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Biology

इन विट्रो रोग मॉडलिंग के लिए मानव प्राथमिक वाल्व कोशिकाओं का अलगाव

Published: April 16, 2021 doi: 10.3791/62439
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,3
1Division of Cardiology, Department of Medicine, and the Pittsburgh Heart, Lung, and Blood Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Cardiothoracic Surgery, University of Pittsburgh and Heart and Vascular Institute, University of Pittsburgh Medical Center, 3Department of Bioengineering, University of Pittsburgh

Summary

यह प्रोटोकॉल सर्जिकल महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन प्रक्रियाओं के दौरान या कैडवेरिक ऊतक से निकाले गए मानव महाधमनी वाल्व के संग्रह का वर्णन करता है, और बाद में रोगी विशिष्ट प्राथमिक वाल्व एंडोथेलियल और अंतरालीय कोशिकाओं के अलगाव, विस्तार और लक्षण वर्णन करता है। सेल व्यवहार्यता और फेनोटाइप विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं के बारे में महत्वपूर्ण विवरण शामिल हैं।

Abstract

कैल्सीफिक महाधमनी वाल्व रोग (सीएवीडी) बुजुर्ग आबादी के लगभग एक तिहाई में मौजूद है। महाधमनी वाल्व का मोटा होना, कठोरता और कैल्सीफिकेशन महाधमनी स्टेनोसिस का कारण बनता है और दिल की विफलता और स्ट्रोक में योगदान देता है। रोग रोगजनन बहुक्रियाशील है, और सूजन, बाह्य मैट्रिक्स रीमॉडेलिंग, अशांत प्रवाह, और यांत्रिक तनाव और तनाव जैसे तनाव वाल्व एंडोथेलियल और वाल्व अंतरालीय कोशिकाओं के ओस्टोजेनिक भेदभाव में योगदान करते हैं। हालांकि, सटीक शुरुआती कारक जो एक स्वस्थ कोशिका के ओस्टोजेनिक संक्रमण को कैल्सीफाइंग सेल में चलाते हैं, पूरी तरह से परिभाषित नहीं हैं। इसके अलावा, सीएवीडी-प्रेरित महाधमनी स्टेनोसिस के लिए एकमात्र वर्तमान चिकित्सा महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन है, जिससे देशी वाल्व को हटा दिया जाता है (सर्जिकल महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन, एसएवीआर) या कैथेटर (ट्रांसकैथेटर महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन, टीएवीआर) के माध्यम से पूरी तरह से ढहने योग्य प्रतिस्थापन वाल्व डाला जाता है। ये सर्जिकल प्रक्रियाएं उच्च लागत पर और गंभीर जोखिमों के साथ आती हैं; इस प्रकार, दवा की खोज के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करना अनिवार्य है। उस अंत तक, वर्तमान अध्ययन एक वर्कफ़्लो विकसित करता है जहां रोगियों और दाता शव ऊतकों से शल्य चिकित्सा से हटाए गए ऊतकों का उपयोग इन विट्रो रोग मॉडलिंग के लिए वाल्वुलर कोशिकाओं की रोगी-विशिष्ट प्राथमिक लाइनों को बनाने के लिए किया जाता है। यह प्रोटोकॉल एक कोल्ड स्टोरेज समाधान के उपयोग का परिचय देता है, जो आमतौर पर अंग प्रत्यारोपण में उपयोग किया जाता है, ताकि उत्पादित ऊतक की कोशिकाओं को बहुत स्थिर करने के लाभ के साथ ऊतक छांटने और प्रयोगशाला प्रसंस्करण के बीच अक्सर लंबे खरीद समय के कारण होने वाले नुकसान को कम किया जा सके। वर्तमान अध्ययन के परिणामों से पता चलता है कि पृथक वाल्व कोशिकाएं दाता से वाल्व हटाने के बाद कई दिनों तक संस्कृति में अपनी प्रोलिफेरेटिव क्षमता और एंडोथेलियल और अंतरालीय फेनोटाइप को बनाए रखती हैं। इन सामग्रियों का उपयोग नियंत्रण और सीएवीडी कोशिकाओं के संग्रह की अनुमति देता है, जिससे नियंत्रण और रोग सेल लाइनें दोनों स्थापित होती हैं।

Introduction

कैल्सीफिक महाधमनी वाल्व रोग (सीएवीडी) एक पुरानी विकृति है जो महाधमनी वाल्व पत्रक की सूजन, फाइब्रोसिस और मैक्रोकैल्सीफिकेशन की विशेषता है। पत्रकों के प्रगतिशील रीमॉडेलिंग और कैल्सीफिकेशन (जिसे महाधमनी स्क्लेरोसिस कहा जाता है) से रक्त प्रवाह (महाधमनी स्टेनोसिस) में रुकावट हो सकती है जो स्ट्रोक में योगदान देती है और दिल की विफलता की ओर ले जाती है। वर्तमान में सीएवीडी के लिए एकमात्र उपचार सर्जिकल या ट्रांसकैथेटर महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन (एसएवीआर और टीएवीआर, क्रमशः) है। सीएवीडी प्रगति को रोकने या रिवर्स करने के लिए कोई गैर-सर्जिकल विकल्प नहीं है, और वाल्व प्रतिस्थापन के बिना, मृत्यु दर 2-3 वर्षों के भीतर 50% तक पहुंच जाती है। इस विकृति को चलाने वाले अंतर्निहित तंत्र को परिभाषित करने से संभावित नवीन चिकित्सीय दृष्टिकोण की पहचान होगी।

एक स्वस्थ वयस्क में, महाधमनी वाल्व पत्रक लगभग एक मिलीमीटर मोटे होते हैं, और उनका मुख्य कार्य बाएं वेंट्रिकल 4 से रक्त के यूनिडायरेक्शनल प्रवाह को बनाएरखना है। तीन पत्रकों में से प्रत्येक में वाल्व एंडोथेलियल कोशिकाओं (वीईसी) की एक परत शामिल है जो पत्रक की बाहरी सतह को रेखाबद्ध करती है और एक बाधा के रूप में कार्य करती है। वीईसी पारगम्यता, भड़काऊ सेल आसंजन और पैराक्रिन सिग्नलिंग 5,6,7 को विनियमित करके वाल्व होमियोस्टैसिस को बनाए रखते हैं। वाल्व अंतरालीय कोशिकाओं (वीआईसी) में वाल्व पत्रक8 के भीतर अधिकांश कोशिकाएं शामिल हैं। वीआईसी को पत्रक में तीन विशिष्ट परतों में व्यवस्थित किया जाता है। इन परतों को वेंट्रिकुलरिस, स्पोंजियोसा और फाइब्रोसा9 के रूप में जाना जाता है। वेंट्रिकुलरिस बाएं वेंट्रिकल का सामना करता है और इसमें कोलेजन और इलास्टिन फाइबर होते हैं। मध्य परत, स्पोंजियोसा में उच्च प्रोटीओग्लाइकेन सामग्री होती है जो हृदय चक्र के दौरान कतरनी लचीलापन प्रदान करती है। बाहरी फाइब्रोसा परत महाधमनी पक्ष पर बहिर्वाह सतह के करीब स्थित है और टाइप 1 और टाइप 3 फाइब्रिलर कोलेजन में समृद्ध है जो डायस्टोलिक10,11,12 के दौरान कोप्टेशन को बनाए रखने की ताकत प्रदान करता है। वीआईसी एक क्वीसेंट अवस्था में रहते हैं, हालांकि, सूजन, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के रीमॉडेलिंग और यांत्रिक तनाव जैसे कारक वीआईसी होमियोस्टैसिस 8,9,13,14,15,16 को बाधित कर सकते हैं। होमियोस्टैसिस के नुकसान के साथ, वीआईसी एक मायोफाइब्रोब्लास्ट जैसे फेनोटाइप को सक्रिय और प्राप्त करते हैं जो प्रोटीन के प्रसार, संकुचन और स्राव में सक्षम होता है जो बाह्य मिलीयू17 को फिर से तैयार करता है। सक्रिय वीआईसी कैल्सीफाइंग कोशिकाओं में संक्रमण कर सकते हैं जो एक मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) के ओस्टियोब्लास्ट 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25 में विभेदन की याद दिलाता है।

कैल्सीफिकेशन कोलेजन युक्त फाइब्रोसा परत में वीईसी और वीआईसी दोनों के योगदान से शुरू होता है, लेकिन पत्रक 8 की अन्य परतों का विस्तार और आक्रमण करताहै। इस प्रकार, यह स्पष्ट है कि वीईसी और वीआईसी दोनों ओस्टोजेनिक जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए उत्तेजनाओं का जवाब देते हैं, हालांकि, ओस्टोजेनिक जीन की सक्रियता को चलाने वाली सटीक घटनाएं, साथ ही कोशिकाओं और पत्रक के बाह्य मैट्रिक्स के बीच जटिल अंतःक्रिया, गलत परिभाषित रहती हैं। म्यूरिन मॉडल सीएवीडी रोगजनन के गैर-आनुवंशिक ड्राइवरों का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श स्रोत नहीं हैं, क्योंकि चूहे सीएवीडी डी नोवो26,27 विकसित नहीं करते हैं, इसलिए प्राथमिक मानव ऊतकों और इन ऊतकों से अलग प्राथमिक सेल लाइनों का उपयोग आवश्यक है। विशेष रूप से, इन कोशिकाओं को उच्च संख्या और अच्छी गुणवत्ता में प्राप्त करना अनिवार्य है, क्योंकि 3 डी सेल संस्कृतियों और ऑर्गेनोइड मॉडलिंग का क्षेत्र बढ़ रहा है और मुराइन मॉडल के लिए एक पूर्व विवो मानव-आधारित विकल्प बनने की संभावना है।

वर्तमान विधि का उद्देश्य एक वर्कफ़्लो साझा करना है जिसने मानव दाताओं से शल्य चिकित्सा द्वारा हटाए गए वाल्वों से प्राप्त वीईसी और वीआईसी को कुशलतापूर्वक अलग करने और विकसित करने की शर्तों को स्थापित किया है। पिछले अध्ययनों ने पोर्सिन28 और मुराइन वाल्व29 से वीईसी और वीआईसी के सफल अलगाव को दिखाया है, हमारे ज्ञान के लिए यह मानव ऊतकों में इन कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन करने वाला पहला है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल मानव उत्पादित वाल्वों पर लागू होता है और कोल्ड स्टोरेज समाधान के उपयोग को पेश करके ऊतक छांटने और प्रयोगशाला प्रसंस्करण के बीच अक्सर लंबे समय तक खरीद समय के कारण होने वाले नुकसान को बहुत कम करता है और सुधारता है, एक बफर समाधान जो अंग प्रत्यारोपण में चिकित्सकीय रूप से उपयोग किया जाता है जो उत्पादित ऊतक की कोशिकाओं को बहुत स्थिर करता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल यह भी दिखाता है कि सेल फेनोटाइप कैसे निर्धारित किया जाए और न्यूनतम सेल क्रॉस-संदूषण के साथ सेल अस्तित्व की उच्च दक्षता की गारंटी दी जाए।

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Protocol

हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित अध्ययनों में नामांकित व्यक्तियों से सभी रोगी नमूने एकत्र किए जाते हैं। सेंटर फॉर ऑर्गन रिकवरी एंड एजुकेशन (CORE) के माध्यम से प्राप्त कैडवेरिक ऊतकों को पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय की कमेटी फॉर ओवरसाइट ऑफ रिसर्च एंड क्लिनिकल ट्रेनिंग (CORID) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. अनुमोदन और सुरक्षा

  1. हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार रोगी के नमूनों या शव ऊतकों के किसी भी संग्रह के लिए संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) अनुमोदन या छूट ज्ञापन प्राप्त करें।
  2. मानव ऊतकों जैसे रक्तजनित रोगजनकों प्रशिक्षण, बायोमेडिकल मानव विषय अनुसंधान, गोपनीयता और सूचना सुरक्षा, और जैविक सामग्री के परिवहन और शिपिंग के साथ काम करने के लिए आवश्यक संस्थागत प्रशिक्षण लें।

2. रसद और तैयारी

  1. सर्जिकल नमूने
    1. सुनिश्चित करें कि एक रेफ्रिजरेटर उपलब्ध है और ऑपरेटिंग रूम के पास स्थित है। सर्जिकल स्टाफ द्वारा उपयोग के लिए इस फ्रिज में कोल्ड स्टोरेज समाधान के 40 एमएल बाँझ एलिकोट युक्त डी-आइडेंटिफाइड नामकरण के साथ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों को पूर्व-लेबल रखें। ये ट्यूब मूल पैकेज पर समाप्ति तिथि तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर हैं।
    2. निष्कर्षण पर, इन ट्यूबों में वाल्व ऊतक रखें। ट्यूबों को एक सीलबंद द्वितीयक कंटेनर में रखें जैसे कि लीक-प्रूफ प्लास्टिक बैग या एक प्लास्टिक कंटेनर जिसे बायोहाजार्ड लेबल के साथ लेबल किया गया है। बायोहैजार्ड के परिवहन के लिए संस्थागत प्रोटोकॉल के अनुसार ऊतकों को उठाया और बर्फ पर ले जाया जाता है।
  2. कैडवेरिक नमूने
    1. बरामद अंगों को कोल्ड स्टोरेज समाधान में डुबोएं, एक सील किए गए द्वितीयक नियंत्रण पोत में रखें, और बायोहैजार्ड के परिवहन के लिए संस्थागत प्रोटोकॉल के अनुसार बर्फ पर परिवहन करें।

3. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. कम से कम एक दिन पहले कोलेजन-लेपित प्लेटें बनाएं।
    1. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में, 5 एमएल आइसोप्रोपिल अल्कोहल, 8.7 एमएल एसिटिक एसिड और कोलेजन आई पाउडर के 0.5 μg मिलाएं। बाँझ पानी के साथ 50 मिलीलीटर तक लाएं। 0.45 μm फ़िल्टर के माध्यम से मिलाएं और फ़िल्टर करें।
    2. बाँझ सेल कल्चर हुड के तहत, पूरे तल को कवर करने के लिए 6 अच्छी प्लेटों और 10 सेमी व्यंजनों में पर्याप्त कोलेजन समाधान जोड़ें। प्लेट को कवर करें और कमरे के तापमान पर 4-6 घंटे के लिए बैठने दें। एक बाँझ पिपेट के साथ अतिरिक्त घोल को हटा दें, एक नई बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें, और अतिरिक्त प्लेटें बनाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बचाएं। समाधान कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सुखाएं, और बाद में उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर एक पुनर्चक्रण योग्य बैग में स्टोर करें। कोलेजन-लेपित प्लेटों और व्यंजनों को कई महीनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. निम्नलिखित वस्तुओं को ऑटोक्लेव करें: ऊतक बल, ऊतक कैंची, कपास स्वैब और धुंध पैड।
  3. वीईसी विकास मीडिया: निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एंडोथेलियल सेल विकास माध्यम तैयार करें और उपयोग करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें। कोशिकाओं पर उपयोग से ठीक पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें, वार्मिंग स्नान में मीडिया को आवश्यकता से अधिक समय तक न छोड़ें (10-15 मिनट पर्याप्त है)। तैयारी के एक महीने के भीतर मीडिया का उपयोग करें।
  4. वीआईसी विकास मीडिया: पूरक डीएमईएम बेस माध्यम (4.5 ग्राम / एल ग्लूकोज, एल-ग्लूटामाइन पूरक, 110 मिलीग्राम / एल सोडियम पाइरूवेट) 30 के साथ 10% गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस और 100 आईयू / एमएल पेनिसिलिन और 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन। 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें। कोशिकाओं पर उपयोग से ठीक पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें, वार्मिंग स्नान में मीडिया को आवश्यकता से अधिक समय तक न छोड़ें (10-15 मिनट पर्याप्त है)।
  5. उपयोग से ठीक पहले बाँझ कुल्ला समाधान बनाएं। 2.5 μg / mL कवकनाशी, 0.05 mg / mL जेंटामाइसिन और 5 μg / mL जीवाणुनाशक के साथ बाँझ पीबीएस पूरक करें।
  6. उपयोग से ठीक पहले बाँझ कोलेजनेज समाधान बनाएं। बाँझ ताजा डीएमईएम बेस माध्यम के 5 एमएल में 5 मिलीग्राम कोलेजनेज II जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं और 0.45 μm फ़िल्टर से गुजरकर घोल को निष्फल करें। उपयोग होने तक बर्फ पर रखें।

4. ऊतक तैयारी और प्रसंस्करण

नोट: काम शुरू करने से पहले मानव ऊतकों के उपयोग के लिए संस्थागत अनुमोदन प्राप्त किया जाना चाहिए। ऊतकों को संभालते समय, निम्नलिखित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहने जाने चाहिए: एक डिस्पोजेबल लिक्विड बैरियर रैप-अराउंड गाउन, या एप्रन और डिस्पोजेबल आस्तीन के चारों ओर तरल-बैरियर रैप के साथ एक समर्पित बटन फ्रंट लैब कोट; सर्जिकल मास्क के साथ एक पूर्ण फेस शील्ड, या सुरक्षा चश्मा; डबल दस्ताने; करीबी जूते; और पैरों को ढंकने के लिए कपड़े। कैल्सीफिकेशन मूल्यांकन (धारा 5) और सेल अलगाव (धारा 6 और 7) के लिए ऊतक तैयारी के व्यापक वर्कफ़्लो आरेख क्रमशः चित्रा 1 ए, बी में चित्रित किए गए हैं।

  1. कैडवेरिक अंग नमूना प्राप्त होने पर, महाधमनी जड़ का उत्पादन और बाँझ कुल्ला घोल के 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में डूब जाता है। सर्जिकल नमूना प्राप्त होने पर, परिवहन जहाजों से हटा दें और बाँझ कुल्ला समाधान के 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में डूब जाएं। रॉकर पर बर्फ की बाल्टी में ऊतक युक्त ट्यूब रखें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए मिलाएं।
    नोट: निष्कर्षण के समय के जितना संभव हो उतना करीब ऊतकों को संसाधित करने से सबसे अच्छी सेल रिकवरी होगी, हालांकि व्यवहार्य कोशिकाओं को एक्सिशन के बाद 61 घंटे से ऊपर एकत्र किया जा सकता है, और डेटा से पता चलता है कि समय बढ़ने के साथ वीआईसी वीईसी की तुलना में अधिक मजबूत होते हैं। यदि ऊतक को तुरंत संसाधित नहीं किया जा सकता है, तो जब संभव हो, ऊतक को हटा दें, चरण 4.1 करें, और फिर ऊतक को ताजा बाँझ कोल्ड स्टोरेज समाधान में वापस रखें और आगे बढ़ने के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। रात या सप्ताहांत सर्जरी के दौरान एकत्र किए गए वाल्व को 4 डिग्री सेल्सियस पर 40 एमएल कोल्ड स्टोरेज समाधान में संग्रहीत किया जा सकता है और अभी भी निष्कर्षण के बाद 2 दिनों से अधिक व्यवहार्य कोशिकाओं को उत्पन्न करने में सक्षम हैं।
  2. 70% इथेनॉल के साथ ट्यूबों को स्प्रे करें और बाँझ हुड में जाएं। ऊतक और उत्पाद शुल्क दो वाल्व पत्रक हटा दें (चित्रा 2 ए)। एक क्रायोजेनिक शीशी में एक पत्रक रखें (या 2-3 शीशियां यदि भविष्य के विश्लेषण के लिए कई छोटे टुकड़ों की आवश्यकता होती है) और तरल नाइट्रोजन में गिरकर फ्रीज करें फिर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    1. यदि वाल्व द्विस्पिड है, तो केवल एक पत्रक का उत्पादन करें। कैंची का उपयोग करके, पत्रक को नोड्यूल से हिंज तक आधा काट लें। स्नैप फ्रीजिंग के लिए पत्रक के आधे हिस्से का उपयोग करें और चरण 4.3 के लिए दूसरे आधे हिस्से का उपयोग करें।
  3. पैराफिन एम्बेडिंग के लिए दूसरे पत्रक को संसाधित करें ताकि कैल्सीफिकेशन सामग्री का आकलन किया जा सके और इसे नोड्यूल से हिंज तक आधा काट दिया जा सके। दोनों टुकड़ों को एक कैसेट में रखें जो 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में डूबा हुआ है, फिर आरटी पर एक रॉकर पर न्यूनतम 2 घंटे के लिए रखें लेकिन 4 घंटे से अधिक नहीं।
    नोट: लंबे निर्धारण समय इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन के साथ अधिक पृष्ठभूमि बनाते हैं। एक बार चरण 4.2 और 4.3 का प्रदर्शन हो जाने के बाद, तुरंत धारा 6 पर जाएं और चरण 6.12 के बाद चरण 4.4 पर वापस आएं।
  4. निर्धारण के बाद, 1 घंटे 3-4 बार ताजा पीबीएस में डूबकर ऊतकों को धोएं। इन धोने के बाद, यदि आवश्यक हो तो नमूने कई महीनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में रह सकते हैं। एम्बेड करने से ठीक पहले अगले चरण पर आगे बढ़ें।
  5. धीरे-धीरे पीबीएस से 70% इथेनॉल में बदलें। 1: 4 70% इथेनॉल: पीबीएस के साथ प्रत्येक चरण में 30-60 मिनट धोएं; 1: 1 70% इथेनॉल: पीबीएस, 4: 1 70% इथेनॉल: पीबीएस; 70% इथेनॉल।
  6. ऊतक को इस तरह एम्बेड करें कि अनुभाग स्थापित प्रोटोकॉल 31 के अनुसार पत्रक (चित्रा 1 ए) की तीन परतों को प्रकटकरेंगे। वैकल्पिक रूप से, और यदि उपलब्ध हो, तो ऊतक को एम्बेड करने और काटने के लिए पैथोलॉजी कोर में लाएं।
  7. ऊतकों को संभालने के बाद, पीपीई को उचित रूप से निपटाने या स्टोर करें और तुरंत हाथ धोएं। सभी उपकरणों, सतहों और ठोस और तरल कचरे को ब्लीच या डिटर्जेंट कीटाणुनाशक के 1:10 कमजोर पड़ने के साथ परिचालित करें। परिशोधन के लिए 20 मिनट की अनुमति दें, फिर 70% इथेनॉल कुल्ला के साथ पालन करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार माइकोप्लाज्मा स्प्रे के साथ सेल कल्चर हुड का इलाज करें।

5. कैल्शियम सामग्री के लिए वॉन कोसा धुंधला

नोट: यह सेल अलगाव और लाइन स्थापना के बाद अच्छी तरह से किया जा सकता है लेकिन ऊतक के कैल्सीफिकेशन स्तर को स्थापित प्राथमिक सेल लाइन से संबंधित दस्तावेजों से जोड़ना सुनिश्चित करें।

  1. ग्लास स्लाइड पर 5 या 10 μm मोटी पैराफिन स्लाइस काटें और स्लाइड को 1 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें, फिर आरटी में ठंडा करें।
  2. ताजा समाधानों का उपयोग करके, निम्नानुसार जलमग्न करके स्लाइडों को डीपैराफिनाइज़ करें: 30 मिनट, 2x के लिए 100% जाइलीन; 3 मिनट, 2x के लिए 100% इथेनॉल; 3 मिनट के लिए 90% इथेनॉल; 3 मिनट के लिए 80% इथेनॉल; 3 मिनट के लिए 70% इथेनॉल; 3 मिनट के लिए 50% इथेनॉल; 3 मिनट के लिए अल्ट्राप्योर पानी; अगले चरणों तक अल्ट्राप्योर पानी में रखें।
    नोट: ऊपर दिए गए समय न्यूनतम हैं, प्रत्येक चरण लंबा हो सकता है।
  3. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार वॉन कोसा स्टेनिंग के साथ आगे बढ़ें।
  4. सूक्ष्म रूप से पूर्ण वाल्व क्षेत्र का आकलन करें और एक नियंत्रण ऊतक (कैल्सीफिकेशन का कोई संकेत नहीं) या सीएवीडी (कैल्सीफिकेशन का कोई सबूत, चित्रा 2 बी) असाइन करें।

6. वाल्व एंडोथेलियल सेल (वीईसी) अलगाव, विस्तार और पुष्टि

  1. एक बाँझ सेल कल्चर हुड में, शेष वाल्व पत्रक युक्त शंक्वाकार ट्यूब खोलें और पत्रक को बर्फ के ठंडे पीबीएस से भरे एक नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें। कैप ट्यूब और धीरे से आरटी पर 2 मिनट के लिए एक रॉकर पर रखें।
  2. ठंडे कोलेजनेज समाधान के 5-7 एमएल से भरे 60 मिमी डिश में ऊतक को हटा दें। बल का उपयोग करके, पत्रक के दोनों किनारों को घोल में 3-4 बार डुबोएं। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 5-10 मिनट के लिए ऊतक को इनक्यूबेट करें, ऊतक को हर 2 मिनट 3-4 बार धीरे से हिलाएं।
  3. डिश से घोल के 2 एमएल को निकालें और एक बाँझ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें। नोड्यूल पर बल रखें और एक सूखे बाँझ कपास के फाहे का उपयोग करें ताकि इसे पत्रक के साथ ले जाते समय स्वैब को घुमाते हुए, बल से हिंज तक स्वाइप किया जा सके। प्रत्येक स्वाइप के बीच, कोशिकाओं को हटाने के लिए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में घोल में स्वैब को स्वाइप करें। ऊतक की सतह को पूरी तरह से स्वैब करने के लिए दोहराएं, फिर पलटें और दूसरी तरफ दोहराएं।
  4. वाल्व पत्रक को एक हाथ में बल के साथ पकड़ते हुए, और दूसरे में 1 एमएल पिपेट, डिश में घोल के साथ पत्रक की सतहों को कुल्ला करें। एक बार कुल्ला करने के बाद, डिश में वीईसी वाले सभी घोल को स्वैब से कोशिकाओं के साथ उसी 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और चरण 6.5 पर आगे बढ़ें। शेष वाल्व ऊतक को 7 एमएल बाँझ कोलेजनेज समाधान के साथ एक नए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें और चरण 7.1 पर आगे बढ़ें।
  5. पृथक वीईसी को पेलेट करने के लिए 5 मिनट के लिए 180 x g पर वीईसी युक्त ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाला और वीईसी विकास मीडिया के 3 एमएल में पुन: निलंबित करें। सेंट्रीफ्यूज एक बार और करें और सुपरनैटेंट को हटा दें। कोशिकाओं को 1 एमएल विकास मीडिया में पुन: निलंबित करें और हेमोसाइटोमीटर और ट्रिपैन ब्लू का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें।
  6. वीईसी विकास मीडिया के 2 एमएल में वीईसी गोली को पुन: निलंबित करें और कोशिकाओं को लगभग 5 x10 5 कोशिकाओं / सेमी2 पर 6 वेल प्लेट के कोलेजन पूर्व-लेपित कुएं में प्लेट करें। कोशिकाओं को कम से कम 3-4 दिनों तक बढ़ने दें, फिर मीडिया को हटा दें और ताजा मीडिया के साथ फिर से भरें। हर 4 दिनों में मीडिया बदलें। वीईसी कोबलस्टोन के आकार के पैच (चित्रा 3 बी, बाएं पैनल) में बढ़ेंगे।
  7. जब वीईसी पैच प्लेट के >80% को कवर करते हैं, तो कोशिकाओं को लगभग 1.3 x 104 कोशिकाओं / सेमी 2 पर विभाजित करते हैं, जोइस बात पर निर्भर करता है कि वे कितनी तेजी से बढ़ते हैं (यदि वे 1 सप्ताह से कम समय में 80% तक पहुंचते हैं तो कोशिकाओं / सेमी 2 की थोड़ी कम संख्या पर विभाजितहोते हैं)।
  8. विभाजित करने के लिए, कोशिकाओं को 2 एमएल डीपीबीएस के साथ दो बार धोएं फिर कोशिकाओं की सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, यह सुनिश्चित करने के लिए जांच करें कि कोशिकाएं ओवरक्यूबेट न हों। वीईसी विकास मीडिया की समान मात्रा जोड़कर पाचन बंद करें और तरल को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 180 x g पर सेंट्रीफ्यूज, सतह पर तैरने वाला हटा दें, और आवश्यक कुओं / प्लेटों की संख्या के लिए मीडिया की उचित मात्रा में पुन: निलंबित करें।
    नोट: एक बार 10 सेमी प्लेट वीईसी में विस्तारित होने के बाद कभी-कभी अपनी आकृति विज्ञान खो सकते हैं और फेनोटाइप बदल सकते हैं क्योंकि वे प्रसार करते हैं। यह तब होता है जब सेल लाइन की स्थापना और विस्तार के दौरान वीईसी को कम स्थिरता पर बीज दिया जाता है।
  9. एक शुद्ध संस्कृति की गारंटी देने के लिए हर विभाजन के साथ सीडी 31+ सुपरपैरामैग्नेटिक मोतियों का उपयोग करने पर विचार करें।
  10. 1 x 108 या उससे कम कोशिकाओं (एक 10 सेमी डिश या उससे कम) के लिए, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार धोकर 25 μL सुपरपैरामैग्नेटिक मोती तैयार करें।
    नोट: चरण 6.10 को वीईसी के ट्रिप्सिनाइजेशन से पहले करने की सिफारिश की जाती है।
  11. चरण 6.8 में कोशिकाओं को अलग करें, लेकिन 0.1% बीएसए, पीएच 7.4 के साथ पीबीएस के 500 μL में फिर से निलंबित हो जाते हैं, और 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जगह देते हैं। कोशिकाओं की 2 एमएल ट्यूब में 500 μL धुले हुए और पुन: निलंबित मोती जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एक घूर्णन पर इनक्यूबेट करें।
  12. 2 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब रखें। जबकि ट्यूब अभी भी चुंबक में है, सावधानी से सुपरनैटेंट को हटा दें। चुंबक से ट्यूब निकालें, 0.1% बीएसए के साथ 1 एमएल ताजा पीबीएस जोड़ें, धीरे से 2-3 बार पिपेट करें, फिर 2 मिनट के लिए चुंबक पर वापस रखें। दो बार और दोहराएं। बफर को अंतिम रूप से हटाने के बाद, रिप्लेटिंग के लिए आवश्यक मात्रा में विकास मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    नोट: कोशिकाओं में अभी भी मोती होंगे, लेकिन ये विकास को प्रभावित नहीं करेंगे और बाद के मार्गों में हटा दिए जाएंगे।
  13. एक बार कोशिकाओं का विस्तार हो जाने के बाद, आकृति विज्ञान के अलावा, इम्यूनोफ्लोरोसेंट मार्करों जैसे वॉन विलेब्रांड फैक्टर (वीडब्ल्यूएफ), कैडरिन 5 (सीडीएच 5), या पीईसीएएम -1/सीडी 31 के लिए सकारात्मक धुंधलापन द्वारा वीईसी फेनोटाइप की पुष्टि करें, और कैल्पोनिन 1 (सीएनएन) या अल्फा -2 चिकनी मांसपेशी एक्टिन जैसे वीआईसी मार्करों के लिए नकारात्मक धुंधलापन ।।

7. वाल्व इंटरस्टीशियल सेल (वीआईसी) अलगाव, विस्तार और भंडारण

  1. जैसा कि चरण 6.4 में कहा गया है, वाल्व ऊतक से वीईसी को हटाने के बाद, पत्रक को 7 एमएल कोलेजनेज समाधान के साथ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखा जाता है। गैस विनिमय की अनुमति देने के लिए कैप को थोड़ा खुला रखते हुए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 12 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। वीआईसी का सफल अलगाव अभी भी कोलेजनेज समाधान में 18 घंटे तक हो सकता है।
  2. इनक्यूबेशन बाद, एक बाँझ सेल कल्चर हुड में, पत्रक ऊतक से वीआईसी की रिहाई सुनिश्चित करने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ पाइपिंग करके ऊतक को धीरे से मिलाएं।
  3. सेल निलंबन को हटा दें और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 0.70 μm फ़िल्टर के माध्यम से पास करें।
  4. 50 एमएल ट्यूब में 7 एमएल वीआईसी विकास माध्यम जोड़ें और 5 मिनट के लिए 180 x g पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। वीआईसी विकास मीडिया के 1 एमएल में एस्पिरेटेड सुपरनैटेंट और रीससस्पेंड सेल पेलेट और सेल नंबर निर्धारित करें। 60 मिमी ऊतक-संस्कृति उपचारित डिश में वीआईसी को 1.3 x 104 कोशिकाओं / सेमी2 पर प्लेट करें।
  5. मीडिया को बदलने से कम से कम 1-2 दिन पहले कोशिकाओं को बढ़ने दें। अवशिष्ट मलबे को हटाने के लिए मीडिया को हटा दें और दो बार डीपीबीएस धोएं और ताजा विकास माध्यम के साथ बदलें। हर 2-3 दिनों में माध्यम को फिर से भरें। वीआईसी फाइब्रोब्लास्ट आकार में बढ़ेगा (चित्रा 3 बी, दाएं पैनल)।
  6. जब वीआईसी >90% की स्थिरता तक पहुंच जाता है, तो अतिरिक्त मीडिया को हटाने के लिए डीपीबीएस के साथ दो बार धोएं और प्लेट को कवर करने के लिए पूर्व-गर्म पृथक्करण अभिकर्मक की उचित मात्रा जोड़कर कोशिकाओं को अलग करें (यानी, 2-3 एमएल प्रति 10 सेमी डिश)। डिश को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। वीआईसी इनक्यूबेशन के 2-3 मिनट के बाद डिश से अलग हो जाएंगे। पूर्व-गर्म मीडिया के 4-6 एमएल जोड़ें।
    नोट: यदि कोशिकाओं को प्लेट से उठाने में 3 मिनट से अधिक समय लगता है, तो पृथक्करण अभिकर्मक ने शक्ति खो दी हो सकती है। यदि आवश्यक हो, तो कोशिकाओं को धीरे से उठाने के लिए एक सेल स्क्रैपर का उपयोग किया जा सकता है।
  7. सेल निलंबन को एक ट्यूब में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 180 x g पर धीरे से सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को हटाने के बाद, धीरे से प्री-वार्मेड वीआईसी ग्रोथ मीडिया में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें और हेमोसाइटोमीटर और ट्रिपैन ब्लू का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें। मूल डिश के 1: 2 घनत्व पर व्यवहार्य कोशिकाओं को बीज दें (यानी, ~ 1 × 106 कोशिकाएं प्रति 10 सेमी डिश या 1.3 x 104 कोशिकाएं / सेमी2)।
  8. इम्यूनोफ्लोरोसेंट मार्करों जैसे कि एफएसएमए, सीएनएन, या एसएम 22 के लिए सकारात्मक धुंधलापन और सीडी 31, सीडीएच 5, या वीडब्ल्यूएफ जैसे वीईसी मार्करों के लिए नकारात्मक धुंधलापन द्वारा वीआईसी फेनोटाइप का आकलन करें (चित्रा 4, दाएं पैनल)।
    नोट: यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल वर्कफ़्लो निष्पक्ष रूप से वीईसी और वीआईसी अलगाव के लिए एक पत्रक का चयन करता है, जबकि शेष पत्रक का उपयोग वॉन कोसा स्टेनिंग (धारा 5) और स्नैप फ्रीजिंग के लिए किया जाता है।

8. दीर्घकालिक सेल भंडारण

  1. एक बार विस्तारित होने के बाद, लंबे समय तक भंडारण के लिए कोशिकाओं को फ्रीज करें। 2-5 एमएल डीपीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं फिर चरण 6.8 और 7.6 में कोशिकाओं को अलग करने के लिए पर्याप्त पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ें। वीईसी या वीआईसी विकास मीडिया की समान मात्रा जोड़कर पाचन बंद करें और सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. हेमोसाइटोमीटर और ट्रिपैन ब्लू का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें।
  3. 5 मिनट के लिए 180 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  4. ठंडे वातानुकूलित विकास मीडिया में कोशिकाओं को ~ 3 × 106 कोशिकाओं / एमएल के सेल घनत्व में पुन: निलंबित करें।
  5. धीरे से घूमने के साथ, ठंडा 2x क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम की समान मात्रा जोड़ें। यह सेल एकाग्रता को ~ 1.5 × 106 कोशिकाओं / एमएल तक लाएगा।
  6. क्रायोप्रिजर्वेशन शीशियों में 1 एमएल का उपयोग करें। कोशिकाओं को निलंबित रखने के लिए शीशियों को सेल फ्रीजिंग कंटेनर में रखें, 5-6 बार बंद करें और उलटा करें। कंटेनर को 6-72 घंटे के लिए या फ्रीजिंग कंटेनर प्रोटोकॉल के अनुसार -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। -80 डिग्री सेल्सियस से शीशियों को हटा दें और दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।

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Representative Results

उपरोक्त प्रोटोकॉल मानव वाल्व ऊतकों की हैंडलिंग और इन ऊतकों से व्यवहार्य सेल लाइनों के अलगाव और स्थापना के लिए आवश्यक चरणों को रेखांकित करता है। महाधमनी वाल्व के पत्रक पैराफिन एम्बेडिंग के लिए संसाधित होते हैं, जैव रासायनिक या आनुवंशिक विश्लेषण के लिए दीर्घकालिक भंडारण के लिए जमे हुए स्नैप होते हैं और वीईसी और वीआईसी के अलगाव के लिए पच जाते हैं (चित्रा 1)। जबकि सर्जिकल नमूनों में महाधमनी स्टेनोसिस का नैदानिक निदान होगा और कैल्सीफिकेशन के भारी नोड्यूल प्रदर्शित हो सकते हैं जो नग्न आंखों से दिखाई दे सकते हैं, महाधमनी वाल्व कैल्सीफिकेशन32 वर्ष के बुजुर्गों (>65 वर्ष) व्यक्तियों की एक महत्वपूर्ण संख्या में मौजूद है, और इस प्रसार के कारण सभी ऊतकों - सर्जिकल और कैडवेरिक - को वॉन कोसा स्टेनिंग या इसी तरह की प्रक्रिया के अधीन किया जाता है ताकि यह आकलन किया जा सके कि कैल्सीफिकेशन मौजूद है या नहीं (चित्रा 2)।

यह पाया गया कि कोल्ड स्टोरेज समाधान के उपयोग ने उत्पादित वाल्व ऊतक की कोशिकाओं को बहुत स्थिर कर दिया। कोल्ड स्टोरेज समाधान का उपयोग लाइव अंग प्रत्यारोपण में किया जाता है। इसे दाता से हटाने से पहले या बाद में अंगों के माध्यम से फ्लश किया जाता है और बर्फ पर परिवहन के दौरान उस अंग के वाहिका में छोड़ दिया जाता है। यह देखा गया कि वीईसी लाइनें सर्जिकल ऊतकों की तुलना में दाता नमूनों से अधिक आसानी से स्थापित की गई थीं, और दाता लाइनों को अधिक मार्ग के लिए अपने एंडोथेलियल सेल आकृति विज्ञान को बनाए रखने की अधिक संभावना थी। यह परेशान करने वाला था, क्योंकि दाता ऊतक अक्सर 12-24 घंटे के पोस्टमॉर्टम के लिए प्रयोगशाला तक नहीं पहुंचते थे, जबकि सर्जिकल ऊतक 2 से 4 घंटे के बीच प्राप्त किया जाता था। पीबीएस के बजाय कोल्ड स्टोरेज समाधान के साथ सर्जिकल नमूना ट्यूबों को पैक करने पर, सेल रिकवरी में बहुत वृद्धि हुई। जैसा कि चित्र 3 में देखा गया है, वाल्व निष्कर्षण के बाद व्यवहार्य वीईसी और वीआईसी दोनों को 61 घंटे से ऊपर प्राप्त किया जा सकता है। जबकि वाल्व छांटने के एक दिन बाद तक कोशिकाओं को अलग करने पर वीईसी की तुलना में जीवित वीआईसी का थोड़ा अधिक प्रतिशत प्राप्त किया जाता है, कोशिकाएं 48 घंटे के बाद व्यवहार्य रहती हैं। कुल बरामद कोशिकाओं का 40% तक जीवित कोशिकाओं के अनुरूप है और हमने जैविक प्रतिकृतियों के बीच लगातार आंकड़े देखे हैं। इसके अलावा, आकृति विज्ञान निरीक्षण भी सेल पहचान की पुष्टि करता है; जबकि वीईसी पैक्ड, कोबलस्टोन जैसी और विकास संपर्क-बाधित कोशिकाओं के रूप में दिखाई देते हैं, वीआईसी आकृति विज्ञान एक धुरी आकार के साथ मायोफाइब्रोब्लास्ट के समान है। नमूनों के इम्यूनोस्टेनिंग ने पुष्टि की कि विस्तारित वीईसी के 91.8% ± 1.8 (एन = 3) एंडोथेलियल मार्कर वीडब्ल्यूएफ के लिए सकारात्मक थे, जबकि विस्तारित वीआईसी के 92.0% ± 5.0 (एन = 3) अंतरालीय सेल मार्कर के लिए सकारात्मक थे (चित्रा 4)। ये आंकड़े पहले रिपोर्ट किए गएपरिणामों के अनुरूप हैं।

Figure 1
चित्र 1: वाल्व ऊतक प्रसंस्करण और मानव नियंत्रण और सीएवीडी वाल्व से सेल अलगाव। (ए) वाल्व के कैल्सीफिकेशन स्तरों के आकलन के लिए ऊतक प्रसंस्करण का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) नियंत्रण और सीएवीडी ऊतकों से मानव वाल्व एंडोथेलियल कोशिकाओं (वीईसी) और वाल्व अंतरालीय कोशिकाओं (वीआईसी) के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए समय पाठ्यक्रम और चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: कैल्सीफिकेशन का आकलन( ए) मानव दाताओं से नियंत्रण (ऊपर) और कैल्सीफाइड (नीचे) वाल्व ऊतकों की प्रतिनिधि छवि। ध्यान दें कि सीएवीडी ऊतक के कैल्सीफिकेशन नोड्यूल्स आकृति विज्ञान और पत्रकों को साफ करने की क्षमता को गंभीर रूप से बदल सकते हैं। (बी) मानव वाल्व ऊतक के निर्धारण और आगे के प्रसंस्करण के बाद नियंत्रण (बाएं) और सीएवीडी (दाएं) वाल्व ऊतक के प्रतिनिधि वॉन कोसा धुंधला होना। नोट कैल्सीफिकेशन पत्रक ऊतक में अंधेरे वर्षा की उपस्थिति से प्रकट होता है। वाल्व छवियों को एक प्रयोगशाला कैमरे के साथ कैप्चर किया गया था। वॉन कोसा सना हुआ वाल्व 10x उद्देश्य, स्केल बार 200 μm के साथ कैप्चर किया गया था। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: सेल सर्वाइवल (ए) वीईसी और वीआईसी उत्तरजीविता वक्रों का आकलन। पांच वाल्व नमूनों से तीन पत्रक प्राप्त किए गए थे। प्रत्येक वाल्व से पहला पत्रक तुरंत संसाधित किया गया था (निष्कर्षण के बाद 3-12 घंटे), दूसरे पत्रक को लगभग 24 घंटे बाद (22-35 घंटे) संसाधित किया गया था, और तीसरे पत्रक को ऊतक (45-61 घंटे) प्राप्त करने के लगभग 48 घंटे बाद संसाधित किया गया था। वाल्व पत्रक को कोल्ड स्टोरेज समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था जब तक कि उन्हें संसाधित नहीं किया गया था। वाई-अक्ष जीवित कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) वीईसी (बाएं पैनल) और वीआईसी (दाएं पैनल) की स्वस्थ संस्कृतियों की आकृति विज्ञान। ग्राफ़ एन = 5 वाल्व ऊतकों से अलग कोशिकाओं के एसडी लाइव सेल अनुपात ± दिखाते हैं। छवियों को क्रमशः 4x और 10x उद्देश्य, स्केल बार 200 μm और 100 μm के साथ कैप्चर किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: वीईसी और वीआईसी पर प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन। वीईसी एंडोथेलियल मार्कर वॉन विलेब्रांड फैक्टर (वीडब्ल्यूएफ, बाएं पैनल) के लिए सकारात्मक हैं, जबकि वीआईसी अंतरालीय मार्कर के लिए सकारात्मक हैं। ध्यान दें कि हमारा अलगाव प्रोटोकॉल एक उच्च अलगाव दक्षता की गारंटी देता है; वीईसी और वीआईसी के बीच कोई क्रॉस-संदूषण का पता नहीं चला है। छवियों को 10x उद्देश्य, स्केल बार 100 μm के साथ कैप्चर किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

मनुष्यों से नियंत्रण और रोग ऊतकों को प्राप्त करना इन विट्रो और पूर्व विवो रोग मॉडलिंग के लिए महत्वपूर्ण है; हालांकि, जबकि कोई अक्सर बेंच से बेडसाइड के बीच की खाई को पाटने की चुनौतियों के बारे में बात करता है, रिवर्स ऑर्डर - सर्जिकल सुइट से बेंच तक जाना - अक्सर एक अंतर के रूप में चुनौतीपूर्ण होता है। प्राथमिक मानव ऊतक नमूने प्राप्त करने के लिए एक बुनियादी वैज्ञानिक के लिए आवश्यक एक निवेशित सर्जन वैज्ञानिक के साथ सहयोग है, जिसमें नर्सों, सर्जिकल तकनीशियनों, चिकित्सक सहायकों, चिकित्सा छात्रों और निवासियों और नैदानिक प्रोटोकॉल प्रबंधकों की एक टीम है जो रोगियों को नामांकित और सहमति दे सकते हैं, उत्पादित ऊतकों के उचित संचालन में भाग ले सकते हैं और सहायता कर सकते हैं, और ऊतक पिकअप के लिए आवश्यक रसद का समन्वय कर सकते हैं। काटने से सेल अलगाव तक के समय को कम करने के लिए शामिल सभी लोगों के अत्यधिक प्रयास के बिना, महत्वपूर्ण सेलुलर सामग्री और इसमें शामिल जानकारी अपूरणीय रूप से बदल जाएगी या खो जाएगी।

ऊतक नमूनों की व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण कोल्ड स्टोरेज समाधान का उपयोग है। यह वही समाधान है जिसका उपयोग यूपीएमसी और अन्य प्रत्यारोपण चिकित्सा केंद्रों में अंग प्रत्यारोपण टीमों द्वारा किया जाता है। बेहतर सेल उपज कैडवेरिक ऊतकों से प्राप्त की गई थी, जिन्हें ऑपरेटिंग रूम से अधिक तेज़ी से प्राप्त ऊतकों की तुलना में दाता से कई घंटे पहले निकाला गया था, लेकिन ठंडे पीबीएस में रखा गया था। यह आकस्मिक खोज मानव ऊतकों से सेल खरीद के लिए आवश्यक रही है। प्रयोगशाला में ऊतक छांटने से प्रसव तक खरीद का समय सर्जिकल ऊतक के लिए 1-5 घंटे और कैडवेरिक ऊतक के लिए 24 घंटे से अधिक होता है। इसकी तुलना में, पशु ऊतकों की खरीद और प्रसंस्करण अक्सर इच्छामृत्यु के मिनटों के भीतर किया जा सकता है, जो सेल व्यवहार्यता के लिए आदर्श है। कोल्ड स्टोरेज समाधान की अनुपस्थिति में, यह संभावना है कि कोशिकाओं के संवर्धन के लिए उपयुक्त माध्यम भी पीबीएस से बेहतर प्रदर्शन कर सकता है, हालांकि जीवित अंग प्रत्यारोपण में कोल्ड स्टोरेज समाधान की सफलता और इस समाधान में कैडवेरिक ऊतकों की प्राप्ति के कारण इस माध्यम का परीक्षण नहीं किया गया था। समाधान शेल्फ-स्थिर है जो ऑपरेटिंग रूम में भंडारण के लिए आदर्श है, और एडेनोसिन जैसे विशिष्ट तत्व ों को इस्किमिया / हाइपोक्सिया 21,34 जैसे सेलुलरतनावों के लिए लाभकारी प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है।

व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक और आवश्यक कदम कवकनाशी, जेंटामाइसिन और जीवाणुनाशक के साथ ऊतकों को धोना है। यह छोटा कुल्ला यह सुनिश्चित करने में मदद करता है कि कोशिकाएं बैक्टीरिया और कवक से दूषित न रहें। वाल्व ऊतक से वीईसी को पचाने के चरण समान रूप से महत्वपूर्ण हैं, जहां कुछ ही मिनटों की अवधि में, वीईसी को अलग किया जाता है और फिर वाल्व पत्रकों की सतह से हटा दिया जाता है। पत्रक के घने बाह्य मैट्रिक्स पर रहने वाले वीआईसी के बाद के पाचन में अवधि और ताकत के लिए बहुत अधिक जगह होती है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित निष्पक्ष ऊतक उपचार वाल्व पत्रक, वीईसी और वीआईसी में मौजूद मुख्य दो सेल आबादी के अलगाव की अनुमति देता है। यद्यपि हाल ही में एकल सेल ट्रांसक्रिपटम विश्लेषण ने मानव वाल्व में रहने वाले कम से कम चौदह अलग-अलग सेल उपप्रकारों के सह-अस्तित्व को दिखाया है, जिसमें सीएवीडी ऊतक35 में छह गैर-वाल्व व्युत्पन्न स्ट्रोमल कोशिकाएं शामिल हैं, यह विविधता इन कठोर ऊतकों को संसाधित करने और पचाने के प्रभावों के कारण भिन्नताओं का प्रतिनिधित्व कर सकती है, या यह विभिन्न माइक्रोएन्वायरमेंट के कारण हो सकती है जिसमें पत्रक कोशिकाएं उजागर होती हैं: वीईसी दो अलग-अलग रक्त प्रवाह के संपर्क में आते हैं जबकि वीआईसी तीन अलग-अलग बाह्य मैट्रिक्स स्ट्रेटम 8,9 में एम्बेडेड होते हैं। यहां वर्णित बड़े पैमाने पर अलगाव प्रोटोकॉल और विश्लेषण यह सुनिश्चित करता है कि 90% से अधिक वीईसी और वीआईसी अपने मुख्य फेनोटाइप के अनुरूप हैं। यद्यपि हेटरोजेनेसिटी की एक डिग्री पाई जा सकती है, यह वीईसी और वीआईसी होमियोस्टेसिस 8,9,13,14,15,16 के अध्ययन के सामान्य परिणामों को प्रभावित नहीं करता है।

यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि रोगी और उनके वाल्व ऊतक, और इस प्रकार उनसे प्राप्त सेल लाइनें समान नहीं हैं। आनुवंशिकी, सह-रुग्णता, सर्जरी और प्रसंस्करण के दौरान हैंडलिंग, और पाचन समाधान सामग्री की ताजगी विकास दर और यहां तक कि शायद पृथक कोशिकाओं के व्यवहार या फेनोटाइप को प्रभावित कर सकती है। जबकि वर्तमान अध्ययन इस प्रक्रिया के साथ पर्याप्त संख्या में व्यवहार्य कोशिकाओं को उत्पन्न करने की क्षमता को प्रदर्शित करता है, इन सेल लाइनों में जन्मजात या प्रेरित अंतर हो सकते हैं जो डाउनस्ट्रीम प्रयोग को प्रभावित कर सकते हैं। रोगी या दाता से ऊतक को हटाने के बाद से समय को ठीक से जानना अक्सर मुश्किल होता है, और विशेष रूप से उत्तरार्द्ध के मामले में, परिसंचरण बंद होने के बाद का समय। इसके अलावा, प्राप्त व्यवहार्य वाल्व कोशिकाओं की संख्या, कोशिकाओं की प्रोलिफेरेटिव क्षमता और सेल फेनोटाइप के प्रतिधारण के बारे में ऊतकों के बीच अंतर्निहित परिवर्तनशीलता है। सेल लाइनें आनुवंशिक उत्परिवर्तन को परेशान कर सकती हैं - या तो जन्मजात या दैहिक - जिनमें से चिकित्सक और अनुसंधान टीम अनजान हैं, और ऊतकों के रीमॉडेलिंग और बाद में हैंडलिंग सेल फेनोटाइप या यहां तक कि एपिजेनेटिक्स को भी संशोधित कर सकते हैं। जैसे, उन सभी प्रयोगों के लिए जिनमें इन प्राथमिक मानव कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है, यह बिल्कुल आवश्यक है कि जैविक प्रतिकृतियां - यानी, विभिन्न रोगियों से प्राप्त सेल लाइनों का उपयोग किया जाए, बावजूद इसके कि वे पर्याप्त समय और लागत वहन करते हैं। यह सुनिश्चित करने में मदद करता है कि कोई भी परिणाम ऊतक की खरीद और प्रसंस्करण से भ्रामक प्रभावों के कारण नहीं है। विभिन्न सेल लाइनों की परिवर्तनीय प्रसार दर को या तो अलग-अलग समय पर प्रयोगों में कोशिकाओं को इकट्ठा करके या विभिन्न घनत्वों पर प्रयोगों के लिए कोशिकाओं को सीडिंग करके समायोजित किया जा सकता है; कोई भी जवाब सभी प्रयोगात्मक डिजाइनों के लिए सबसे अच्छा नहीं है। हालांकि जटिलताएं महत्वहीन नहीं हैं, इन विट्रो और एक्स विवो प्रयोगात्मक मॉडल के लिए प्राथमिक मानव नियंत्रण और सीएवीडी ऊतक-व्युत्पन्न सेल लाइनों का उपयोग सीएवीडी रोगजनन को चलाने वाले शुरुआती कारकों को परिभाषित करने और प्रक्रियाओं का प्रचार करने के लिए आवश्यक है।

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Disclosures

आईएस को एट्रिकर और मेडट्रोनिक से संस्थागत अनुसंधान सहायता प्राप्त होती है और मेडट्रोनिक संवहनी के लिए सलाहकार के रूप में कार्य करता है। इनमें से कोई भी संघर्ष इस काम से संबंधित नहीं है। अन्य सभी लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि की व्यावहारिक चर्चा और महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए जेसन डोबिन्स को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम उनकी मदद और समर्थन के लिए सेंटर फॉर ऑर्गन रिकवरी एंड एजुकेशन को स्वीकार करना चाहते हैं और इस अध्ययन को संभव बनाने के लिए ऊतक दाताओं और उनके परिवारों को धन्यवाद देते हैं। हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित अध्ययनों में नामांकित व्यक्तियों से सभी रोगी नमूने एकत्र किए जाते हैं। सेंटर फॉर ऑर्गन रिकवरी एंड एजुकेशन (CORE) के माध्यम से प्राप्त कैडवेरिक ऊतकों को पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय की कमेटी फॉर ओवरसाइट ऑफ रिसर्च एंड क्लिनिकल ट्रेनिंग (CORID) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

Biorender.com के साथ बनाए गए कुछ आंकड़े।

सीएसएच को नेशनल हार्ट, लंग एंड ब्लड इंस्टीट्यूट के 22 एचएल 117917 और आर01 एचएल 142932, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन 20आईपीए 35260111 द्वारा समर्थित किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter Thermo Scientific 7211345 Preparing plate with collagen coating
10 cm cell culture plate Greiner Bio-One 664160 Cell culture/cell line expansion
10 mL serological pipet Fisher 14955234 VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
1000 μL filter tips VWR 76322-154 Cell culture/cell line expansion
10XL filter tips VWR 76322-132 Cell culture/cell line expansion
15 mL conical tubes Thermo Scientific 339650 Tissue storage, VIC/VEC isolation
16% paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710S Tissue and cell fixative
190 proof ethanol Decon 2801 Disinfection
1x DPBS: no calcium, no magnesium Gibco 14190250 Saline solution. VIC/VEC isolation
1x PBS Fisher BP2944100 Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
20 μL filter tips VWR 76322-134 Cell culture/cell line expansion
200 proof ethanol Decon 2701 Deparaffinizing tissue samples
2-propanol Fisher A416P 4 Making collagen coated plates
5 mL serological pipet Fisher 14955233 VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 Tissue storage, VIC/VEC isolation
60 mm dish GenClone 25-260 VEC isolation
6-well cell culture plate Corning 3516 Cell culture/cell line expansion
Acetic acid, glacial Fisher BP2401 500 Making collagen coated plates
AlexaFluor 488 phalloidin Invitrogen A12379 Fluorescent f-actin counterstain
Belzer UW Cold Storage Transplant Solution Bridge to Life BUW0011L Tissue storage solution
Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25g Bioworld 220700233 VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
Calponin 1 antibody  Abcam ab46794 Primary antibody (VIC positive stain)
CD31 (PECAM-1) (89C2) Cell Signaling 3528 Primary antibody (VEC positive stain)
CD31+ Dynabeads Invitrogen 11155D VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
CDH5 Cell Signaling 2500 Primary antibody (VEC positive stain)
Cell strainer with 0.70 μm pores Corning 431751 VIC isolation
Collagen 1, rat tail protein Gibco A1048301 Making collagen coated plates
Collagenase II Worthington Biochemical Corporation LS004176 Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray Decon 4101 Disinfection
Countess II Automated Cell Counter Invitrogen A27977 Automated cell counter
Countess II reusable slide coverslips Invitrogen 2026h Automated cell counter required slide cover
Coverslips Fisher 125485E Mounting valve samples
Cryogenic vials Olympus Plastics 24-202 Freezing cells/tissue samples
Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula  Clorox N/A Disinfection
DMEM Gibco 10569044 Growth media. VIC expansion
EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 Lonza Walkersville CC3129 Growth media. VEC expansion
EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit Lonza Walkersville CC4176 Growth media supplement. VEC expansion
EVOS FL Microscope Life Technologies Model Number: AME3300 Fluorescent imaging
EVOS XL Microscope Life Technologies AMEX1000 Visualizing cells during cell line expansion
Fetal Bovine Serum - Premium Select R&D Systems S11550 VIC expansion
Fine scissors Fine Science Tools 14088-10 Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Fisherbrand Cell Scrapers Fisher 08-100-241 VIC expansion
Fungizone Gibco 15290-026 Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Gentamicin Gibco 15710-064 Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Glass slides Globe Scientific Inc 1358L mounting valve samples
Goat anti-Mouse 488 Invitrogen A11001 Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Mouse 594 Invitrogen A11005 Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 488 Invitrogen A11008 Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 594 Invitrogen A11012 Fluorescent secondary Antibody
Invitrogen Countess II FL Reusable Slide Invitrogen A25750 Automated cell counter required slide
Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) Invitrogen R37606 Fluorescent nucleus counterstain
LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cells HyClone Laboratories, Inc. SR30002 Frozen cell storage
Mounting Medium Fisher Chemical Permount SP15-100 Mounting valve samples
Mr. Frosty freezing container Nalgene 51000001 Container for controlled sample freezing
Mycoplasma-ExS Spray PromoCell PK-CC91-5051 Disinfection
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140163 Antibiotic. VIC expansion
Plasmocin Invivogen ANTMPT Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion
SM22a antibody Abcam ab14106 Primary antibody (VIC positive stain)
Sstandard pattern scissors Fine Science Tools 14001-14 Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Sterile cotton swab Puritan 25806 10WC VEC isolation
Swingsette human tissue cassette Simport Scientific M515-2 Tissue embedding container
Taylor Forceps (17cm) Fine Science Tools 11016-17 Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061 cell counting solution
TrypLE Express Enzyme Gibco 12604021 Splitting VIC/VECs
Von Kossa kit Polysciences 246331 Staining paraffin sections of tissues for calcification
von Willebrand factor antibody Abcam ab68545 Primary antibody (VEC positive stain)
Xylenes Fisher Chemical X3S-4 Deparaffinizing tissue samples
αSMA antibody Abcam ab7817 Primary antibody (VIC positive stain)

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References

  1. Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
  2. Nishimura, R. A., et al. AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines. Circulation. 129, 2440-2492 (2014).
  3. Clark, M. A., et al. Clinical and economic outcomes after surgical aortic valve replacement in Medicare patients. Risk Manag Healthc Policy. 5, 117-126 (2012).
  4. Misfeld, M., Sievers, H. H. Heart valve macro- and microstructure. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 362, 1421-1436 (2007).
  5. Anstine, L. J., Bobba, C., Ghadiali, S., Lincoln, J. Growth and maturation of heart valves leads to changes in endothelial cell distribution, impaired function, decreased metabolism and reduced cell proliferation. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 100, 72-82 (2016).
  6. Mahler, G. J., Butcher, J. T. Inflammatory regulation of valvular remodeling: the good(?), the bad, and the ugly. Internation Journal of Inflammation. 2011, 721419 (2011).
  7. Gould, S. T., Matherly, E. E., Smith, J. N., Heistad, D. D., Anseth, K. S. The role of valvular endothelial cell paracrine signaling and matrix elasticity on valvular interstitial cell activation. Biomaterials. 35, 3596-3606 (2014).
  8. Leopold, J. A. Cellular mechanisms of aortic valve calcification. Circulation: Cardiovascular Intervention. 5, 605-614 (2012).
  9. Chen, J. H., Simmons, C. A. Cell-matrix interactions in the pathobiology of calcific aortic valve disease: Critical roles for matricellular, matricrine, and matrix mechanics cues. Circulation Research. 108, 1510-1524 (2011).
  10. Sacks, M. S., Schoen, F. J., Mayer, J. E. Bioengineering challenges for heart valve tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 289-313 (2009).
  11. Taylor, P. M., Batten, P., Brand, N. J., Thomas, P. S., Yacoub, M. H. The cardiac valve interstitial cell. Internation Journal of Biochemistry and Cell Biology. 35, 113-118 (2003).
  12. Taylor, P. M., Allen, S. P., Yacoub, M. H. Phenotypic and functional characterization of interstitial cells from human heart valves, pericardium and skin. Journal of Heart Valve Disease. 9, 150-158 (2000).
  13. Rajamannan, N. M., et al. Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group. Executive summary: Calcific aortic valve disease-2011 update. Circulation. 124, 1783-1791 (2011).
  14. Wang, H., Leinwand, L. A., Anseth, K. S. Cardiac valve cells and their microenvironment--insights from in vitro studies. Nature Reviews Cardiology. 11, 715-727 (2014).
  15. Yutzey, K. E., et al. Calcific aortic valve disease: a consensus summary from the Alliance of Investigators on Calcific Aortic Valve Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34, 2387-2393 (2014).
  16. Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 317, 141-155 (2019).
  17. Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. American Journal of Pathology. 171, 1407-1418 (2007).
  18. Liu, A. C., Gotlieb, A. I. Characterization of cell motility in single heart valve interstitial cells in vitro. Histology and Histopathology. 22, 873-882 (2007).
  19. Yip, C. Y., Chen, J. H., Zhao, R., Simmons, C. A. Calcification by valve interstitial cells is regulated by the stiffness of the extracellular matrix. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29, 936-942 (2009).
  20. Song, R., Fullerton, D. A., Ao, L., Zhao, K. S., Meng, X. An epigenetic regulatory loop controls pro-osteogenic activation by TGF-beta1 or bone morphogenetic protein 2 in human aortic valve interstitial cells. Journal of Biological Chemistry. 292, 8657-8666 (2017).
  21. Xu, M. H., et al. Absence of the adenosine A2A receptor confers pulmonary arterial hypertension and increased pulmonary vascular remodeling in mice. Journal of Vascular Research. 48, 171-183 (2011).
  22. Jian, B., Narula, N., Li, Q. Y., Mohler, E. R., Levy, R. J. Progression of aortic valve stenosis: TGF-beta1 is present in calcified aortic valve cusps and promotes aortic valve interstitial cell calcification via apoptosis. Annals of Thoracic Surgery. 75, 465 (2003).
  23. Bogdanova, M., et al. Interstitial cells in calcified aortic valves have reduced differentiation potential and stem cell-like properties. Science Reports. 9, 12934 (2019).
  24. Gendron, N., et al. Human aortic valve interstitial cells display proangiogenic properties during calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (1), 415-429 (2021).
  25. Wirrig, E. E., Yutzey, K. E. Conserved transcriptional regulatory mechanisms in aortic valve development and disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 737-741 (2014).
  26. Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 270-278 (2014).
  27. Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310 (2011).
  28. Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2158 (2010).
  29. Miller, L. J., Lincoln, J. Isolation of murine valve endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51860 (2014).
  30. Selig, J. I., et al. Impact of hyperinsulinemia and hyperglycemia on valvular interstitial cells - A link between aortic heart valve degeneration and type 2 diabetes. Biochimica Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1865, 2526-2537 (2019).
  31. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  32. Martinsson, A., et al. Temporal trends in the incidence and prognosis of aortic stenosis: A nationwide study of the Swedish population. Circulation. 131, 988-994 (2015).
  33. Rabkin-Aikawa, E., Farber, M., Aikawa, M., Schoen, F. J. Dynamic and reversible changes of interstitial cell phenotype during remodeling of cardiac valves. Journal of Heart Valve Diseases. 13, 841-847 (2004).
  34. St Hilaire, C., Carroll, S. H., Chen, H., Ravid, K. Mechanisms of induction of adenosine receptor genes and its functional significance. Journal of Cell Physiology. 218, 35-44 (2009).
  35. Xu, K., et al. Cell-type transcriptome atlas of human aortic valves reveal cell heterogeneity and endothelial to mesenchymal transition involved in calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40, 2910-2921 (2020).

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जीव विज्ञान अंक 170
इन विट्रो रोग मॉडलिंग के लिए मानव प्राथमिक वाल्व कोशिकाओं का अलगाव
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Cuevas, R. A., Chu, C. C., Moorhead III, W. J., Wong, R., Sultan, I., St. Hilaire, C. Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling. J. Vis. Exp. (170), e62439, doi:10.3791/62439 (2021).

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