Summary
यहां, हम ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) का उपयोग करके सीटू में मेगाकारियोसाइट्स की अल्ट्रास्ट्रक्चर का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। मुरीन बोन मैरो एकत्र किए जाते हैं, तय किए जाते हैं, एपॉक्सी राल में एम्बेडेड होते हैं और अल्ट्राथिन वर्गों में कटौती करते हैं। इसके विपरीत धुंधला होने के बाद, बोन मैरो को 120 केवी पर टेम माइक्रोस्कोप के तहत मनाया जाता है।
Abstract
मेगाकारियोसाइट्स का भेदभाव और परिपक्वता बोन मैरो के सेलुलर और बाह्यकोशिक घटकों के साथ निकट सहयोग में होती है। इन प्रक्रियाओं को मेगाकारियोसाइट साइटोप्लाज्म में आवश्यक संरचनाओं की क्रमिक उपस्थिति जैसे पॉलीप्लाइड और पॉलीलोबुलेटेड न्यूक्लियस, एक आंतरिक झिल्ली नेटवर्क जैसे सीमांकन झिल्ली प्रणाली (डीएमएस) और घने और अल्फा कणिकाओं की विशेषता है जो प्लेटलेट्स परिसंचारी में पाए जाएंगे। इस लेख में, हम ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) का उपयोग करके मुरीन मेगाकारियोसाइट्स के सीटू अल्ट्रास्ट्रक्चरल अध्ययन में एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो बोन मैरो में उनके परिपक्वता चरण और सेलुलर घनत्व को परिभाषित करने वाली प्रमुख विशेषताओं की पहचान के लिए अनुमति देता है। बोन मैरो को फ्लश किया जाता है, तय किया जाता है, इथेनॉल में निर्जलित किया जाता है, प्लास्टिक राल में एम्बेडेड होता है, और क्रॉस-सेक्शन पैदा करने के लिए घुड़सवार होता है। अर्ध-पतली और पतले वर्ग क्रमशः हिस्टोलॉजिकल और तेम टिप्पणियों के लिए तैयार किए जाते हैं। इस विधि का उपयोग किसी भी बोन मैरो सेल के लिए किया जा सकता है, किसी भी ईएम सुविधा में और एक ही माउस पर कई इमेजिंग दृष्टिकोणों के संयोजन के लिए अनुमति देने वाले छोटे नमूना आकारों का उपयोग करने का लाभ है।
Introduction
मेगाकारियोसाइट्स विशेष बड़े पॉलीप्लाइड कोशिकाएं हैं, जो बोन मैरो में स्थानीयकृत हैं, जो प्लेटलेट उत्पादन1के लिए जिम्मेदार हैं। वे एक जटिल परिपक्वता प्रक्रिया के माध्यम से हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं, जिसके दौरान मेगाकारियोसाइट अग्रदूत उत्तरोत्तर आकार में वृद्धि करते हैं, जबकि साइटोप्लाज्म और नाभिक 2 में व्यापक सहवर्ती रूपात्मक रूपात्मक परिवर्तनों से गुजरतेहैं। परिपक्वता के दौरान, मेगाकारियोसाइट्स कई विशिष्ट संरचनात्मक तत्वों का विकास करते हैं जिनमें शामिल हैं: एक पॉलीलोब्लुलेटेड न्यूक्लियस, सतह झिल्ली के इन्वेजिनेशन जो सीमांकन झिल्ली प्रणाली (डीएमएस) बनाते हैं, एक परिधीय क्षेत्र जो ऐक्टिन आधारित साइटोस्केलेटल नेटवर्क से घिरे ऑर्गेनेल्स से रहित है, और α-कणिकाओं, घने कणिकाओं, lysosomes, और कई गोलगी परिसरों सहित कई ऑर्गेनेल्स। अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्तर पर, एक प्रमुख संशोधन देखा गया है कि डीएमएस3द्वारा सीमित असतत क्षेत्रों में साइटोप्लाज्मिक कंपार्टमेंटाइजेशन है। झिल्ली की यह व्यापक आपूर्ति प्लेटलेट उत्पादन के प्रारंभिक चरण में लंबी साइटोप्लाज्मिक प्रक्रियाओं के विस्तार को बढ़ावा देगी, जो तब परिसंचरण के अंदर प्लेटलेट्स में फिर से तैयार हो जाएगी। मेगाकार्योसाइट भेदभाव और परिपक्वता के दौरान कोई भी दोष प्लेटलेट काउंट और/या प्लेटलेट फंक्शन की अवधि में प्लेटलेट उत्पादन को प्रभावित कर सकता है ।
पतली परत ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) दशकों से पसंद का इमेजिंग दृष्टिकोण रहा है जो मेगाकारियोसाइट्स की उच्च गुणवत्ता वाले अल्ट्रास्ट्रक्चर प्रदान करता है जिसने थ्रोम्बोपोइसिस4,5के शरीर विज्ञान की हमारी समझ को आकार दिया है। यह पेपर एक मानकीकृत टेम विधि पर केंद्रित है जो देशी अस्थि मज्जा माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर सीटू में होने वाली प्लेटलेट बायोजेनेसिस की प्रक्रिया को कैप्चर करने की अनुमति देता है, जो किसी भी अस्थि मज्जा कोशिका प्रकार का विश्लेषण करने के लिए एक आधार के रूप में भी काम कर सकता है। हम अपरिपक्व से पूरी तरह परिपक्व तक मेगाकारियोसाइट्स के विकास के अल्ट्रास्ट्रक्चरल उदाहरण प्रदान करते हैं, जो साइनसॉइड6के माइक्रोसर्कुलेशन में साइटोप्लाज्मिक प्रक्रियाओं का विस्तार करते हैं। हम बोन मैरो के पुनर्जनन और प्लेटलेट उत्पादन क्षमता पर निर्देश देते हुए विभिन्न मेगाकार्योसाइट परिपक्वता चरणों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक आसान प्रक्रिया का भी वर्णन करते हैं।
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों यूरोपीय मानकों के अनुसार प्रदर्शन किया गया 2010/63/यूरोपीय संघ और स्ट्रासबर्ग विश्वविद्यालय के पशु प्रयोगों की नैतिकता पर CREMEAS समिति (Comité Régional d' Ethique en Matière d ' Expérimentation Animale स्ट्रासबर्ग) । प्रोटोकॉल को स्कीमेटिक रूप से चित्र 1 में दिखाया गयाहै ।
1. बोन मैरो संग्रह और निर्धारण (चित्रा 1A)
सावधानी: इस प्रक्रिया में कैंसरजनक, उत्परिवर्तनीय, और/या जहरीले पदार्थ शामिल हैं और रासायनिक निष्कर्षण हुड के तहत किया जाता है। दस्ताने और सुरक्षा चश्मा जैसे उपयुक्त सुरक्षा उपकरण पहनें।
- कोकोडिलेट बफर (पूरक फ़ाइलदेखें) में 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड से मिलकर फिक्सेटिव समाधान तैयार करें।
- बोन मैरो संग्रह
- या तो सेक्स के वयस्क C57BL/6 चूहों का उपयोग करें 12-18 सप्ताह की उम्र । सीओ 2 श्वासावरोध औरगर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु।
- पतली कैंची की एक जोड़ी के साथ, जांघ के चारों ओर त्वचा को काटें और त्वचा को छीलने के लिए चिमटी का उपयोग करें। पंजा के चरम को हटा दें और फिर कूल्हे और जांघ के बीच काट लें। घुटने की अभिव्यक्ति पर काटने से फीमर से अलग टिबिया और एक स्केलपेल का उपयोग करके टिबिया और फीमर पर अनुयायी ऊतक को हटा दें।
- एक तेज रेजर ब्लेड के साथ एपिफिसिस निकालें। चिमटी के साथ फीमर पकड़े हुए, 21 जी सुई के साथ कैकोडिलेट बफर से भरी 5 एमएल सिरिंज का उपयोग करें ताकि बोन मैरो को 2 एमएल कैकोडिलेट बफर से भरी 15 एमएल ट्यूब में फ्लश किया जा सके। ऐसा करने के लिए, बोन मैरो खोलने में सुई के बेवेल डालें और धीरे-धीरे प्लंजर दबाए जब तक कि मज्जा निष्कासित न हो जाए।
- सुधार में तेजी से विसर्जन द्वारा बोन मैरो निर्धारण।
- फ्लशिंग के तुरंत बाद, कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए ताजा ग्लूटारल्डिहाइड फिक्सेटिव समाधान (पहले 1.1 में तैयार) के 1 एमएल में बोन मैरो सिलेंडर को स्थानांतरित करने के लिए प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करें।
नोट: ऊतक को संरक्षित करने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि हड्डी विच्छेदन से लेकर निर्धारण चरण तक की पूरी प्रक्रिया 10 मिनट से भी कम समय में पूरी हो जाए। निर्धारण के लिए, सुनिश्चित करें कि गर्मी के झटके से बचने के लिए फिक्सेटिव समाधान कमरे के तापमान पर है।
- फ्लशिंग के तुरंत बाद, कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए ताजा ग्लूटारल्डिहाइड फिक्सेटिव समाधान (पहले 1.1 में तैयार) के 1 एमएल में बोन मैरो सिलेंडर को स्थानांतरित करने के लिए प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करें।
2. एगर उठे में अस्थि मज्जा एम्बेड
नोट: मज्जा ऊतक विभिन्न धोने के चरणों और सामग्री आसानी से खो दिया जा सकता है के दौरान अपनी अखंडता को बनाए रखने के लिए पर्याप्त एकजुट नहीं है। इस समस्या को दूर करने के लिए, मैरो को निर्जलीकरण से पहले आगर के एक जेल में कवर किया जाता है।
- अनुपूरक फाइलमें वर्णित अगेनसं समाधान तैयार करें .
- कैकोडीलेट बफर में सेक्शन 1.3 से फिक्स्ड मैरो को धोएं और प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करके इसे ध्यान से ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित करें। एक गर्म पिपेट का उपयोग करके, बोन मैरो सिलेंडर पर 2% तरल आगार की एक बूंद जल्दी से लागू करें।
नोट: अगर जल्दी जमना जबकि ठंडा । अस्थि मज्जा के एक समरूप आवरण सुनिश्चित करने के लिए, आगर समाधान गर्म रखा जाना है जब तक यह स्लाइड पर जमा है । - जल्दी से स्लाइड को बर्फ पर तेजी से रखें जब तक कि एगर जम न जाए (1-2 मिनट)।
- एक माइक्रोस्कोप के तहत, इन क्षेत्रों में संभावित ऊतक संपीड़न के कारण अस्थि मज्जा सिलेंडर के चरम को काटने और त्यागने के लिए एक तेज रेजर ब्लेड का उपयोग करें। 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में मैरो ब्लॉक स्थानांतरित करें जिसमें 1 एमएल कैकोडिलेट बफर होता है।
3. राल में अस्थि मज्जा एम्बेड
सावधानी: राल घटक विषाक्त हैं; कुछ कैंसरजनक हैं और एक रासायनिक निष्कर्षण हुड के तहत देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। दस्ताने और सुरक्षा चश्मे जैसे उपयुक्त सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें। ओस्मियम टेट्रोक्साइड कमरे के तापमान पर अत्यधिक अस्थिर होता है और इसकी वाष्प आंखों, नाक और गले के लिए बहुत हानिकारक होती है। खारिज होने से पहले, वनस्पति तेल की अपनी मात्रा को दो बार जोड़कर 2% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड को बेअसर किया जाना चाहिए।
- अनुपूरक फाइलमें वर्णित एपॉक्सी राल तैयार करें ।
- राल एम्बेडिंग
नोट: ओसमियम, यूरेनाइल एसीटेट और इथेनॉल के लगातार स्नान में ऊष्मायन के दौरान नमूनों को एक ही माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें। एक पाश्चर पिपेट के साथ सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें। प्रत्येक स्नान के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधान की मात्रा नमूने की कम से कम 10x मात्रा के बराबर होनी चाहिए।- 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कैकोडिलेट बफर में 1% ऑस्मियम के साथ ब्लॉक को ठीक करने के बाद, एक बार कैकोडिलेट बफर में धोएं और फिर एक बार आसुत पानी में।
- 1 घंटे के लिए आसुत पानी में 4% यूरेसिल एसीटेट के साथ दाग, आसुत पानी में दो बार धोएं।
- आसुत पानी में इथेनॉल की एक वर्गीकृत श्रृंखला के माध्यम से निर्जलित: 5 मिनट के लिए 75% इथेनॉल में 4 बार, इसके बाद 20 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में 3 बार और फिर 20 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में 3 बार। इस कदम पर, फ्रीजर से एपॉक्सी राल की एक सिरिंज लें।
नोट: प्रोटोकॉल 1 घंटे के लिए 100% इथेनॉल में रोका जा सकता है। - मज्जा के अंदर एपॉक्सी राल की एक समान घुसपैठ और बहुलीकरण प्राप्त करने के लिए, पहले 15 मिनट के लिए प्रोपलीन ऑक्साइड के लगातार स्नान में ब्लॉकों को इनक्यूबेट करें।
- 1 घंटे के लिए 100% प्रोपलीन ऑक्साइड और एपॉक्सी राल और इनक्यूबेट का 1:1 मिश्रण जोड़ें। नमूनों को कमरे के तापमान पर धीमी रोटरी शेखर पर रखें।
- 100% एपॉक्सी राल जोड़ें आंदोलन के तहत रातभर इनक्यूबेशन के लिए नमूना छोड़ दें।
- 2 घंटे के इनक्यूबेशन के लिए 100% एपॉक्सी राल जोड़ें, अभी भी आंदोलन के तहत।
- एक माइक्रोस्कोप के नीचे, मैरो ब्लॉक को फ्लैट सिलिकॉन मोल्ड में रखें। पूरे बोन मैरो के बाद के ट्रांसवर्सल सेक्शनिंग की अनुमति देने के लिए नमूनों को उन्मुख करें। मोल्ड्स को एपॉक्सी राल से भरें और उन्हें 48 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
नोट: सभी समाधान (इथेनॉल और प्रोपलीन ऑक्साइड को छोड़कर) नमूनों के संदूषण से बचने के लिए 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किए जाते हैं। राल का पर्याप्त बहुलीकरण सुनिश्चित करने के लिए, मोल्डों को भरते समय बुलबुले से बचें।
4. अल्ट्राथिन सेक्शनिंग(चित्रा 1B)
नोट: ट्रांसमिशन ईएम को पतले ऊतक वर्गों की आवश्यकता होती है जिसके माध्यम से इलेक्ट्रॉन कोशिकाओं, संरचना और आंतरिक ऑर्गेनेल्स (कणिकाओं, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम, गोलगी) के आंतरिक और संगठन के प्रक्षेपण छवि को उत्पन्न कर सकते हैं और इंट्रासेल्युलर सेल झिल्ली की व्यवस्था।
- एक अल्ट्रा माइक्रोटोम समर्थन में नमूना ब्लॉक माउंट। इसे सैंपल होल्डर पर लगाएं। एक घूर्णन हीरा या टंगस्टन मिलिंग कटर के साथ ऊतक के चारों ओर राल की अधिकता को दूर करने के लिए नमूनों को 45 डिग्री पर ट्रिम करें।
- पानी की टंकी से लैस हीरे के चाकू ब्लेड के साथ अल्ट्रामाइक्रोटम पर नमूनों को माउंट करें। हिस्टोलॉजिकल और टेम विश्लेषण के लिए क्रमशः 500 एनएम और 100 एनएम मोटाई के ट्रांसवर्स सेक्शन में कटौती करें। एक पाश के साथ पानी की सतह पर अस्थायी वर्गों को इकट्ठा करें।
- एक गिलास स्लाइड पर 500 एनएम मोटी अनुभाग और नीचे एक कागज फिल्टर के साथ 200 जाल पतली बार तांबे ग्रिड पर 100 एनएम मोटी वर्गों जमा करें। एक शर्त के लिए पांच ग्रिड तैयार करें: पहले दो ग्रिड दाग और यदि आवश्यक हो तो तीन शेष ग्रिड को बैकअप के रूप में रखें।
5. हिसटोलॉजी के लिए टोलुइडीन ब्लू धुंधला
नोट: हिस्ट्रो के नमूने का तेजी से मूल्यांकन करने के लिए, हिस्ट्रोलॉजी के लिए धुंधला अनुभाग तीन कारणों से महत्वपूर्ण है: 1) यह सुनिश्चित करने के लिए कि ऊतक वास्तव में कट गया है और राल नहीं है, 2) शामिल करने की गुणवत्ता की जांच करने के लिए, और 3) तेजी से मज्जा नमूने का मूल्यांकन करने के लिए। यदि यह सही नहीं है, तो ब्लॉक में गहराई से काटें।
- एक गर्मी की थाली (60 डिग्री सेल्सियस) पर अर्ध-पतली वर्गों को सुखा लें।
- स्लाइड पर आसुत पानी में फ़िल्टर किए गए 1% टोल्यूडीन ब्लू/1% सोडियम बोरेट जोड़ें और 1-2 मिनट के लिए गर्म प्लेट (60 डिग्री सेल्सियस) पर गर्म करें। स्लाइड्स को आसुत पानी से धोएं और इसे हीट प्लेट पर सूखने दें।
- पाली (ब्यूटिल मेथाक्रिलेट-सह-मिथाइल मेथाक्रिलेट) की एक बूंद के साथ कवरस्लिप पर माउंट सेक्शन बढ़ते मध्यम और एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करते हैं।
6. TEM अवलोकन के लिए भारी धातु धुंधला(चित्रा 1C)
नोट: इसके विपरीत के लिए, ग्रिड के ऊपरी हिस्से को लूप के साथ प्रत्येक क्रमिक स्नान की 100 माइक्रोन बूंदों पर उलटा किया जाता है। उपयोग करने से पहले, प्रत्येक समाधान 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर किया गया है। धीरे एक फिल्टर पेपर पर ग्रिड पक्ष से संपर्क करके प्रत्येक स्नान के बीच तरल की अधिकता निकालें।
- 5 मिनट के लिए आसुत पानी में 4% यूरेसिल एसीटेट के साथ दाग।
- 5 मिनट के लिए आसुत पानी में 3 बार धोएं।
- 3 मिनट के लिए सीसा साइट्रेट के साथ दाग।
- 5 मिनट के लिए आसुत पानी में 3 बार धोएं।
- ग्रिड को फिल्टर पेपर के संपर्क में निचले हिस्से से जमा करें ताकि उन्हें सूखने दिया जा सके।
नोट: भारी धातुओं कार्बन डाइऑक्साइड की उपस्थिति में प्रतिक्रिया। वर्षा को कम करने के लिए, इसके विपरीत के दौरान हवा विस्थापन से बचें, बात न करें, पर्यावरण को शांत रखें और एयर कंडीशनिंग को बंद करें।
7. TEM(चित्रा 1E)
नोट: अनुभागों को टेम माइक्रोस्कोप में पेश किया जाता है और 120 केवी पर जांच की जाती है।
- पहले तैयारी के सामान्य पहलू (राल में छेद की अनुपस्थिति, वर्गों में सिलवटों/संपीड़न, धुंधला होने के कारण उपजी) के सामान्य पहलू की सराहना करने के लिए कम आवर्धन (< 500x) पर अनुभागों की जांच करें।
- फिर उच्च आवर्धन (~ 2000x परिपक्वता के चरण को अलग करने की अनुमति) पर वर्गों की जांच करें। पूरे ट्रांसवर्सल वर्गों पर परिपक्वता के प्रत्येक चरण से मेगाकारियोसाइट्स को मैन्युअल रूप से गिनें (प्रत्येक चरण की नेत्रहीन पहचान कैसे करें, इस पर प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
नोट: ग्रिड के प्रत्येक वर्ग को परीक्षा के लिए एक क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया है (जो 200 जाल तांबे ग्रिड के लिए 16000 μm2 के बराबर है)। - मेगाकार्योसाइट्स की संख्या का आकलन करने के लिए, केवल उन वर्गों की मात्रा निर्धारित करें जो पूरी तरह से एक वर्ग के साथ कवर किए जाते हैं। ऐसा करने के लिए, पर्वतमाला की स्क्रीनिंग के आधार पर एक मॉडल का उपयोग करें। अनुभाग के एक छोर से दूसरे में वर्गों की पहली श्रृंखला का निरीक्षण करें, फिर उसी तरह एक और सीमा, आदि। इस प्रक्रिया का उपयोग करके, पूरी तरह से और व्यवस्थित रूप से पूरे मज्जा ट्रांसवर्सल सेक्शन स्क्वायर को स्क्वायर से स्क्रीन करें।
- प्रत्येक वर्ग के लिए, स्टेज I, II या III मेगाकारियोसाइट्स की संख्या स्कोर करें।
नोट: कणिकाओं, डीएमएस संगठन, साइटोप्लाज्मिक क्षेत्रों के आकार और पॉलीलोब्लुलेटेड नाभिक का विश्लेषण करने के लिए उच्च आवर्धन की आवश्यकता होती है।
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Representative Results
बोन मैरो हिस्ट्रोलॉजी
एक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत बोन मैरो टोल्यूडीन ब्लू हिस्टोलॉजी का अवलोकन जैसे, ऊतक कॉम्पैक्टनेस, माइक्रोवेसेल निरंतरता, और मेगाकारियोसाइट्स (चित्रा 1D) के आकार और आकार के संदर्भ में समग्र ऊतक वास्तुकला का तेजी से विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह बोन मैरो ब्लॉक में गहरी कटौती की आवश्यकता को निर्धारित करने के लिए अल्ट्राथिन वर्गों से पहले किया जाता है। उनके विशाल आकार और परमाणु lobulation के कारण, अधिक परिपक्व megakaryocytes आसानी से एक 40x उद्देश्य के साथ कल्पना की जा सकती है । यह ऊतक में परिपक्व मेगाकारियोसाइट्स के घनत्व और माइक्रोवेसेल्स के लिए उनके सापेक्ष स्थानीयकरण का एक उत्कृष्ट और तेजी से अवलोकन देता है। ऐसे अर्ध-पतले वर्गों में मेगाकार्योसाइट प्रसार और परिपक्वता में विसंगतियों का पहले ही पता लगाया जा सकता है ।
बोन मैरो अल्ट्रास्ट्रक्चर
अलग अल्ट्रास्ट्रक्चरल विशेषताओं के आधार पर, मुरीन मेगाकारियोसाइट्स को 4 चरणों में विभाजित किया जाता है जो उनकी परिपक्वता (चित्र 2 ए) में अनुक्रमिक चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्टेज I मेगाकारियोसाइट्स व्यास में 10-15 माइक्रोन होते हैं जिसमें एक बड़े नाभिक होते हैं जो अधिकांश कोशिका पर कब्जा करते हैं और प्रचुर मात्रा में राइबोसोम और रफ एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम होते हैं। डीएमएस के शुरुआती पता लगाने योग्य चरण की उपस्थिति, जिसे प्री-डीएमएस कहा जाता है, ईएम विश्लेषण3में चरण I MKs को अलग करने के लिए भी एक महत्वपूर्ण कसौटी है। परिपक्वता के चरण II में, कणिका गठन शुरू होता है और डीएमएस का विकास शुरू किया जाता है। मेगाकारियोसाइट्स आकार में वृद्धि करते हैं, व्यास में 15-25 माइक्रोन को मापते हैं और परमाणु लोबेशन विकसित करते हैं। परिपक्व चरण III मेगाकारियोसाइट्स व्यास में 25-50 माइक्रोन विशाल कोशिकाएं हैं। उनके साइटोप्लाज्म में स्पष्ट रूप से परिभाषित साइटोप्लाज्मिक क्षेत्रों और ऑर्गेनेल्स से रहित एक परिधीय क्षेत्र के साथ एक अच्छी तरह से विकसित डीएमएस शामिल हैं। इस स्तर पर, नाभिक आम तौर पर सनकी रूप से स्थित है और परमाणु झिल्ली पर स्थित संघनित क्रोमेटिन के साथ बहुत अनियमित दिखाई देता है। अंतिम चरण में एक नग्न नाभिक की विशेषता है, जिसे पाइरेनोसिटे भी कहा जाता है, जिसमें साइटोप्लाज्म के थोक समाप्त होने के बाद प्लाज्मा झिल्ली से घिरा एक बड़ा नाभिक शामिल है। जंगली प्रकार C57BL/6 चूहों में, अस्थि मज्जा के बारे में 8% चरण मैं, 20% चरण द्वितीय, ७१% चरण III megakaryocytes और < 1% pyrenocytes शामिल हैं । मेगाकारियोसाइट्स की औसत संख्या प्रति वर्ग 1.7 और 2.2 कोशिकाओं के बीच है। यह मनमाना वर्गीकरण आसानी से कोशिका भेदभाव की एक सतत प्रक्रिया की निगरानी और इसकी संभावित विसंगतियों का पता लगाने की अनुमति देता है ।
परिपक्वता के इन शास्त्रीय चरणों के अलावा, बोन मैरो में फिक्स्ड मेगाकारियोसाइट्स का अवलोकन मेगाकारियोसाइट्स साइनसॉयसाइट्स के साथ साइनसॉयसाइट्स के साथ बातचीत करने वाली घटनाओं की श्रृंखला का विश्लेषण करने की अनुमति देता है। एंडोथेलियल कोशिकाओं के संपर्क में मेगाकारियोसाइट्स अक्सर पतले वर्गों में देखे जाते हैं। इस अवसर पर कोई भी व्यक्ति मेगाकारियोसाइट्स को एंडोथेलियम में प्रवेश करने वाले छोटे आक्रामक फलाव का गठन करता है या इसके साइटोप्लाज्म के बड़े प्रक्षेपण को साइनसॉयडल ल्यूमेन7,8में विस्तारित करता है । उल्लेखनीय रूप से, ये इंट्रावैस्कुलर साइटोप्लाज्मिक प्रक्रियाएं चर आकार, लंबाई और व्यास प्रदर्शित करती हैं, जो परिसंचरण में प्रगतिशील प्लेटलेट रीमॉडलिंग को दर्शाती हैं। सामान्य परिसंचरण में पहले से मौजूद प्लेटलेट्स, परिवर्ती माइक्रोट्यूबुले कुंडल द्वारा बनाए रखा एक डिस्कोइड आकार होने, साइन्यूसाइड के ल्यूमेन में भी दिखाई देते हैं। प्लेटलेट्स की यह विशिष्ट आकृति विज्ञान नमूने के सही निर्धारण का संकेत है।
ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में अल्ट्रास्ट्रक्चरल विवरणों की कल्पना करने के लिए आवश्यक संकल्प का स्तर होता है, जैसे कि परमाणु लोबुलेशन, डीएमएस के स्थानिक संगठन और आकार, आकार और वितरण के मामले में कणिकाएं। चित्रा 2C एक चरण III मेगाकारियोसाइट में पेरिन्यूक्लियर क्षेत्र का एक उदाहरण है जिसमें α कणिकाओं, गोलगी सिस्टर्ना, माइटोकॉन्ड्रिया और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम की उपस्थिति दिखाई देती है। चित्रा 2 सी में भी उल्लेखनीय एक बहुवृक्षीय शरीर है, जो अल्फा और घने कणिकाओं के गठन में एक मध्यवर्ती चरण का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें व्यास9,10में 200 Å से कम मापने वाले गुणक एक्सोसोम होते हैं। अंत में, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी मेगाकारियोसाइट्स के अंदर मौजूद न्यूट्रोफिल और अन्य हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं की कल्पना करने में सक्षम बनाता है, (चित्रा 2D) एम्पेरीपोलेसिस नामक एक असामान्य प्रक्रिया के बाद जिससे एक कोशिका एक और जीवित कोशिका11में प्रवेश करती है। यह प्रक्रिया, जो सामान्य शारीरिक स्थिति में मेगाकारियोसाइट्स के 4% से संबंधित है, कुछ रोग स्थितियों में काफी वृद्धि की जा सकती है12।
चित्रा 1:प्रायोगिक सेटअप का योजनाबद्ध चित्रण। (A)बोन मैरो एम्बेडिंग प्रक्रिया। बोन मैरो को ग्लूटाराल्डिहाइड समाधान में तेजी से विसर्जन द्वारा निकाल दिया जाता है और तय किया जाता है। तस्वीर फ्लशिंग के बाद बोन मैरो सिलेंडर की ठेठ उपस्थिति दिखाता है । कमरे के तापमान पर 1 घंटे के निर्धारण के बाद, मज्जा को एगर उठे में घिरा हुआ है, ऑस्मियम टेट्रोक्साइड में पोस्ट-फिक्स किया गया है और यूरेसिल एसीटेट में इनक्यूबेटेड किया जाता है। ऊतकों को फिर बफर में धोया जाता है, वर्गीकृत इथेनॉल की एक श्रृंखला में निर्जलित किया जाता है, प्रोपलीन ऑक्साइड में इनक्यूबेटेड होता है और एपॉक्सी राल के साथ घुसपैठ की जाती है। (ख)बोन मैरो सेक्शनिंग को ब्लॉक करते हैं । एम्बेडेड बोन मैरो को अल्ट्रामाइक्रोटोम धारक पर रखा जाता है, जो 45 डिग्री पर छंटनी की जाती है और या तो अर्ध-पतली (500 एनएम) या पतली (100 एनएम) वर्गों में कटौती की जाती है। अल्ट्रास्ट्रक्चरल अध्ययनों के लिए, फ्लोटिंग सेक्शन को लूप के साथ उठाया जाता है और नीचे एक पेपर फिल्टर के साथ ग्रिड पर जमा किया जाता है। (ग)TEM टिप्पणियों के लिए कंट्रास्ट धुंधला । ग्रिड यूरेसिल एसीटेट बूंदों पर उलटा होते हैं, आसुत पानी की बूंदों पर धोए जाते हैं और धुलाई के एक और रन से पहले सीसा साइट्रेट पर इनक्यूबेटेड होते हैं। सूखने के बाद (धाराओं के साथ ऊपरी पक्ष) नमूनों की टेम के तहत जांच करने की तैयारी है। (घ)एक माउस फेमोरल मैरो अनुभाग के हिस्टोलॉजी टोलुइडीन नीले रंग से सना हुआ । विशाल कोशिकाएं परिपक्व मेगाकारियोसाइट्स (1) के अनुरूप हैं, कुछ साइनसॉइड (2) के संपर्क में हैं। साइनसॉइड एक बड़े केंद्रीय साइनस नस (3) पर एकाग्र होते हैं। बार: 20 माइक्रोन इनसेट: 40x आवर्धन पर एक परिपक्व मेगाकार्योसाइट की सामान्य उपस्थिति। (ई)कम आवर्धन पर बोन मैरो सेक्शन की प्रतिनिधि तेम छवि । कोशिकाओं को कसकर थोड़ा बाहुलर अंतरिक्ष के साथ पैक कर रहे हैं। खंड के प्रत्येक ग्रिड वर्ग को योजनाबद्ध तीर पथ (लाल तीर) का पालन करके एक छोर से दूसरे में मनाया जाता है। बार: 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2-मेगाकारियोसाइट्स अल्ट्रास्ट्रक्चर की सीटू छवियों में प्रतिनिधि। (एक)जंगली प्रकार के मेगाकारियोसाइट्स की विशेषता परिपक्वता चरण। मेगाकारियोसाइट्स को चार परिपक्वता चरणों में वर्गीकृत किया जाता है: स्टेज I, एक बड़े नाभिक के साथ व्यास में 10-15 माइक्रोन; चरण II, विकास के तहत डीएमएस युक्त व्यास में एक सेल 15-30 माइक्रोन; चरण III, एक 30-50 माइक्रोन सेल जिसमें एक अच्छी तरह से विकसित सीमांकन झिल्ली प्रणाली (डीएमएस) होती है जो साइटोप्लाज्मिक क्षेत्रों को परिभाषित करती है और एक ऑर्गेनेल-फ्री पेरिफेरल जोन होती है। एक पाइरेनोसिट पूर्ण साइटोप्लाज्मिक विस्तार के बाद अस्थि मज्जा में शेष नग्न पॉलीलोबुलेटेड नाभिक से मेल खाता है। बार: 10 माइक्रोन(बी)मेगाकार्योसाइट-एंडोथेलियल सेल इंटरैक्शन और इंट्रावैस्कुलर साइटोप्लाज्मिक प्रक्रियाएं। (i) मेगाकारियोसाइट का परिधीय क्षेत्र (पीजेड) साइनसॉयडल एंडोथेलियम की एब्यूमिनल सतह के निकट रूप से अपूरणीय है । (ii) एक मेगाकार्योसाइट जो शॉर्ट इनवेसिव प्रोट्रूस िएषणता बनाता है जो एंडोथेलियल लेयर (एरोहेड) में गहराई से प्रवेश करता है। (iii-v) तीर अलग-अलग व्यास के साथ मेगाकारियोसाइट्स की साइटोप्लाज्मिक प्रक्रियाओं का संकेत देते हैं, जिनमें से कुछ बहुत बड़े हैं और एक परिधीय क्षेत्र है जो उन टुकड़ों का प्रतिनिधित्व कर सकता है जो अभी खून में प्रवेश कर चुके हैं। (vi) साइनस ल्यूमेन में देखा जाने वाला एक विशिष्ट डिस्कोइड प्लेटलेट (पी) । प्रत्येक माइक्रोग्राफ में, लाल रेखा एंडोथेलियल बैरियर के चमकदार पक्ष को इंगित करती है और तारा साइनसॉयड ल्यूमेन को इंगित करता है। बार: 2 माइक्रोन(C)एक परिपक्व मेगाकारियोसाइट के पेरिन्यूक्लियर क्षेत्र के उच्च आवर्धन। α, अल्फा कणिका; रीर, रफ एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम; जी, गोलगी; एमवीबी, मल्टीवेस्कुलर बॉडी; एम, माइटोकॉन्ड्रिया। बार: 0.5 माइक्रोन(D)एम्पेरीपोलेसिस दिखाने वाले मेगाकारियोसाइट का उदाहरण। घिरा हुआ न्यूट्रोफिल मेगाकारियोसाइट्स के साथ बातचीत से रूपात्मक रूप से अनछुए दिखाई देता है । बार: 2 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
मेगाकारियोपोइसिस और प्लेटलेट बनने को समझने के लिए उनके मूल वातावरण में मेगाकारियोसाइट्स की सीधी जांच जरूरी है। इस पांडुलिपि में, हम विसर्जन द्वारा बोन मैरो फ्लशिंग और निर्धारण के संयोजन के लिए एक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विधि प्रदान करते हैं, जिससे बोन मैरो में हो रही मेगाकार्योसाइट मॉर्मोजेनेसिस की पूरी प्रक्रिया की आकृति विज्ञान विशेषताओं को सीटू में विच्छेदन करने की अनुमति होती है।
बोन मैरो का फ्लशिंग इस विधि का एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि उच्च गुणवत्ता वाले फ्लशिंग की सफलता ऑपरेटर के अभ्यास और प्रशिक्षण पर निर्भर करती है। हालांकि नाजुक, अस्थि मज्जा फ्लशिंग खनिज हड्डी को हटाने से बचने का सबसे अच्छा तरीका है, जिसे आमतौर पर मेगाकारियोसाइट आकृति विज्ञान पर महत्वपूर्ण कलाकृतियों से जुड़े पूर्ण डिकलिफिकेशन के लिए 2 सप्ताह के EDTA उपचार की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, टिबिया और फीमर से पूरे अनफिक्ड बोन मैरो एकत्र करने का एक बड़ा लाभ एक ही माउस के लिए कई इमेजिंग दृष्टिकोण को संयोजित करने की क्षमता है। व्यवहार में, अल्ट्रास्ट्रक्चरल अध्ययन के लिए केवल एक ही अस्थि मज्जा की आवश्यकता होती है, अन्य तीन नमूने पूरक विश्लेषणों के लिए उपलब्ध हैं। दूसरा बोन मैरो का उपयोग ताजा बोन मैरो एक्सप्लांट की तैयारी के लिए किया जा सकता है, वास्तविक समय में देशी मेगाकारियोसाइट्स 6 के प्रॉपलेटगठनकी गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए। तीसरा नमूना आमतौर पर मोटी वर्गों पर इम्यूनोदाता अध्ययन के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो उनके प्राकृतिक वातावरण के भीतर मेगाकारियोसाइट्स की 3डी इमेजिंग और वितरण प्रदान करता है। अंतिम नमूने को इम्यूनोगोल्ड इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा आगे के अध्ययन के लिए फ्रीज और संग्रहीत किया जा सकता है, जहां प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की उच्च संकल्प4पर जांच की जाती है। ये संयुक्त इमेजिंग विधियां, माउस में जीन के लक्षित विलोपन/उत्परिवर्तन की उपलब्धता के साथ, थ्रोम्बोपोइसिस में दिए गए प्रोटीन की जैविक भूमिका को सीटू में चित्रित करने का एक महत्वपूर्ण साधन प्रदान करती हैं । हालांकि, यहां यह बताया जाना चाहिए कि इस विधि की एक सीमा मज्जा को फ्लश करने के लिए आवश्यक एपिफिसिस की वापसी है। एपिफिसिस को हेमेटोपोइसिस के लिए महत्वपूर्ण क्षेत्र माना जाता है, और इसलिए उनके हटाने से हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं और सगाई13के प्रारंभिक चरणों का विश्लेषण करने की किसी भी संभावना में बाधा आती है। एक अन्य सीमा यह है कि अपरिपक्व चरण से पहले मेगाकार्योसाइट्स के जनकों की पहचान नहीं की जा सकती क्योंकि इन कोशिकाओं में विशिष्ट अल्ट्रास्ट्रक्चरल विशेषताएं नहीं हैं। इस सीमा को दूर करने के लिए, एक EM इम्यूनोगोल्ड दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है।
विधि का दूसरा महत्वपूर्ण कदम विसर्जन द्वारा अस्थि मज्जा निर्धारण है। जब यहां वर्णित शर्तों के तहत प्रदर्शन किया जाता है, यानी, कॉम्पैक्ट बोन मैरो सिलेंडर को बाहर निकालने के तुरंत बाद निर्धारण, इसके निम्नलिखित फायदे हैं: (i) यह प्रदर्शन करने में त्वरित और आसान है, (ii) यह परफ्यूजन6द्वारा निर्धारण के बाद देखे गए एक अल्ट्रास्ट्रक्चर को संरक्षित करता है, और (iii) यह साइनसॉयड ब्लडस्ट्रीम में मुफ्त मेगाकारियोसाइट प्रक्रियाओं और प्लेटलेट्स को बनाए रखता है जो अन्यथा फ्लश आउट हो जाते हैं/ इस तकनीक के साथ साइनसॉयडिकल सर्कुलेशन में मेगाकारियोसाइट्स के प्रवेश की जांच करना और साइटोप्लाज्मिक प्रक्रियाओं के सभी मध्यवर्ती रूपों की विशेषता होना संभव है जिनसे प्लेटलेट्स उत्पन्न होते हैं8. इसके अनुरूप, हाल ही में यह सूचित किया गया है कि वीवो में मेगाकारियोसाइट्स से बड़े फलाव का तावण संरचनात्मक रूप से विट्रो मेंमेगाकारियोसाइट्स द्वारा बनाए गए पतले एक्सटेंशन से अलग हैं, विशेष रूप से माइक्रोट्यूबल्स7की एक अलग व्यवस्था के साथ। इसी प्रकार, हमने हाल ही में दर्शाया है कि वीवो में प्लेटलेट्स निर्माण को नियंत्रित करने वाला तंत्र विट्रो14में पहचाने गए तंत्र से भिन्न है ।
महत्वपूर्ण अल्ट्रास्ट्रक्चरल मतभेदों को तेजी से इन विट्रो सुसंस्कृत और वीवो जनित देशी मेगाकारियोसाइट्स के बीच पहचाना जाता है, जो एक पूर्ण मेगाकारियोसाइट भेदभाव/परिपक्वता के लिए अस्थि मज्जा माइक्रोएनवायरमेंट की आवश्यकता को रेखांकित करता है । इस लेख में वर्णित विसर्जन द्वारा बोन मैरो फ्लशिंग और निर्धारण के संयोजन के बाद, पारंपरिक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अभी भी शारीरिक और रोग स्थितियों के तहत मेगाकारियोसाइट जीव विज्ञान और प्लेटलेट गठन का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण बना हुआ है।
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Disclosures
लेखकों को घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक तकनीकी सहायता के लिए फैबियन प्रोमर, जीन-येव्स रेन्केल, डेविड हॉफमैन, मोनिक फ्रायंड का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को एआरएमईएसए (एसोसिएशन डी रेचेचे एट डेवेलोपमेंट एन मेडेसिन एट सैंटे पब्लिक), यूरोपीय संघ द्वारा यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (ईआरडीएफ) के माध्यम से और ग्रांट एएनआर-17-सीई14-0001-01 द्वारा H.D.S. को समर्थन दिया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate - Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
References
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
- Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
- Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
- Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
- Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
- Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
- Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
