Summary
Her præsenterer vi en protokol til at analysere ultrastruktur af megakaryocytterne in situ ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM). Murin knoglemarv indsamles, fast, indlejret i epoxyharpiks og skæres i ultratynde sektioner. Efter kontrastfarvning observeres knoglemarven under et TEM-mikroskop ved 120 kV.
Abstract
Differentiering og modning af megakaryocytter forekommer i tæt samarbejde med de cellulære og ekstracellulære komponenter i knoglemarven. Disse processer er karakteriseret ved den gradvise forekomst af væsentlige strukturer i megakaryocytcytcytoplasmaet som en polyploid og polylobuleret kerne, et internt membrannetværk kaldet afgrænsning membransystem (DMS) og de tætte og alfagranulat, der vil blive fundet i cirkulerende blodplader. I denne artikel beskriver vi en standardiseret protokol for in situ ultrastrukturelle undersøgelse af murine megakaryocytter ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM), der giver mulighed for identifikation af nøglekarakteristika, der definerer deres modningsstadium og cellulær tæthed i knoglemarven. Knoglemarv er skyllet, fast, dehydreret i ethanol, indlejret i plastharpiks, og monteret til generering af tværsnit. Halvtynde og tynde sektioner er forberedt til henholdsvis histologiske og TEM-observationer. Denne metode kan bruges til enhver knoglemarvscelle, i enhver EM-facilitet og har den fordel at bruge små prøvestørrelser, der giver mulighed for kombinationen af flere billeddannelsesmetoder på den samme mus.
Introduction
Megakaryocytter er specialiserede store polyploidceller, lokaliseret i knoglemarven, der er ansvarlig for blodpladeproduktion1. De stammer fra hæmatoopoietiske stamceller gennem en indviklet modningsproces, hvor megakaryocytprækursorer gradvist øges i størrelse, mens de gennemgår omfattende samtidige morfologiske ændringer i cytoplasmaet og kernen2. Under modning udvikler megakaryocytter en række forskellige strukturelle elementer, herunder: en polylobuleret kerne, invaginationer af overflademembranen, der danner afgrænsningsmembransystemet (DMS), en perifer zone uden organeller omgivet af det actinbaserede cytoskeletale netværk og talrige organeller, herunder α granulater, tætte granulater, lysosomer og flere Golgi-komplekser. På det ultrastrukturelle niveau observeres en væsentlig ændring den cytoplasmatiske opdeling i diskrete regioner afgrænset af DMS3. Denne omfattende forsyning af membraner vil brændstof forlængelsen af lange cytoplasmaiske processer i den indledende fase af blodpladeproduktion, som derefter vil ombygges til blodplader inde i cirkulationen. Enhver defekt under megakaryocytdifferentiering og modning kan påvirke blodpladeproduktionen i form af blodpladeantal og/eller blodpladefunktion.
Tyndt lag transmission elektronmikroskopi (TEM) har været billeddannelse tilgang valg i årtier giver høj kvalitet ultrastruktur af megakaryocytter, der har formet vores forståelse af fysiologi af trombopoiesis4,5. Dette papir fokuserer på en standardiseret TEM metode gør det muligt at fange processen med blodplade biogenese forekommer in situ inden for den indfødte knoglemarvs mikromiljø, som også kunne tjene som grundlag for at analysere enhver knoglemarvscelletype. Vi giver ultrastrukturelle eksempler på udviklingen af megakaryocytter fra umodne til fuldt modne, som udvider cytoplasmaiske processer i mikrocirkulationen af sinusoider6. Vi beskriver også en nem procedure for at kvantificere de forskellige megakaryocyt modning faser, instruere om regenerering og blodplade produktionskapacitet af knoglemarven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med europæiske standarder 2010/63/EU og CREMEAS's komité for etik i dyreforsøg ved universitetet i Strasbourg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). Protokollen vises skematisk i figur 1.
1. Indsamling og fiksering af knoglemarv ( figur 1A)
FORSIGTIG: Denne procedure omfatter kræftfremkaldende, mutagene og/eller giftige stoffer og udføres under en kemisk ekstraktionshætte. Brug passende beskyttelsesudstyr såsom handsker og beskyttelsesbriller.
- Klargør den fiksative opløsning bestående af 2,5 % glutaraldehyd i kakodytbuffer (se supplerende fil).
- Indsamling af knoglemarv
- Brug voksne C57BL/6 mus af begge køn 12-18 uger. Aflive musene ved CO2 kvælning og cervikal dislokation.
- Med en tynd saks skæres huden rundt om låret og brug pincet til at skrælle huden af. Fjern potens ekstremitet og skær derefter mellem hofte og lår. Løsriv skinnebenet fra lårbenet ved at skære på knæet artikulation og fjerne klæbende væv på skinneben og lårben ved hjælp af en skalpel.
- Fjern epifyserne med et skarpt barberblad. Mens lårbenet holder med pincet, skal du bruge en 5 mL sprøjte fyldt med kakodylat buffer med en 21 G nål til at skylle knoglemarven i en 15 mL rør fyldt med 2 mL cacodylate buffer. For at gøre dette skal du indsætte nålens facet i knoglemarvsåbningen og langsomt trykke på stemplet, indtil marven er udstødt.
- Knoglemarvsfiksering ved hurtig nedsænkning i fiksativ.
- Umiddelbart efter skylning skal du bruge en plastpipette til at overføre knoglemarvscylinderen til 1 minut frisk glutaraldehydfiksiv opløsning (tidligere fremstillet i 1.1) i 60 min ved stuetemperatur.
BEMÆRK: For at bevare vævet skal du sikre dig, at hele processen, fra knogledektion til fikseringstrinnet, er afsluttet på mindre end 10 min. Til fikseringen skal du sikre dig, at fiksativopløsningen er ved stuetemperatur for at undgå varmechok.
- Umiddelbart efter skylning skal du bruge en plastpipette til at overføre knoglemarvscylinderen til 1 minut frisk glutaraldehydfiksiv opløsning (tidligere fremstillet i 1.1) i 60 min ved stuetemperatur.
2. Integrering af knoglemarv i agarose
BEMÆRK: Marvvæv er ikke tilstrækkeligt sammenhængende til at opretholde sin integritet under de forskellige vasketrin, og materialet kan let gå tabt. For at overvinde dette problem er marven dækket af en gel af agar før dehydrering.
- Forbered agaroseopløsningen som beskrevet i den supplerende fil.
- Den faste marv vaskes fra punkt 1.3 i kakodylatbuffer, og den overføres forsigtigt til en glasrutschebane med en plastikpipette. Brug en varm pipette, hurtigt anvende et fald på 2% flydende agar til knoglemarvscylinderen.
BEMÆRK: Agaren størkner hurtigt under afkøling. For at sikre en homogen belægning af knoglemarven skal agaropløsningen holdes varm, indtil den deponeres på diaset. - Placer hurtigt rutsjebanen på is, indtil agaren størkner (1-2 min).
- Under et mikroskop skal du bruge et skarpt barberblad til at skære og kassere ekstremiteterne af knoglemarvscylinderen på grund af mulig vævskomprimering i disse områder. Marvblokkene overføres i 1,5 mL mikrocentrifugerør, der indeholder 1 mL cacodylatbuffer.
3. Integrering af knoglemarv i harpiks
FORSIGTIG: Harpikskomponenter er giftige; nogle er kræftfremkaldende og skal håndteres med forsigtighed under en kemisk ekstraktionshætte. Brug passende beskyttelsesudstyr såsom handsker og beskyttelsesbriller. Osmium tetroxid er meget flygtig ved stuetemperatur og dens dampe er meget skadelige for øjne, næse og hals. Før de kasseres, skal 2% osmium tetroxid neutraliseres ved at tilsætte dobbelt så meget vegetabilsk olie.
- Forbered epoxyharpiksen som beskrevet i den supplerende fil.
- Harpiksindlejring
BEMÆRK: Opbevar prøverne i de samme mikrocentrifugrør under inkubationer i successive bade af osmium, uranylacetat og ethanol. Aspirere supernatanterne med en Pasteur pipette. Den opløsningsmængde, der anvendes til hvert bad, skal være lig med mindst 10x prøvens volumen.- Blokkene efter 1 % med 1 % osmium i kakodylatbuffer i 1 time ved 4 °C, vask en gang i cacodylatebuffer og derefter en gang i destilleret vand.
- Plet med 4% uranylacetat i destilleret vand i 1 time, vask to gange i destilleret vand.
- Dehydrere gennem en gradueret serie af ethanol i destilleret vand: 4 gange i 75% ethanol i 5 min, efterfulgt af 3 gange i 95% ethanol i 20 min og derefter 3 gange i 100% ethanol i 20 min. På dette trin skal du tage en sprøjte epoxyharpiks ud fra fryseren.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause i 100% ethanol i 1 time. - For at opnå ensartet infiltration og polymerisering af epoxyharpiks inde i marven inkuberes først blokkene i 2 på hinanden følgende bade af propylenoxid i 15 min.
- Tilsæt en 1:1 blanding af 100% propylenoxid og epoxyharpiks og inkuber i 1 time. Læg prøverne på en langsom roterende shaker ved stuetemperatur.
- Tilsæt 100% epoxyharpiks lad prøven til inkubation natten over under omrøring.
- Tilsæt 100% epoxyharpiks til 2 timers inkubation, stadig under agitation.
- Under et mikroskop skal marvblokkene placeres i flade silikoneforme. Orientate prøver til at tillade efterfølgende tværgående afsnit af hele knoglemarven. Fyld formene med epoxyharpiks og læg dem ved 60 °C i 48 timer.
BEMÆRK: Alle opløsninger (undtagen ethanol og propylenoxid) filtreres gennem 0,22 μm filter for at undgå forurening af prøver. For at sikre tilstrækkelig polymerisering af harpiksen skal du undgå bobler, mens du fylder formene.
4. Ultratynde afsnit (Figur 1B)
BEMÆRK: Transmission EM kræver tynde væv sektioner, hvorigennem elektroner kan passere generere en projektion billede af det indre af celler, struktur og organisering af indre organeller (granulater, endoplasmisk reticulum, Golgi) og arrangementet af intracellulære cellemembraner.
- Monter prøveblokken i en ultramikrotomstøtte. Sæt den på prøveholderen. Trim prøverne ved 45° for at fjerne overskuddet af harpiks omkring vævet med en roterende diamant eller wolfram fræser.
- Monter prøverne på ultramikrotomen med et diamantknivblad udstyret med en vandtank. Skær tværgående sektioner på henholdsvis 500 nm og 100 nm tykkelse til histologiske og TEM-analyser. Saml flydende sektioner på vandoverfladen med en løkke.
- Sæt den 500 nm tykke sektion på en glasrutschebane og 100 nm tykke sektioner på 200 mesh tynd-bar kobbergitre med et papirfilter nedenunder. Forbered fem gitre til en betingelse: plette to gitre først og holde de tre resterende gitre som en backup, hvis det er nødvendigt.
5. Toluidine blå farvning til histologi
BEMÆRK: Farvning sektioner til histologi er vigtigt af tre grunde: 1) for at sikre, at vævet rent faktisk er skåret og ikke harpiks, 2) for at kontrollere kvaliteten af optagelsen, og 3) til hurtigt at evaluere marv prøve. Hvis dette ikke er korrekt, skære dybere i blokken.
- Halvtynde sektioner glider på en varmeplade (60 °C).
- Der tilsættes filtreret 1% toluidiumblå/1 % natriumborat i destilleret vand på rutsjebanerne og varmen på en kogeplade (60 °C) i 1-2 min. Vask rutsjebanerne med destilleret vand og lad det tørre på varmepladen.
- Monter sektioner på coverslips med en dråbe Poly (butyl methacrylate-co-methyl methacrylat) montering medium og undersøge under et let mikroskop.
6. Heavy metal farvning til TEM observation (Figur 1C)
BEMÆRK: For kontrasten vendes oversiden af gitrene på 100 μL dråber af hvert efterfølgende bad med en løkke. Før brug er hver opløsning 0,22 μm filtreret. Fjern overskydende væske mellem hvert bad ved forsigtigt at kontakte gittersiden på et filterpapir.
- Plet med 4% uranylacetat i destilleret vand i 5 min.
- Vask 3 gange i destilleret vand i 5 min.
- Plet med blycitrat i 3 min.
- Vask 3 gange i destilleret vand i 5 min.
- Sæt gitrene ved den nederste side i kontakt med filterpapiret for at lade dem tørre.
BEMÆRK: Tungmetaller reagerer i nærværelse af kuldioxid. For at minimere bundfaldene skal du undgå luftforskydning under kontrasten, ikke tale, holde miljøet roligt og slukke for klimaanlægget.
7. TEM (figur 1E)
BEMÆRK: Sektionerne indføres i et TEM-mikroskop og undersøges ved 120 kV.
- Først undersøge sektioner ved lav forstørrelse (< 500x) for at forstå det generelle aspekt af præparatet (fravær af hul i harpiksen, folder / kompression i sektionerne, bundfald på grund af farvning).
- Undersøg derefter sektionerne ved højere forstørrelse (~ 2000x, der gør det muligt at skelne modningsstadiet). Tæl manuelt megakaryocytterne fra hvert modningsstadium over hele tværgående sektioner (se repræsentative resultater om, hvordan de visuelt identificerer hvert trin).
BEMÆRK: Hver kvadrat af gitrene defineres som et undersøgelsesområde (som er lig med 16000 μm2 for 200 mesh kobbergitre). - For at vurdere antallet af megakaryocytter kvantificeres kun de firkanter, der er fuldt dækket af et afsnit. For at gøre dette skal du bruge en model baseret på screening af intervaller. Overhold en første række firkanter fra en ekstremitet af sektionen til en anden, så et andet interval på samme måde osv. Ved hjælp af denne procedure, screene fuldt ud og systematisk hele marv tværgående sektion kvadrat for kvadrat.
- For hver firkant skal du score antallet af trin I, II eller III megakaryocytter.
BEMÆRK: Højere forstørrelser er nødvendige for at analysere granulatet, DMS-organisationen, størrelsen af cytoplasmaiske territorier og den polylobulatede kerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Knoglemarvs histologi
Observation af knoglemarvs toluid blå histologi under et let mikroskop er nøglen til hurtigt at analysere den samlede vævsarkitektur med hensyn til f.eks væv kompakthed, mikrovessel kontinuitet, og størrelsen og formen af megakaryocytter (Figur 1D). Det udføres før ultratynde sektioner for at bestemme behovet for at skære dybere i knoglemarvsblokken. På grund af deres gigantiske størrelse og nukleare lobulation kan de mere modne megakaryocytter let visualiseres med et 40x-mål. Dette giver et fremragende og hurtigt overblik over tætheden af modne megakaryocytter i vævet og deres relative lokalisering til mikrovessels. Anomalier i megakaryocyt spredning og modning kunne allerede blive påvist i sådanne semi-tynde sektioner.
Knoglemarvs ultrastruktur
På grundlag af forskellige ultrastrukturelle egenskaber opdeles murin megakaryocytter i 4 faser, der repræsenterer sekventielle stadier i deres modning (figur 2A). Fase I megakaryocytter er 10-15 μm i diameter med en stor kerne, der optager det meste af cellen og indeholder rigelige ribosomer og ru endoplasmisk reticulum. Tilstedeværelsen af den tidligste påviselige fase af DMS, kaldet pre-DMS, er også et centralt kriterium for at skelne fase I MKs i TEM analyse3. I modningsfasen begynder granuledannelsen, og udviklingen af DMS påbegyndes. Megakaryocytter øger størrelsen, måler 15-25 μm i diameter og udvikler nuklear lobulation. Modne fase III megakaryocytter er gigantiske celler 25-50 μm i diameter. Deres cytoplasma indeholder en veludviklet DMS med klart definerede cytoplasmaiske territorier og en perifer zone blottet for organeller. På dette stadium er kernen generelt placeret excentrisk og forekommer meget uregelmæssig med kondenseret kromatin placeret ved atommembranen. Det sidste trin er karakteriseret ved en nøgen kerne, også kaldet pyrenocyt, der består af en stor kerne omgivet af en plasmamembran, efter at hovedparten af cytoplasma er elimineret. I vilde type C57BL/6 mus, knoglemarven omfatter omkring 8% fase I, 20% fase II, 71% fase III megakaryocytter og < 1% pyrenocytter. Det gennemsnitlige antal megakaryocytter er mellem 1,7 og 2,2 celler pr. Kvadrat. Denne vilkårlige klassificering gør det muligt nemt nemt at bekvemt overvåge en kontinuerlig proces med celledifferentiering og opdage dens mulige anomalier.
Ved siden af disse klassiske stadier af modning, observation af faste megakaryocytter i knoglemarven gør det muligt at analysere den række begivenheder, der opstår som megakaryocytter interagere med sinusoide væg (Figur 2B). Megakaryocytter i kontakt med endotelcellerne observeres ofte i tynde sektioner. Til tider observerer man megakaryocytter danner korte invasive fremspring trænger ind i endothelium eller udvide store projektion af sin cytoplasma i sinusoide lumen7,8. Bemærkelsesværdigt, disse intravaskulære cytoplasmaiske processer vise variable størrelser, længder og diametre, der illustrerer den progressive blodplade remodeling i omløb. Blodplader, der allerede er til stede i den generelle cirkulation, der har en discoidform, der opretholdes af omkredslige mikrotubulespoler, er også synlige i bihuloidernes lumen. Denne typiske morfologi af blodpladerne er tegn på den korrekte fiksering af prøven.
Transmission elektronmikroskopi har det opløsningsniveau, der kræves for at visualisere ultrastrukturelle detaljer, såsom nuklear lobulation, rumlig organisering af DMS og granulat med hensyn til størrelse, form og fordeling. Figur 2C er et eksempel på perinuklearområdet i en fase III megakaryocyt, der viser tilstedeværelsen af α granulat, Golgi cisternae, mitokondrier og endoplasmisk reticulum. Også bemærkelsesværdigt i figur 2C er en multivesicular krop, som repræsenterer et mellemstadium i dannelsen af alfa og tætte granulater, der indeholder multipla exosomer måler mindre end 200 Å i diameter9,10. Endelig transmission elektronmikroskopi gør det muligt at visualisere neutrofiler og andre hæmatopoietiske celler til stede inde i megakaryocytter, (Figur 2D) efter en usædvanlig proces kaldet emperipolese, hvorved en celle trænger ind i en anden levende celle11. Denne proces, som vedrører 4% af megakaryocytter i normal fysiologisk tilstand, kan øges betydeligt under visse patologiske forhold12.
Figur 1: Skematisk illustration af forsøgsopsætningen. (A) Knoglemarvsindlejringsprocedure. Knoglemarven skylles og fastgøres ved hurtig nedsænkning i glutaraldehydopløsning. Fotografiet illustrerer det typiske udseende af knoglemarvscylinderen efter skylning. Efter 1 h fiksering ved stuetemperatur er marven omgivet af agarose, post-fast i osmium tetroxid og inkuberet i uranylacetat. Vævene skylles derefter i buffer, dehydreres i en række gradueret ethanol, inkuberes i propylenoxid og infiltreres med epoxyharpiks. (B) Knoglemarv blokerer sektionsopdelning. Den indlejrede knoglemarv er monteret på en ultramikrotomholder, trimmet ved 45° og skåret enten i halvtynde (500 nm) eller tynde (100 nm) sektioner. Til ultrastrukturelle undersøgelser samles de flydende sektioner op med en løkke og deponeres på gitre med et papirfilter nedenunder. (C) Kontrastfarvning for TEM-observationer. Gitre vendes på uranylacetatdråber, vaskes på destillerede vanddråber og inkuberes på blycitrat før en anden vask. Efter tørring (overside med sektionerne) er prøverne klar til at blive undersøgt under TEM' en. (D) Histologi af en mus lårmarvs sektion plettet med toluidin blå. De gigantiske celler svarer til modne megakaryocytter (1), hvoraf nogle er i kontakt med bihulider (2). Bihuloiderne konvergerer på en stor central sinus vene (3). Bar: 20 μm. Indsat: Normalt udseende af en moden megakaryocyt ved 40x forstørrelse. (E) Repræsentativt TEM-billede af en knoglemarvssektion ved lav forstørrelse. Cellerne er tæt pakket med lidt ekstracellulær plads. Hver gitter firkant af sektionen observeres fra en ekstremitet til en anden ved at følge den skematiske pilede kurve (røde pile). Bar: 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative in situ-billeder af megakaryocytter ultrastruktur. (A) Karakteristiske modningsstadier af megakaryocytter af vildtypen. Megakaryocytter er klassificeret i fire modningsstadier: Fase I, en celle 10-15 μm i diameter med en stor kerne; fase II, en celle med en diameter på 15-30 μm, der indeholder den DMS, der er under udvikling fase III, en 30-50 μm celle, der indeholder et veludviklet afgrænsningsmembransystem (DMS), der definerer cytoplasmaiske territorier og har en organelfri perifer zone. En pyrenocyt svarer til den nøgne polylobulated kerne tilbage i knoglemarven efter fuld cytoplasmisk forlængelse. Stænger: 10 μm (B) Megakaryocyt-endotelcelleinteraktioner og intravaskulære cytoplasmaiske processer. (i) Den perifere zone (PZ) af en megakaryocyt er tæt apposed til den abluminale overflade af sinusoide endotel. ii) En megakaryocyt, der danner korte invasive fremspring, der trænger dybt ind i endotellaget (pilespidser). (iii-v) Pilene angiver cytoplasmaiske processer af megakaryocytter med varierende diametre, hvoraf nogle er meget store og har en perifer zone, der kan repræsentere fragmenter, der lige er kommet ind i blodbanen. (vi) En typisk discoid blodplade (P) observeret i sinus lumen. I hver mikrograf angiver den røde linje den lysende side af endotelbarrieren, og stjernen angiver de sinusoide lumen. Stænger: 2 μm. (C) Højere forstørrelser i perinuklearområdet i en moden megakaryocyt. α alfagranulat; rer, ru endoplasmisk reticulum; G, golgi; MVB, multivesicular krop; m, mitokondrier. Bar: 0,5 μm. (D) Eksempel på en megakaryocyt, der viser emperipolese. Den opslugte neutrofil synes morfologisk uændret af samspillet med megakaryocytter. Bar: 2 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil: Forberedelse af reagenserne. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Direkte undersøgelse af megakaryocytter i deres oprindelige miljø er afgørende for at forstå megakaryopoiesis og blodplade dannelse. I dette manuskript leverer vi en transmissionselektronmikroskopimetode, der kombinerer knoglemarvsskylning og fiksering ved nedsænkning, hvilket gør det muligt at dissekere in situ morfologiegenskaberne for hele processen med megakaryocytmorphogenese, der finder sted i knoglemarven.
Skylningen af knoglemarven er et kritisk trin i denne metode, da succesen med en højkvalitets skylning afhænger af operatørens praksis og træning. Selvom delikat, rødmen knoglemarven er den bedste måde at undgå fjernelse af mineraliseret knogle, som normalt kræver en 2-ugers EDTA behandling for fuldstændig afkalkning forbundet med betydelige artefakter på megakaryocyt morfologi. Derudover, en stor fordel ved at indsamle hele ufikserede knoglemarv fra skinneben og lårben er evnen til at kombinere flere billeddannelse tilgange til den samme mus. I praksis er der kun behov for en enkelt knoglemarv til den ultrastrukturelle undersøgelse, idet de tre andre prøver er tilgængelige til supplerende analyser. Den anden knoglemarv kan derefter bruges til fremstilling af friske knoglemarvseksplanter, for i realtid at studere dynamikken i proplatelet dannelse af indfødte megakaryocytter6. Den tredje prøve er normalt designet til immunstaining undersøgelser på tykke sektioner, giver 3D-billeddannelse og distribution af megakaryocytter inden for deres naturlige miljø. Den sidste prøve kan fryses og opbevares til yderligere undersøgelser af immunogold elektronmikroskopi, hvor den subcellulære lokalisering af proteiner undersøges ved høj opløsning4. Disse kombinerede billeddannelsesmetoder sammen med tilgængeligheden af målrettet sletning/mutation af gener i en mus er et vigtigt middel til at afgrænse det biologiske proteins biologiske rolle i trombopoiesis. Det skal dog påpeges her, at en begrænsning af denne metode er tilbagetrækningen af de epifyser, der er nødvendige for at skylle marven. Epiphyses er kendt for at være vigtige områder for hæmatopoiesis, og deres fjernelse forhindrer derfor enhver mulighed for at analysere hæmatoopoietiske stamceller og de indledende faser af engagement13. En anden begrænsning er, at forfædre til megakaryocytter før det umodne stadium jeg ikke kan identificeres, fordi disse celler ikke har specifikke ultrastrukturelle træk. For at overvinde denne begrænsning kunne der anvendes en EM-immunogold-tilgang.
Det andet vigtige trin i metoden er knoglemarvsfiksering ved nedsænkning. Når den udføres under de betingelser, der er beskrevet her, dvs. fiksering umiddelbart efter skylning af den kompakte knoglemarvscylinder, har den følgende fordele: (i) det er hurtigt og nemt at udføre, (ii) det bevarer en ultrastruktur tæt på den, der observeres efter fiksering ved perfusion6, og (iii) det opretholder gratis megakaryocytprocesser og blodplader i den sinusoide blodbanen, som ellers skylles ud / tabt efter perfusion. Med denne teknik er det muligt at undersøge indst inde i den sinusformede cirkulation og karakterisere alle de mellemliggende former for cytoplasmaiske processer, hvorfra blodplader opstår8. I overensstemmelse med dette er det for nylig blevet rapporteret, at de store fremspring, der intravaserer fra megakaryocytter in vivo, strukturelt adskiller sig fra de tynde udvidelser dannet af megakaryocytter in vitro, med især et andet arrangement af mikrotubulerne7. På samme måde har vi for nylig vist, at mekanismen for blodplader dannelse in vivo adskiller sig fra den identificerede in vitro14.
Vigtige ultrastrukturelle forskelle er i stigende grad anerkendt mellem in vitro kultiverede og in vivo genereret indfødte megakaryocytter, understreger behovet for knoglemarvs mikromiljø for en fuld megakaryocyt differentiering / modning. Efter kombination af knoglemarvsskylning og fiksering ved nedsænkning beskrevet i denne artikel er konventionel transmissionselektronmikroskopi stadig et uvurderligt værktøj til at studere megakaryocytbiologi og blodpladedannelse under fysiologiske og patologiske forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund for teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), Den Europæiske Union gennem Den Europæiske Fond for Regionaludvikling (EFRU) og af Grant ANR-17-CE14-0001-01 til H.d.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate - Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
References
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
- Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
- Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
- Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
- Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
- Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
- Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
