Summary
Splitsing onder doelen en tagmentatie (CUT&Tag) is een efficiënte chromatine epigenomische profileringsstrategie. Dit protocol presenteert een verfijnde CUT&Tag strategie voor de profilering van histonmodificaties in planten.
Abstract
Epigenomische regulatie op chromatisch niveau, inclusief DNA- en histonmodificaties, gedrag van transcriptiefactoren en niet-coderende RNA's met hun gerekruteerde eiwitten, leiden tot temporele en ruimtelijke controle van genexpressie. Splitsing onder doelen en tagmentatie (CUT & Tag) is een enzym-tetheringmethode waarbij het specifieke chromatine-eiwit eerst wordt herkend aan zijn specifieke antilichaam en vervolgens het antilichaam een eiwit A-transposase (pA-Tn5) fusie-eiwit bindt, dat het beoogde chromatine in situ splitst door de activering van magnesiumionen. Hier bieden we ons eerder gepubliceerde CUT & Tag-protocol met intacte kernen geïsoleerd uit allortetraploïde katoenbladeren met modificatie. Dit stapsgewijze protocol kan worden gebruikt voor epigenomisch onderzoek in planten. Daarnaast worden substantiële wijzigingen voor de isolatie van plantenkernen voorzien van kritische opmerkingen.
Introduction
Transcriptiefactorbindende DNA-sites en open chromatine geassocieerd met histonmodificatiemerken vervullen een cruciale functionele rol bij het reguleren van genexpressie en zijn de belangrijkste aandachtspunten van epigenetisch onderzoek1. Conventioneel is chromatine immunoprecipitatie assay (ChIP) in combinatie met diepe sequencing (ChIP-seq) gebruikt voor de genoombrede identificatie van specifieke chromatine histonmodificatie of DNA-doelen met specifieke eiwitten, en wordt op grote schaal toegepast op het gebied van epigenetica2. Cleavage under targets and tagmentation (CUT&Tag) technologie werd oorspronkelijk ontwikkeld door het Henikoff Lab om de eiwit-geaffilieerde DNA-fragmenten in het hele genoom te vangen5. In vergelijking met ChIP genereert CUT&Tagcan DNA-bibliotheken met een hoge resolutie en een uitzonderlijk lage achtergrond met behulp van een klein aantal cellen met een vereenvoudigde procedure3. Tot op heden zijn methoden voor de analyse van chromatinegebieden met specifieke histonmodificaties met behulp van CUT&Tag vastgesteld in dierlijke cellen4,5. Specifiek is eencellige CUT&Tag (scCUT&Tag) ook met succes ontwikkeld voor menselijke weefsels en cellen6. Vanwege de complexiteit van de celwand en secundaire metabolieten is CUT&Tag echter nog steeds technisch uitdagend voor plantenweefsels.
Eerder rapporteerden we een CUT& Tag-protocol met intacte kernen geïsoleerd uit allotetraploïde katoenbladeren4. Om de efficiëntie van kernisolatie en DNA-vastlegging met behulp van plantenweefsel aan te tonen, wordt hier de profileringsprocedure gepresenteerd. De belangrijkste stappen omvatten intacte kernisolatie, in situ incubatie met het antilichaam voor chromatinemodificatie, transposase-incubatie, adaptorintegratie en DNA-bibliotheekvoorbereiding. De probleemoplossing richt zich op de CUT&Tag-bibliotheekvoorbereiding voor de isolatie van de kernen van de plant en de kwaliteitscontrole.
In deze studie presenteren we een verfijnde CUT&Tag strategie voor planten. We bieden niet alleen een stapsgewijs protocol voor H3K4me3-profilering in katoenbladeren, maar we bieden ook een geoptimaliseerde methodologie voor isolatie van plantenkernen, inclusief de strategie voor het selecteren van de concentratie van wasmiddel voor een goede cellyse en de strategie om de kernen te filteren. Gedetailleerde stappen met kritische opmerkingen zijn ook opgenomen in dit bijgewerkte protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereid transposase- en voorraadoplossingen voor (dag 1)
OPMERKING: In dit deel worden de oligonucleotideadapters gecomplexeerd met Tn5-transposase om actief transposase te maken.
- Verdun primers (primer A, primer B en primer C) tot een concentratie van 100 μM met behulp van de gloeibuffer (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (zie tabel 1 voor sequentie-informatie van primers en tabel 2 voor de recepten voor werkoplossingen). Bewaren bij -20 °C tot gebruik.
- Stel de volgende twee reacties in PCR-buizen in: Reactie 1 (adapter AB), 10 μL van 100 μM primer A, 10 μL van 100 μM primer B; Reactie 2 (adapter AC), 10 μL van 100 μM primer A, 10 van μL 100 μM primer C.
- Gloei de adapters in de PCR-machine met behulp van het volgende programma: warmtedeksel (102 °C), 75 °C gedurende 15 minuten, 60 °C gedurende 10 minuten, 50 °C gedurende 10 minuten, 40 °C gedurende 10 minuten, 25 °C gedurende 30 minuten.
OPMERKING: De adapters zijn gedeeltelijk dubbelstrengs DNA-moleculen (concentratie = 50 pmol/μL). - Stel de volgende reactie in een centrifugebuis van 1,5 ml in: 10 μl pA-Tn5 transposase (500 ng/μl of 7,5 pmol/μl), 0,75 μl adapter AB (50 pmol/μl), 0,75 μl adapter AC (50 pmol/μl), 7 μl koppelingsbuffer. Pipetteer 20x zachtjes om goed te mengen en incubeer bij 30 °C in een waterbad gedurende 1 uur. De uiteindelijke concentratie transposase = 4 pmol/μL. Bewaren bij -20 °C tot gebruik.
OPMERKING: Molaire verhouding van adapter AB: adapter AC: transposase = 0,5:0,5:1. - Bereid de stamoplossingen volgens de recepten in tabel 2 en autoclaaf of filtreer de stamoplossingen om te steriliseren.
- Autoclaaf en steriliseren schaar, filtreerpapier, een roestvrijstalen zeef, een vijzel, stampers, enz.
2. Kernisolatie (Dag 2)
- Koel de centrifuge voor tot 4 °C. Bereid voor elke 1 g van de grondstof (katoenen bladeren) 25 ml nucleaire isolatiebuffer A (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 ml nucleaire isolatiebuffer B (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 ml nucleaire wasbuffer (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidine, proteaseremmer cocktail 0,1%), 1 ml antilichaambuffer (50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidine, 1 mg/ml BSA, proteaseremmer cocktail 0,1%, 0,05% w/v digitonine). Laat de buizen op ijs zitten tot gebruik.
- Maal verse bladeren (~ 1 g) in vloeibare stikstof tot een fijn poeder en breng over in een buis van 50 ml met 25 ml gekoelde nucleaire isolatiebuffer A.
- Meng de bufferoplossing voorzichtig en incubeer de buis gedurende 5 minuten op ijs met zacht schudden om het materiaal gelijkmatig te verspreiden.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 rcf bij 4 °C om de celkorrel te vormen.
- Decanteer het supernatant en resuspend de pellet met 20 ml gekoelde nucleaire isolatiebuffer B aangevuld met 0,5% Triton X-100. Keer de buis voorzichtig om om de pellet volledig te resuspenderen.
OPMERKING: De nucleaire isolatiebuffer B van 20 ml is van toepassing op 1 g uitgangsmateriaal en dit volume kan dienovereenkomstig worden geschaald.- Voer een pilottest uit om het effect van de serieconcentratie van Triton X-100 te testen (bijv. 2 ml nucleaire isolatiebuffer B, elk met 0,1%, 0,25%, 0,5% en 1% Triton X-100 voor 100 mg gemalen weefsels). De juiste concentratie triton X-100 wordt aangegeven door een ophoping van witte /grijze kernen aan de onderkant en een donkergroen supernatant na lysis en centrifugeren op lage snelheid (< 500 rcf gedurende 4 minuten).
- Filter het resulterende cellysaat met een combinatie van twee zeven: een zeef met 500 mazen aan de bovenkant om het grotere weefselafval te verwijderen en een zeef met 1000 mazen aan de onderkant om de kernen te verzamelen.
OPMERKING: Kies een geschikte maaswijdte voor de zeven, afhankelijk van de kerngrootte van de planten. - Gebruik steriel filterpapier aan de achterkant van de zeef om kleincellig vuil in het lysaat te absorberen.
- Breng de resterende kernen met lysaat aan de bovenzijde van de zeef met 1000 mazen over in vier verse centrifugebuizen van 1,5 ml.
- Centrifugeer gedurende 4 minuten bij 300 rcf bij 4 °C om de kernen op te vangen.
- Verwijder zoveel mogelijk van het supernatant met een pipetpunt en was de pellet met nucleaire wasbuffer.
- Voeg 800 μL van de nucleaire wasbuffer toe en keer de buizen voorzichtig om om de pellet opnieuw te scharuspenderen. Draai de buis opnieuw gedurende 4 minuten bij 300 rcf bij 4 °C.
- Voer in totaal 3 wasbeurten uit.
- (Optioneel) Stel de kernen voor onder een microscoop voor DAPI-kleuring.
- Breng 100 μL kernsuspensie over in de nucleaire wasbuffer vanaf stap 2.11. naar een nieuwe buis van 1,5 ml. Voeg 900 μL nucleaire wasbuffer en 2 μL DAPI-stamoplossing (1 mg/ml) toe om een uiteindelijke werkconcentratie van 2 μg/ml voor DAPI te maken. Incubeer de buis in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer na het kleuren gedurende 4 minuten bij 300 rcf bij 4 °C om de kernen op te vangen.
- Verwijder zoveel mogelijk van het supernatant met behulp van een pipetpunt. Was 3 keer met 800 μL van de nucleaire wasbuffer.
- Verwijder zoveel mogelijk van het supernatant en resuspend de kernen met 100 μL nucleaire wasbuffer.
- Stel de kernen voor onder een fluorescentiemicroscoop met behulp van het DAPI-kanaal.
- Combineer de kernen uit twee buizen (~ 50 μL kernen in volume in elke buis van 1,5 ml). Centrifugeer gedurende 4 min bij 300 rcf bij 4 °C. Verwijder zoveel mogelijk van de resterende buffer met behulp van een pipetpunt.
3. Antilichaam incubatie
- Resuspend elke 50 μL kernen in een buis van 1,5 ml met 1 ml antilichaambuffer.
- Stel de volgende reacties in 1,5 ml buizen in: twee biologische replicaties van IgG-controlegroepen met 150 μL kernen (~ 1 μg chromatine) en 2 μL IgG (1 mg/ml) in elke buis, twee biologische replicaties van H3K4me3-testgroepen met 150 μL kernen en 2 μL anti-H3K4me3-antilichaam (1 mg/ml) in elke buis.
- Meng de oplossing voorzichtig en laat de buizen op een horizontale schudder voor hybridisatie gedurende een nacht bij 4 °C en 12 tpm.
- Koel de centrifuge voor tot 4 °C. Bereid verse 50 ml immunoprecipitatie (IP) wasbuffer (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidine, proteaseremmer cocktail 0,1%, 0,05% w / v digitonine) in een centrifugebuis van 50 ml. Laat de buis op ijs zitten.
- Centrifugeer de buizen gedurende 4 minuten bij 300 rcf bij 4 °C. Verwijder de antilichaambuffer uit elke buis.
- Voeg 800 μL IP-wasbuffer toe aan elke buis en meng voorzichtig. Laat de buizen op een horizontale shaker gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en 12 rpm.
- Centrifugeer de buizen na het wassen gedurende 4 minuten bij 300 rcf bij 4 °C. Verwijder het supernatant met een pipetpunt.
OPMERKING: Om verstoring van de kernkorrel te voorkomen, laat u ~ 50-80 μL van de buffer met de kernen. - Herhaal stap 3.6.-3.7. nog twee keer.
- Na de derde wasbeurt gedurende 2 minuten centrifugeren bij 300 rcf bij 4 °C. Verwijder de resterende buffer zoveel mogelijk.
4. Transposase incubatie
- Maak vers 1 ml transposase-incubatiebuffer (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidine, proteaseremmer cocktail 0,1%, 0,05% w/v digitonine) door 1 ml van de IP-wasbuffer te mengen met 30 μL van 5 M NaCl.
- Om het Tn5 transposasemengsel voor incubatie te bereiden, voegt u 1 μL van het transposase toe aan elke 150 μL van de transposase-incubatiebuffer.
OPMERKING: Bereid de transposase-oplossingsmix eerst op basis van het aantal reacties en voeg vervolgens een aliquot van 150 μL toe aan elke buis. - Resuspend de kernen met 150 μL transposase-oplossing.
- Laat de buizen op een horizontale shaker bij 12 rpm gedurende 2-3 uur bij kamertemperatuur en meng elke 10-15 min.
- Centrifugeer na transposase-incubatie de buizen gedurende 4 minuten bij 300 rcf bij 4 °C. Verwijder de transposase-incubatiebuffer in elke buis.
- Was de buizen met ip-wasbuffer. Voeg hiervoor 800 μL IP-wasbuffer toe aan elke buis, meng voorzichtig en laat de buizen op een horizontale shaker bij 12 tpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur staan.
- Centrifugeer gedurende 4 min bij 300 rcf bij 4 °C. Verwijder het supernatant met een pipetpunt.
- Herhaal stap 4.6.-4.7. nog twee keer.
- Na de derde wasbeurt gedurende 2 minuten centrifugeren bij 300 rcf bij 4 °C. Verwijder de resterende buffer zoveel mogelijk.
5. Tagmentatie
- Maak vers 2 ml van de tagmentatiebuffer (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidine, proteaseremmer cocktail 0,1%, 10 mM MgCl2, 0,05% w/v digitonine) door 2 ml IP-wasbuffer te mengen met 60 μL van 5 M NaCl en 20 μL van 1 M MgCl2.
- Resuspend de kernen met 300 μL tagmentatiebuffer.
- Meng de oplossing en incubeer in een waterbad van 37 °C gedurende 1 uur voor tagmentatie.
- Stop de tagmentatie met 10 μL van 0,5 M EDTA (eindconcentratie ~15 mM) en 30 μL van 10% SDS (eindconcentratie 1%).
6. DNA-extractie en NGS-bibliotheekconstructie
- Voeg 300 μL CTAB DNA-extractiebuffer toe zoals beschreven7. Incubeer de buizen in een waterbad van 65 °C gedurende 30 minuten. Keer om om elke ~ 10 min.
- Voeg 600 μL fenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1) toe aan elke buis. Meng.
- Centrifugeer de faseslots gelbuizen gedurende 2 minuten bij 13.000 rcf bij 4 °C. Breng de bovenstaande oplossing over in fasevergrendelingsgeleizen.
- Centrifugeer gedurende 10 min bij 13.000 rcf bij 4 °C.
- Breng het supernatant (~600 μL) over in een nieuwe buis van 1,5 ml.
- Voeg 600 μL chloroform toe aan elke buis. Meng.
- Centrifugeer gedurende 10 min bij 13.000 rcf bij 4 °C.
- Breng het supernatant (~600 μL) over in een nieuw buisje van 1,5 ml.
- Voeg 12 μL 100% ethanol en 2 μL GlycoBlue Coprecipitant toe. Meng goed en bewaar bij -20 °C gedurende 1 uur.
- Centrifugeer gedurende 10 min bij 13.000 rcf bij 4 °C.
- Decanteer het bovennatuurlijke. Was de DNA-pellet met 75% (v/v) ethanol en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 13.000 rcf bij 4 °C.
- Decanteer het bovennatuurlijke. Droog de DNA-pellet aan de lucht en resuspend het DNA in 25 μL ddH2O.
- Stel de PCR-reactie als volgt in. Voeg voor een totaal van 50 μL reactie 24 μL DNA, 11 μL ddH2O, 10 μL 5x TAE-buffer, 2 μL P5 primer (10 μM), 2 μL P7 primer (10 μM) en 1 μL TruePrep Amplify Enzyme toe. PCR-programma: 72 °C gedurende 3 min, 98 °C gedurende 30 s; vervolgens 14 cycli van 98 °C gedurende 30 s, 60 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s, gevolgd door 72 °C gedurende 5 minuten.
OPMERKING: De eerste 72 °C gedurende 3 minuten voor verlenging kan niet worden overgeslagen. Overemplificatie van de bibliotheek zal leiden tot een hoog niveau van PCR-duplicaten in de NGS. Begin met 12-14 PCR-cycli in PCR-reactie voor H3K4me3 bij gebruik van ~ 1 μg chromatine in elke reactie. - Laad 2 μL van de PCR-producten op 1,5% agarosegel voor elektroforese.
- Zuiver de PCR-producten met behulp van commerciële DNA-zuivering magnetische kralen.
- Kwantificeer de bibliotheek met een fluorometer en agarose gel elektroforese.
OPMERKING: De effectieve concentratie van de bibliotheek moet worden >2 nM door qPCR om een goede kwaliteit te garanderen. - Voer next-generation sequencing (NGS) en data-analyse uit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de CUT&Tag workflow. Figuur 2 toont de DAPI-kleuring van de intacte kernen. Het doel van de "kernisolatie" stap was om de intacte kernen te verkrijgen in een voldoende hoeveelheid voor de daaropvolgende CUT & Tag-reactie. Figuur 3 toont de agarose gel elektroforese van PCR producten. De IgG-negatieve controle is parallel vereist bij het opzetten van het experiment. Vergeleken met de IgG-controlegroep varieerde het grootste deel van de DNA-fragmenten getrokken met H3K4me3-antilichaammonster van ~ 280 tot 500 basenparen. Figuur 4 toont de resulterende next-generation sequencing voor het anti-H3K4me3 antilichaam in vergelijking met de IgG negatieve controlegroepen.
Figuur 1: De workflow van CUT&Tag. Dit cijfer is gewijzigd van Tao et al.4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: DAPI-kleuring van intacte kernen geïsoleerd uit katoenbladeren. Schaalbalk = 20 μM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Agarose gel elektroforese van 2 μL PCR producten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve IGV-screenshot voor H3K4me3-signalen. (A) Representatief IGV-overzicht van CUT&Tag-signalen in een groot genoomgebied. ~1500 kb genoomgebieden werden willekeurig geselecteerd. (B) Representatieve IGV-screenshot voor genen met verschillende expressieniveaus toonde een hoge resolutie van CUT& Tag-signalen. De genormaliseerde bigWig-bestanden gegenereerd uit bamCompare door het behandeling bam-bestand (CUT & Tag anti-H3K4me3-reactie) en het controle bam-bestand (IgG) te vergelijken, werden gebruikt. TPM, transcripties per kilobase van exon-model per miljoen in kaart gebrachte reads. Dit cijfer is aangepast van Tao et al.4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Primersequenties. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Buffer- en oplossingsrecepten. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we CUT & Tag beschreven, een technologie voor het genereren van DNA-bibliotheken met een hoge resolutie en een uitzonderlijk lage achtergrond met behulp van een klein aantal cellen met een vereenvoudigde procedure in vergelijking met chromatine-immunoprecipitatie (ChIP). Ons succes met H3K4me3-profilering in katoenbladeren suggereert dat CUT & Tag, dat voor het eerst werd ontworpen voor dierlijke cellen, ook kan worden gebruikt voor plantencellen. Zowel het Tris-buffersysteem dat vaak wordt gebruikt voor ChIP-assay8 als het HEPES-buffersysteem dat wordt gebruikt voor cut&tag-werk voor CUT&Tag met behulp van plantenkernen4,9. De isolatie van intacte plantenkernen is de cruciale stap voor de succesvolle toepassing van CUT&Tag in planten. In de eerder gerapporteerde methodologie voor kernisolatie4 werd de oplossing van gemalen weefsels gefilterd door twee lagen Miracloth vóór cellysis. We vonden de efficiëntie van het verkrijgen van voldoende kernen verminderd bij het gebruik van relatief oude bladeren (bijv. Bladeren van 2 maanden oude katoenplanten) en katoenvezels (bijv. 20-DPA-vezel) omdat Miracloth de meeste gemalen weefsels behoudt. In dit videoprotocol werd de isolatie van de kernen van de plant geoptimaliseerd door het cellysaat te filteren door een roestvrijstalen zeef met 500 mazen (20 μM poriegrootte). Deze veranderde werking verbeterde aanzienlijk de efficiëntie van het verwijderen van groter weefselafval en het verkrijgen van voldoende kernen voor de daaropvolgende reactie.
Na PCR voor bibliotheekconstructie (Stap 6.13.) kunnen de DNA-fragmenten worden gezuiverd en vervolgens geprofileerd door NGS. Als de IgG-controlegroep echter ook een verrijking in kleine fragmenten weergeeft, duidt dit op een sterke achtergrond van willekeurige DNA-knip door transposase, die kan worden veroorzaakt door beschadigde kernen of onvoldoende wassen voor de verwijdering van ongebonden antilichamen of transposase. In dit geval werden de parallelle monsters voor specifieke antilichamen niet aanbevolen voor verdere NGS.
Onlangs is eencellige CUT&Tag door aanpassing van het op druppels gebaseerde 10x Genomics eencellige ATAC-seq-platform ontwikkeld en toegepast bij het profileren van H3K4me3,H3K27me3, H3K27ac en H3K36me3 histonmodificaties. In een onderzoek naar de chromatinebezetting van transcriptiefactor OLIG2 gaf de cohesinecomplexcomponent RAD21 in het muizenbrein unieke inzichten in epigenomische landschappen in het centrale zenuwstelsel6. Zo kan CUT&Tag worden toegepast om de epigenomische landschappen te onderzoeken op zowel bulk histonmodificatie als de specifieke TF's met lage inputvereisten9, zelfs op het niveau van één cel6. Deze toepassingen van CUT&Tag geven aan dat de studie van plant epigenetische regulatie bij het coördineren van gen functionele netwerken tijdens de dynamiek van ontwikkeling en omgevingsreacties nauwkeurig kan zijn in het temporele en ruimtelijke patroon.
CUT&Tag is een methode die nog in ontwikkeling is en problemen die moeten worden aangepakt. Voor de transcriptiefactoren die niet overvloedig tot expressie komen of zwak, voorbijgaand of indirect gebonden zijn aan chromatine10, moeten de verschillen tussen crosslinked en native kernen in CUT&Tag worden vergeleken. De CUT&Tag-strategie voor profilering met transcriptiefactoren bij lage abundantie is technisch nog steeds een uitdaging. Bovendien, vanwege de beperkte beschikbaarheid van eiwit-epitoop, werken de meeste ChIP-antilichamen die zijn gevalideerd om te werken met crosslinking-omstandigheden mogelijk niet goed met native omstandigheden in CUT & Tag; de gevoeligheid en specificiteit van antilichamen moeten worden gevalideerd. Bovendien heeft de Tn5-transposase die in CUT&Tag wordt gebruikt een hoge affiniteit met open-chromatinegebieden11, dus CUT&Tag kan bias introduceren, die ook in toekomstige studies moet worden aangepakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs hebben geen belangenconflicten met een bedrijf dat handelt in een van de bovengenoemde producten.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk financieel ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) en Fundamental Research Funds for the Central Universities, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) en het JCIC-MCP-project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
- Abascal, F., et al.
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120 (2020).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
- Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
- Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).
- Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).
- Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).
