden von Nakamoto, M. & Nakamoto, C 16 bzw. Nakamoto etal.15 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Aufbau der Glühreaktion | |
| Oberstrang-Oligo (200 μM im TE-Puffer) | 5 μl (Endkonzentration 50 μM) |
| Unterstrang-Oligo (200 μM im TE-Puffer) | 5 μl (Endkonzentration 50 μM) |
| 10x Oligo-Glühpuffer* | 2 μl |
| DNase/RNase-freies Wasser* | 8 μl |
| Gesamt | 20 μl |
| * Wird im miRNA-Expressionskit enthalten (siehe Materialtabelle) | |
Tabelle 1: Aufbau der Glühreaktion
| 2x AP-Substratpuffer | |
| 10 M Diethanolamin (pH 9,8) | 4 ml |
| 1 M MgCl2 | 10 μl |
| L-Homoarginin | 45 mg |
| Rinderserumalbumin (BSA) | 10 mg |
| p-Nitrophenylphosphat | 63 mg |
| H2O | Zu einem Gesamtvolumen von 20 ml hinzufügen |
Tabelle 2: 2x AP-Substratpuffer. Die Lösung sollte in Aliquoten bei -20 °C gelagert und vor Licht geschützt werden, da p-Nitrophenylphosphat lichtempfindlich ist.
| Reaktions-Setup | |||
| pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x prä-miRNA-Plasmid (aus Abschnitt 1.5) oder pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatives Kontrollplasmid* (0,1 μg/μl) |
1 μl | ||
| 10x Pfu-Puffer | 5 μl | ||
| dNTP-Mix (je 10 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP) | 1 μl | ||
| EmGFP-Forward-Primer* (5'-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3'; 10 μM) | 1 μl | ||
| miRNA-Reverse-Primer* (5'- CTCTAGATCAACCACTTTGT-3'; 10 μM) | 1 μl | ||
| Pfu-DNA-Polymerase (5 Einheiten/μl) | 0,5 μl | ||
| H2O | 40,5 μl | ||
| Gesamtvolumen | 50 μl | ||
| * Wird im miRNA-Expressionskit bereitgestellt. | |||
| Thermocycling-Bedingungen | |||
| 94 °C | 5 Minuten | ||
| 30 Zyklen der folgenden: | |||
| 94 °C | 45 Sek. | ||
| 58 °C | 1 min | ||
| 72 °C | 2 Minuten | ||
| 72 °C | 10 min | ||
Tabelle 3: Reaktionsaufbau und Thermocycling-Bedingungen.
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Discussion
Dieses Protokoll bietet einen detaillierten Leitfaden für das Gen-Silencing in der sich entwickelnden Netzhaut von Küken durch transgene Expression künstlicher miRNAs unter Verwendung der In-Ovo-Elektroporation und des Tol2-Transposon-Systems.
Die folgenden Faktoren sind für die erfolgreiche Durchführung dieser Technik von entscheidender Bedeutung. Erstens ist es wichtig, miRNA-Sequenzen zu verwenden, von denen bestätigt wurde, dass sie robuste Knockdown-Effekte ausüben. Bevor Sie sie für die In-ovo-Elektroporation anwenden, testen Sie einzelne prä-miRNA-Sequenzen in In-vitro-Assays auf ihre Gensuppressionseffizienz (Schritt 1.4) und verketten Sie zwei prä-miRNA-Sequenzen, die die höchsten Knockdown-Aktivitäten aufweisen (Schritt 1.5). Zweitens ist es wichtig, das Sehvesikel und das umgebende Nervengewebe nicht zu beschädigen, wenn die Mikropipettennadel zur Injektion der DNA-Lösung eingeführt wird. Eine übermäßige Schädigung der Embryonen kann zu embryonalen Missbildungen und zum Tod führen. Um Gewebeschäden zu vermeiden, führen Sie die Mikropipette in der richtigen Ausrichtung in das Sehvesikel ein. Kleinere und schärfere Spitzen der Mikropipettennadel würden das Eindringen in das Sehvesikel sanfter machen und zu weniger Gewebeschäden führen. Nadeln mit sehr kleinen Spitzen haben jedoch Schwierigkeiten, die DNA-Lösung zu laden und freizugeben. In der hier beschriebenen Studie wurden Nadeln mit einer Spitzenöffnung von 10-20 μm Durchmesser verwendet. Drittens stellen Sie sicher, dass Sie das gesamte optische Vesikel mit der DNA-Lösung füllen (wie durch die Ausbreitung des schnellen Grüns visualisiert). Viertens platzieren Sie die Elektroden in den optimalen Positionen, um DNAs in den gewünschten Bereich des optischen Vesikels zu bringen (z. B. Schläfenseite, Nasenseite). Negativ geladene DNA-Moleküle bewegen sich zur Anodenseite; Daher wirkt sich die präzise Platzierung und Ausrichtung der Elektroden entscheidend auf das Endergebnis aus. Verwenden Sie schließlich die optimalen DNA-Konzentrationen und Elektroporationsparameter.
Wenn nach 24 Stunden Elektroporation kein Fluoreszenzsignal beobachtet wird, sollte Folgendes beachtet werden: (1) Vergewissern Sie sich, dass die elektroporierten Plasmide korrekte Sequenzen aufweisen. (2) Überprüfen Sie erneut die Konzentration und Reinheit der einzelnen Plasmide. (3) Stellen Sie sicher, dass die DNA-Lösung das Lumen des Sehvesikels ausfüllt und nicht in das Neuralrohr diffundiert. (4) Überprüfen Sie, ob die verwendeten Elektroporationsparameter korrekt sind. (5) Prüfen Sie, ob die Elektroden mit der Vitelline-Membran in Kontakt sind, während die elektrischen Impulse angelegt werden.
Die Kombination von In-ovo-Elektroporation und einer Transposon-vermittelten Genintegrationsmethode in diesem Protokoll bietet mehrere entscheidende Vorteile. Zum einen unterstützt es die stabile Produktion von miRNAs und damit die anhaltende Unterdrückung von Zielgenen. Die Entwicklung der Netzhaut des Kükens beginnt bei E1,5 und dauert bis zum Schlüpfen (retinale Ganglienzellen werden im Zeitraum von E2 bis E9 produziert). Für die Loss-of-Function-Analyse der Genfunktion sollte die Expression künstlicher miRNAs während dieses Zeitraums stabil aufrechterhalten werden. Die Expression von RNAi-Sequenzen mit konventionellen Expressionsvektoren ist im Allgemeinen vorübergehend, da das Expressionskonstrukt nicht effizient in die Chromosomen integriert werden kann. Bei dem hier beschriebenen Verfahren wird die chromosomale Integration der Expressionskassette jedoch durch die Aktivität der co-elektroporierten Transposase vermittelt, was zu einer stabilen Expression der Transgene führt.
Zweitens induziert derselbe CAGGS-Promotor bei dieser Methode die co-cistronische Expression mehrerer miRNA-Sequenzen und des EmGFP-Markers in transfizierten Zellen, wodurch das Risiko einer Promotorinterferenz umgangen wird, was eine der häufigsten Komplikationen bei retroviralen Vektoren ist, die zwei Promotoren enthalten, um eine duale Genexpression zu erreichen25.
Schließlich wird das Transgen, das bei dieser Methode elektroporiert wird, im Gegensatz zu replikationskompetenten retroviralen Vektoren nicht auf benachbarte Zellen übertragen. Daher kann der Bereich der Transfektion genauer gesteuert werden, indem die entsprechenden Elektrodentypen verwendet und in den richtigen Positionen platziert werden.
Trotz der oben beschriebenen Vorteile weist die derzeitige Methode auch Einschränkungen auf, die der In-Ovo-Elektroporation inhärent sind. Zum Beispiel können die Transfektions- und Gensuppressionsraten zwischen den Embryonen variieren, und eine relativ große Anzahl von Embryonen muss für die Analyse transfiziert werden. Darüber hinaus ist die Elektroporation in die embryonale Netzhaut in ovo in späteren Entwicklungsstadien (z. B. E4-E5) experimentell schwierig, da sich die Augen in diesen Stadien in unmittelbarer Nähe des Herzens befinden, was das Risiko eines Herzstillstands nach der Elektroporation erhöht.
Das hier beschriebene System ermöglicht eine schnelle und robuste Genunterdrückung in der sich entwickelnden Netzhaut der Küken. Dieser Ansatz kann auch auf andere Teile des Kükenembryos angewendet werden, einschließlich des neuronalen und nicht-neuronalen Gewebes. Wir erwarten daher, dass dieses System zur Aufklärung der molekularen Mechanismen der Kükenentwicklung beitragen kann.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die pT2K-CAGGS- und pCAGGS-T2TP-Vektoren wurden freundlicherweise von Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Kyoto, Japan) bzw. Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Mishima, Japan) zur Verfügung gestellt. Wir danken Michael Berberoglu für die entscheidende Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Royal Society und des Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (UK) an M.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
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