Summary
En este trabajo, describimos los protocolos utilizados en los ensayos basados en replicon y en enzimas virales para detectar inhibidores de la replicación del virus del Zika en un formato de detección de alto rendimiento.
Abstract
El descubrimiento de fármacos antivirales requiere el desarrollo de ensayos bioquímicos y celulares confiables que se puedan realizar en formatos de detección de alto rendimiento (HTS). Se cree que las proteínas no estructurales (NS) del flavivirus se ensamblan co-traslacionalmente en las membranas del retículo endoplásmico (ER), formando el complejo de replicación (RC). El NS3 y el NS5 son las enzimas más estudiadas del RC y constituyen los principales objetivos para el desarrollo de fármacos debido a sus funciones cruciales en la replicación del genoma viral. El dominio de la proteasa NS3, que requiere NS2B como cofactor, es responsable de la escisión de la poliproteína viral inmadura en las proteínas NS maduras, mientras que el dominio NS5 RdRp es responsable de la replicación del ARN. A continuación, describimos en detalle los protocolos utilizados en los exámenes basados en replicon y los ensayos enzimáticos para probar grandes bibliotecas de compuestos para detectar inhibidores de la replicación del virus del Zika (ZIKV). Los replicones son sistemas subgenómicos autorreplicantes expresados en células de mamíferos, en los que los genes estructurales virales son reemplazados por un gen reportero. Los efectos inhibitorios de los compuestos sobre la replicación del ARN viral se pueden evaluar fácilmente midiendo la reducción de la actividad de la proteína reportera. Los exámenes basados en replicon se realizaron utilizando una línea celular de replicon BHK-21 ZIKV que expresa renilla luciferasa como gen reportero. Para caracterizar los objetivos específicos de los compuestos identificados, establecimos ensayos in vitro basados en fluorescencia para la proteasa NS3 expresada recombinantemente y NS5 RdRp. La actividad proteolítica de la proteasa viral se midió utilizando el sustrato peptídico fluorogénico Bz-nKRR-AMC, mientras que la actividad de elongación NS5 RdRp se detectó directamente por el aumento de la señal fluorescente de SYBR Green I durante el alargamiento del ARN, utilizando la plantilla sintética de autocebado biotinilado 3′UTR-U30 (5'-biotina-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3').
Introduction
El virus Zika (ZIKV) es un virus emergente transmitido por artrópodos miembro del género Flavivirus,que incluye el virus del dengue (DENV), el virus de la encefalitis japonesa (JEV) y el virus de la fiebre amarilla (YFV), que representan amenazas constantes para la salud pública1. El brote de ZIKV 2015-16 en las Américas recibió atención mundial después de su aparición en Brasil debido a la asociación con trastornos neurológicos graves, como la microcefalia congénita asociada a ZIKV en recién nacidos2,3 y el síndrome de Guillain-Barré en adultos4. Aunque el número de casos de infección disminuyó a lo largo de los próximos dos años, las transmisiones autóctonas de ZIKV transmitidas por mosquitos se verificaron en 87 países y territorios en 2019, lo que evidencia el potencial del virus para resurgir como una epidemia5. Hasta la fecha, no hay vacunas aprobadas o medicamentos efectivos contra la infección por ZIKV.
El descubrimiento de fármacos antivirales requiere el desarrollo de ensayos celulares y bioquímicos confiables que se puedan realizar en formatos de detección de alto rendimiento (HTS). Los exámenes basados en replicon y los ensayos basados en enzimas virales son dos estrategias valiosas para probar compuestos de moléculas pequeñas para inhibidores de ZIKV1. Se cree que las proteínas no estructurales (NS) del flavivirus se ensamblan cotraducciónlmente en las membranas del retículo endoplásmico (RE), formando el complejo de replicación (RC)6. El NS3 y el NS5 son las enzimas más estudiadas del RC y constituyen los principales objetivos para el desarrollo de fármacos debido a sus funciones cruciales en la replicación del genoma viral. El dominio de la proteasa NS3, que requiere NS2B como cofactor, es responsable de la escisión de la poliproteína viral inmadura en las proteínas NS maduras, mientras que el dominio NS5 RdRp es responsable de la replicación del ARN6.
Los replicones son sistemas subgenómicos autorreplicantes expresados en células de mamíferos, en los que los genes estructurales virales son reemplazados por un gen reportero. Los efectos inhibitorios de los compuestos sobre la replicación del ARN viral pueden evaluarse fácilmente midiendo la reducción de la actividad de la proteínareportera 7. A continuación, describimos los protocolos utilizados para el cribado de inhibidores de la replicación ziKV en un formato de placa de 96 pozos. Los ensayos basados en replicon se realizaron utilizando una línea celular BHK-21 ZIKV Rluc replicon que hemos desarrollado recientemente8. Para caracterizar los objetivos específicos de los compuestos identificados, establecimos ensayos in vitro basados en fluorescencia para la proteasa NS3 expresada recombinantemente utilizando el sustrato peptídico fluorogénico, Bz-nKRR-AMC, mientras que para NS5 RdRp medimos el alargamiento de la plantilla de autocebado biotinilado sintético 3′UTR-U30 (5'-biotina-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3'), utilizando el colorante intercalante SYBR Green I.
La proteasa ZIKV (45-96 residuos del cofactor NS2B unidos a los residuos 1-177 del dominio proteasa NS3 por un enlazador rico en glicina [G4SG4])se obtuvo, según se describe para YFV9,mientras que la polimerasa (276-898 residuos del dominio RdRp) se clonó y expresó, como se detalla en10. Ambas secuencias enzimáticas se derivaron de GenBank ALU33341.1. Como exámenes antivirales primarios, los compuestos se prueban a 10 μM y los que muestran actividades ≥ 80% se evalúan de manera dependiente de la dosis, lo que resulta en las concentraciones efectivas / inhibición (EC50 o IC50) y citotóxicas (CC50). En el contexto de resultados representativos, se muestran los valores EC50 y CC50 de NITD008, un inhibidor conocido de flavivirus11,a partir de cribados basados en replicon. Para los ensayos enzimáticos, se muestran los valores de IC50 de dos compuestos de la Caja de Respuesta Pandémica MMV/DNDi, una biblioteca compuesta por 400 moléculas con actividades antibacterianas, antifúngicas y antivirales. Los protocolos descritos en este trabajo podrían modificarse para detectar inhibidores de otros flavivirus relacionados.
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Protocol
1. Ensayo de actividad de luciferasa
NOTA: Asegúrese de que todos los procedimientos que involucran cultivo celular se lleven a cabo en campanas de bioseguridad certificadas (ver Tabla de Materiales).
- Preparar medios de crecimiento consistentes en el Medio de Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% FBS y 500 μg/mL G418.
- Prepare una solución de stock de 10 mM de compuestos probados en 100% DMSO, y luego diluirlos a 1 mM en 100% DMSO.
- Cultivo ZIKV Rluc células replicon en medios de crecimiento en un matraz de cultivo de 75 cm2 a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2(ver Tabla de Materiales)hasta alcanzar el 70-90% de confluencia.
- Deseche el medio. Agregue 5 ml de tripsina-EDTA al matraz durante 5 a 10 minutos y luego centrífuga las células a 125 x g durante 5 minutos.
- Deseche el sobrenadante, resuspenda las células en 5 mL de DMEM 10% FBS y cuente 10 μL de células resuspendidas en un hemocitómetro.
- Ajustar las células a 2 x 104 células/pozo en DMEM 10% FBS y sembrar 100 μL de células por pozo en una placa de cultivo celular de 96 pozos (ver Tabla de Materiales).
- Incubar la placa durante 16 h a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2(ver Tabla de Materiales).
- A continuación, deseche el medio con una micropipeta multicanal y agregue 100 μL/pozo de DMEM 2% FBS a la placa.
- Agregue 1 μL de los compuestos por pozo para dar como resultado una concentración final de 10 μM 1% DMSO en medio de ensayo. En la primera columna, agregue solo 1% DMSO como control sin inhibición y NITD008 en la última columna, como control positivo (inhibición 100%).
- Incubar la placa durante 48 h a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2(ver Tabla de Materiales).
- Descongele el kit del sistema de ensayo de luciferasa renilla a temperatura ambiente, prepare una solución de trabajo 1x tampón de lisis de lisis de renilla luciferasa y un volumen apropiado de reactivo de renilla luciferasa (tampón de ensayo + sustrato; 100 μL por pozo), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Deseche el sobrenadante de las células con una micropipeta multicanal y agregue 25 μL de 1x Renilla luciferase Lysis Buffer por pozo.
- Incubar la placa a temperatura ambiente durante 15 min y luego transferir 20 μL de lisatos celulares con una micropipeta multicanal a una placa blanca opaca de 96 pozos (ver Tabla de Materiales)que contiene 100 μL/pozo de Reactivo de ensayo de Renilla luciferasa.
- Lea las señales luminiscentes en un luminómetro o en cualquier equipo que tenga la opción de leer luminiscencia (ver Tabla de Materiales).
- Para cada placa, calcule el valor del factor Z 12, de la siguiente manera: Z′ = 1 - ((3SD de muestra + 3SD de control)/│Media de muestra - Media de control│); DE - desviación estándar. Un factor Z entre 0.5 y 1.0 significa un ensayo de buena calidad 12.
- Para determinar los valores ec50 de los compuestos, proceda como se describe en los pasos 1.3 a 1.8 y luego agregue los compuestos diluidos en serie a las células, junto con los controles negativo (1% DMSO) y positivo (NITD008 a 10 μM). Realice el ensayo dos veces por duplicado.
- Trazar los valores medios de las tasas de inhibición por concentración de compuestos y utilizar un software de análisis gráfico para realizar un ajuste sigmoidal y obtener los valores ec50.
2. Ensayo MTT basado en la proliferación celular
- Proceda como se describe en los pasos 1.1 a 1.8 del punto 1.
- Agregue los compuestos inicialmente a 10 μM y el DMSO de control al 1% a las células.
- Preparar una solución de 5 mg/ml de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-bromuro de tetrazolio difenil) en solución salina tamponada con fosfato (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4; pH 7.4) y vórtice hasta la solubilización completa de MTT.
- Añadir la solución de MTT a las células a una décima parte del volumen del pozo (10 μL/pozo).
- Incubar la placa a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2(ver Tabla de Materiales)durante 3-4 h.
- Deseche el sobrenadante con una micropipeta multicanal y agregue 100 μL de DMSO (100%) a cada pozo.
- Solubiliza los cristales de formazán mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo y luego lee la absorbancia a 570 nm en un espectrofotómetro (ver Tabla de Materiales).
- Para determinar los valores CC50 de los compuestos, proceda como se describe en los pasos 1.1 a 1.8 del punto 1 y luego agregue los compuestos diluidos en serie a las células, junto con el control negativo (1% DMSO). Realice el ensayo dos veces por duplicado.
- Trazar los valores medios de las tasas de inhibición por concentración de compuestos y utilizar un software de análisis gráfico para realizar un ajuste sigmoidal y obtener los valores de CC50.
3. Ensayo de actividad de la proteasa NS2B-NS3
- Descongelar una alícuota de proteína sobre hielo.
- Ajuste la temperatura del lector de placas (consulte la Tabla de materiales)a 37 °C.
- Preparar la cantidad apropiada de proteína diluida a 80 nM (5 μL/pozo). La concentración final de proteína es de 4 nM.
- Descongelar la cantidad adecuada de sustrato Bz-nKRR-AMC sobre hielo (solución de 300 μM diluida en tampón de ensayo, 10 μL/pozo).
- En una placa blanca de 96 pozos (ver Tabla de Materiales),dispensar 84 μL de tampón de ensayo (20 mM Tris pH 8.5, 5% de glicerol y 0.01% de Tritón X-100) en cada pozo.
- Para realizar la reacción de control positiva, a cada pozo de la última columna dispensar 1 μL de Aprotinina para alcanzar la concentración final de 1 μM (solución stock 100 μM diluida en agua)
- Para realizar la reacción de control negativa, a la primera columna dispensar 1 μL de DMSO (concentración final 1%).
- Para realizar el cribado de compuestos, dispensar 1 μL de cada compuesto para alcanzar una concentración final de 10 μM (concentración de stock de 1 mM) excluyendo pozos de control positivos y negativos.
- Dispensar 5 μL de la solución de proteasa.
- Incubar la placa a 4 °C durante 30 minutos.
- Para iniciar la reacción, dispensar 10 μL de solución stock de Bz-nKRR-AMC (concentración final de 30 μM).
- Establezca la longitud de onda de excitación en 380 nm y la emisión en 460 nm y lea la fluorescencia durante 30 minutos cada 1 minuto en un lector de microplacas (consulte la Tabla de materiales). Realice todo el experimento a 37 °C.
- Calcular los valores medios de la fluorescencia para reacciones de control positivas y negativas. Establecer como 100% de la actividad de la proteasa el valor medio de fluorescencia para reacciones de control negativas restado del valor medio de control positivo y calcular los porcentajes de actividad para cada compuesto.
- Para cada placa, calcule el valor del factor Z, como se describe en el paso 1.15.
- Proceder con la determinación de IC50 para compuestos que exhibieron una tasa de inhibición superior al 80%.
- Realice el ensayo por triplicados como se describe en los pasos 3.1-3.13, utilizando una dilución en serie del compuesto.
- Trazar los valores medios de las tasas de inhibición por concentración de compuestos y utilizar un software de análisis gráfico para realizar un ajuste sigmoidal y obtener los valores de IC50.
4. Ensayo de elongación NS5 RdRp
NOTA: Todos los materiales utilizados en este ensayo están certificados libres de RNasa, DNasa y pirogenasa.
- Prepare tanto el tampón de ensayo (50 mM Tris pH 7.0, 2.5 mM MnCl2, 0.01% Triton X-100) como la solución de stock de ATP de 200 mM con agua tratada con dietilbiocarbonato al 0.1% (DEPC).
- Anneal una alícuota de 5 μL de 200 μM 3′UTR-U30 (5'-biotina-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') en agua tratada con PCR incubándola durante 5 minutos a 55 °C en un termociclador.
- Descongelar la solución stock de NS5 RdRp, 200 mM ATP y x10.000 SYBR Green I sobre hielo.
- Diluir la proteína a una concentración final de 250 nM en 3 ml de tampón de ensayo.
- Preparar la solución de sustrato diluyendo las soluciones stock del ATP, 3'UTR-U30 y SYBR Green I en 3 mL de tampón de ensayo a una concentración final de 1 mM, 300 nM y 1X, respectivamente.
- En una placa de PCR de 96 pozos (ver Tabla de Materiales),agregue 24.5 μL de proteína diluida en las columnas 1 a 11 de cada fila. Agregue el mismo volumen de tampón de ensayo en los pozos restantes.
- Para el control y la reacción en blanco, agregue 0,5 μL de DMSO en las columnas 1 y 12. Añadir 0,5 μL de compuesto diluido en DMSO a una concentración final de solución de stock de 10 μM 1mM).
- Selle la placa con una película de sellado e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Comience la reacción agregando 25 μL de solución de sustrato y selle la placa nuevamente.
- Incubar a 30 °C en un sistema de PCR en tiempo real (ver Tabla de Materiales)y monitorizar la fluorescencia durante 1 hora, midiendo la fluorescencia cada 30 s con el filtro FAM (Emisión:494 nm/Excitación:521 nm).
- Para cada placa, calcule el valor del factor Z, como se describe en el paso 1.15.
- Proceda con la determinación de IC50 para compuestos que exhibieron una tasa de inhibición superior al 80%, como se describe en el paso 3.15.
- Trazar los valores medios de las tasas de inhibición por concentración de compuestos y utilizar un software de análisis gráfico para realizar un ajuste sigmoidal y obtener los valores de IC50.
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Representative Results
Todos los protocolos aquí descritos se establecieron en placas de 96 pozos y permite la evaluación de 80 compuestos por placa en un cribado primario de una sola concentración, incluyendo los controles negativo y positivo colocados en la primera y última columna de las placas, respectivamente. Los cribados basados en replicones se representan en la Figura 1,que incluye el constructo de ARN desarrollado para obtener la línea celular BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo(Figura 1A),la representación esquemática de los ensayos(Figura 1B)y las curvas dosis-respuesta de NITD008 (EC50 de 0,28 μM, CC50 > 10 μM)(Figura 1C). Los valores EC50 y CC50 de los compuestos afectados se determinan como las concentraciones necesarias para inhibir el 50% de la actividad de Rluc y causar un 50% de citotoxicidad, respectivamente. Con respecto al ensayo de luciferasa, DMSO 1% se utiliza como control sin inhibidor (inhibición del 0%) y NITD008 se utiliza como control positivo (inhibición del 100%), como se describió anteriormente8.
La actividad de la proteasa NS2B-NS3 se mide mediante el monitoreo de fluorescencia de AMC liberado debido a la actividad proteolítica de la proteasa (Figura 2A). La aprotinina, una proteína que actúa como inhibidor de la tripsina y que ya está descrita como inhibidora de las proteasas flavivirus13,14,15,se utilizó en este ensayo como control positivo experimental (IC50 de 0,13 ± 0,02 μM, datos no mostrados). La Figura 2B ilustra una curva de inhibición dosis-respuesta de una molécula dirigida a la actividad de la proteasa, el compuesto MMV1634402 (IC50 de 0,36 ± 0,08 μM). La actividad de elongación de NS5 RdRp se mide en tiempo real por el aumento de la intensidad de fluorescencia de SYBR Green I cuando se intercala con el dsRNA sintetizado(Figura 2C). La curva de inhibición dosis-respuesta de una molécula de impacto dirigida a ZIKV RdRp, el compuesto MMV1782220 (IC50 de 1,9 ± 0,8 μM), se muestra en la Figura 2D. Dado que los inhibidores análogos de nucleósidos, como NITD008, no son adecuados para ensayos enzimáticos, ya que los fosfatos deben incorporarse intracelularmente a la molécula16,no utilizamos ningún control positivo para el ensayo de elongación NS5 RdRp. Sin embargo, la clofazimina, un antibiótico comercial, que recientemente identificamos como un inhibidor de la polimerasa viral8,podría usarse como control experimental en próximos ensayos.
Figura 1: Proyecciones basadas en Replicon. A)Representación esquemática del constructo de replicon ZIKV que contiene una secuencia de Rluc en el extremo 5' UTR y un gen Neo en el terminal 3' UTR, que hemos desarrollado para obtener la línea celular BHK-21-RepZIKV-IRES_Neo 8. B)Representación esquemática del ensayo de actividad de la luciferasa y del ensayo MTT basado en la proliferación celular realizado para detectar inhibidores de la replicación de ZIKV. C)Las curvas dosis-respuesta (CE50 y CC50) de NITD008. El ensayo se realizó por duplicado. Las barras de error representan las desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ensayos basados en enzimas virales. A) Representación esquemática del ensayo de actividad de la proteasa NS2B-NS3. B)La curva de inhibición dosis-respuesta (IC50) del compuesto MMV1634402. C)Representación esquemática del ensayo de actividad de la ARN polimerasa NS5 RdRp. D) La curva de inhibición dosis-respuesta (IC50) del compuesto MMV1782220. Los ensayos se realizaron por triplicado. Las barras de error representan las desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los protocolos descritos en este documento podrían adaptarse fácilmente para las pruebas de detección en formatos de 384 o 1536 pozos. Para los cribados bioquímicos y/o celulares realizados en formato HTS, el valor del factor Z', un parámetro estadístico, se calcula para cada placa para garantizar la sensibilidad, reproducibilidad y precisión de esos ensayos12. Se espera un valor del factor Z' de 0,5 o superior para los cribado basados en replicon, mientras que se espera un valor de 0,7 o superior para los ensayos de actividad NS3 y NS5. Para el HTS basado en replicon, hemos desarrollado las células BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo, una línea celular estable que alberga un replicon ZIKV replicativo que contiene una secuencia de Renilla luciferasa(Rluc)en la región 5' UTR y un gen de la neomicina fosfotransferasa (Neo) impulsado por un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) en el 3'UTR. Se retuvieron 38 residuos de cápside y 30 residuos de genes envolventes que son necesarios para el correcto inicio de la traducción del ARN, para mantener niveles de replicación comparables y sensibilidad farmacológica entre los pasajes celulares8. Debido a la falta de genes estructurales, los replicones no producen viriones de progenie, eliminando así el riesgo de infección viral adquirida en laboratorio17.
Los ensayos antivirales que utilizan las células de replicon ZIKV consisten en la actividad de la luciferasa y los ensayos MTT (citotoxicidad) basados en la proliferación celular realizados en paralelo. Esto es necesario para excluir los golpes falsos positivos, que comprenden moléculas que interfieren directamente con la expresión y/o actividad de la proteína reportera y aquellas que afectan negativamente la salud celular7. Los sistemas Replicon permiten el descubrimiento de moléculas que inhiben la replicación del ARN, pero no las requeridas para la entrada viral y el ensamblaje/ liberación de viriones. Alternativamente, los replicons se pueden empaquetar para producir partículas de replicon de virus (VRP) proporcionando las proteínas estructurales en trans17. Las partículas infecciosas de una sola ronda (SRIP) resultantes son infecciosas, pero el virus de la progenie no puede propagarse ya que el genoma del paquete carece de genes estructurales. Por lo tanto, los VRP podrían usarse para detectar inhibidores de la entrada /replicación viral midiendo los niveles de la proteínareportera 7.
Además de los exámenes basados en replicon, también detallamos aquí los protocolos utilizados en los ensayos basados en enzimas virales para la proteasa NS3 recombinante y NS5 RdRp. La actividad proteolítica de la proteasa viral se midió utilizando el sustrato peptídico fluorogénico Bz-nKRR-AMC, que contiene la secuencia de reconocimiento y escisión de la proteasa ZIKV junto con la etiqueta fluorescente 7-amina-4-metilcumarina (AMC). Debido a la actividad de la proteasa, se libera la etiqueta fluorescente y la velocidad de reacción se mide directamente mediante el monitoreo de la fluorescencia en un espectrofotómetro18,19. Este ensayo es altamente sensato, relativamente barato, rápido y adecuado para la detección de grandes bibliotecas de compuestos20,21. El principal inconveniente es el posible enfriamiento entre los compuestos probados y el fluoróforo que puede conducir a golpes falsos positivos. Sin embargo, este problema podría abordarse mediante una medición de fluorescencia adicional en presencia de AMC. Además, los compuestos que muestran emisión o absorción en la misma longitud de onda del fluoróforo no pueden ser evaluados por este método18,20.
Respecto al NS5 RdRp, su actividad de elongación se detecta directamente por el aumento de la señal fluorescente de SYBR Green I durante el alargamiento de una plantilla autocebante 3'UTR-U30. El protocolo se adaptó a partir de ensayos con colorantes intercalantes como Pico Green y SYTO 9 que han sido ampliamente utilizados para evaluar compuestos para diferentes polimerasas virales22,23,24,25,26. A pesar de que hemos utilizado una plantilla biotinilada autocebante27 en el ensayo, también se pueden usar otras plantillas, comopoliU, 25. La principal desventaja de este método es el elevado número de falsos golpes positivos que interactúan con el tinte, ya sea interfiriendo con la fluorescencia o disminuyendo la intercalación de dsRNA28. Por lo tanto, los compuestos afectados deben validarse con contraensayos como los métodos de biofísica o comparando la fluorescencia SYBR™ Green I en dsRNA con y sin el compuesto29. Sin embargo, la fácil implementación, la medición directa y la asequibilidad son puntos clave para el uso de métodos basados en fluorescencia como plataformas HTS, en comparación con los ensayos radioetiquetados o acoplados que son difíciles de implementar en campañas de mediana / gran escala27,30,31.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), la subvención CEPID 2013/07600-3 a GO, la subvención 2018/05130-3 a RSF y 2016/19712-9 a ASG, y la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (subvención 88887.516153/2020-00) a ASG. Nos gustaría agradecer a Medicine for Malaria Ventures (MMV, www.mmv.org) y a la iniciativa Drugs for Neglected Diseases (DNDi, www.dndi.org) por su apoyo, diseño de la Caja de Respuesta a la Pandemia y suministro de los compuestos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' | Dharmacon | - | 100 ng |
| 96-well cell culture plates | KASVI | K12-096 | |
| 96-well PCR Microplate | KASVI | K4-9610 | |
| 96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate | Corning | 3922 | |
| AMC (7-amine-4-methylcoumarin) | SIGMA-Aldrich | 257370 | 100 mg |
| Aprotinin from bovine lung | SIGMA-Aldrich | A1153 | 10 mg |
| ATP | JenaBioscience | NU-1010-1G | 1 g |
| Bz-nKRR-AMC | International Peptides | - | 5 mg |
| Class II Biohazard Safety Cabinet | ESCO | ||
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA-Aldrich | D5758 | 25 mL |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | SIGMA-Aldrich | 472301 | 1 L |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO | 3760091 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12657-029 | 500 mL |
| G418 | SIGMA-Aldrich | A1720 | Disulfate salt |
| Glycerol | SIGMA-Aldrich | G5516 | 1 L |
| HERACELL VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MnCl2 tetrahydrate | SIGMA-Aldrich | 203734 | 25 g |
| MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) | Invitrogen | M6494 | |
| NITD008 ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | SML2409 | 5 mg |
| qPCR system Mx3000P | Agilent | ||
| Renilla luciferase Assay System | PROMEGA | E2810 | |
| SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader | Molecular Devices | ||
| SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | ||
| SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | 500 µl |
| Triton X-100 | SIGMA-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Trizma base | SIGMA-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Trypsin-EDTA Solution 1X | SIGMA-Aldrich | 59417-C | 100 mL |
References
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