Profilering af H3K4me3-modifikation i planter ved hjælp af spaltning under mål og tagmentering

Summary

Spaltning under mål og tagmentation (CUT&Tag) er en effektiv kromatin epigenomisk profileringsstrategi. Denne protokol præsenterer en raffineret CUT&Tag-strategi til profilering af histonmodifikationer i planter.

Abstract

Epigenomisk regulering på kromatisk niveau, herunder DNA- og histonmodifikationer, transkriptionsfaktorers adfærd og ikke-kodende RNA'er med deres rekrutterede proteiner, fører til tidsmæssig og rumlig kontrol af genekspression. Spaltning under mål og tagmentation (CUT &Tag) er en enzym-tethering metode, hvor det specifikke kromatinprotein først genkendes af dets specifikke antistof, og derefter binder antistoffet et protein A-transposase (pA-Tn5) fusionsprotein, som spalter det målrettede kromatin in situ ved aktivering af magnesiumioner. Her leverer vi vores tidligere offentliggjorte CUT & Tag-protokol ved hjælp af intakte kerner isoleret fra allortetraploide bomuldsblade med modifikation. Denne trinvise protokol kan bruges til epigenomisk forskning i planter. Derudover er væsentlige ændringer for isolering af plantekerner forsynet med kritiske kommentarer.

Introduction

Transkriptionsfaktorbindende DNA-steder og åbent kromatin forbundet med histonmodifikationsmærker tjener kritiske funktionelle roller i reguleringen af genekspression og er de vigtigste fokusområder for epigenetisk ^forskning1. Konventionelt er kromatinimmunfældningsassay (ChIP) kombineret med dyb sekventering (ChIP-seq) blevet anvendt til genom-dækkende identifikation af specifik kromatinhistonemodifikation eller DNA-mål med specifikke proteiner og er bredt vedtaget inden for ^epigenetik2. Spaltning under mål og tagmentationsteknologi (CUT&Tag) blev oprindeligt udviklet af Henikoff Lab til at fange de proteintilknyttede DNA-fragmenter i hele ^genomet5. Sammenlignet med ChIP genererer CUT&Tagcan DNA-biblioteker med høj opløsning og usædvanlig lav baggrund ved hjælp af et lille antal celler med en forenklet ^procedure3. Hidtil er der etableret metoder til analyse af kromatinregioner med specifikke histonmodifikationer ved hjælp af CUT&Tag i ^{dyreceller4,5}. Specifikt er enkeltcellet CUT&Tag (scCUT&Tag) også blevet udviklet med succes til humane væv og ^celler6. På grund af kompleksiteten af cellevæggen og sekundære metabolitter er CUT&Tag dog stadig teknisk udfordrende for plantevæv.

Tidligere rapporterede vi en CUT&Tag-protokol ved hjælp af intakte kerner isoleret fra allotetraploide ^{bomuldsblade4}. For at demonstrere effektiviteten af kerneisolering og DNA-fangst ved hjælp af plantevæv præsenteres profileringsproceduren her. De vigtigste trin omfatter intakt kerneisolering, in situ-inkubation med antistoffet til kromatinmodifikation, transposaseinkubation, adaptorintegration og DNA-biblioteksforberedelse. Fejlfindingen fokuserer på CUT&Tag-bibliotekets forberedelse til isolering af plantekerner og kvalitetskontrol.

I denne undersøgelse præsenterer vi en raffineret CUT&Tag-strategi for planter. Ikke alene leverer vi en trinvis protokol til H3K4me3-profilering i bomuldsblade, men vi leverer også en optimeret metode til isolering af plantekerner, herunder strategien for valg af koncentration af vaskemiddel til korrekt cellelyse og strategien til at filtrere kernerne. Detaljerede trin med kritiske kommentarer er også inkluderet i denne opdaterede protokol.

Protocol

1. Forbered transposase- og lageropløsninger (dag 1)

BEMÆRK: I denne del er oligonukleotidadapterne kompleksiseret med Tn5-transposase for at fremstille aktiv transposase.

1. Fortynd primere (primer A, primer B og primer C) til 100 μM koncentration ved hjælp af udglødningsbufferen (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (se tabel 1 for sekvensinformation om primere og tabel 2 for opskrifterne til arbejdsløsninger). Opbevares ved -20 °C indtil brug.
2. Der opstilles følgende to reaktioner i PCR-rør: Reaktion 1 (adapter AB), 10 μL 100 μM primer A, 10 μL 100 μM primer B; Reaktion 2 (adapter AC), 10 μL 100 μM primer A, 10 af μL 100 μM primer C.
3. Anneal adapterne i PCR-maskinen ved hjælp af følgende program: varmelåg (102 °C), 75 °C i 15 minutter, 60 °C i 10 minutter, 50 °C i 10 minutter, 40 °C i 10 minutter, 25 °C i 30 minutter.
   BEMÆRK: Adapterne er delvist dobbeltstrengede DNA-molekyler (koncentration = 50 pmol / μL).
4. Følgende reaktion opstilles i et 1,5 ml centrifugerør: 10 μL pA-Tn5-transposase (500 ng/μL eller 7,5 pmol/μL), 0,75 μL adapter AB (50 pmol/μL), 0,75 μL adapter AC (50 pmol/μL), 7 μL koblingsbuffer. Pipette 20x forsigtigt for at blande godt og inkubere ved 30 °C i et vandbad i 1 time. Den endelige koncentration af transposase = 4 pmol/μL. Opbevares ved -20 °C indtil brug.
   BEMÆRK: Molært forhold mellem adapter AB: adapter AC: transposase = 0,5:0,5:1.
5. Forbered stamopløsningerne i henhold til opskrifterne i tabel 2 og autoklave eller filtrer stamopløsningerne til sterilisering.
6. Autoklave og sterilisere saks, filterpapir, en sigte i rustfrit stål, en mørtel, pestler osv.

2. Kerneisolering (dag 2)

1. Forkøl centrifugen til 4 °C. For hver 1 g af udgangsmaterialet (bomuldsblade) fremstilles 25 ml nuklear isolationsbuffer A (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 ml nuklear isolationsbuffer B (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 ml nuklear vaskebuffer (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidin, proteasehæmmercocktail 0,1%), 1 ml antistofbuffer (50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidin, 1 mg/ml BSA, proteasehæmmercocktail 0,1%, 0,05% w/v digitonin). Lad rørene sidde på is indtil brug.
2. Slib friske blade (~ 1 g) i flydende nitrogen til et fint pulver og overfør til et 50 ml rør indeholdende 25 ml kølet nuklear isolationsbuffer A.
3. Bland bufferopløsningen forsigtigt og inkuber røret på is i 5 minutter med blid omrystning for at sprede materialet jævnt.
4. Centrifuge i 5 minutter ved 500 rcf ved 4 °C for at danne cellepillen.
5. Dekanter supernatanten og resuspend pelleten med 20 ml kølet nuklear isolationsbuffer B suppleret med 0,5% Triton X-100. Vend røret forsigtigt for at suspendere pillen helt.
   BEMÆRK: Den 20 ml nukleare isolationsbuffer B gælder for 1 g udgangsmateriale, og dette volumen kan skaleres i overensstemmelse hermed.
   1. Udfør et pilotassay for at teste effekten af seriekoncentrationen af Triton X-100 (f.eks. 2 ml nuklear isolationsbuffer B, hver med 0,1%, 0,25%, 0,5% og 1% Triton X-100 for 100 mg slibet væv). Den passende koncentration af Triton X-100 er indikeret ved en ophobning af hvide/grå kerner i bunden og en mørkegrøn supernatant efter lysis og centrifugering ved lav hastighed (< 500 rcf i 4 min).
6. Filtrer det resulterende cellelysat med en kombination af to sigter: en 500-maske sigte på toppen for at fjerne det større vævsaffald og en 1000-maske sigte på bunden for at samle kernerne.
   BEMÆRK: Vælg en passende maskestørrelse til sigterne afhængigt af planternes kernestørrelse.
7. Brug sterilt filterpapir på bagsiden af sigten til at absorbere småcellerester i lysatet.
8. Overfør de resterende kerner, der indeholder lysat, på oversiden af den 1000-maskede sigte til fire friske 1,5 ml centrifugerør.
9. Centrifuge i 4 minutter ved 300 rcf ved 4 °C for at opsamle kernerne.
10. Fjern så meget af supernatanten som muligt ved hjælp af en pipettespids, og vask pillen med nuklear vaskebuffer.
11. Tilsæt 800 μL af den nukleare vaskebuffer og vend rørene forsigtigt for at suspendere pelleten igen. Drej røret igen i 4 minutter ved 300 rcf ved 4 °C.
12. Udfør i alt 3 vaske.
13. (Valgfrit) Forestil dig kernerne under et mikroskop til DAPI-farvning.
    1. Overfør 100 μL kernesuspension i den nukleare vaskebuffer fra trin 2.11. til et nyt 1,5 ml rør. Der tilsættes 900 μL nuklear vaskebuffer og 2 μL DAPI-stamopløsning (1 mg/ml) for at lave en endelig arbejdskoncentration på 2 μg/ml for DAPI. Inkuber røret i mørke i 30 minutter ved stuetemperatur.
    2. Efter farvning centrifugeres i 4 minutter ved 300 rcf ved 4 °C for at opsamle kernerne.
    3. Fjern så meget af supernatanten som muligt ved hjælp af en pipettespids. Vask 3 gange med 800 μL af den nukleare vaskebuffer.
    4. Fjern så meget af supernatanten som muligt, og ophæng kernerne igen med 100 μL nuklear vaskebuffer.
    5. Forestil dig kernerne under et fluorescensmikroskop ved hjælp af DAPI-kanalen.
14. Kombiner kernerne fra to rør (~ 50 μL kerner i volumen i hvert 1,5 ml rør). Centrifuge i 4 minutter ved 300 rcf ved 4 °C. Fjern så meget af den resterende buffer som muligt ved hjælp af en pipettespids.

3. Antistofinkubation

1. Resuspend hver 50 μL kerner i et 1,5 ml rør med 1 ml antistofbuffer.
2. Der opstilles følgende reaktioner i 1,5 ml rør: to biologiske replikater af IgG-kontrolgrupper med 150 μL kerner (~ 1 μg kromatin) og 2 μL IgG (1 mg/ml) i hvert rør, to biologiske replikater af H3K4me3-assaygrupper med 150 μL kerner og 2 μL anti-H3K4me3-antistof (1 mg/ml) i hvert rør.
3. Bland opløsningen forsigtigt og lad rørene stå på en vandret ryster til hybridisering natten over ved 4 °C og 12 omdr./min.
4. Forkøl centrifugen til 4 °C. Forbered frisk 50 ml immunfældning (IP) vaskebuffer (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidin, proteasehæmmercocktail 0,1%, ,0,05% w/v digitonin) i et 50 ml centrifugerør. Lad røret sidde på is.
5. Centrifuger rørene i 4 minutter ved 300 rcf ved 4 °C. Fjern antistofbufferen fra hvert rør.
6. Tilsæt 800 μL IP-vaskebuffer til hvert rør og bland forsigtigt. Lad rørene stå på en vandret ryster i 5 minutter ved stuetemperatur og 12 o / min.
7. Efter vask centrifugeres rørene i 4 minutter ved 300 rcf ved 4 °C. Fjern supernatanten ved hjælp af en pipettespids.
   BEMÆRK: For at undgå forstyrrelse af kernepillen skal du lade ~ 50-80 μL af bufferen være med kernerne.
8. Gentag trin 3.6.-3.7. to gange mere.
9. Efter den tredje vask centrifugeres i 2 minutter ved 300 rcf ved 4 °C. Fjern den resterende buffer så meget som muligt.

4. Transposase inkubation

1. Der fremstilles frisk 1 ml transposaseinkubationsbuffer (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidin, proteasehæmmercocktail 0,1%, 0,05% w/v digitonin) ved at blande 1 ml af IP-vaskebufferen med 30 μL 5 M NaCl.
2. For at forberede Tn5-transposaseblandingen til inkubation tilsættes 1 μL af transposasen til hver 150 μL af transposaseinkubationsbufferen.
   BEMÆRK: Forbered transsatoropløsningsblandingen først i henhold til antallet af reaktioner, og tilsæt derefter en alikvote på 150 μL til hvert rør.
3. Resuspend kernerne med 150 μL transposaseopløsning.
4. Lad rørene stå på en vandret ryster ved 12 o / min i 2-3 timer ved stuetemperatur og bland hvert 10-15 minut.
5. Efter transposaseinkubation centrifugeres rørene i 4 minutter ved 300 rcf ved 4 °C. Fjern transposaseinkubationsbufferen i hvert rør.
6. Vask rørene med IP-vaskebuffer. For at gøre dette skal du tilføje 800 μL IP-vaskebuffer til hvert rør, blande forsigtigt og lade rørene stå på en vandret ryster ved 12 o / min i 5 minutter ved stuetemperatur.
7. Centrifuge i 4 minutter ved 300 rcf ved 4 °C. Fjern supernatanten ved hjælp af en pipettespids.
8. Gentag trin 4.6.-4.7. to gange mere.
9. Efter den tredje vask centrifugeres i 2 minutter ved 300 rcf ved 4 °C. Fjern den resterende buffer så meget som muligt.

5. Tagmentation

1. Frisk lav 2 ml af tagmentationsbufferen (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidin, proteasehæmmercocktail 0,1%, 10 mM _MgCl2, 0,05% w/v digitonin) ved at blande 2 ml IP-vaskebuffer med 60 μL 5 M NaCl og 20 μL 1 M _MgCl2.
2. Resuspend kernerne med 300 μL tagmentationsbuffer.
3. Bland opløsningen og inkuber i et 37 °C vandbad i 1 time til tagmentation.
4. Stop tagmenteringen med 10 μL 0,5 M EDTA (endelig koncentration ~ 15 mM) og 30 μL 10% SDS (endelig koncentration 1%).

6. DNA-ekstraktion og NGS-bibliotekskonstruktion

1. Tilsæt 300 μL CTAB DNA-ekstraktionsbuffer som ^beskrevet7. Inkuber rørene i et 65 °C vandbad i 30 minutter. Omvendt for at blande hvert ~ 10. minut.
2. Tilsæt 600 μL phenol: chloroform: isoamylalkohol (25:24:1) til hvert rør. Bland grundigt.
3. Forcentrifugering af faselåsgelrørene i 2 minutter ved 13.000 rcf ved 4 °C. Overfør ovenstående opløsning til faselåsgelrør.
4. Centrifuge i 10 minutter ved 13.000 rcf ved 4 °C.
5. Overfør supernatanten (~ 600 μL) til et nyt 1,5 ml rør.
6. Tilsæt 600 μL chloroform til hvert rør. Bland grundigt.
7. Centrifuge i 10 minutter ved 13.000 rcf ved 4 °C.
8. Overfør supernatanten (~ 600 μL) til et nyt 1,5 ml rør.
9. Der tilsættes 12 μL 100 % ethanol og 2 μL GlycoBlue Coprecipitant. Bland grundigt og opbevar ved -20 °C i 1 time.
10. Centrifuge i 10 minutter ved 13.000 rcf ved 4 °C.
11. Dekanter supernatanten. DNA-pelleten vaskes med 75% (v/v) ethanol og centrifuge i 5 minutter ved 13.000 rcf ved 4 °C.
12. Dekanter supernatanten. Lufttør DNA-pelleten og resuspend DNA'et i 25 μL _ddH2O.
13. Konfigurer PCR-reaktionen som følger. For i alt 50 μL reaktion tilsættes 24 μL DNA, 11 μL _ddH2O, 10 μL 5x TAE-buffer, 2 μL P5-primer (10 μM), 2 μL P7-primer (10 μM) og 1 μL TruePrep Amplify-enzym. PCR-program: 72 °C i 3 minutter, 98 °C i 30 s; derefter 14 cyklusser på 98 °C i 30 s, 60 °C i 30 s og 72 °C i 30 s, efterfulgt af 72 °C i 5 minutter.
    BEMÆRK: De første 72 °C i 3 minutter til forlængelse kan ikke springes over. Overamplificering af biblioteket vil føre til et højt niveau af PCR-dubletter i NGS. Start fra 12-14 PCR-cyklusser i PCR-reaktion for H3K4me3, når der anvendes ~1 μg kromatin i hver reaktion.
14. Læg 2 μL af PCR-produkterne på 1,5% agarosegel til elektroforese.
15. Rens PCR-produkterne ved hjælp af kommercielle DNA-oprensningsmagnetperler.
16. Kvantificering af biblioteket med et fluorometer og agarosegelelektroforese.
    BEMÆRK: Effektiv koncentration af biblioteket skal >2 nM af qPCR for at sikre god kvalitet.
17. Udfør næste generations sekventering (NGS) og dataanalyse.

Representative Results

Figur 1 viser CUT&Tag-arbejdsgangen. Figur 2 viser DAPI-farvningen af de intakte kerner. Målet med trinnet "kerneisolering" var at opnå de intakte kerner i en tilstrækkelig mængde til den efterfølgende CUT & Tag-reaktion. Figur 3 viser agarosegelelektroforesen af PCR-produkter. Den IgG-negative kontrol kræves parallelt, når eksperimentet konfigureres. Sammenlignet med IgG-kontrolgruppen varierede størstedelen af DNA-fragmenterne trukket med H3K4me3-antistofprøven fra ~ 280 til 500 basepar. Figur 4 viser den resulterende næste generations sekventering for anti-H3K4me3-antistoffet sammenlignet med de IgG-negative kontrolgrupper.

Figur 1: Arbejdsgangen for CUT&Tag. Denne figur er modificeret fra Tao et ^al.4. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: DAPI-farvning af intakte kerner isoleret fra bomuldsblade. Skalabjælke = 20 μM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Agarosegelelektroforese af 2 μL PCR-produkter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Repræsentativt IGV-skærmbillede for H3K4me3-signaler. (A) Repræsentativ IGV-oversigt over CUT&Tag-signaler på tværs af et stort genomområde. ~ 1500 kb genomregioner blev tilfældigt udvalgt. (B) Repræsentativt IGV-skærmbillede for gener med forskellige ekspressionsniveauer viste høj opløsning af CUT&Tag-signaler. De normaliserede bigWig-filer genereret fra bamCompare ved at sammenligne behandling bam-filen (CUT& Tag anti-H3K4me3-reaktion) og kontrolbamsfilen (IgG) blev brugt. TPM, transkripter pr. kilobase exon-model pr. million kortlagte læsninger. Denne figur er modificeret fra Tao et ^al.4. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Grundsekvenser. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Buffer- og opløsningsopskrifter. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Her har vi beskrevet CUT&Tag, en teknologi til generering af DNA-biblioteker i høj opløsning og usædvanlig lav baggrund ved hjælp af et lille antal celler med en forenklet procedure sammenlignet med kromatinimmunfældning (ChIP). Vores succes med H3K4me3 profilering i bomuldsblade tyder på, at CUT&Tag, som først blev designet til dyreceller, også kan bruges til planteceller. Både Tris-buffersystemet, der almindeligvis anvendes til ChIP-assay8, og HEPES-buffersystemet, der anvendes til dyre-CUT&Tag-arbejde til CUT&Tag ved hjælp af ^{plantekerner4,9}. Isoleringen af intakte plantekerner er det afgørende skridt for en vellykket anvendelse af CUT&Tag i planter. I den tidligere rapporterede metode til ^{kerneisolering4} blev opløsningen af slibet væv filtreret gennem to lag Miracloth før cellelyse. Vi fandt effektiviteten af at opnå tilstrækkelige kerner reduceret, når man bruger relativt gamle blade (f.eks. Blade fra 2 måneder gamle bomuldsplanter) og bomuldsfibre (f.eks. 20-DPA-fiber), fordi Miracloth bevarer det meste af det malede væv. I denne videoprotokol blev plantekerneisoleringen optimeret ved at filtrere cellelysatet gennem en 500-mesh (20 μM porestørrelse) rustfri stålsigte. Denne ændrede operation forbedrede signifikant effektiviteten af at fjerne større vævsaffald og opnå tilstrækkelige kerner til den efterfølgende reaktion.

Efter PCR til bibliotekskonstruktion (trin 6.13.) kan DNA-fragmenterne renses og derefter profileres af NGS. Men hvis IgG-kontrolgruppen også afbilder en berigelse i små fragmenter, indikerer det en stærk baggrund for tilfældig DNA-skæring med transposase, som kan være forårsaget af beskadigede kerner eller utilstrækkelig vask til fjernelse af ubundet antistof eller transposase. I dette tilfælde blev de parallelle prøver for specifikke antistoffer ikke anbefalet til yderligere NGS.

For nylig er enkeltcelle CUT &Tag ved at tilpasse den dråbebaserede 10x Genomics enkeltcelle ATAC-seq-platform blevet udviklet og anvendt til profilering af H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac og H3K36me3 histonmodifikationer. I en undersøgelse af kromatinbelægningen af transkriptionsfaktoren OLIG2 gav den sammenhængende komplekse komponent RAD21 i musehjernen unik indsigt i epigenomiske landskaber i ^{centralnervesystemet6}. CUT&Tag kan således anvendes til at undersøge de epigenomiske landskaber for både bulk histonmodifikation og de specifikke TF'er med lave ^inputkrav9, selv på enkeltcelleniveau6. Disse anvendelser af CUT&Tag indikerer, at undersøgelsen af planteepigenetisk regulering i koordinering af genfunktionelle netværk under udviklingsdynamikken og miljøresponser kan være præcis i det tidsmæssige og rumlige mønster.

CUT&Tag er en metode, der stadig er under udviklingsprocesser med problemer, der skal løses. For transkriptionsfaktorer, der ikke udtrykkes rigeligt eller er svagt, forbigående eller indirekte bundet til ^kromatin10, skal forskellene mellem tværbundne og indfødte kerner i CUT&Tag sammenlignes. CUT&Tag-strategien for profilering med transkriptionsfaktorer ved lav overflod er stadig teknisk udfordrende. På grund af den begrænsede tilgængelighed af proteinepitope fungerer de fleste ChIP-antistoffer, der er valideret til at arbejde med tværbindingsbetingelser, muligvis ikke godt med indfødte forhold i CUT & Tag; antistoffernes følsomhed og specificitet skal valideres. Desuden har Tn5-transposasen, der anvendes i CUT&Tag, høj affinitet til åbne kromatinregioner11, og CUT&Tag kan derfor introducere bias, som også skal behandles i fremtidige undersøgelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Anti-H3K4me3	Millipore	07-473
Normal rabbit IgG	Millipore	12-370
Chemicals
Bovine Serum Albumin (BSA)			Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C
digitonin (~50% (TLC)	Sigma-Aldrich	D141	Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C
dimethyl sulfoxide (DMSO)
chloroform
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)			Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH
ethanol
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)	Invitrogen	AM9516
magnesium chloride (MgCl2)			Make 1 M MgCl2 stock solution
protease inhibitor cocktail	Calbiochem	539133-1SET
potassium chloride (KCl)			Make 1 M KCl stock solution
phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v)
sodium chloride (NaCl)			Make 5 M NaCl stock solution
spermidine			Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C.
sodium dodecyl sulfate (SDS)			Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter
Tris base			Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution
Triton X-100			Make 20% Triton X-100 stock solution
Enzyme
Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag	Vazyme	S602/S603	Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody.
TruePrep Amplify Enzyme	Vazyme	TD601
Equipment
Centrifuge	Eppendorf	5424R
PCR machine	Applied Biosystems	ABI9700
Orbital shaker	MIULAB	HS-25
NanoDrop One  spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-ONE-W