Summary
Qui presentiamo un protocollo per analizzare l'ultrastruttura dei megacariociti in situ utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM). I midolli ossei murini vengono raccolti, fissati, incorporati in resina epossidica e tagliati in sezioni ultrassteste. Dopo la colorazione di contrasto, il midollo osseo viene osservato al microscopio TEM a 120 kV.
Abstract
La differenziazione e la maturazione dei megacariociti avvengono in stretta associazione con i componenti cellulari ed extracellulari del midollo osseo. Questi processi sono caratterizzati dalla graduale comparsa di strutture essenziali nel citoplasma dei megacariociti come un nucleo poliploide e polilobulato, una rete di membrana interna chiamata sistema di membrana di demarcazione (DMS) e i granuli densi e alfa che si troveranno nelle piastrine circolanti. In questo articolo, descriviamo un protocollo standardizzato per lo studio ultrastrutturale in situ dei megacariociti murini utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), consentendo l'identificazione delle caratteristiche chiave che definiscono il loro stadio di maturazione e la densità cellulare nel midollo osseo. I midollo osseo vengono lavati, fissati, disidratati in etanolo, incorporati in resina plastica e montati per generare sezioni trasversali. Sezioni semisottili e sottili sono preparate rispettivamente per osservazioni istologiche e TEM. Questo metodo può essere utilizzato per qualsiasi cellula del midollo osseo, in qualsiasi struttura EM e ha il vantaggio di utilizzare campioni di piccole dimensioni che consentono la combinazione di diversi approcci di imaging sullo stesso topo.
Introduction
I megacariociti sono cellule poliploidi specializzate di grandi dimensioni, localizzate nel midollo osseo, responsabili della produzione piastrinica1. Hanno origine da cellule staminali ematopoietiche attraverso un intricato processo di maturazione, durante il quale i precursori dei megacariociti aumentano progressivamente di dimensioni, mentre subiscono estesi cambiamenti morfologici concomitanti nel citoplasma e nel nucleo2. Durante la maturazione, i megacariociti sviluppano una serie di elementi strutturali distinguibili tra cui: un nucleo polilobulato, invaginazioni della membrana superficiale che formano il sistema di membrana di demarcazione (DMS), una zona periferica priva di organelli circondata dalla rete citoscheletrica a base di actina e numerosi organelli tra cui α-granuli, granuli densi, lisosomi e complessi multipli di Golgi. A livello ultrastrutturale, una modifica importante osservata è la compartimentazione citoplasmatica in regioni discrete delimitate dal DMS3. Questa vasta fornitura di membrane alimenterà l'estensione di lunghi processi citoplasmatici nella fase iniziale della produzione piastrinica, che poi si rimodellerà in piastrine all'interno della circolazione. Qualsiasi difetto durante la differenziazione e la maturazione dei megacariociti può influenzare la produzione piastrinica in termini di conta piastrinica e/o funzione piastrinica.
La microscopia elettronica a trasmissione a strato sottile (TEM) è stata l'approccio di imaging di scelta per decenni fornendo un'ultrastruttura di alta qualità dei megacariociti che hanno plasmato la nostra comprensione della fisiologia della trombopoiesi4,5. Questo documento si concentra su un metodo TEM standardizzato che consente di catturare il processo di biogenesi piastrinica che si verifica in situ all'interno del microambiente del midollo osseo nativo, che potrebbe anche servire come base per analizzare qualsiasi tipo di cellula del midollo osseo. Forniamo esempi ultrastrutturali dello sviluppo di megacariociti da immaturi a completamente maturi, che estendono i processi citoplasmatici nella microcircolazione delle sinusoidi6. Descriviamo anche una procedura semplice per quantificare le diverse fasi di maturazione dei megacariociti, istruendo sulla rigenerazione e sulla capacità di produzione piastrinica del midollo osseo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le norme europee 2010/63/UE e il Comitato CREMEAS per l'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di Strasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). Il protocollo è schematicamente mostrato nella Figura 1.
1. Raccolta e fissazione del midollo osseo ( Figura 1A)
ATTENZIONE: Questa procedura include sostanze cancerogene, mutagene e/o tossiche e viene eseguita sotto un cappuccio di estrazione chimica. Indossare adeguati dispositivi di protezione come guanti e occhiali di protezione.
- Preparare la soluzione fissativa costituita da glutaraldeide al 2,5% in tampone di cacodilato (vedere File supplementare).
- Raccolta del midollo osseo
- Utilizzare topi adulti C57BL/6 di entrambi i sessi 12-18 settimane di età. Eutanasia dei topi mediante asfissia di CO2 e lussazione cervicale.
- Con un paio di forbici sottili, tagliare la pelle intorno alla coscia e usare una pinzetta per staccare la pelle. Rimuovere l'estremità della zampa e quindi tagliare tra l'anca e la coscia. Staccare la tibia dal femore tagliando l'articolazione del ginocchio e rimuovere il tessuto aderente su tibie e femori usando un bisturi.
- Rimuovere le epifisi con una lama di rasoio affilata. Mentre si tiene il femore con una pinzetta, utilizzare una siringa da 5 mL riempita con tampone cacodilato con un ago da 21 G per lavare il midollo osseo in un tubo da 15 ml riempito con tampone cacodilato da 2 ml. Per fare ciò, inserire la smussatura dell'ago nell'apertura del midollo osseo e premere lentamente lo stantuffo fino a quando il midollo non viene espulso.
- Fissazione del midollo osseo mediante rapida immersione nel fissativo.
- Immediatamente dopo il lavaggio, utilizzare una pipetta di plastica per trasferire il cilindro del midollo osseo in 1 mL di soluzione fissativa di glutaraldeide fresca (precedentemente preparata in 1.1) per 60 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Per preservare il tessuto, assicurarsi che l'intero processo, dalla dissezione ossea alla fase di fissazione, sia completato in meno di 10 minuti. Per la fissazione, assicurarsi che la soluzione fissativa sia a temperatura ambiente per evitare shock termici.
- Immediatamente dopo il lavaggio, utilizzare una pipetta di plastica per trasferire il cilindro del midollo osseo in 1 mL di soluzione fissativa di glutaraldeide fresca (precedentemente preparata in 1.1) per 60 minuti a temperatura ambiente.
2. Incorporare il midollo osseo nell'agarose
NOTA: il tessuto midollare non è sufficientemente coeso per mantenere la sua integrità durante le diverse fasi di lavaggio e il materiale può essere facilmente perso. Per superare questo problema, il midollo è coperto da un gel di agar prima della disidratazione.
- Preparare la soluzione di agarose come descritto nel file supplementare.
- Lavare il midollo fisso dal punto 1.3 in tampone cacodilato e trasferirlo accuratamente su un vetrino usando una pipetta di plastica. Utilizzando una pipetta calda, applicare rapidamente una goccia di agar liquido al 2% sul cilindro del midollo osseo.
NOTA: L'agar si solidifica rapidamente durante il raffreddamento. Per garantire una copertura omogenea del midollo osseo, la soluzione di agar deve essere mantenuta calda fino a quando non si deposita sul vetrino. - Posizionare rapidamente lo scivolo sul ghiaccio fino a quando l'agar si solidifica (1-2 min).
- Al microscopio, utilizzare una lama di rasoio affilata per tagliare e scartare le estremità del cilindro del midollo osseo a causa della possibile compressione del tessuto in queste aree. Trasferire i blocchi di midollo in tubi microcentrifuga da 1,5 mL contenenti 1 mL di tampone di cacodilato.
3. Incorporare il midollo osseo nella resina
ATTENZIONE: i componenti in resina sono tossici; alcuni sono cancerogeni e devono essere maneggiati con cura sotto una cappa di estrazione chimica. Utilizzare dispositivi di protezione appropriati come guanti e occhiali di protezione. Il tetrexide di osmio è altamente volatile a temperatura ambiente e i suoi vapori sono molto dannosi per gli occhi, il naso e la gola. Prima di essere scartato, il tetrexuro di osmio al 2% deve essere neutralizzato aggiungendo il doppio del suo volume di olio vegetale.
- Preparare la resina epossidica come descritto nel file supplementare.
- Incorporamento in resina
NOTA: Conservare i campioni nelle stesse provette di microcentrifuga durante le incubazioni in bagni successivi di osmio, acetato di uranile ed etanolo. Aspirare i supernatanti con una pipetta Pasteur. Il volume di soluzione utilizzato per ciascun bagno deve essere pari ad almeno 10 volte il volume del campione.- Post-fissare i blocchi con osmio all'1% in tampone cacodilato per 1 ora a 4 °C, lavare una volta in tampone cacodilato e poi una volta in acqua distillata.
- Macchiare con acetato di uranile al 4% in acqua distillata per 1 ora, lavare due volte in acqua distillata.
- Disidratare attraverso una serie graduata di etanolo in acqua distillata: 4 volte in etanolo al 75% per 5 minuti, seguito da 3 volte in etanolo al 95% per 20 minuti e poi 3 volte in etanolo al 100% per 20 minuti. A questo punto, togliere una siringa di resina epossidica dal congelatore.
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa in etanolo al 100% per 1 ora. - Per ottenere un'infiltrazione e polimerizzazione uniforme della resina epossidica all'interno del midollo, incubare prima i blocchi in 2 bagni successivi di ossido di propilene per 15 min.
- Aggiungere una miscela 1:1 di ossido di propilene al 100% e resina epossidica e incubare per 1 ora. Posizionare i campioni su uno shaker rotativo lento a temperatura ambiente.
- Aggiungere 100% resina epossidica lasciare il campione per l'incubazione notturna sotto agitazione.
- Aggiungere resina epossidica al 100% per 2 ore di incubazione, ancora in agitazione.
- Al microscopio, posizionare i blocchi di midollo in stampi in silicone piatti. Orientare i campioni per consentire il successivo sezionamento trasversale dell'intero midollo osseo. Riempire gli stampi con resina epossidica e posizionarli a 60 °C per 48 ore.
NOTA: Tutte le soluzioni (ad eccezione dell'etanolo e dell'ossido di propilene) vengono filtrate attraverso un filtro da 0,22 μm per evitare la contaminazione dei campioni. Per garantire un'adeguata polimerizzazione della resina, evitare bolle durante il riempimento degli stampi.
4. Sezionamento ultrasebrisante (Figura 1B)
NOTA: La trasmissione EM richiede sezioni di tessuto sottili attraverso le quali gli elettroni possono passare generando un'immagine di proiezione dell'interno delle cellule, della struttura e dell'organizzazione degli organelli interni (granuli, reticolo endoplasmatico, Golgi) e la disposizione delle membrane cellulari intracellulari.
- Montare il blocco campione in un supporto ultra-microtome. Mettilo sul portase campioni. Tagliare i campioni a 45° per rimuovere l'eccesso di resina intorno al tessuto con una fresa rotante a diamante o tungsteno.
- Montare i campioni sull'ultramicrotomo con una lama diamanta dotata di un serbatoio d'acqua. Taglio di sezioni trasversali di spessore 500 nm e 100 nm per analisi istologiche e TEM, rispettivamente. Raccogli sezioni galleggianti sulla superficie dell'acqua con un anello.
- Depositare la sezione spessa 500 nm su una diapositiva di vetro e le sezioni spesse 100 nm su griglie di rame a barra sottile a 200 maglie con un filtro di carta sottostante. Preparare cinque griglie per una condizione: macchiare prima due griglie e mantenere le tre griglie rimanenti come backup, se necessario.
5. Colorazione blu toluidina per istologia
NOTA: La colorazione delle sezioni per l'istologia è importante per tre motivi: 1) per assicurarsi che il tessuto sia effettivamente tagliato e non la resina, 2) per verificare la qualità dell'inclusione e 3) per valutare rapidamente il campione di midollo. Se questo non è corretto, taglia più in profondità nel blocco.
- Asciugare le sezioni semisottili scorrere su una piastra termica (60 °C).
- Aggiungere l'1% di toluidina blu filtrato/l'1% di borato di sodio in acqua distillata sui vetrini e riscaldare su una piastra calda (60 °C) per 1-2 min. Lavare i vetrini con acqua distillata e lasciarli asciugare sulla piastra termica.
- Montare sezioni su coverslips con una goccia di mezzo di montaggio Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) ed esaminare al microscopio ottico.
6. Colorazione di metalli pesanti per l'osservazione TEM (Figura 1C)
NOTA: Per il contrasto, il lato superiore delle griglie viene invertito su gocce da 100 μL di ogni bagno successivo con un anello. Prima dell'uso, ogni soluzione viene filtrata con 0,22 μm. Rimuovere l'eccesso di liquido tra ogni bagno contattando delicatamente il lato griglia su una carta da filtro.
- Macchiare con acetato di uranile al 4% in acqua distillata per 5 min.
- Lavare 3 volte in acqua distillata per 5 min.
- Macchiare con citrato di piombo per 3 min.
- Lavare 3 volte in acqua distillata per 5 min.
- Depositare le griglie sul lato inferiore a contatto con la carta da filtro per lasciarle asciugare.
NOTA: I metalli pesanti reagiscono in presenza di anidride carbonica. Per ridurre al minimo i precipitati, evitare lo spostamento d'aria durante il contrasto, non parlare, mantenere l'ambiente calmo e spegnere l'aria condizionata.
7. TEM (Figura 1E)
NOTA: Le sezioni vengono introdotte in un microscopio TEM ed esaminate a 120 kV.
- Esaminare innanzitutto le sezioni a basso ingrandimento (< 500x) per apprezzare l'aspetto generale della preparazione (assenza di foro nella resina, pieghe/compressione nelle sezioni, precipitati dovuti alla colorazione).
- Quindi esaminare le sezioni a ingrandimento più elevato (~ 2000x che consente di distinguere lo stadio di maturazione). Contare manualmente i megacariociti di ogni fase di maturazione su intere sezioni trasversali (vedere Risultati rappresentativi su come identificare visivamente ogni fase).
NOTA: Ogni quadrato delle griglie è definito come un'area per l'esame (che equivale a 16000 μm2 per 200 griglie di rame a maglie). - Per valutare il numero di megacariociti, quantificare solo i quadrati che sono completamente coperti da una sezione. Per fare ciò, utilizzare un modello basato sullo screening degli intervalli. Osserva una prima gamma di quadrati da un'estremità della sezione a un'altra, poi un'altra gamma allo stesso modo, ecc. Utilizzando questa procedura, schermare completamente e sistematicamente l'intero midollo trasversale sezione quadrato per quadrato.
- Per ogni quadrato, segna il numero di megacariociti dello stadio I, II o III.
NOTA: sono necessari ingrandimenti più elevati per analizzare i granuli, l'organizzazione DMS, la dimensione dei territori citoplasmatici e il nucleo polilobulato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Istologia del midollo osseo
L'osservazione dell'istologia blu toluidina del midollo osseo al microscopio ottico è la chiave per analizzare rapidamente l'architettura complessiva del tessuto in termini, ad esempio, di compattezza dei tessuti, continuità dei microvasi e dimensioni e forma dei megacariociti (Figura 1D). Viene eseguito prima di sezioni ultrassanteli per determinare la necessità di tagliare più in profondità nel blocco del midollo osseo. A causa delle loro dimensioni giganti e della lobulazione nucleare, i megacariociti più maturi possono essere facilmente visualizzati con un obiettivo 40x. Ciò fornisce un'eccellente e rapida panoramica della densità dei megacariociti maturi nel tessuto e della loro relativa localizzazione ai microvasi. Anomalie nella proliferazione e nella maturazione dei megacariociti potrebbero già essere state rilevate in tali sezioni semi-sottili.
Ultrastruttura del midollo osseo
Sulla base di caratteristiche ultrastrutturali distinte, i megacariociti murini sono suddivisi in 4 stadi che rappresentano gli stadi sequenziali nella loro maturazione (Figura 2A). I megacariociti di stadio I hanno un diametro di 10-15 μm con un grande nucleo che occupa la maggior parte della cellula e contiene abbondanti ribosomi e reticolo endoplasmatico ruvido. La presenza del primo stadio rilevabile del DMS, chiamato pre-DMS, è anche un criterio chiave per distinguere gli MV di stadio I nell'analisi TEM3. Nella fase II della maturazione, inizia la formazione dei granuli e viene avviato lo sviluppo del DMS. I megacariociti aumentano di dimensioni, misurando 15-25 μm di diametro e sviluppano la lobulazione nucleare. I megacariociti maturi di stadio III sono cellule giganti di 25-50 μm di diametro. Il loro citoplasma contiene un DMS ben sviluppato con territori citoplasmatici chiaramente definiti e una zona periferica priva di organelli. In questa fase, il nucleo si trova generalmente in modo eccentrico e appare molto irregolare con cromatina condensata situata sulla membrana nucleare. L'ultimo passo è caratterizzato da un nucleo nudo, chiamato anche pirenocita, costituito da un grande nucleo circondato da una membrana plasmatica dopo che la maggior parte del citoplasma è stata eliminata. Nei topi selvatici di tipo C57BL/6, il midollo osseo comprende circa l'8% di stadio I, il 20% di stadio II, il 71% di megacariociti di stadio III e < l'1% di pirenociti. Il numero medio di megacariociti è compreso tra 1,7 e 2,2 cellule per quadrato. Questa classificazione arbitraria consente di monitorare comodamente un processo continuo di differenziazione cellulare e rilevare le sue possibili anomalie.
Accanto a questi classici stadi di maturazione, l'osservazione di megacariociti fissi nel midollo osseo permette di analizzare la serie di eventi che si verificano quando i megacariociti interagiscono con la parete sinusoidale (Figura 2B). I megacariociti a contatto con le cellule endoteliali sono frequentemente osservati in sezioni sottili. A volte si osservano megacariociti che formano brevi sporgenze invasive penetrando nell'endotelio o estendendo la grande proiezione del suo citoplasma nel lume sinusoidale7,8. Sorprendentemente, questi processi citoplasmatici intravascolare mostrano dimensioni, lunghezze e diametri variabili, illustrando il progressivo rimodellamento piastrinico nella circolazione. Piastrine già presenti nella circolazione generale, aventi una forma discoide mantenuta da bobine di microtubuli circonferenziali, sono visibili anche nel lume delle sinusoidi. Questa morfologia tipica delle piastrine è indicativa della corretta fissazione del campione.
La microscopia elettronica a trasmissione ha il livello di risoluzione richiesto per visualizzare dettagli ultrastrutturali, come la lobulazione nucleare, l'organizzazione spaziale del DMS e dei granuli in termini di dimensioni, forma e distribuzione. La Figura 2C è un esempio della regione perinucleare in un megacariocita di stadio III che mostra la presenza di granuli di α, cisterne di Golgi, mitocondri e reticolo endoplasmatico. Degno di nota nella Figura 2C è anche un corpo multivesicolare, che rappresenta uno stadio intermedio nella formazione di granuli alfa e densi, contenente esosomi multipli che misurano meno di 200 Å di diametro9,10. Infine, la microscopia elettronica a trasmissione consente di visualizzare neutrofili e altre cellule ematopoietiche presenti all'interno dei megacariociti, (Figura 2D) seguendo un processo non comune chiamato emperipolesi per cui una cellula penetra in un'altra cellula vivente11. Questo processo, che riguarda il 4% dei megacariociti in condizioni fisiologiche normali, può essere significativamente aumentato in determinate condizioni patologiche12.
Figura 1: Illustrazione schematica del setup sperimentale. (A) Procedura di incorporamento del midollo osseo. Il midollo osseo viene lavato e fissato mediante rapida immersione in soluzione di glutaraldeide. La fotografia illustra l'aspetto tipico del cilindro del midollo osseo dopo il lavaggio. Dopo 1 ora di fissazione a temperatura ambiente, il midollo è circondato in agarose, post-fissato in tetroxide di osmio e incubato in acetato di uranile. I tessuti vengono poi risciacquati in tampone, disidratati in una serie di etanolo graduato, incubati in ossido di propilene e infiltrati con resina epossidica. (B) Il midollo osseo blocca il sezionamento. Il midollo osseo incorporato è montato su un supporto ultramicrotomico, tagliato a 45 ° e tagliato in sezioni semisottili (500 nm) o sottili (100 nm). Per gli studi ultrastrutturali, le sezioni galleggianti vengono raccolte con un anello e depositate su griglie con un filtro di carta sottostante. (C) Colorazione a contrasto per le osservazioni TEM. Le griglie sono invertite su gocce di acetato di uranile, lavate su gocce d'acqua distillata e incubate su citrato di piombo prima di un'altra serie di lavaggi. Dopo l'essiccazione (lato superiore con le sezioni), i campioni sono pronti per essere esaminati sotto il TEM. (D) Istologia di una sezione di midollo femorale di topo macchiata di blu toluidina. Le cellule giganti corrispondono a megacariociti maturi (1), alcuni in contatto con sinusoidi (2). Le sinusoidi convergono su una grande vena sinusale centrale (3). Barra: 20 μm. Inserto: Aspetto normale di un megacariocita maturo con ingrandimento 40x. (E) Immagine TEM rappresentativa di una sezione di midollo osseo a basso ingrandimento. Le cellule sono strettamente imballate con poco spazio extracellulare. Ogni quadrato della griglia della sezione viene osservato da un'estremità all'altra seguendo il percorso frecciato schematico (frecce rosse). Barra: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative in situ dell'ultrastruttura dei megacariociti. (A) Stadi di maturazione caratteristici dei megacariociti wild-type. I megacariociti sono classificati in quattro fasi di maturazione: Stadio I, una cellula di 10-15 μm di diametro con un nucleo grande; stadio II, una cella di 15-30 μm di diametro contenente il DMS in fase di sviluppo; stadio III, una cellula di 30-50 μm contenente un sistema di membrana di demarcazione (DMS) ben sviluppato che definisce i territori citoplasmatici e ha una zona periferica priva di organelli. Un pirenocita corrisponde al nucleo polilobulato nudo che rimane nel midollo osseo dopo la piena estensione citoplasmatica. Barre: 10 μm (B) Interazioni megacariocita-cellule endoteliali e processi citoplasmatici intravascolare. (i) La zona periferica (PZ) di un megacariocita è strettamente apposta sulla superficie abluminale dell'endotelio sinusoidale. (ii) Un megacariocita che forma brevi sporgenze invasive che penetrano profondamente nello strato endoteliale (punte di freccia). (iii-v) Le frecce indicano processi citoplasmatici di megacariociti con diametri variabili, alcuni dei quali sono molto grandi e hanno una zona periferica che può rappresentare frammenti appena entrati nel flusso sanguigno. (vi) Una tipica piastrina discoide (P) osservata nel lume del seno. In ogni micrografia, la linea rossa indica il lato luminale della barriera endoteliale e la stella indica il lume sinusoide. Barre: 2 μm. (C) Ingrandimenti più elevati della regione perinucleare di un megacariocita maturo. α, granulo alfa; rer, reticolo endoplasmatico ruvido; G, golgi; MVB, corpo multivesicolare; m, mitocondri. Bar: 0,5 μm. (D) Esempio di un megacariocita che mostra emperipolesi. Il neutrofilo inghiottito appare morfologicamente inalterato dall'interazione con i megacariociti. Bar: 2 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare: Preparazione dei reagenti. Fare clic qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'esame diretto dei megacariociti nel loro ambiente nativo è essenziale per comprendere la megacariopoiesi e la formazione piastrinica. In questo manoscritto, forniamo un metodo di microscopia elettronica a trasmissione che combina il lavaggio del midollo osseo e la fissazione per immersione, consentendo di sezionare in situ le caratteristiche morfologiche dell'intero processo di morfogenesi dei megacariociti che si svolge nel midollo osseo.
Il rossore del midollo osseo è un passaggio critico di questo metodo, poiché il successo di un lavaggio di alta qualità dipende dalla pratica e dalla formazione dell'operatore. Sebbene delicato, il lavaggio del midollo osseo è il modo migliore per evitare la rimozione dell'osso mineralizzato, che di solito richiede un trattamento EDTA di 2 settimane per la completa decalcificazione associata a artefatti significativi sulla morfologia dei megacariociti. Inoltre, uno dei principali vantaggi della raccolta di interi midolli ossei non fissati da tibia e femori è la capacità di combinare diversi approcci di imaging allo stesso topo. In pratica, per lo studio ultrastrutturale è necessario un solo midollo osseo, mentre gli altri tre campioni sono disponibili per analisi complementari. Il secondo midollo osseo può quindi essere utilizzato per la preparazione di espianti di midollo osseo fresco, per studiare in tempo reale la dinamica della formazione di proplatelet di megacariociti nativi6. Il terzo campione è solitamente progettato per studi di immuno colorazione su sezioni spesse, fornendo imaging 3D e distribuzione di megacariociti all'interno del loro ambiente naturale. L'ultimo campione può essere congelato e conservato per ulteriori studi mediante microscopia elettronica immunogold, dove la localizzazione subcellulare delle proteine viene studiata ad alta risoluzione4. Questi metodi di imaging combinati, insieme alla disponibilità della delezione/mutazione mirata di geni in un topo, forniscono un mezzo importante per delineare in situ il ruolo biologico di una determinata proteina nella trombopoiesi. Tuttavia, va sottolineato qui che una limitazione di questo metodo è il ritiro delle epifisi necessarie per lavare il midollo. Le epifisi sono note per essere aree importanti per l'ematopoiesi e la loro rimozione ostacola quindi qualsiasi possibilità di analizzare le cellule staminali ematopoietiche e le fasi iniziali di impegno13. Un'altra limitazione è che i progenitori dei megacariociti prima dello stadio immaturo non possono essere identificati perché queste cellule non hanno caratteristiche ultrastrutturali specifiche. Per superare questa limitazione, potrebbe essere utilizzato un approccio EM immunogold.
Il secondo passo importante del metodo è la fissazione del midollo osseo per immersione. Se eseguito nelle condizioni qui descritte, cioè la fissazione immediatamente dopo il lavaggio del cilindro compatto del midollo osseo, ha i seguenti vantaggi: (i) è veloce e facile da eseguire, (ii) conserva un'ultrastruttura vicina a quella osservata dopo la fissazione per perfusione6e (iii) mantiene liberi i processi dei megacariociti e le piastrine nel flusso sanguigno sinusoide che vengono altrimenti eliminati / persi dopo la perfusione. Con questa tecnica è possibile studiare l'ingresso dei megacariociti nella circolazione sinusoidale e caratterizzare tutte le forme intermedie dei processi citoplasmatici da cui sorgono le piastrine8. In linea con questo, è stato recentemente riportato che le grandi protrusioni intravasanti da megacariociti in vivo sono strutturalmente distinte dalle sottili estensioni formate da megacariociti in vitro, con in particolare una diversa disposizione dei microtubuli7. Allo stesso modo, abbiamo recentemente dimostrato che il meccanismo che governa la formazione di piastrine in vivo differisce da quello identificato in vitro14.
Importanti differenze ultrastrutturali sono sempre più riconosciute tra i megacariociti nativi coltivati in vitro e quelli generati in vivo, sottolineando la necessità del microambiente midollare per una completa differenziazione/maturazione dei megacariociti. A seguito della combinazione di arrossamento del midollo osseo e fissazione per immersione descritta in questo articolo, la microscopia elettronica a trasmissione convenzionale rimane ancora uno strumento inestimabile per studiare la biologia dei megacariociti e la formazione delle piastrine, in condizioni fisiologiche e patologiche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), dall'Unione Europea attraverso il Fondo Europeo di Sviluppo Regionale (FESR) e dalla Sovvenzione ANR-17-CE14-0001-01 a H.d.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate - Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
References
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
- Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
- Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
- Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
- Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
- Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
- Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
