Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der Ultrastruktur der Megakaryozyten in situ mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) vor. Murine Knochenmarke werden gesammelt, fixiert, in Epoxidharz eingebettet und in ultradünnen Abschnitten geschnitten. Nach der Kontrastfärbung wird das Knochenmark unter einem TEM-Mikroskop bei 120 kV beobachtet.
Abstract
Differenzierung und Reifung von Megakaryozyten erfolgen in enger Verbindung mit den zellulären und extrazellulären Komponenten des Knochenmarks. Diese Prozesse sind durch das allmähliche Auftreten essentieller Strukturen im Megakaryozytenzytoplasma wie einem polyploiden und polylobulierten Kern, einem internen Membrannetzwerk namens Demarkationsmembransystem (DMS) und den dichten und Alpha-Granula, die in zirkulierenden Blutplättchen gefunden werden, gekennzeichnet. In diesem Artikel beschreiben wir ein standardisiertes Protokoll für die in situ ultrastrukturelle Untersuchung von murinen Megakaryozyten mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), das die Identifizierung von Schlüsselmerkmalen ermöglicht, die ihr Reifestadium und ihre Zelldichte im Knochenmark definieren. Knochenmark wird gespült, fixiert, in Ethanol dehydriert, in Kunststoffharz eingebettet und zur Erzeugung von Querschnitten montiert. Halbdünne und dünne Schnitte werden für histologische bzw. TEM-Beobachtungen hergestellt. Diese Methode kann für jede Knochenmarkzelle in jeder EM-Einrichtung verwendet werden und hat den Vorteil, dass kleine Stichprobengrößen verwendet werden, die die Kombination mehrerer Bildgebungsansätze auf derselben Maus ermöglichen.
Introduction
Megakaryozyten sind spezialisierte große polyploide Zellen, die im Knochenmark lokalisiert sind und für die Thrombozytenproduktion verantwortlich sind1. Sie stammen aus hämatopoetischen Stammzellen durch einen komplizierten Reifungsprozess, bei dem Megakaryozytenvorläufer zunehmend an Größe zunehmen, während sie gleichzeitig umfangreiche morphologische Veränderungen im Zytoplasma und im Zellkern erfahren2. Während der Reifung entwickeln Megakaryozyten eine Reihe von unterscheidbaren Strukturelementen, darunter: ein polylobulierter Kern, Einfärbungen der Oberflächenmembran, die das Demarkationsmembransystem (DMS) bilden, eine periphere Zone ohne Organellen, die vom Aktin-basierten Zytoskelettnetzwerk umgeben ist, und zahlreiche Organellen, darunter α-Granula, dichte Granula, Lysosomen und mehrere Golgi-Komplexe. Auf der ultrastrukturellen Ebene ist eine wesentliche Beobachtete Modifikation die zytoplasmatische Kompartimentierung in diskrete Regionen, die durch das DMS3begrenzt werden. Diese umfangreiche Versorgung mit Membranen wird die Verlängerung langer zytoplasmatischer Prozesse in der Anfangsphase der Thrombozytenproduktion vorantreiben, die sich dann im Kreislauf in Blutplättchen umwandeln. Jeder Defekt während der Megakaryozytendifferenzierung und -reifung kann die Thrombozytenproduktion in Bezug auf die Thrombozytenzahl und / oder die Thrombozytenfunktion beeinflussen.
Die Dünnschichttransmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist seit Jahrzehnten der bildgebende Ansatz der Wahl und bietet eine qualitativ hochwertige Ultrastruktur von Megakaryozyten, die unser Verständnis der Physiologie der Thrombopoese geprägt haben4,5. Diese Arbeit konzentriert sich auf eine standardisierte TEM-Methode, die es ermöglicht, den Prozess der Thrombozytenbiogenese in situ innerhalb der nativen Knochenmark-Mikroumgebung zu erfassen, die auch als Grundlage für die Analyse eines beliebigen Knochenmarkzelltyps dienen könnte. Wir liefern ultrastrukturelle Beispiele für die Entwicklung von Megakaryozyten von unreif bis voll ausgereift, die zytoplasmatische Prozesse in die Mikrozirkulation von Sinusoiden ausdehnen6. Wir beschreiben auch ein einfaches Verfahren zur Quantifizierung der verschiedenen Megakaryozyten-Reifungsstadien, das die Regenerations- und Thrombozytenproduktionskapazität des Knochenmarks anleitet.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den europäischen Normen 2010/63/EU und dem CREMEAS-Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen der Universität Straßburg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg) durchgeführt. Das Protokoll ist in Abbildung 1schematisch dargestellt.
1. Knochenmarkentnahme und -fixierung ( Abbildung 1A)
VORSICHT: Dieses Verfahren umfasst krebserzeugende, erbgutverändernde und/oder toxische Substanzen und wird unter einer chemischen Extraktionshaube durchgeführt. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung wie Handschuhe und Schutzbrillen.
- Die fixierende Lösung bestehend aus 2,5% Glutaraldehyd in Cacodylatpuffer herstellen (siehe Ergänzungsdatei).
- Knochenmarksammlung
- Verwenden Sie erwachsene C57BL/6-Mäuse beiderlei Geschlechts im Alter von 12 bis 18 Wochen. Euthanasierung der Mäuse durch CO2-Erstickung und zervikale Luxation.
- Schneiden Sie mit einer dünnen Schere die Haut um den Oberschenkel und schälen Sie die Haut mit einer Pinzette ab. Entfernen Sie die Extremität der Pfote und schneiden Sie dann zwischen Hüfte und Oberschenkel. Lösen Sie die Tibia vom Femur, indem Sie an der Knieartikulation schneiden und adhärentes Gewebe an Tibias und Femuren mit einem Skalpell entfernen.
- Entfernen Sie die Epiphysen mit einer scharfen Rasierklinge. Während Sie den Femur mit einer Pinzette halten, verwenden Sie eine 5 ml Spritze, die mit Cacodylatpuffer mit einer 21 G Nadel gefüllt ist, um das Knochenmark in ein 15 ml Röhrchen zu spülen, das mit 2 ml Cacodylatpuffer gefüllt ist. Führen Sie dazu die Abschrägung der Nadel in die Knochenmarköffnung ein und drücken Sie langsam auf den Kolben, bis das Mark ausgestoßen ist.
- Knochenmarkfixierung durch schnelles Eintauchen in Fixiermittel.
- Unmittelbar nach dem Spülen wird der Knochenmarkzylinder mit einer Kunststoffpipette für 60 min bei Raumtemperatur in 1 ml frische Glutaraldehyd-Fixierlösung (zuvor in 1.1 hergestellt) überführt.
HINWEIS: Um das Gewebe zu erhalten, stellen Sie sicher, dass der gesamte Prozess, von der Knochendissektion bis zum Fixationsschritt, in weniger als 10 Minuten abgeschlossen ist. Stellen Sie für die Fixierung sicher, dass die Fixierlösung Raumtemperatur hat, um einen Hitzeschock zu vermeiden.
- Unmittelbar nach dem Spülen wird der Knochenmarkzylinder mit einer Kunststoffpipette für 60 min bei Raumtemperatur in 1 ml frische Glutaraldehyd-Fixierlösung (zuvor in 1.1 hergestellt) überführt.
2. Einbetten von Knochenmark in Agarose
HINWEIS: Knochenmarkgewebe ist nicht ausreichend kohäsiv, um seine Integrität während der verschiedenen Waschschritte aufrechtzuerhalten, und Material kann leicht verloren gehen. Um dieses Problem zu überwinden, wird das Mark vor der Austrocknung mit einem Agargel bedeckt.
- Bereiten Sie die Agaroselösung wie in der Ergänzungsdateibeschrieben vor.
- Waschen Sie das feste Mark aus Abschnitt 1.3 in Cacodylatpuffer und geben Sie es vorsichtig mit einer Kunststoffpipette auf einen Glasträger. Tragen Sie mit einer warmen Pipette schnell einen Tropfen 2% flüssiges Agar auf den Knochenmarkzylinder auf.
HINWEIS: Das Agar erstarrt beim Abkühlen schnell. Um eine homogene Abdeckung des Knochenmarks zu gewährleisten, muss die Agarlösung warm gehalten werden, bis sie sich auf dem Objektträger ablagert. - Legen Sie die Rutsche schnell schnell auf Eis, bis sich das Agar erstarrt (1-2 min).
- Verwenden Sie unter einem Mikroskop eine scharfe Rasierklinge, um die Extremitäten des Knochenmarkzylinders wegen der möglichen Gewebekompression in diesen Bereichen zu schneiden und zu verwerfen. Übertragen Sie die Markblöcke in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die 1 ml Cacodylatpuffer enthalten.
3. Einbetten von Knochenmark in Harz
VORSICHT: Harzbestandteile sind giftig; einige sind krebserregend und müssen vorsichtig unter einer chemischen Absaugung gehandhabt werden. Verwenden Sie geeignete Schutzausrüstung wie Handschuhe und Schutzbrillen. Osmiumtetroxid ist bei Raumtemperatur sehr flüchtig und seine Dämpfe sind sehr schädlich für Augen, Nase und Rachen. Vor der Entsorgung müssen 2% Osmiumtetroxid durch Zugabe des doppelten Volumens an Pflanzenöl neutralisiert werden.
- Bereiten Sie das Epoxidharz wie in der Ergänzungsdateibeschrieben vor.
- Harzeinbettung
HINWEIS: Bewahren Sie die Proben während der Inkubationen in aufeinanderfolgenden Bädern von Osmium, Uranylacetat und Ethanol in denselben Mikrozentrifugenröhrchen auf. Aspirieren Sie die Überstände mit einer Pasteurpipette. Das Volumen der für jedes Bad verwendeten Lösung muss mindestens dem 10-fachen volumen der Probe entsprechen.- Die Blöcke mit 1% Osmium im Cacodylatpuffer für 1 h bei 4 °C fixieren, einmal im Cacodylatpuffer und dann einmal in destilliertem Wasser waschen.
- Mit 4% Uranylacetat in destilliertem Wasser für 1 h färben, zweimal in destilliertem Wasser waschen.
- Dehydrieren Sie durch eine abgestufte Reihe von Ethanol in destilliertem Wasser: 4 mal in 75% Ethanol für 5 min, gefolgt von 3 mal in 95% Ethanol für 20 min und dann 3 mal in 100% Ethanol für 20 min. Nehmen Sie bei diesem Schritt eine Spritze Epoxidharz aus dem Gefrierschrank.
HINWEIS: Das Protokoll kann in 100% Ethanol für 1 h pausiert werden. - Um eine gleichmäßige Infiltration und Polymerisation von Epoxidharz im Mark zu erhalten, inkubieren Sie zuerst die Blöcke in 2 aufeinanderfolgenden Propylenoxidbädern für 15 min.
- Fügen Sie eine 1: 1-Mischung aus 100% Propylenoxid und Epoxidharz hinzu und inkubieren Sie für 1 h. Legen Sie die Proben auf einen langsamen Rotationsschüttler bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie 100% Epoxidharz hinzu und lassen Sie die Probe über Nacht unter Rühren inkubieren.
- Fügen Sie 100% Epoxidharz für 2 h Inkubation hinzu, noch unter Rühren.
- Legen Sie die Markblöcke unter einem Mikroskop in flache Silikonformen. Orientieren Sie die Proben so, dass eine anschließende Querschnittung des gesamten Knochenmarks möglich ist. Füllen Sie die Formen mit Epoxidharz und stellen Sie sie 48 h lang bei 60 °C ab.
HINWEIS: Alle Lösungen (außer Ethanol und Propylenoxid) werden durch einen 0,22-μm-Filter filtriert, um eine Kontamination der Proben zu vermeiden. Um eine ausreichende Polymerisation des Harzes zu gewährleisten, vermeiden Sie Blasen beim Füllen der Formen.
4. Ultradünne Schnitte (Abbildung 1B)
HINWEIS: Die Transmissions-EM erfordert dünne Gewebeschnitte, durch die Elektronen hindurchgehen können, um ein Projektionsbild des Inneren von Zellen, der Struktur und Organisation der inneren Organellen (Granula, endoplasmatisches Retikulum, Golgi) und der Anordnung der intrazellulären Zellmembranen zu erzeugen.
- Montieren Sie den Probenblock in einer Ultra-Mikrotomstütze. Legen Sie es auf den Probenhalter. Schneiden Sie die Proben auf 45° ab, um den Überschuss an Harz um das Gewebe mit einem rotierenden Diamant- oder Wolframfräser zu entfernen.
- Montieren Sie die Proben auf dem Ultramikrotom mit einer Diamantmesserklinge, die mit einem Wassertank ausgestattet ist. Schneiden Sie Querschnitte von 500 nm bzw. 100 nm Dicke für histologische bzw. TEM-Analysen. Sammeln Sie schwimmende Abschnitte auf der Wasseroberfläche mit einer Schlaufe.
- Legen Sie den 500 nm dicken Abschnitt auf einem Glasobjektträger und die 100 nm dicken Abschnitte auf 200-mesh-Dünnstab-Kupfergittern mit einem Papierfilter darunter ab. Bereiten Sie fünf Gitter für eine Bedingung vor: Färben Sie zuerst zwei Gitter und behalten Sie die drei verbleibenden Gitter bei Bedarf als Backup.
5. Toluidinblaufärbung für die Histologie
HINWEIS: Das Färben von Abschnitten für die Histologie ist aus drei Gründen wichtig: 1) um sicherzustellen, dass das Gewebe tatsächlich geschnitten wird und nicht das Harz, 2) um die Qualität des Einschlusses zu überprüfen, und 3) um die Knochenmarkprobe schnell zu bewerten. Wenn dies nicht korrekt ist, schneiden Sie tiefer in den Block.
- Trocknen Sie die halbdünnen Schnitte auf einer Heizplatte (60 °C).
- Filtriertes 1% Toluidinblau/1 % Natriumborat in destilliertem Wasser auf die Objektträger geben und auf einer Heizplatte (60 °C) für 1-2 min erhitzen. Waschen Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser und lassen Sie sie auf der Wärmeplatte trocknen.
- Befestigen Sie Abschnitte auf Deckgläsern mit einem Tropfen Poly(butylmethacrylat-co-methylmethacrylat) Montagemedium und untersuchen Sie unter einem Lichtmikroskop.
6. Schwermetallfärbung zur TEM-Beobachtung (Abbildung 1C)
HINWEIS: Für den Kontrast wird die Oberseite der Gitter auf 100 μL Tropfen jedes nachfolgenden Bades mit einer Schlaufe invertiert. Vor der Verwendung wird jede Lösung 0,22 μm gefiltert. Entfernen Sie den Flüssigkeitsüberschuss zwischen den einzelnen Bädern, indem Sie vorsichtig die Gitterseite auf einem Filterpapier berühren.
- Färbung mit 4% Uranylacetat in destilliertem Wasser für 5 min.
- 3 mal in destilliertem Wasser für 5 min waschen.
- 3 min mit Bleicitrat färben.
- 3 mal in destilliertem Wasser für 5 min waschen.
- Legen Sie die Gitter an der Unterseite in Kontakt mit dem Filterpapier ab, um sie trocknen zu lassen.
HINWEIS: Schwermetalle reagieren in Gegenwart von Kohlendioxid. Um die Ausscheidungen zu minimieren, vermeiden Sie Luftverschiebungen während des Kontrasts, sprechen Sie nicht, halten Sie die Umgebung ruhig und schalten Sie die Klimaanlage aus.
7. TEM (Abbildung 1E)
HINWEIS: Die Schnitte werden in ein TEM-Mikroskop eingebracht und bei 120 kV untersucht.
- Untersuchen Sie zunächst die Abschnitte bei geringer Vergrößerung (< 500x), um den allgemeinen Aspekt der Vorbereitung zu würdigen (Fehlen eines Lochs im Harz, Falten / Kompression in den Abschnitten, Ausscheidungen aufgrund von Flecken).
- Untersuchen Sie dann die Abschnitte mit höherer Vergrößerung (~ 2000x, um das Reifestadium zu unterscheiden). Zählen Sie manuell die Megakaryozyten aus jedem Stadium der Reifung über ganze Transversalabschnitte (siehe Repräsentative Ergebnisse zur visuellen Identifizierung jedes Stadiums).
HINWEIS: Jedes Quadrat der Gitter ist als untersuchungsbedürftiger Bereich definiert (was 16000 μm2 für 200 Mesh Kupfergitter entspricht). - Um die Anzahl der Megakaryozyten zu beurteilen, quantifizieren Sie nur die Quadrate, die vollständig mit einem Abschnitt bedeckt sind. Verwenden Sie dazu ein Modell, das auf dem Screening von Bereichen basiert. Beobachten Sie einen ersten Bereich von Quadraten von einem Ende des Abschnitts zu einem anderen, dann einen anderen Bereich auf die gleiche Weise usw. Mit diesem Verfahren sieben Sie den gesamten Querschnitt des Knochenmarks vollständig und systematisch Quadrat für Quadrat.
- Bewerten Sie für jedes Quadrat die Anzahl der Megakaryozyten der Stufe I, II oder III.
HINWEIS: Höhere Vergrößerungen sind erforderlich, um die Granula, die DMS-Organisation, die Größe der zytoplasmatischen Territorien und den polylobulierten Kern zu analysieren.
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Representative Results
Histologie des Knochenmarks
Die Beobachtung der Knochenmark-Toluidin-Blau-Histologie unter einem Lichtmikroskop ist der Schlüssel zur schnellen Analyse der gesamten Gewebearchitektur in Bezug auf z.B. Gewebekompaktheit, Mikrogefäßkontinuität und die Größe und Form von Megakaryozyten (Abbildung 1D). Es wird vor ultradünnen Abschnitten durchgeführt, um die Notwendigkeit zu bestimmen, tiefer in den Knochenmarkblock zu schneiden. Aufgrund ihrer riesigen Größe und Kernlobulation können die reiferen Megakaryozyten leicht mit einem 40-fachen Objektiv visualisiert werden. Dies gibt einen hervorragenden und schnellen Überblick über die Dichte der reifen Megakaryozyten im Gewebe und ihre relative Lokalisation zu den Mikrogefäßen. Anomalien in der Proliferation und Reifung von Megakaryozyten konnten bereits in solchen halbdünnen Abschnitten nachgewiesen werden.
Knochenmark-Ultrastruktur
Auf der Grundlage unterschiedlicher ultrastruktureller Eigenschaften werden murine Megakaryozyten in 4 Stufen unterteilt, die sequentielle Stadien in ihrer Reifung darstellen (Abbildung 2A). Megakaryozyten im Stadium I haben einen Durchmesser von 10-15 μm, wobei ein großer Kern den größten Teil der Zelle einnimmt und reichlich Ribosomen und ein raues endoplasmatisches Retikulum enthält. Das Vorhandensein der frühesten nachweisbaren Stufe des DMS, die als Prä-DMS bezeichnet wird, ist auch ein Schlüsselkriterium für die Unterscheidung von Stufe-I-MKs in der TEM-Analyse3. Im Stadium II der Reifung beginnt die Granulatbildung und die Entwicklung des DMS wird eingeleitet. Megakaryozyten nehmen an Größe zu, messen 15-25 μm im Durchmesser und entwickeln eine Kernlobulation. Reife Megakaryozyten im Stadium III sind Riesenzellen mit einem Durchmesser von 25-50 μm. Ihr Zytoplasma enthält ein gut entwickeltes DMS mit klar definierten zytoplasmatischen Territorien und einer peripheren Zone ohne Organellen. In diesem Stadium befindet sich der Kern im Allgemeinen exzentrisch und erscheint sehr unregelmäßig mit kondensiertem Chromatin an der Kernmembran. Der letzte Schritt ist durch einen nackten Kern, auch Pyrenozyten genannt, gekennzeichnet, der aus einem großen Kern besteht, der von einer Plasmamembran umgeben ist, nachdem der Großteil des Zytoplasmas eliminiert wurde. Bei Wildtyp-C57BL/6-Mäusen besteht das Knochenmark aus etwa 8% Megakaryozyten im Stadium I, 20% im Stadium II, 71% megakaryozyten des Stadiums III und < 1% aus Pyrenozyten. Die durchschnittliche Anzahl der Megakaryozyten liegt zwischen 1,7 und 2,2 Zellen pro Quadrat. Diese willkürliche Klassifizierung ermöglicht es, einen kontinuierlichen Prozess der Zelldifferenzierung bequem zu überwachen und seine möglichen Anomalien zu erkennen.
Neben diesen klassischen Stadien der Reifung erlaubt die Beobachtung von fixierten Megakaryozyten im Knochenmark die Analyse der Reihe von Ereignissen, die auftreten, wenn Megakaryozyten mit der Sinuswand interagieren (Abbildung 2B). Megakaryozyten in Kontakt mit den Endothelzellen werden häufig in Dünnschliffen beobachtet. Gelegentlich beobachtet man Megakaryozyten, die kurze invasive Vorsprünge bilden, die in das Endothel eindringen oder eine große Projektion seines Zytoplasmas in das sinusförmige Lumenausdehnen 7,8. Bemerkenswerterweise zeigen diese intravaskulären zytoplasmatischen Prozesse variable Größen, Längen und Durchmesser, die den progressiven Thrombozytenumbau im Kreislauf veranschaulichen. Blutplättchen, die bereits im allgemeinen Kreislauf vorhanden sind und eine diskoide Form aufweisen, die durch umlaufende Mikrotubuli-Spulen aufrechterhalten wird, sind auch im Lumen der Sinusoiden sichtbar. Diese typische Morphologie der Blutplättchen ist bezeichnend für die korrekte Fixierung des Exemplars.
Die Transmissionselektronenmikroskopie hat die Auflösung, die erforderlich ist, um ultrastrukturelle Details wie Kernlobulation, räumliche Organisation des DMS und der Granula in Bezug auf Größe, Form und Verteilung zu visualisieren. Abbildung 2C ist ein Beispiel für die perinukleäre Region in einem Megakaryozyten im Stadium III, die das Vorhandensein von α Granula, Golgi-Zisternae, Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum zeigt. Bemerkenswert in Abbildung 2C ist auch ein multivesikulärer Körper, der ein Zwischenstadium bei der Bildung von Alpha- und dichten Granula darstellt und Multiples-Exosomen mit einem Durchmesser von weniger als 200 Å im Durchmesser9,10 enthält. Schließlich ermöglicht die Transmissionselektronenmikroskopie die Visualisierung von Neutrophilen und anderen hämatopoetischen Zellen, die in den Megakaryozyten vorhanden sind (Abbildung 2D) nach einem ungewöhnlichen Prozess namens Emperipolesis, bei dem eine Zelle in eine andere lebende Zelleeindringt 11. Dieser Prozess, der 4% der Megakaryozyten in normalem physiologischem Zustand betrifft, kann bei bestimmten pathologischen Zuständen signifikant erhöht werden12.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus. (A) Verfahren zum Einbetten in das Knochenmark. Das Knochenmark wird durch schnelles Eintauchen in Glutaraldehydlösung gespült und fixiert. Das Foto veranschaulicht das typische Aussehen des Knochenmarkzylinders nach der Spülung. Nach 1 h Fixierung bei Raumtemperatur wird das Mark von Agarose umgeben, in Osmiumtetroxid postfixiert und in Uranylacetat inkubiert. Die Gewebe werden dann in Puffer gespült, in einer Reihe von gradiertem Ethanol dehydriert, in Propylenoxid inkubiert und mit Epoxidharz infiltriert. (B) Knochenmark blockiert das Schneiden. Das eingebettete Knochenmark ist auf einem Ultramikrotomhalter montiert, auf 45° getrimmt und entweder in halbdünnen (500 nm) oder dünnen (100 nm) Abschnitten geschnitten. Für ultrastrukturelle Untersuchungen werden die schwimmenden Abschnitte mit einer Schlaufe aufgenommen und mit einem darunter liegenden Papierfilter auf Gittern abgeschieden. (C) Kontrastfärbung für TEM-Beobachtungen. Gitter werden auf Uranylacetattropfen invertiert, auf destillierten Wassertropfen gewaschen und vor einem weiteren Waschgang mit Bleicitrat inkubiert. Nach dem Trocknen (Oberseite mit den Schnitten) sind die Proben bereit, unter dem TEM untersucht zu werden. (D) Histologie eines mit Toluidinblau gefärbten Oberschenkelmarkabschnitts der Maus. Die Riesenzellen entsprechen reifen Megakaryozyten (1), von denen einige in Kontakt mit Sinusoiden stehen (2). Die Sinusoide konvergieren an einer großen zentralen Sinusvene (3). Bar: 20 μm. Einschub: Normales Aussehen eines reifen Megakaryozyten bei 40-facher Vergrößerung. (E) Repräsentatives TEM-Bild eines Knochenmarkschnitts bei geringer Vergrößerung. Die Zellen sind dicht gepackt mit wenig extrazellulärem Raum. Jedes Gitterquadrat des Abschnitts wird von einem Extrem zum anderen beobachtet, indem man dem schematischen Pfeilpfad (rote Pfeile) folgt. Balken: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative In-situ-Aufnahmen der Ultrastruktur von Megakaryozyten. (A) Charakteristische Reifestadien von Wildtyp-Megakaryozyten. Megakaryozyten werden in vier Reifestufen eingeteilt: Stadium I, eine Zelle mit einem Durchmesser von 10-15 μm und einem großen Kern; Stufe II, eine Zelle mit einem Durchmesser von 15-30 μm, die das in der Entwicklung befindliche DMS enthält; Stadium III, eine 30-50 μm große Zelle, die ein gut entwickeltes Demarkationsmembransystem (DMS) enthält, das zytoplasmatische Territorien definiert und eine organellenfreie periphere Zone aufweist. Ein Pyrenozyt entspricht dem nackten polylobulierten Kern, der nach vollständiger zytoplasmatischer Ausdehnung im Knochenmark verbleibt. Balken: 10 μm (B) Megakaryozyten-Endothelzell-Interaktionen und intravaskuläre zytoplasmatische Prozesse. (i) Die periphere Zone (PZ) eines Megakaryozyten ist eng mit der abluminalen Oberfläche des sinusförmigen Endothels verbunden. (ii) Ein Megakaryozyten, der kurze invasive Vorsprünge bildet, die tief in die Endothelschicht eindringen (Pfeilspitzen). iii-v) Die Pfeile zeigen zytoplasmatische Prozesse von Megakaryozyten mit unterschiedlichen Durchmessern an, von denen einige sehr groß sind und eine periphere Zone haben, die Fragmente darstellen kann, die gerade in den Blutkreislauf gelangt sind. (vi) Ein typisches diskoides Thrombozyten (P), das im Sinuslumen beobachtet wird. In jeder Mikroaufnahme zeigt die rote Linie die luminale Seite der Endothelbarriere und der Stern das sinusförmige Lumen an. Balken: 2 μm. (C) Höhere Vergrößerungen der perinukleären Region eines reifen Megakaryozyten. α, Alpha-Granulat; rer, raues endoplasmatisches Retikulum; G, Golgi; MVB, multivesikulärer Körper; m, Mitochondrien. Bar: 0,5 μm. (D) Beispiel eines Megakaryozyten mit Emperipolese. Das verschlungene Neutrophil erscheint morphologisch unverändert durch die Interaktion mit Megakaryozyten. Balken: 2 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Datei: Vorbereitung der Reagenzien. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die direkte Untersuchung von Megakaryozyten in ihrer natürlichen Umgebung ist unerlässlich, um Megakaryopoese und Thrombozytenbildung zu verstehen. In diesem Manuskript stellen wir eine Transmissionselektronenmikroskopie-Methode zur Verfügung, die Knochenmarkspülung und Fixierung durch Eintauchen kombiniert und es ermöglicht, die morphologischen Eigenschaften des gesamten Prozesses der Megakaryozytenmorphogenese im Knochenmark in situ zu sezieren.
Die Spülung des Knochenmarks ist ein kritischer Schritt dieser Methode, da der Erfolg einer qualitativ hochwertigen Spülung von der Praxis und Ausbildung des Bedieners abhängt. Obwohl empfindlich, ist das Spülen des Knochenmarks der beste Weg, um die Entfernung des mineralisierten Knochens zu vermeiden, was normalerweise eine 2-wöchige EDTA-Behandlung zur vollständigen Entkalkung erfordert, die mit signifikanten Artefakten in der Megakaryozytenmorphologie verbunden ist. Darüber hinaus ist ein großer Vorteil der Sammlung ganzer unfixierter Knochenmarke aus Schienbein und Oberschenkelknochen die Möglichkeit, mehrere Bildgebungsansätze für dieselbe Maus zu kombinieren. In der Praxis wird für die ultrastrukturelle Untersuchung nur ein einziges Knochenmark benötigt, die anderen drei Proben stehen für ergänzende Analysen zur Verfügung. Das zweite Knochenmark kann dann für die Herstellung von frischen Knochenmark-Explantaten verwendet werden, um in Echtzeit die Dynamik der Proplatbildung von nativen Megakaryozyten zu untersuchen6. Die dritte Probe ist in der Regel für Immunfärbungsstudien an dicken Abschnitten konzipiert und bietet 3D-Bildgebung und Verteilung von Megakaryozyten in ihrer natürlichen Umgebung. Die letzte Probe kann eingefroren und für weitere Untersuchungen mittels Immungold-Elektronenmikroskopie gelagert werden, wobei die subzelluläre Lokalisation von Proteinen mit hoher Auflösung untersucht wird4. Diese kombinierten bildgebenden Verfahren bieten zusammen mit der Verfügbarkeit der gezielten Deletion/Mutation von Genen in einer Maus ein wichtiges Mittel, um die biologische Rolle eines bestimmten Proteins bei thrombopoiesen in situ zu beschreiben. Es sollte jedoch hier darauf hingewiesen werden, dass eine Einschränkung dieser Methode der Entzug der Epiphysen ist, die zum Spülen des Knochenmarks benötigt werden. Es ist bekannt, dass Epiphysen wichtige Bereiche für die Hämatopoese sind, und ihre Entfernung behindert daher jede Möglichkeit, hämatopoetische Stammzellen und die Anfangsphasen des Engagements zu analysieren13. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass Vorläufer von Megakaryozyten vor dem unreifen Stadium I nicht identifiziert werden können, da diese Zellen keine spezifischen ultrastrukturellen Merkmale aufweisen. Um diese Einschränkung zu überwinden, könnte ein EM-Immunogold-Ansatz verwendet werden.
Der zweite wichtige Schritt der Methode ist die Knochenmarkfixierung durch Eintauchen. Wenn sie unter den hier beschriebenen Bedingungen durchgeführt wird, d.h. die Fixierung unmittelbar nach dem Ausspülen des kompakten Knochenmarkzylinders, hat sie folgende Vorteile: (i) sie ist schnell und einfach durchzuführen, (ii) sie bewahrt eine Ultrastruktur, die derjenigen nahe kommt, die nach der Fixierung durch Perfusion6beobachtet wird, und (iii) sie erhält freie Megakaryozytenprozesse und Blutplättchen im sinusoiden Blutkreislauf aufrecht, die ansonsten nach der Perfusion ausgespült / verloren werden. Mit dieser Technik ist es möglich, den Eintritt von Megakaryozyten in den sinusförmigen Kreislauf zu untersuchen und alle Übergangsformen zytoplasmatischer Prozesse zu charakterisieren, aus denen Blutplättchen entstehen8. In Übereinstimmung damit wurde kürzlich berichtet, dass sich die großen Vorsprünge, die in vivo von Megakaryozyten intravasieren, strukturell von den dünnen Extensions unterscheiden, die von Megakaryozyten in vitrogebildet werden, mit einer bemerkenswerten Anordnung der Mikrotubuli7. In ähnlicher Weise haben wir kürzlich gezeigt, dass sich der Mechanismus, der die Thrombozytenbildung in vivo steuert, von dem in vitroidentifizierten Mechanismus unterscheidet14.
Wichtige ultrastrukturelle Unterschiede werden zunehmend zwischen in vitro kultivierten und in vivo erzeugten nativen Megakaryozyten erkannt, was die Notwendigkeit der Mikroumgebung des Knochenmarks für eine vollständige Megakaryozytendifferenzierung / -reifung unterstreicht. Nach der in diesem Artikel beschriebenen Kombination von Knochenmarkspülung und Fixierung durch Eintauchen bleibt die konventionelle Transmissionselektronenmikroskopie immer noch ein unschätzbares Werkzeug, um die Megakaryozytenbiologie und die Thrombozytenbildung unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Die Autoren danken Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), der Europäischen Union über den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE) und durch den Zuschuss ANR-17-CE14-0001-01 an H.d.S. unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate - Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
References
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