Summary
I detta arbete beskriver vi de protokoll som används i replicon-baserade och virala enzymbaserade analyser för att screena för hämmare av Zika virus replikering i ett screening format med hög genomströmning.
Abstract
Antiviral läkemedelsupptäckt kräver utveckling av tillförlitliga biokemiska och cellulära analyser som kan utföras i HTS-format (High-Throughput Screening). Flavivirus icke-strukturella (NS) proteiner tros sam-translationally montera på endoplasmic reticulum (ER) membran, bildar replikering komplexa (RC). NS3 och NS5 är de mest studerade enzymerna i RC och utgör de viktigaste målen för läkemedelsutveckling på grund av deras avgörande roller i viral genomreplikering. NS3 protease domän, som kräver NS2B som dess kofaktor, är ansvarig för klyvning av omogna viral polyprotein i mogna NS proteiner, medan NS5 RdRp domänen är ansvarig för RNA-replikeringen. Häri beskriver vi i detalj de protokoll som används vid repliconbaserade screenings och enzymatiska analyser för att testa stora sammansatta bibliotek för hämmare av Zika-virus (ZIKV) replikering. Replicons är självreplikatoriska subgenomsystem uttryckta i däggdjursceller, där de virala strukturella generna ersätts av en reportergen. De hämmande effekterna av föreningar på viral RNA-replikation kan enkelt utvärderas genom att mäta minskningen av reporterproteinaktiviteten. Replicon-baserade screenings utfördes med hjälp av en BHK-21 ZIKV replicon cellinje uttrycker Renilla luciferase som en reporter gen. För att karakterisera de specifika målen för identifierade föreningar etablerade vi in vitro fluorescensbaserade analyser för rekombinant uttryckt NS3 proteas och NS5 RdRp. Den proteolytiska aktiviteten hos virusproteasen mättes med hjälp av det fluorogena peptidsubstratet Bz-nKRR-AMC. medan NS5 RdRp förlängning verksamhet upptäcktes direkt av ökningen av fluorescerande signalen av SYBR Green I under RNA förlängning, med hjälp av den syntetiska biotinylerade själv-priming mall 3′UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3').
Introduction
Zikaviruset (ZIKV) är en framväxande leddjursburen virusmedlem i släktet Flavivirus, som inkluderar det nära besläktade Dengueviruset (DENV), japanskt encefalitvirus (JEV) och Gula febern-viruset (YFV), som utgör ständiga hot mot folkhälsan1. ZIKV-utbrottet 2015-16 i Amerika fick global uppmärksamhet efter dess uppkomst i Brasilien på grund av sambandet med allvarliga neurologiska störningar, såsom medfödd ZIKV-associerad mikrocefali hos nyfödda2,3 och Guillain-Barré syndrom hos vuxna4. Även om antalet infektionsfall minskade under de kommande två åren, verifierades autoktona myggburna överföringar av ZIKV i 87 länder och territorier under 2019, vilket innebär att virusets potential kan återuppstå som en epidemi5. Hittills finns det inga godkända vacciner eller effektiva läkemedel mot ZIKV-infektion.
Antiviral läkemedelsupptäckt kräver utveckling av tillförlitliga cellulära och biokemiska analyser som kan utföras i HTS-format (High-Throughput Screening). Repliconbaserade screenings och virala enzymbaserade analyser är två värdefulla strategier för att testa småmolekylföreningar för hämmare av ZIKV1. Flavivirus icke-strukturella (NS) proteiner tros samöversättningar montera på de endoplasmatiska reticulum (ER) membran, bildar replikering komplexa (RC)6. NS3 och NS5 är de mest studerade enzymerna i RC och utgör de viktigaste målen för läkemedelsutveckling på grund av deras avgörande roller i viral genomreplikering. NS3 protease domän, som kräver NS2B som dess kofaktor, är ansvarig för klyvning av det omogna virala polyproteinet i de mogna NS-proteinerna, medan NS5 RdRp domänen är ansvarig för RNA-replikeringen6.
Replicons är självreplikatoriska subgenomsystem uttryckta i däggdjursceller, där de virala strukturella generna ersätts av en reportergen. De hämmande effekterna av föreningar på viral RNA-replikering kan enkelt utvärderas genom att mäta minskningen av reporterproteinaktiviteten7. Häri beskriver vi de protokoll som används för screeninghämmare av ZIKV-replikeringen i ett 96-brunnsplattaformat. De replicon-baserade analyserna utfördes med hjälp av en BHK-21 ZIKV Rluc replicon cellinje som vi nyligen har utvecklat8. För att karakterisera de specifika målen för identifierade föreningar etablerade vi in vitro fluorescensbaserade analyser för rekombinant uttryckt NS3 proteas med hjälp av fluorogena peptid substrat, Bz-nKRR-AMC, medan vi för NS5 RdRp mätte förlängningen av den syntetiska biotinylerade självprimingmallen 3′UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3'), med hjälp av det intercalating färgämnet SYBR Green I.
ZIKV-proteasen (45-96 rester av NS2B-kofaktor kopplad till resthalter 1-177 av NS3 proteasdomän av en glycinrik linker [G4SG4]) erhölls, enligt beskrivningen för YFV9, medan polymerasen (276-898 rester av RdRp-domänen) klonades och uttrycktes, som beskrivsi 10. Båda enzymsekvenserna härleddes från GenBank ALU33341.1. Som primära antivirala screenings testas föreningar vid 10 μM och de som visar aktiviteter ≥ 80% utvärderas sedan på ett dosberoende sätt, vilket resulterar i effektiv/hämning (EC50 eller IC50)och cytotoxiska (CC50)koncentrationer. I samband med representativa resultat visas EC50- och CC50-värdena för NITD008, en känd flavivirushämmare11, från repliconbaserade screenings. För enzymatiska analyser visas IC50-värdena för två föreningar från MMV/DNDi Pandemic Response Box, ett bibliotek bestående av 400 molekyler med antibakteriella, svampdödande och antivirala aktiviteter. De protokoll som beskrivs i detta arbete kan ändras till skärm för hämmare av andra relaterade flavivirus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Luciferase aktivitetsanalys
OBS: Se till att alla procedurer som involverar cellkultur utförs i certifierade biosäkerhetshuvar (se Materialförteckning ).
- Förbered tillväxtmedier bestående av Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) kompletterat med 10% FBS och 500 μg/mL G418.
- Förbered en 10 mM lagerlösning av testade föreningar i 100% DMSO och späd dem sedan till 1 mM i 100% DMSO.
- Kultur ZIKV Rluc repliconceller i tillväxtmedier i en 75 cm2 odlingskolv vid 37 °C i en CO2-fuktadinkubator (se Materialförteckning)tills de når 70-90% konfluens.
- Kassera mediet. Tillsätt 5 ml trypsin-EDTA till kolven i 5 till 10 min och centrifugera sedan cellerna vid 125 x g i 5 minuter.
- Kassera supernatanten, återanvänd cellerna i 5 ml DMEM 10% FBS och räkna 10 μL återanvända celler vid en hemocytometer.
- Justera cellerna till 2 x 104 celler/brunn i DMEM 10% FBS och frö 100 μL celler per brunn i en 96-brunns cellkulturplatta (se Materialförteckning).
- Inkubera plattan i 16 timmar vid 37 °C i en CO2-fuktadinkubator (se materialförteckning ).
- Kassera sedan mediet med en flerkanalsmikropipett och tillsätt 100 μL/brunn DMEM 2% FBS till plattan.
- Tillsätt 1 μL av föreningarna per brunn för att resultera i en slutlig koncentration på 10 μM 1% DMSO i analysmedium. I den första kolumnen lägger du bara till 1% DMSO som en hämningskontroll utan hämning och NITD008 i den sista kolumnen, som en positiv kontroll (100% hämning).
- Inkubera plattan i 48 timmar vid 37 °C i en CO2-fuktadinkubator (se materialförteckning ).
- Tina Renilla luciferase Assay System kit vid rumstemperatur, förbered en 1x Renilla luciferase Lysis Buffer arbetslösning och en lämplig volym Renilla Luciferase reagens (Analysbuffert + substrat; 100 μL per brunn), enligt tillverkarens instruktioner.
- Kassera supernatanten från cellerna med en flerkanalsmikropipett och tillsätt 25 μL 1x Renilla luciferase Lysis Buffer per brunn.
- Inkubera plattan vid rumstemperatur i 15 minuter och överför sedan 20 μL celllysat med en flerkanalig mikropipett till en vit ogenomskinlig 96-brunnsplatta (se materialförteckning)som innehåller 100 μL/brunn Renilla luciferase Assay Reagent.
- Läs av de självlysande signalerna i en luminometer eller i någon utrustning som har möjlighet att avläsa luminescence (se Materialförteckning ).
- För varje platta, beräkna Z-faktorvärdet 12, enligt följande: Z′ = 1 - ((3SD prov + 3SD kontroll)/▼Provvärde - Kontrollvärde▼); SD - standardavvikelse. En Z-faktor mellan 0,5 och 1,0 betyder en bra kvalitetsanalys 12.
- För att bestämma EC50-värdena för föreningar, fortsätt enligt beskrivningen i steg 1.3 till 1.8 och tillsätt sedan föreningarna seriellt utspädda till cellerna , tillsammans med de negativa (1% DMSO) och positiva (NITD008 vid 10 μM) kontroller. Utför analysen två gånger i dubbletter.
- Rita de genomsnittliga värdena för hämningshastigheter per sammansatt koncentration och använd en programvara för grafanalys för att utföra en sigmoidal montering och erhålla EC50-värdena.
2. Cellproliferationsbaserad MTT-analys
- Fortsätt enligt beskrivningen i punkt 1 steg 1.1 till 1.8.
- Tillsätt föreningarna initialt vid 10 μM och kontrollen 1% DMSO till cellerna.
- Bered en 5 mg/ml MTT-lösning (3-(4,5-dimetyletyletiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1,8 mM KH2PO4; pH 7.4) och virvel tills fullständig löslighet av MTT.
- Tillsätt MTT-lösningen i cellerna vid en tiondel av brunnsvolymen (10 μL/brunn).
- Inkubera plattan vid 37 °C i en CO2-fuktadinkubator (se materialförteckning)i 3-4 timmar.
- Kassera supernatanten med en flerkanalsmikropipett och tillsätt 100 μL DMSO (100%) till varje brunn.
- Löslighet formazankristallerna genom att leda upp och ner och sedan avläsa absorbansen vid 570 nm i en spektrofotometer (se Materialförteckning ).
- För att bestämma CC50-värdena för föreningar, fortsätt enligt beskrivningen i punkt 1 steg 1.1 till 1.8 och tillsätt sedan föreningarna seriellt utspädda i cellerna, tillsammans den negativa (1% DMSO) kontrollen. Utför analysen två gånger i dubbletter.
- Rita de genomsnittliga värdena för hämningshastigheter per sammansatt koncentration och använd en grafanalysprogramvara för att utföra en sigmoidal montering och erhålla CC50-värdena.
3. NS2B-NS3 protease aktivitetsanalys
- Tina upp ett protein alikvot på is.
- Ställ in plåtläsarens (se Materialförteckning)temperatur på 37°C.
- Förbered den tilltitlade mängden protein som späds ut till 80 nM (5 μL/brunn). Slutlig proteinkoncentration är 4 nM.
- Tina upp lämplig mängd Bz-nKRR-AMC-substrat på is (300 μM stamlösning utspädd i analysbuffert, 10 μL/brunn).
- I en 96-brunns vit platta (se Materialförteckning)doserar du 84 μL analysbuffert (20 mM Tris pH 8,5, 5% glycerol och 0,01% Triton X-100) i varje brunn.
- För att göra den positiva kontrollreaktionen, dosera 1 μL Aprotinin på varje brunn i den sista kolumnen för att uppnå slutlig koncentration på 1 μM (stamlösning 100 μM utspädd i vatten)
- För att göra den negativa kontrollreaktionen doserar den första kolumnen 1 μL DMSO (slutlig koncentration 1%).
- För att utföra sammansatt screening, dispensera 1 μL av varje förening för att uppnå slutlig koncentration på 10 μM (1 mM stockkoncentration) exklusive positiva och negativa kontrollbrunnar.
- Dispensera 5 μL av proteaslösningen.
- Inkubera plattan vid 4 °C i 30 minuter.
- För att starta reaktionen, dispensera 10 μL Bz-nKRR-AMC-stamlösning (slutlig koncentration på 30 μM).
- Ställ excitationsvåglängden på 380 nm och utsläppet till 460 nm och läs fluorescensen i 30 minuter var 1 minut i en mikroplatta (se Materialförteckning). Utför hela experimentet vid 37 °C.
- Beräkna medelvärdena för fluorescensen för positiva och negativa kontrollreaktioner. Ange som 100% av proteasaktiviteten medelvärdet av fluorescens för negativa kontrollreaktioner subtraherade av medelvärdet av positiv kontroll och beräkna procentandelen aktivitet för varje förening.
- För varje platta beräknar du Z-faktorvärdet enligt beskrivningen i steg 1.15.
- Fortsätt med IC50-bestämning för föreningar som uppvisade en hämningshastighet högre än 80%.
- Utför analysen i tre exemplar enligt beskrivningen i steg 3.1-3.13 med hjälp av en seriell utspädning av föreningen.
- Rita de genomsnittliga värdena för hämningshastigheter per sammansatt koncentration och använd en grafanalysprogramvara för att utföra en sigmoidal montering och erhålla IC50-värdena.
4. NS5 RdRp förlängningsanalys
OBS: Alla material som används i denna analys är RNase, DNase och pyrogenasfria certifierade.
- Förbered både analysbufferten (50 mM Tris pH 7,0, 2,5 mM MnCl2, 0,01% Triton X-100) och 200 mM ATP-stamlösning med 0,1% diethylpyrocarbonat (DEPC) behandlat vatten.
- Anneal a 5 μL alikvot på 200 μM 3′UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') i PCR-behandlat vatten genom att inkubera det i 5 minuter vid 55 °C i en termocyklist.
- Tina lagerlösningen av NS5 RdRp, 200 mM ATP och x10.000 SYBR Green I på is.
- Späd proteinet till en slutlig koncentration av 250 nM i 3 ml analysbuffert.
- Bered substratlösning genom att späda ut lagerlösningarna i ATP, 3'UTR-U30 och SYBR Green I i 3 ml analysbuffert till en slutlig koncentration på 1 mM, 300 nM respektive 1X.
- I en PCR-platta med 96 brunnar (se materialförteckning)tillsätt 24,5 μL utspädd protein i kolumnerna 1 till 11 i varje rad. Tillsätt samma volym analysbuffert i de återstående brunnarna.
- För kontroll och blind reaktion, tillsätt 0,5 μL DMSO i kolumnerna 1 och 12. Tillsätt 0,5 μL sammansatt förening som späds ut i DMSO till en slutlig koncentration på 10 μM 1mM stamlösning).
- Försegla plattan med en tätningsfilm och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter.
- Starta reaktionen genom att tillsätta 25 μL substratlösning och täta plattan igen.
- Inkubera vid 30 °C i ett PCR-system i realtid (se materialförteckning)och övervaka fluorescensen i 1 timme och mät fluorescensen var 30:e med FAM-filtret (Utsläpp:494 nm/Excitation:521 nm).
- För varje platta beräknar du Z-faktorvärdet enligt beskrivningen i steg 1.15.
- Fortsätt med IC50-bestämning för föreningar som uppvisade en hämningshastighet högre än 80%, enligt beskrivningen i steg 3.
- Rita de genomsnittliga värdena för hämningshastigheter per sammansatt koncentration och använd en grafanalysprogramvara för att utföra en sigmoidal montering och erhålla IC50-värdena.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alla protokoll som beskrivs häri var stablished i 96-brunn plattor och tillåter utvärdering av 80 föreningar per platta i en primär screening av en enda koncentration, inklusive negativa och positiva kontroller placeras vid första respektive sista kolumnen av plattorna. De repliconbaserade screeningsna är representerade i figur 1, som inkluderar RNA-konstruktionen utvecklad för att erhålla BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo-cellinjen (figur 1A), analysschemarepresentationen (figur 1B) och dosresponskurvorna för NITD008 (EG50 på 0,28 μM, CC50 > 10 μM) (Figur 1C). EC50- och CC50-värdena för träffföreningar bestäms som de koncentrationer som krävs för att hämma 50% av Rluc-aktiviteten respektive orsaka 50% cytotoxicitet. När det gäller luciferasanalysen används DMSO 1% som en ingen hämmarkontroll (0% hämning) och NITD008 används som en positiv kontroll (100% hämning), som tidigarebeskrivits 8.
Proteasaktiviteten NS2B-NS3 mäts genom fluorescensövervakning av AMC som frigörs på grund av proteolytisk aktivitet hos proteasen (figur 2A). Aprotinin, ett protein som fungerar som trypsinhämmare och redan beskrivs som en hämmare av flavivirusproteaser13,14,15, användes i denna analys som en experimentell positiv kontroll (IC50 av 0, 13 ± 0, 02 μM, data som inte visas). Figur 2B illustrerar en dosresponshämningskurva för en molekyl som riktar sig till proteasaktiviteten, den sammansatta MMV1634402 (IC50 på 0,36 ± 0,08 μM). NS5 RdRps förlängningsaktivitet mäts i realtid genom ökningen av fluorescensintensiteten hos SYBR Green I när den är intercalated med syntetiserade dsRNA (Figur 2C). Dosresponshämningskurvan för en träffmolekyl riktad mot ZIKV RdRp, föreningen MMV1782220 (IC50 på 1,9 ± 0,8 μM), finns i figur 2D. Eftersom nukleosidanaloghämmare, såsom NITD008, inte är lämpliga för enzymatiska analyser, eftersom fosfater måste införlivas intracellulärt tillmolekylen 16, använde vi ingen positiv kontroll för NS5 RdRp förlängningsanalys. Clofazimine, ett kommersiellt antibiotikum, som vi nyligen identifierade som en hämmare av viral polymeras8, kan dock användas som en experimentell kontroll i nästa analyser.
Figur 1: Repliconbaserade visningar. A) Schematisk representation av ZIKV replicon konstruktion som innehåller en Rluc sekvens vid 5' UTR ändstation och en Neo gen vid 3' UTR ändstationen, som vi har utvecklat för att få BHK-21-RepZIKV-IRES_Neo cellinje 8. B) Schematisk representation av luciferas aktivitetsanalys och cell spridning-baserade MTT analys utförs för att screena för hämmare av ZIKV replikering. C) Dosresponskurvorna (EC50 och CC50)för NITD008. Analysen utfördes i dubbletter. Felstaplar representerar standardavvikelser. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Viral enzymbaserade analyser. A) Schematisk representation av NS2B-NS3 proteasaktivitetsanalys. B) Dosresponshämningskurvan (IC50)av sammansatt MMV1634402. C) Schematisk representation av NS5 RdRp RNA polymeras aktivitetsanalys. D) Dosresponshämningskurvan (IC50)av sammansatt MMV1782220. Analyserna utfördes i triplikater. Felstaplar representerar standardavvikelser. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De protokoll som beskrivs häri kan lätt anpassas för screening i 384- eller 1536-brunnsformat. För biokemiska och/eller cellbaserade screeninger som utförs i HTS-format beräknas faktorvärdet Z, en statistisk parameter, för varje platta för att säkerställa känsligheten, reproducerbarheten och noggrannheten hos dessa analyser12. Ett Z- faktorvärde på 0,5 eller högre förväntas för repliconbaserade screenings medan ett värde på 0,7 eller högre förväntas för aktivitetsanalyserna NS3 och NS5. För replicon-baserade HTS har vi utvecklat BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo-cellerna, en stabil cellinje som hyser en replikativ ZIKV-replicon som innehåller en Renilla luciferase (Rluc ) -sekvensenvid 5' UTR-regionen och en neomycin fosfotransferas (Neo) gen driven av en intern ribosomal ingångsplats (IRES) vid 3'UTR. Vi behöll 38 rester av capsid och 30 rester av omstundsregener som krävs för korrekt initiering av RNA-översättningen, för att upprätthålla jämförbara replikeringsnivåer och läkemedelskänslighet mellancellpassager 8. På grund av bristen på strukturella gener producerar repliconer inte avkomman virions, vilket eliminerar risken för laboratorieförvärvad virusinfektion17.
De antivirala analyserna med zikv-repliconcellerna består av luciferasaktiviteten och de cellproliferationsbaserade MTT-analyserna (cytotoxicitet) som utförs parallellt. Detta är nödvändigt för att utesluta falskt positiva träffar, bestående av molekyler som direkt stör reporterproteinuttrycket och/eller aktiviteten och de som påverkar cellhälsannegativt 7. Repliconsystem gör det möjligt att upptäcka molekyler som hämmar RNA-replikation men inte de som krävs för viral in- och virionmontering/frisättning. Alternativt kan replicons förpackas för att producera virus repliconpartiklar (VRPs) genom att tillhandahålla de strukturella proteinerna i trans17. De resulterande enstaka infektiösa partiklarna (SRIPs) är smittsamma, men avkommavirus kan inte spridas eftersom förpackningsgenomet saknar strukturella gener. Därför kan VRP användas för att testa för hämmare av viral ingång/replikering genom att mäta nivåerna avreporterproteinet 7.
Förutom de repliconbaserade screeningsna, vi också detaljerade häri protokollen som används i virala enzymbaserade analyser för rekombinant NS3 protease och NS5 RdRp. Proteolytisk aktivitet av viral proteas mättes med hjälp av fluorogena peptid substrat Bz-nKRR-AMC, som innehåller ZIKV protease erkännande och klyvning sekvens i kombination med fluorescerande taggen 7-amine-4-metylcoumarin (AMC). På grund av proteasaktiviteten frigörs den fluorescerande taggen och reaktionshastigheten mäts direkt genom att övervaka fluorescensen i en spektrofotometer18,19. Denna analys är mycket förnuftig, relativt billig, snabb och lämplig för screening av stora sammansatta bibliotek20,21. Den största nackdelen är den möjliga släckningen mellan testade föreningar och fluorforen som kan leda till falskt positiva träffar. Denna fråga skulle dock kunna lösas genom ytterligare fluorescensmätning i närvaro av AMC. Föreningar som visar utsläpp eller absorption i samma våglängd av fluorforen kan inte heller utvärderas med denna metod18,20.
När det gäller NS5 RdRp detekteras dess förlängningsaktivitet direkt av ökningen av fluorescerande signalen från SYBR Green I under förlängningen av en självprimande 3'UTR-U30-mall. Protokollet anpassades från analyser med intercalating färgämnen som Pico Green och SYTO 9 som har använts i stor utsträckning för att utvärdera föreningar för olika virala polymeraser22,23,24,25,26. Även om vi har använt en självprimande biotinyleradmall 27 i analysen, kan andra mallar, såsom poliU, ocksåanvändas 25. Den största nackdelen med denna metod är det höga antalet falskt positiva träffar som interagerar med färgämnet, antingen genom att störa fluorescensen eller genom att minska dsRNA-interkalationen28. Därför måste träffföreningar valideras med motanalyser som biofysikmetoder eller genom att jämföra SYBR™ Green I fluorescens i dsRNA med och utan föreningen29. Den enkla implementeringen, den direkta mätningen och överkomliga priser är dock viktiga punkter för användningen av fluorescensbaserade metoder som HTS-plattformar, i jämförelse med radiomärkta eller kopplade analyser som är svåra att genomföra i medelstora/ storskaliga kampanjer27,30,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författare förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), CEPID-bidrag 2013/07600-3 till GO. bevilja RSF och RSF och 2016/19712-9 till ASG och Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (anslag 88887,516153/2020-00) till ASG. Vi vill tacksamt tacka Initiativet Medicine for Malaria Ventures (MMV, www.mmv.org) och initiativet Drugs for Neglected Diseases (DNDi, www.dndi.org) för deras stöd, utformning av pandemic response box och leverans av föreningarna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' | Dharmacon | - | 100 ng |
| 96-well cell culture plates | KASVI | K12-096 | |
| 96-well PCR Microplate | KASVI | K4-9610 | |
| 96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate | Corning | 3922 | |
| AMC (7-amine-4-methylcoumarin) | SIGMA-Aldrich | 257370 | 100 mg |
| Aprotinin from bovine lung | SIGMA-Aldrich | A1153 | 10 mg |
| ATP | JenaBioscience | NU-1010-1G | 1 g |
| Bz-nKRR-AMC | International Peptides | - | 5 mg |
| Class II Biohazard Safety Cabinet | ESCO | ||
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA-Aldrich | D5758 | 25 mL |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | SIGMA-Aldrich | 472301 | 1 L |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO | 3760091 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12657-029 | 500 mL |
| G418 | SIGMA-Aldrich | A1720 | Disulfate salt |
| Glycerol | SIGMA-Aldrich | G5516 | 1 L |
| HERACELL VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MnCl2 tetrahydrate | SIGMA-Aldrich | 203734 | 25 g |
| MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) | Invitrogen | M6494 | |
| NITD008 ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | SML2409 | 5 mg |
| qPCR system Mx3000P | Agilent | ||
| Renilla luciferase Assay System | PROMEGA | E2810 | |
| SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader | Molecular Devices | ||
| SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | ||
| SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | 500 µl |
| Triton X-100 | SIGMA-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Trizma base | SIGMA-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Trypsin-EDTA Solution 1X | SIGMA-Aldrich | 59417-C | 100 mL |
References
- Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
- Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
- de Araújo, T. V. B., et al. Association between microcephaly, Zika virus infection, and other risk factors in Brazil: Final report of a case-control study. The Lancet Infectious Diseases. 18 (3), 328-336 (2018).
- Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
- Pielnaa, P., et al. Zika virus-spread, epidemiology, genome, transmission cycle, clinical manifestation, associated challenges, vaccine and antiviral drug development. Virology. 543, 34-42 (2020).
- Bollati, M., et al. Structure and functionality in flavivirus NS-proteins: Perspectives for drug design Flaviviral NS3 protein Flaviviral NS5 protein Protease Helicase Polymerase Methyltransferase Flavivirus protein structure Antivirals VIZIER Consortium. Antiviral Research. 87, 125-148 (2010).
- Fernandes, R. S., et al. Reporter replicons for antiviral drug discovery against positive single-stranded RNA viruses. Viruses. 12 (6), (2020).
- Fernandes, R. S., et al. Discovery of an imidazonaphthyridine and a riminophenazine as potent anti-Zika virus agents through a replicon-based high-throughput screening. Virus Research. 299, 198388 (2021).
- Noske, G. D., et al. Structural characterization and polymorphism analysis of the NS2B-NS3 protease from the 2017 Brazilian circulating strain of Yellow Fever virus. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1864 (4), 129521 (2020).
- Godoy, A. S., et al. Crystal structure of Zika virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. Nature Communications. 8, 14764 (2017).
- Yin, Z., et al. An adenosine nucleoside inhibitor of dengue virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (48), 20435-20439 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Brecher, M., Zhang, J., Li, H. The flavivirus protease as a target for drug discovery. Virologica Sinica. 28 (6), 326-336 (2013).
- Noble, C. G., Seh, C. C., Chao, A. T., Shi, P. Y. Ligand-bound structures of the dengue virus protease reveal the active conformation. Journal of Virology. 86 (1), 438-446 (2012).
- Chen, X., et al. Mechanisms of activation and inhibition of Zika virus NS2B-NS3 protease. Cell Research. 26 (11), 1260-1263 (2016).
- Eyer, L., Nencka, R., de Clercq, E., Seley-Radtke, K., Růžek, D. Nucleoside analogs as a rich source of antiviral agents active against arthropod-borne flaviviruses. Antiviral Chemistry and Chemotherapy. 26, (2018).
- Xie, X., et al. Zika Virus Replicons for Drug Discovery. EBioMedicine. 12, 156-160 (2016).
- Pan, K. L., Lee, J. C., Sung, H. W., Chang, T. Y., Hsu, J. T. A. Development of NS3/4A protease-based reporter assay suitable for efficiently assessing hepatitis C virus infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4825-4834 (2009).
- Khumthong, R., Angsuthanasombat, C., Panyim, S., Katzenmeier, G. In Vitro Determination of Dengue Virus Type 2 NS2B-NS3 Protease Activity with Fluorescent Peptide Substrates. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 35 (2), (2002).
- Ulanday, G. E. L., Okamoto, K., Morita, K. Development and utility of an in vitro, fluorescence-based assay for the discovery of novel compounds against dengue 2 viral protease. Tropical Medicine and Health. 44 (1), 1-10 (2016).
- Ong, I. L. H., Yang, K. L. Recent developments in protease activity assays and sensors. Analyst. 142 (11), 1867-1881 (2017).
- Eltahla, A. A., Lackovic, K., Marquis, C., Eden, J. S., White, P. A. A fluorescence-based high-throughput screen to identify small compound inhibitors of the genotype 3a hepatitis c virus RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1027-1034 (2013).
- Eydoux, C., et al. A fluorescence-based high throughput-screening assay for the SARS-CoV RNA synthesis complex. Journal of Virological Methods. 288, 114013 (2021).
- Shimizu, H., et al. Discovery of a small molecule inhibitor targeting dengue virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (11), 1-21 (2019).
- Sáez-Álvarez, Y., Arias, A., del Águila, C., Agudo, R. Development of a fluorescence-based method for the rapid determination of Zika virus polymerase activity and the screening of antiviral drugs. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Kocabas, F., Turan, R. D., Aslan, G. S. Fluorometric RdRp assay with self-priming RNA. Virus Genes. 50 (3), 498-504 (2015).
- Niyomrattanakit, P., et al. A fluorescence-based alkaline phosphatase-coupled polymerase assay for identification of inhibitors of dengue virus RNA-Dependent RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 16 (2), 201-210 (2011).
- Simeonov, A., Davis, M. I. Interference with Fluorescence and Absorbance Flow Chart Fluorescence Interferences. (Md). , 1-8 (2016).
- Genick, C. C., et al. Applications of biophysics in high- Throughput screening hit validation. Journal of Biomolecular Screening. 19 (5), 707-714 (2014).
- Smith, T. M., et al. Identifying initiation and elongation inhibitors of dengue virus RNA polymerase in a high-throughput lead-finding campaign. Journal of Biomolecular Screening. 20 (1), 153-163 (2015).
- Porecha, R., Herschlag, D.
