Summary
In dit werk beschrijven we de protocollen die worden gebruikt in op replicon gebaseerde en virale enzymgebaseerde testen om te screenen op remmers van Zika-virusreplicatie in een screeningsformaat met hoge doorvoer.
Abstract
De ontdekking van antivirale geneesmiddelen vereist de ontwikkeling van betrouwbare biochemische en cellulaire assays die kunnen worden uitgevoerd in hts-formaten (high-throughput screening). Van de flavivirus niet-structurele (NS) eiwitten wordt gedacht dat ze co-translationeel assembleren op de endoplasmatische reticulum (ER) membranen, waardoor het replicatiecomplex (RC) wordt gevormd. De NS3 en NS5 zijn de meest bestudeerde enzymen van de RC en vormen de belangrijkste doelen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen vanwege hun cruciale rol in virale genoomreplicatie. NS3-proteasedomein, dat NS2B als cofactor vereist, is verantwoordelijk voor de splitsing van het onrijpe virale polyproteïne in de volwassen NS-eiwitten, terwijl het NS5 RdRp-domein verantwoordelijk is voor de RNA-replicatie. Hierin beschrijven we in detail de protocollen die worden gebruikt in replicon-gebaseerde screenings en enzymatische assays om grote samengestelde bibliotheken te testen op remmers van de replicatie van het Zika-virus (ZIKV). Replicons zijn zelfreplicerende subgenomische systemen die tot expressie komen in zoogdiercellen, waarbij de virale structurele genen worden vervangen door een reporter-gen. De remmende effecten van verbindingen op virale RNA-replicatie kunnen eenvoudig worden geëvalueerd door de vermindering van de reporter-eiwitactiviteit te meten. De op replicon gebaseerde screenings werden uitgevoerd met behulp van een BHK-21 ZIKV replicon cellijn die Renilla luciferase tot expressie bracht als een reporter-gen. Om de specifieke doelen van geïdentificeerde verbindingen te karakteriseren, hebben we in-vitro fluorescentie-gebaseerde assays vastgesteld voor recombinant tot expressie gebracht NS3-protease en NS5 RdRp. De proteolytische activiteit van het virale protease werd gemeten met behulp van het fluorogene peptidesubstraat Bz-nKRR-AMC, terwijl de NS5 RdRp-rekactiviteit direct werd gedetecteerd door de toename van het fluorescerende signaal van SYBR Green I tijdens RNA-rek, met behulp van de synthetische gebiotinyleerde zelfaanzuigende sjabloon 3′UTR-U30 (5'-biotine-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3').
Introduction
Het Zika-virus (ZIKV) is een opkomend door geleedpotigen overgedragen viruslid van het geslacht Flavivirus, dat het nauw verwante Dengue-virus (DENV), Japanse encefalitisvirus (JEV) en Gele Koortsvirus (YFV) omvat, die constante bedreigingen vormen voor de volksgezondheid1. De ZIKV-uitbraak van 2015-16 in Noord- en Zuid-Amerika kreeg wereldwijde aandacht na de opkomst ervan in Brazilië vanwege de associatie met ernstige neurologische aandoeningen, zoals congenitale ZIKV-geassocieerde microcefalie bij pasgeborenen2,3 en Guillain-Barré-syndroom bij volwassenen4. Hoewel het aantal gevallen van infectie in de komende twee jaar afnam, werden autochtone door muggen overgedragen transmissies van ZIKV in 2019 geverifieerd in 87 landen en gebieden, wat het potentieel van het virus waaruit het potentieel blijkt om opnieuw op te duiken als een epidemie5. Tot op heden zijn er geen goedgekeurde vaccins of effectieve geneesmiddelen tegen ZIKV-infectie.
De ontdekking van antivirale geneesmiddelen vereist de ontwikkeling van betrouwbare cellulaire en biochemische testen die kunnen worden uitgevoerd in hts-formaten (high-throughput screening). Replicon-gebaseerde screenings en virale enzymgebaseerde assays zijn twee waardevolle strategieën om verbindingen met kleine moleculen te testen op remmers van ZIKV1. Van de flavivirus niet-structurele (NS) eiwitten wordt gedacht dat ze co-translationeel assembleren op de endoplasmatische reticulum (ER) membranen, het vormen van het replicatiecomplex (RC)6. De NS3 en NS5 zijn de meest bestudeerde enzymen van de RC en vormen de belangrijkste doelen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen vanwege hun cruciale rol in virale genoomreplicatie. NS3-proteasedomein, dat NS2B als cofactor vereist, is verantwoordelijk voor de splitsing van het onrijpe virale polyproteïne in de volwassen NS-eiwitten, terwijl het NS5 RdRp-domein verantwoordelijk is voor de RNA-replicatie6.
Replicons zijn zelfreplicerende subgenomische systemen die tot expressie komen in zoogdiercellen, waarbij de virale structurele genen worden vervangen door een reporter-gen. De remmende effecten van verbindingen op virale RNA-replicatie kunnen eenvoudig worden geëvalueerd door de vermindering van de reporter-eiwitactiviteit te meten7. Hierin beschrijven we de protocollen die worden gebruikt voor het screenen van remmers van de ZIKV-replicatie in een 96-well plaatformaat. De replicon-gebaseerde assays werden uitgevoerd met behulp van een BHK-21 ZIKV Rluc replicon cellijn die we onlangs hebben ontwikkeld8. Om de specifieke doelen van geïdentificeerde verbindingen te karakteriseren, hebben we in vitro fluorescentie-gebaseerde assays vastgesteld voor recombinant tot expressie gebracht NS3-protease met behulp van het fluorogene peptidesubstraat, Bz-nKRR-AMC, terwijl we voor NS5 RdRp de verlenging van de synthetische gebiotinyleerde zelfaanzuigende sjabloon 3′UTR-U30 (5'-biotine-U30-ACUGGAGAUCUCGAUCUCCAGU-3) hebben gemeten, met behulp van de intercalerende kleurstof SYBR Green I.
Het ZIKV-protease (45-96 residuen van NS2B-cofactor gekoppeld aan residuen 1-177 van NS3-proteasedomein door een glycinerijke linker [G4SG4]) werd verkregen, zoals beschreven voor YFV9, terwijl het polymerase (276-898 residuen van RdRp-domein) werd gekloond en uitgedrukt, zoals beschreven in10. Beide enzymsequenties zijn afgeleid van GenBank ALU33341.1. Als primaire antivirale screenings worden verbindingen getest op 10 μM en die met activiteiten ≥ 80% worden vervolgens op een dosisafhankelijke manier geëvalueerd, wat resulteert in de effectieve / remming (EC50 of IC50) en de cytotoxische (CC50) concentraties. In de context van representatieve resultaten worden de EC50- en CC50-waarden van NITD008, een bekende flavivirusremmer11, van op replicon gebaseerde screenings getoond. Voor de enzymatische assays worden de IC50-waarden van twee verbindingen uit de MMV/DNDi Pandemic Response Box getoond, een bibliotheek bestaande uit 400 moleculen met antibacteriële, schimmelwerende en antivirale activiteiten. De protocollen die in dit werk worden beschreven, kunnen worden aangepast om te screenen op remmers van andere gerelateerde flavivirussen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Luciferase activiteitstest
OPMERKING: Zorg ervoor dat alle procedures met betrekking tot celkweek worden uitgevoerd in gecertificeerde bioveiligheidskappen (zie Tabel met materialen).
- Bereid groeimedia bestaande uit Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS en 500 μg/ml G418.
- Bereid een 10 mM stockoplossing van geteste verbindingen in 100% DMSO en verdun ze vervolgens tot 1 mM in 100% DMSO.
- Kweek ZIKV Rluc repliconcellen in groeimedia in een 75 cm2 kweekkolf bij 37 °C in een CO2-bevochtigde incubator (zie Materialentabel) totdat ze 70-90% confluentie bereiken.
- Gooi het medium weg. Voeg gedurende 5 tot 10 minuten 5 tot 10 ml trypsine-EDTA toe aan de kolf en centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 125 x g.
- Gooi het supernatant weg, resuspend de cellen in 5 ml DMEM 10% FBS en tel 10 μL geresuspendeerde cellen op een hemocytometer.
- Pas de cellen aan op 2 x 104 cellen/put in DMEM 10% FBS en zaad 100 μL cellen per put in een 96-well celkweekplaat (zie Materialen tabel).
- Incubeer de plaat gedurende 16 uur bij 37 °C in een CO2-bevochtigde incubator (zie Tabel met materialen).
- Gooi vervolgens het medium weg met een meerkanaals micropipette en voeg 100 μL/put DMEM 2% FBS toe aan de plaat.
- Voeg 1 μL van de verbindingen per put toe om te resulteren in een eindconcentratie van 10 μM 1% DMSO in het testmedium. Voeg in de eerste kolom slechts 1% DMSO toe als een controle zonder remming en NITD008 in de laatste kolom, als een positieve controle (100% remming).
- Incubeer de plaat gedurende 48 uur bij 37 °C in een CO2-bevochtigde incubator (zie Tabel met materialen).
- Ontdooi de Renilla luciferase Assay System kit bij kamertemperatuur, bereid een 1x Renilla luciferase Lysis Buffer werkoplossing en een geschikt volume Renilla Luciferase reagens (Assay buffer + substraat; 100 μL per putje), volgens de instructies van de fabrikant.
- Gooi het supernatant uit de cellen met een meerkanaals micropipette en voeg 25 μL 1x Renilla luciferase Lysis Buffer per put toe.
- Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en breng vervolgens 20 μL cellysaten over met een meerkanaals micropipette naar een witte ondoorzichtige 96-well plaat (zie Tabel met materialen) met 100 μL /put renilla luciferase assay reagens.
- Lees de luminescerende signalen af in een luminometer of in apparatuur die de mogelijkheid heeft om luminescentie af te lezen (zie Tabel met materialen).
- Bereken voor elke plaat de Z-factorwaarde 12, als volgt: Z′ = 1 - ((3SD van monster + 3SD van controle)/│Gemiddelde van monster - Gemiddelde van controle│); SD - standaarddeviatie. Een Z-factor tussen 0,5 en 1,0 betekent een goede kwaliteitstest 12.
- Om de EC50-waarden van verbindingen te bepalen, gaat u verder zoals beschreven in stappen 1.3 tot 1.8 en voegt u vervolgens de verbindingen toe die serieel verdund zijn aan de cellen , samen met de negatieve (1% DMSO) en positieve (NITD008 bij 10 μM) controles. Voer de test twee keer in duplicaten uit.
- Plot de gemiddelde waarden van remmingssnelheden per samengestelde concentratie en gebruik een grafiekanalysesoftware om een sigmoïdale aanpassing uit te voeren en de EC50-waarden te verkrijgen.
2. Op celproliferatie gebaseerde MTT-assay
- Ga verder zoals beschreven in punt 1 stap 1.1 tot en met 1.8.
- Voeg de verbindingen in eerste instantie toe bij 10 μM en de controle 1% DMSO aan de cellen.
- Bereid een 5 mg/ml MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide) oplossing in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4; pH 7,4) en vortex tot volledige oplosbaarheid van MTT.
- Voeg de MTT-oplossing toe aan de cellen op een tiende van het putvolume (10 μL/put).
- Incubeer de plaat bij 37 °C in een CO2-bevochtigde incubator (zie Materialentabel) gedurende 3-4 uur.
- Gooi het supernatant weg met een meerkanaals micropipette en voeg 100 μL DMSO (100%) toe aan elke put.
- Verdoef de formazankristallen door op en neer te pipetteren en lees vervolgens de absorptie bij 570 nm af in een spectrofotometer (zie Materiaaltabel).
- Om de CC50-waarden van verbindingen te bepalen, gaat u verder zoals beschreven in punt 1 stap 1.1 tot en met 1.8 en voegt u vervolgens de verbindingen die serieel verdund zijn toe aan de cellen, samen met de negatieve (1% DMSO) controle. Voer de test twee keer in duplicaten uit.
- Plot de gemiddelde waarden van remmingssnelheden per samengestelde concentratie en gebruik een grafiekanalysesoftware om een sigmoïdale aanpassing uit te voeren en de CC50-waarden te verkrijgen.
3. NS2B-NS3 protease activiteit assay
- Ontdooi een eiwit aliquot op ijs.
- Stel de temperatuur van de plaatlezer (zie Materiaaltabel) inop 37°C.
- Bereid de juiste hoeveelheid eiwit verdund tot 80 nM (5 μL /well). De uiteindelijke eiwitconcentratie is 4 nM.
- Ontdooi de juiste hoeveelheid Bz-nKRR-AMC-substraat op ijs (300 μM stamoplossing verdund in assaybuffer, 10 μL/put).
- In een 96-well witte plaat (zie Tabel van materialen), 84 μL assay buffer (20 mM Tris pH 8,5, 5% glycerol en 0,01% Triton X-100) in elke put.
- Om de positieve controlereactie te maken, wordt in elke put van de laatste kolom 1 μL Aprotinine geslagen om de uiteindelijke concentratie van 1 μM te bereiken (stamoplossing 100 μM verdund in water)
- Om de negatieve controlereactie te maken, wordt aan de eerste kolom 1 μL DMSO (eindconcentratie 1%) verstrekt.
- Om de samengestelde screening uit te voeren, dispense 1 μL van elke verbinding om de uiteindelijke concentratie van 10 μM (1 mM voorraadconcentratie) te bereiken, exclusief positieve en negatieve controleputten.
- Dispense 5 μL van de protease-oplossing.
- Incubeer de plaat bij 4 °C gedurende 30 minuten.
- Om de reactie te starten, dispense 10 μL Bz-nKRR-AMC stockoplossing (eindconcentratie van 30 μM).
- Stel de excitatiegolflengte in op 380 nm en de emissie op 460 nm en lees de fluorescentie gedurende 30 minuten elke 1 minuut in een microplaatlezer (zie Materialentabel). Voer het hele experiment uit bij 37 °C.
- Bereken de gemiddelde waarden van de fluorescentie voor positieve en negatieve controlereacties. Stel de gemiddelde waarde van fluorescentie voor negatieve controlereacties in op 100% van de proteaseactiviteit, afgetrokken van de gemiddelde waarde van positieve controle en bereken de percentages activiteit voor elke verbinding.
- Bereken voor elke plaat de Z-factorwaarde, zoals beschreven in stap 1.15.
- Ga verder met IC50-bepaling voor verbindingen die een remmingspercentage van meer dan 80% vertoonden.
- Voer de test uit in drievoud zoals beschreven in stappen 3.1-3.13, met behulp van een seriële verdunning van de verbinding.
- Plot de gemiddelde waarden van remmingssnelheden per samengestelde concentratie en gebruik een grafiekanalysesoftware om een sigmoïdale aanpassing uit te voeren en de IC50-waarden te verkrijgen.
4. NS5 RdRp-rektest
OPMERKING: Alle materialen die in deze test worden gebruikt, zijn RNase-, DNase- en pyrogenasevrij gecertificeerd.
- Bereid zowel de testbuffer (50 mM Tris pH 7,0, 2,5 mM MnCl2,0,01% Triton X-100) als de 200 mM ATP-stamoplossing voor met 0,1% diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water.
- Gloei een aliquot van 5 μL van 200 μM 3′UTR-U30 (5'-biotine-U30-ACUGGAGAAGAUCGAUCUCCAGU-3') in pcr-behandeld water door het gedurende 5 minuten bij 55 °C in een thermocycler te incuberen.
- Ontdooi de voorraadoplossing van NS5 RdRp, 200 mM ATP en x10.000 SYBR Green I op ijs.
- Verdun het eiwit tot een eindconcentratie van 250 nM in 3 ml testbuffer.
- Bereid de substraatoplossing door de stamoplossingen van de ATP, 3'UTR-U30 en SYBR Green I in 3 ml testbuffer te verdunn tot een eindconcentratie van respectievelijk 1 mM, 300 nM en 1X.
- Voeg in een 96-well PCR-plaat (zie Tabel met materialen) 24,5 μL verdund eiwit toe in de kolommen 1 tot en met 11 van elke rij. Voeg hetzelfde volume testbuffer toe aan de resterende putten.
- Voeg voor controle en blancoreactie 0,5 μL DMSO toe in de kolommen 1 en 12. Voeg 0,5 μL verbinding verdund in DMSO toe aan een eindconcentratie van 10 μM 1mM stamoplossing).
- Sluit de plaat af met een afdichtingsfolie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Start de reactie door 25 μL substraatoplossing toe te voegen en de plaat opnieuw af te sluiten.
- Incubeer bij 30 °C in een real-time PCR-systeem (zie Materialentabel) en monitor de fluorescentie gedurende 1 uur, waarbij de fluorescentie om de 30 s wordt gemeten met het FAM-filter (Emissie:494 nm/Excitatie:521 nm).
- Bereken voor elke plaat de Z-factorwaarde, zoals beschreven in stap 1.15.
- Ga verder met IC50-bepaling voor verbindingen die een remmingspercentage van meer dan 80% vertoonden, zoals beschreven in stap 3.15.
- Plot de gemiddelde waarden van remmingssnelheden per samengestelde concentratie en gebruik een grafiekanalysesoftware om een sigmoïdale aanpassing uit te voeren en de IC50-waarden te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle hierin beschreven protocollen zijn gestabileerd in 96-well platen en maken de evaluatie van 80 verbindingen per plaat mogelijk in een primaire screening van een enkele concentratie, inclusief de negatieve en positieve controles die respectievelijk in de eerste en laatste kolom van de platen zijn geplaatst. De op replicon gebaseerde screenings zijn weergegeven in figuur 1,waaronder het RNA-construct dat is ontwikkeld om de BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo-cellijn te verkrijgen (figuur 1A), de schematische representatie van de assays (figuur 1B) en de dosis-responscurven van NITD008 (EC50 van 0,28 μM, CC50 > 10 μM) (figuur 1C). De EC50- en CC50-waarden van hitverbindingen worden bepaald als de concentraties die nodig zijn om respectievelijk 50% van de Rluc-activiteit te remmen en 50% cytotoxiciteit te veroorzaken. Met betrekking tot de luciferase-assay wordt DMSO 1% gebruikt als een controle zonder remmers (0% remming) en NITD008 wordt gebruikt als een positieve controle (100% remming), zoals eerder beschreven8.
De NS2B-NS3 protease activiteit wordt gemeten door fluorescentie monitoring van AMC vrijgegeven als gevolg van de proteolytische activiteit van het protease (Figuur 2A). Aprotinine, een eiwit dat fungeert als trypsineremmer en al wordt beschreven als een remmer van flavivirusproteasen13,14,15, werd in deze test gebruikt als een experimentele positieve controle (IC50 van 0,13 ± 0,02 μM, gegevens niet getoond). Figuur 2B illustreert een dosis-respons remmingscurve van een molecuul gericht op de protease-activiteit, de verbinding MMV1634402 (IC50 van 0,36 ± 0,08 μM). De rekactiviteit van NS5 RdRp wordt in realtime gemeten door de toename van de fluorescentie-intensiteit van SYBR Green I wanneer geïntercaleerd met het gesynthetiseerde dsRNA (Figuur 2C). De dosis-respons remmingscurve van een hitmolecuul gericht op ZIKV RdRp, de verbinding MMV1782220 (IC50 van 1,9 ± 0,8 μM), wordt getoond in figuur 2D. Aangezien nucleoside analoge remmers, zoals NITD008, niet geschikt zijn voor enzymatische assays, omdat fosfaten intracellulair moeten worden opgenomen in het molecuul16,hebben we geen positieve controle gebruikt voor NS5 RdRp-rektest. Clofazimine, een commercieel antibioticum, dat we onlangs hebben geïdentificeerd als een remmer van viraal polymerase8,kan echter worden gebruikt als een experimentele controle in volgende testen.
Figuur 1: Screenings op basis van replicon. A) Schematische weergave van het ZIKV replicon construct met een Rluc sequentie op het 5' UTR eindpunt en een Neo gen op het 3' UTR eindpunt, dat we hebben ontwikkeld om de BHK-21-RepZIKV-IRES_Neo cellijn 8te verkrijgen. B) Schematische weergave van de luciferase-activiteitstest en op celproliferatie gebaseerde MTT-test uitgevoerd om te screenen op remmers van ZIKV-replicatie. C) De dosis-responscurven (EC50 en CC50) van NITD008. De test werd in duplicaten uitgevoerd. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Virale enzymgebaseerde assays. A) Schematische weergave van NS2B-NS3 protease activiteit assay. B) De dosis-respons remmingscurve (IC50) van verbinding MMV1634402. C) Schematische weergave van NS5 RdRp RNA polymerase activiteitstest. D) De dosis-respons remmingscurve (IC50) van verbinding MMV1782220. De testen werden uitgevoerd in drievoud. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierin beschreven protocollen kunnen gemakkelijk worden aangepast voor screenings in een 384- of 1536-well-formaat. Voor biochemische en/of celgebaseerde screenings die in HTS-formaat worden uitgevoerd, wordt voor elke plaat de Z'-factorwaarde, een statistische parameter, berekend om de gevoeligheid, reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van die testen te waarborgen12. Een Z'-factorwaarde van 0,5 of hoger wordt verwacht voor op replicon gebaseerde screenings, terwijl een waarde van 0,7 of hoger wordt verwacht voor de NS3- en NS5-activiteitstests. Voor het op replicon gebaseerde HTS hebben we de BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo-cellen ontwikkeld, een stabiele cellijn met een replicatief ZIKV-replicon met een Renilla luciferase (Rluc ) -sequentiein het 5 'UTR-gebied en een neomycinefosfotransferase (Neo) -gen aangedreven door een interne ribosomale entry site (IRES) bij de 3'UTR. We hebben 38 residuen van capsid en 30 residuen van envelopgenen behouden die nodig zijn voor de juiste initiatie van de RNA-translatie, om vergelijkbare replicatieniveaus en geneesmiddelgevoeligheid tussen celpassages te behouden8. Vanwege het gebrek aan structurele genen produceren replicons geen virionen van nakomelingen, waardoor het risico op laboratorium-verworven virale infectiewordt geëlimineerd 17.
De antivirale assays met behulp van de ZIKV replicon cellen bestaan uit de luciferase activiteit en de cel proliferatie-gebaseerde MTT (cytotoxiciteit) assays uitgevoerd parallel. Dit is nodig om vals-positieve treffers uit te sluiten, bestaande uit moleculen die direct interfereren met de expressie en/of activiteit van het reportereiwit en die welke de gezondheid van de cel nadelig beïnvloeden7. Replicon-systemen maken de ontdekking mogelijk van moleculen die RNA-replicatie remmen, maar niet die nodig zijn voor virale binnenkomst en virionassemblage / -afgifte. Als alternatief kunnen replicons worden verpakt om virusrelicondeeltjes (VRP's) te produceren door de structurele eiwitten in trans17te leveren. De resulterende single-round infectieuze deeltjes (MOP's) zijn infectieus, maar het nageslachtsvirus kan zich niet verspreiden omdat het pakketgenoom geen structurele genen heeft. Daarom kunnen VRP's worden gebruikt om te testen op remmers van virale entry / replicatie door de niveaus van het reporter-eiwit te meten7.
Naast de op replicon gebaseerde screenings, hebben we hierin ook de protocollen beschreven die worden gebruikt in virale enzymgebaseerde assays voor het recombinante NS3-protease en NS5 RdRp. De proteolytische activiteit van het virale protease werd gemeten met behulp van het fluorogene peptidesubstraat Bz-nKRR-AMC, dat de ZIKV-proteaseherkenning en splitsingssequentie bevat in combinatie met de fluorescerende tag 7-amine-4-methylcoumarine (AMC). Door de protease-activiteit komt de fluorescerende tag vrij en wordt de reactiesnelheid direct gemeten door de fluorescentie te monitoren in een spectrofotometer18,19. Deze test is zeer verstandig, relatief goedkoop, snel en geschikt voor screening van grote samengestelde bibliotheken20,21. Het grote nadeel is de mogelijke doofsing tussen geteste verbindingen en de fluorofoor die kan leiden tot vals-positieve treffers. Dit probleem kan echter worden verholpen door een extra fluorescentiemeting in aanwezigheid van AMC. Ook verbindingen die emissie of absorptie in dezelfde golflengte van de fluorofoor vertonen, kunnen niet worden geëvalueerd met deze methode18,20.
Met betrekking tot de NS5 RdRp wordt de rekactiviteit direct gedetecteerd door de toename van het fluorescerende signaal van SYBR Green I tijdens de verlenging van een zelfaanzuigende 3'UTR-U30-sjabloon. Het protocol is aangepast van assays met intercalerende kleurstoffen zoals Pico Green en SYTO 9 die op grote schaal zijn gebruikt om verbindingen voor verschillende virale polymerasen te evalueren22,23,24,25,26. Hoewel we een zelfaanzuigende gebiotinyleerde sjabloon27 in de test hebben gebruikt, kunnen andere sjablonen, zoals poliU, ook worden gebruikt25. Het grootste nadeel van deze methode is het hoge aantal vals-positieve treffers die interageren met de kleurstof, hetzij door de fluorescentie te verstoren of door de dsRNA-intercalatie te verminderen28. Daarom moeten hitverbindingen worden gevalideerd met tegentesten zoals biofysische methoden of door de SYBR™ Green I-fluorescentie in dsRNA te vergelijken met en zonder de verbinding29. Niettemin zijn de eenvoudige implementatie, directe meting en betaalbaarheid belangrijke punten voor het gebruik van op fluorescentie gebaseerde methoden als HTS-platforms, in vergelijking met radiogelabelde of gekoppelde assays die moeilijk te implementeren zijn in middelgrote / grootschalige campagnes27,30,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), CEPID-subsidie 2013/07600-3 aan GO, subsidie 2018/05130-3 aan RSF en 2016/19712-9 aan ASG, en Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (subsidie 88887.516153/2020-00) aan ASG. We willen de Medicine for Malaria Ventures (MMV, www.mmv.org) en het Drugs for Neglected Diseases-initiatief (DNDi, www.dndi.org) dankbaar bedanken voor hun steun, het ontwerp van de Pandemic Response Box en het leveren van de verbindingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' | Dharmacon | - | 100 ng |
| 96-well cell culture plates | KASVI | K12-096 | |
| 96-well PCR Microplate | KASVI | K4-9610 | |
| 96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate | Corning | 3922 | |
| AMC (7-amine-4-methylcoumarin) | SIGMA-Aldrich | 257370 | 100 mg |
| Aprotinin from bovine lung | SIGMA-Aldrich | A1153 | 10 mg |
| ATP | JenaBioscience | NU-1010-1G | 1 g |
| Bz-nKRR-AMC | International Peptides | - | 5 mg |
| Class II Biohazard Safety Cabinet | ESCO | ||
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA-Aldrich | D5758 | 25 mL |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | SIGMA-Aldrich | 472301 | 1 L |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO | 3760091 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12657-029 | 500 mL |
| G418 | SIGMA-Aldrich | A1720 | Disulfate salt |
| Glycerol | SIGMA-Aldrich | G5516 | 1 L |
| HERACELL VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MnCl2 tetrahydrate | SIGMA-Aldrich | 203734 | 25 g |
| MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) | Invitrogen | M6494 | |
| NITD008 ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | SML2409 | 5 mg |
| qPCR system Mx3000P | Agilent | ||
| Renilla luciferase Assay System | PROMEGA | E2810 | |
| SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader | Molecular Devices | ||
| SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | ||
| SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | 500 µl |
| Triton X-100 | SIGMA-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Trizma base | SIGMA-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Trypsin-EDTA Solution 1X | SIGMA-Aldrich | 59417-C | 100 mL |
References
- Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
- Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
- de Araújo, T. V. B., et al. Association between microcephaly, Zika virus infection, and other risk factors in Brazil: Final report of a case-control study. The Lancet Infectious Diseases. 18 (3), 328-336 (2018).
- Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
- Pielnaa, P., et al. Zika virus-spread, epidemiology, genome, transmission cycle, clinical manifestation, associated challenges, vaccine and antiviral drug development. Virology. 543, 34-42 (2020).
- Bollati, M., et al. Structure and functionality in flavivirus NS-proteins: Perspectives for drug design Flaviviral NS3 protein Flaviviral NS5 protein Protease Helicase Polymerase Methyltransferase Flavivirus protein structure Antivirals VIZIER Consortium. Antiviral Research. 87, 125-148 (2010).
- Fernandes, R. S., et al. Reporter replicons for antiviral drug discovery against positive single-stranded RNA viruses. Viruses. 12 (6), (2020).
- Fernandes, R. S., et al. Discovery of an imidazonaphthyridine and a riminophenazine as potent anti-Zika virus agents through a replicon-based high-throughput screening. Virus Research. 299, 198388 (2021).
- Noske, G. D., et al. Structural characterization and polymorphism analysis of the NS2B-NS3 protease from the 2017 Brazilian circulating strain of Yellow Fever virus. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1864 (4), 129521 (2020).
- Godoy, A. S., et al. Crystal structure of Zika virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. Nature Communications. 8, 14764 (2017).
- Yin, Z., et al. An adenosine nucleoside inhibitor of dengue virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (48), 20435-20439 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Brecher, M., Zhang, J., Li, H. The flavivirus protease as a target for drug discovery. Virologica Sinica. 28 (6), 326-336 (2013).
- Noble, C. G., Seh, C. C., Chao, A. T., Shi, P. Y. Ligand-bound structures of the dengue virus protease reveal the active conformation. Journal of Virology. 86 (1), 438-446 (2012).
- Chen, X., et al. Mechanisms of activation and inhibition of Zika virus NS2B-NS3 protease. Cell Research. 26 (11), 1260-1263 (2016).
- Eyer, L., Nencka, R., de Clercq, E., Seley-Radtke, K., Růžek, D. Nucleoside analogs as a rich source of antiviral agents active against arthropod-borne flaviviruses. Antiviral Chemistry and Chemotherapy. 26, (2018).
- Xie, X., et al. Zika Virus Replicons for Drug Discovery. EBioMedicine. 12, 156-160 (2016).
- Pan, K. L., Lee, J. C., Sung, H. W., Chang, T. Y., Hsu, J. T. A. Development of NS3/4A protease-based reporter assay suitable for efficiently assessing hepatitis C virus infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4825-4834 (2009).
- Khumthong, R., Angsuthanasombat, C., Panyim, S., Katzenmeier, G. In Vitro Determination of Dengue Virus Type 2 NS2B-NS3 Protease Activity with Fluorescent Peptide Substrates. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 35 (2), (2002).
- Ulanday, G. E. L., Okamoto, K., Morita, K. Development and utility of an in vitro, fluorescence-based assay for the discovery of novel compounds against dengue 2 viral protease. Tropical Medicine and Health. 44 (1), 1-10 (2016).
- Ong, I. L. H., Yang, K. L. Recent developments in protease activity assays and sensors. Analyst. 142 (11), 1867-1881 (2017).
- Eltahla, A. A., Lackovic, K., Marquis, C., Eden, J. S., White, P. A. A fluorescence-based high-throughput screen to identify small compound inhibitors of the genotype 3a hepatitis c virus RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1027-1034 (2013).
- Eydoux, C., et al. A fluorescence-based high throughput-screening assay for the SARS-CoV RNA synthesis complex. Journal of Virological Methods. 288, 114013 (2021).
- Shimizu, H., et al. Discovery of a small molecule inhibitor targeting dengue virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (11), 1-21 (2019).
- Sáez-Álvarez, Y., Arias, A., del Águila, C., Agudo, R. Development of a fluorescence-based method for the rapid determination of Zika virus polymerase activity and the screening of antiviral drugs. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Kocabas, F., Turan, R. D., Aslan, G. S. Fluorometric RdRp assay with self-priming RNA. Virus Genes. 50 (3), 498-504 (2015).
- Niyomrattanakit, P., et al. A fluorescence-based alkaline phosphatase-coupled polymerase assay for identification of inhibitors of dengue virus RNA-Dependent RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 16 (2), 201-210 (2011).
- Simeonov, A., Davis, M. I. Interference with Fluorescence and Absorbance Flow Chart Fluorescence Interferences. (Md). , 1-8 (2016).
- Genick, C. C., et al. Applications of biophysics in high- Throughput screening hit validation. Journal of Biomolecular Screening. 19 (5), 707-714 (2014).
- Smith, T. M., et al. Identifying initiation and elongation inhibitors of dengue virus RNA polymerase in a high-throughput lead-finding campaign. Journal of Biomolecular Screening. 20 (1), 153-163 (2015).
- Porecha, R., Herschlag, D.
