Summary
מחשוף תחת מטרות ותגיות (CUT&Tag) היא אסטרטגיית פרופיל אפיגנומית כרומטין יעילה. פרוטוקול זה מציג אסטרטגיית CUT&Tag מעודנת ליצירת פרופיל של שינויים בהיסטון בצמחים.
Abstract
רגולציה אפיגנומית ברמה הכרומטית, כולל שינויי DNA והיסטון, התנהגויות של גורמי שעתוק, ו- RNAs שאינם מקודדים עם החלבונים המגויסים שלהם, מובילים לשליטה זמנית ומרחבית בביטוי הגנים. מחשוף תחת מטרות ותגית (CUT&Tag) היא שיטה לקשירת אנזימים שבה חלבון הכרומטין הספציפי מזוהה תחילה על ידי הנוגדן הספציפי שלו, ולאחר מכן הנוגדנים קושרים חלבון A-transposase (pA-Tn5) חלבון היתוך חלבון, אשר מבקע את הכרומטין הממוקד במקום על ידי הפעלת יוני מגנזיום. כאן, אנו מספקים פרוטוקול CUT&Tag שפורסם בעבר שלנו באמצעות גרעינים שלמים מבודדים מעלי כותנה allortetraploid עם שינוי. פרוטוקול שלב אחר שלב זה יכול לשמש למחקר אפיגנומי בצמחים. בנוסף, שינויים משמעותיים בבידוד גרעיני הצמח מסופקים עם הערות קריטיות.
Introduction
גורם שעתוק מחייב אתרי DNA וכרום פתוח הקשורים לסימני שינוי היסטון משרתים תפקידים פונקציונליים קריטיים בוויסות ביטוי הגנים והם המוקדים העיקריים של מחקר אפיגנטי1. באופן קונבנציונלי, בדיקת אימונופרציפציה כרומטין (ChIP) יחד עם ריצוף עמוק (ChIP-seq) שימשו לזיהוי רחב הגנום של שינוי היסטון כרומטין ספציפי או מטרות DNA עם חלבונים ספציפיים, והוא מאומץ באופן נרחב בתחום האפיגנטיקה2. מחשוף תחת מטרות וטכנולוגיית תיוג (CUT&Tag) פותחה במקור על ידי מעבדת Henikoff כדי ללכוד את שברי ה- DNA הקשורים לחלבון ברחבי הגנום5. בהשוואה ל- ChIP, CUT&Tagcan מייצרים ספריות DNA ברזולוציה גבוהה וברקע נמוך במיוחד באמצעות מספר קטן של תאים עם הליך פשוט3. עד כה, שיטות לניתוח של אזורי כרומטין עם שינויים histone ספציפיים באמצעות CUT&Tag הוקמו בתאי בעלי חיים4,5. באופן ספציפי, CUT&Tag חד-תאי (scCUT&Tag) פותח בהצלחה גם עבור רקמות ותאים אנושיים6. עם זאת, בשל המורכבות של דופן התא ומטבוליטים משניים, CUT&Tag עדיין מאתגר מבחינה טכנית עבור רקמות צמחים.
בעבר, דיווחנו על פרוטוקול CUT&Tag באמצעות גרעינים שלמים מבודדים מעלי כותנה allotetraploid4. כדי להדגים את היעילות של בידוד גרעינים ולכידת DNA באמצעות רקמת צמח, הליך הפרופיל מוצג כאן. הצעדים העיקריים כוללים בידוד גרעינים שלם, בדגרה במקום עם הנוגדן לשינוי כרומטין, דגירה של טרנספוזאז, שילוב מתאם והכנת ספריית DNA. פתרון הבעיות מתמקד בהכנת ספריית CUT&Tag לבידוד גרעיני הצמח ובקרת האיכות.
במחקר זה, אנו מציגים אסטרטגיית CUT&Tag מעודנת לצמחים. לא רק שאנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב עבור פרופיל H3K4me3 בעלי כותנה, אלא שאנו מספקים גם מתודולוגיה ממוטבת לבידוד גרעינים צמחיים, כולל האסטרטגיה לבחירת ריכוז חומר הניקוי לליזה נכונה של התאים והאסטרטגיה לסנן את הגרעינים. שלבים מפורטים עם הערות קריטיות כלולים גם בפרוטוקול מעודכן זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. להכין פתרונות חילוף ומלאי (יום 1)
הערה: בחלק זה, מתאמי oligonucleotide מורכבים עם טרנספוזאז Tn5 כדי לבצע חילוף פעיל.
- לדלל פריימרים (פריימר A, פריימר B, פריימר C, פריימר C) ל 100 μM ריכוז באמצעות מאגר חישול (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 מ"מ EDTA) (עיין בטבלה 1 לקבלת מידע רצף של פריימרים וטבלה 2 למתכונים לפתרונות עבודה). יש לאחסן בטמפרטורה של עד 20°C עד לשימוש.
- הגדר את שתי התגובות הבאות בצינורות PCR: תגובה 1 (מתאם AB), 10 μL של 100 μM פריימר A, 10 μL של 100 μM פריימר B; תגובה 2 (מתאם AC), 10 μL של 100 μM פריימר A, 10 של μL 100 μM פריימר C.
- חישת המתאמים במכונת PCR באמצעות התוכנית הבאה: מכסה חום (102 °C (102 °C ),75 °C (75 °F) במשך 15 דקות, 60 °C (60 °F) במשך 10 דקות, 50 °C (50 °F) במשך 10 דקות.
הערה: המתאמים הם חלקית מולקולות DNA כפולות גדילים (ריכוז = 50 pmol / μL). - הגדר את התגובה הבאה בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל: 10 μL של pA-Tn5 transposase (500 ng/ μL או 7.5 pmol / μL), 0.75 μL של מתאם AB (50 pmol / μL), 0.75 μL של מתאם AC (50 pmol / μL), 7 μL של חיץ צימוד. פיפטה 20x בעדינות לערבב היטב ולדגור ב 30 °C (50 °F) באמבט מים במשך 1 שעות. הריכוז הסופי של transposase = 4 pmol / μL. לאחסן ב -20 °C (60 °F) עד השימוש.
הערה: יחס טוחנת של מתאם AB: מתאם AC: transposase = 0.5:0.5:5:1. - הכינו את פתרונות המלאי בהתאם למתכונים המסופקים בטבלה 2 ו- autoclave או לסנן את פתרונות המלאי לעיקור.
- Autoclave ולחטא מספריים, נייר סינון, מסננת נירוסטה, מרגמה, עלים, וכו '.
2. בידוד גרעינים (יום 2)
- מצננים מראש את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס. עבור כל 1 גרם של החומר ההתחלתי (עלי כותנה), להכין 25 מ"ל של מאגר בידוד גרעיני A (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 מ"מ EDTA), 20 מ"ל של חיץ בידוד גרעיני B (10 mM טריס pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 מ"ל של חיץ כביסה גרעינית (10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5 מ"מ זרע, קוקטייל מעכבי פרוטאז 0.1%), 1 מ"ל של חיץ נוגדנים (50 מ"מ טריס pH 8.0, 1 מ"מ EDTA, 150 מ"מ NaCl, 0.5 מ"מ זרע, 1 מ"ג / מ"ל BSA, קוקטייל מעכב פרוטאז 0.1%, 0.05% w / v digitonin). תן לצינורות לשבת על קרח עד השימוש.
- טוחנים עלים טריים (~ 1 גרם) בחנקן נוזלי לאבקה עדינה ומעבירים לצינור 50 מ"ל המכיל 25 מ"ל של חיץ בידוד גרעיני צונן A.
- מערבבים את תמיסת החיץ בעדינות ודוללים את הצינור על הקרח במשך 5 דקות עם רעד עדין כדי לפזר את החומר באופן שווה.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500 rcf ב 4 °C (4 °F) כדי ליצור את גלולה התא.
- Decant supernatant ו resuspened את הכדור עם 20 מ"ל של חיץ בידוד גרעיני צונן B בתוספת 0.5% טריטון X-100. הפוך את הצינור בעדינות כדי resuspend את הכדור לחלוטין.
הערה: מאגר הבידוד הגרעיני B של 20 מ"ל ישים עבור חומר התחלתי של 1 גרם, וניתן לשנות את קנה המידה של אמצעי אחסון זה בהתאם.- בצע בדיקת פיילוט כדי לבדוק את ההשפעה של ריכוז הסדרה של טריטון X-100 (למשל, 2 מ"ל חיץ בידוד גרעיני B, כל אחד עם 0.1%, 0.25%, 0.25%, 0.5%, ו 1% טריטון X-100 עבור 100 מ"ג של רקמות טחונות). הריכוז המתאים של טריטון X-100 מסומן על ידי הצטברות של גרעינים לבנים / אפורים בתחתית ו supernatant ירוק כהה לאחר תמוגה וצנטריפוגה במהירות נמוכה (< 500 rcf במשך 4 דקות).
- סנן את lysate התא המתקבל עם שילוב של שתי מסננות: מסננת 500-רשת בחלק העליון כדי להסיר את פסולת הרקמה הגדולה יותר מסננת 1000-mesh בתחתית כדי לאסוף את הגרעינים.
הערה: בחר גודל רשת מתאים עבור המסננים בהתאם לגודל הגרעינים של הצמחים. - השתמש בנייר סינון סטרילי בצד האחורי של המסננת כדי לספוג פסולת תאים קטנים בליסט.
- מעבירים את הגרעינים הנותרים המכילים ליסאט בצד העליון של מסננת 1000-mesh לארבעה צינורות צנטריפוגה טריים של 1.5 מ"ל.
- צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (4 °F) כדי לאסוף את הגרעינים.
- הסר כמה שיותר של supernatant ככל האפשר באמצעות קצה פיפטה לשטוף את הכדור עם חיץ לשטוף גרעיני.
- מוסיפים 800 μL של מאגר לשטוף גרעיני ולהפוך את הצינורות בעדינות כדי resuspend את הכדור. לסובב את הצינור שוב במשך 4 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (50 °F).
- בצע בסך הכל 3 שטיפות.
- (אופציונלי) דמיינו את הגרעינים מתחת למיקרוסקופ להכתמת DAPI.
- העבר 100 μL של השעיית גרעינים במאגר לשטוף גרעיני משלב 2.11. לצינור חדש של 1.5 מ"ל. הוסף 900 μL של מאגר לשטוף גרעיני ו 2 μL של פתרון מלאי DAPI (1 מ"ג / מ"ל) כדי להפוך את ריכוז העבודה הסופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל עבור DAPI. לדגור על הצינור בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר הכתמה, צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (4 °F) כדי לאסוף את הגרעינים.
- הסר כמה שיותר של supernatant ככל האפשר באמצעות קצה פיפטה. לשטוף 3 פעמים עם 800 μL של מאגר לשטוף גרעיני.
- הסר כמה שיותר של supernatant ככל האפשר ו resuspend את הגרעינים עם 100 μL של חיץ לשטוף גרעיני.
- דמיין את הגרעינים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות ערוץ DAPI.
- שלב את הגרעינים משני צינורות (~ 50 μL של גרעינים בנפח בכל צינור 1.5 מ"ל). צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (4 °F). הסר כמה שיותר מהמאגר הנותר באמצעות קצה פיפטה.
3. דגירת נוגדנים
- Resuspend כל 50 μL של גרעינים בצינור 1.5 מ"ל עם 1 מ"ל של חיץ נוגדנים.
- הגדר את התגובות הבאות בצינורות 1.5 מ"ל: שני העתקים ביולוגיים של קבוצות בקרה IgG עם 150 μL של גרעינים (~ 1 מיקרוגרם של כרומטין) ו 2 μL של IgG (1 מ"ג / מ"ל) בכל צינור, שני העתקים ביולוגיים של קבוצות בדיקה H3K4me3 עם 150 μL של גרעינים ו 2 μL של נוגדן אנטי H3K4me3 (1 מ"ג / מ"ל) בכל צינור.
- מערבבים את התמיסה בעדינות ומשאירים את הצינורות על שייקר אופקי להכלאה למשך הלילה ב-4 °C (60 °F) ו-12 סל"ד.
- מצננים מראש את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס. הכינו 50 מ"ל טריים של חיץ כביסה אימונו-הסתברותי (IP) (10 מ"מ טריס pH 8.0, 150 מ"מ NaCl, 0.5 מ"מ זרע, קוקטייל מעכב פרוטאז 0.1%, 0.05% w /v digitonin) בצינור צנטריפוגות 50 מ"ל. תן לצינור לשבת על קרח.
- צנטריפוגה הצינורות במשך 4 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (50 °F). הסר את מאגר הנוגדנים מכל צינור.
- הוסיפו 800 μL של מאגר כביסה IP לכל צינור וערבבו בעדינות. השאירו את הצינורות על שייקר אופקי במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ו 12 סל"ד.
- לאחר הכביסה, צנטריפוגות הצינורות במשך 4 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (4 °F). הסר את supernatant באמצעות קצה פיפטה.
הערה: כדי למנוע כל הפרעה של גלולה הגרעינים, להשאיר ~ 50-80 μL של המאגר עם הגרעינים. - חזור על שלבים 3.6.6.-3.7. עוד פעמיים.
- לאחר השטיפה השלישית, צנטריפוגה במשך 2 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (4 °F). הסר את המאגר הנותר ככל האפשר.
4. דגירה של טרנספוזאז
- הפוך טרי 1 מ"ל של מאגר דגירה transposase (10 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5 מ"מ זרע, קוקטייל מעכב פרוטאז 0.1%, 0.05% w / v digitonin) על ידי ערבוב 1 מ"ל של מאגר לשטוף IP עם 30 μL של 5 M NaCl.
- כדי להכין את תערובת Tn5 transposase לדגירה, להוסיף 1 μL של transposase לכל 150 μL של מאגר הדגירה transposase.
הערה: הכן את תערובת פתרון transposase תחילה בהתאם למספר התגובות, ולאחר מכן להוסיף aliquot של 150 μL לכל צינור. - Resuspend הגרעין עם 150 μL של פתרון transposase.
- השאירו את הצינורות על שייקר אופקי ב 12 סל"ד במשך 2-3 שעות בטמפרטורת החדר ומערבבים כל 10-15 דקות.
- לאחר דגירה transposase, צנטריפוגה הצינורות במשך 4 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (65 °F). הסר את מאגר הדגירה transposase בכל צינור.
- לשטוף את הצינורות עם מאגר לשטוף IP. כדי לעשות זאת, להוסיף 800 μL של חיץ לשטוף IP לכל צינור, לערבב בעדינות, ולהשאיר את הצינורות על שייקר אופקי ב 12 סל"ד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (4 °F). הסר את supernatant באמצעות קצה פיפטה.
- חזור על שלבים 4.6.-4.7. עוד פעמיים.
- לאחר השטיפה השלישית, צנטריפוגה במשך 2 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (4 °F). הסר את המאגר הנותר ככל האפשר.
5. תיוג
- הפוך טרי 2 מ"ל של מאגר התיוג (10 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5 mM זרע, קוקטייל מעכב פרוטאז 0.1%, 10 מ"מ MgCl2, 0.05% w / v digitonin) על ידי ערבוב 2 מ"ל של חוצץ כביסה IP עם 60 μL של 5 M NaCl ו 20 μL של 1 M MgCl2.
- Resuspend הגרעין עם 300 μL של מאגר תיוג.
- מערבבים את התמיסה ודגרו באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לתיוג.
- עצור את התיוג עם 10 μL של 0.5 M EDTA (ריכוז סופי ~ 15 מ"מ) ו 30 μL של 10% SDS (ריכוז סופי 1%).
6. הפקת דנ"א ובניית ספריית NGS
- הוסף 300 μL של מאגר חילוץ DNA CTAB כמתואר7. לדגור על הצינורות באמבט מים 65 °C (65 °F) במשך 30 דקות. הופכים לערבב כל ~ 10 דקות.
- הוסף 600 μL של פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25:24:1) לכל צינור. מערבבים היטב.
- מראש צנטריפוגה צינורות ג'ל נעילת פאזה במשך 2 דקות ב 13,000 rcf ב 4 °C (66 °F). העבר את הפתרון לעיל לצינורות ג'ל נעילת פאזה.
- צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 13,000 rcf ב 4 °C (4 °F).
- העבר את supernatant (~ 600 μL) לצינור חדש 1.5 מ"ל.
- הוסף 600 μL של כלורופורם לכל צינור. מערבבים היטב.
- צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 13,000 rcf ב 4 °C (4 °F).
- העבר את supernatant (~ 600 μL) לצינור חדש 1.5 מ"ל.
- הוסף 12 μL של 100% אתנול ו 2 μL של GlycoBlue Coprecipitant. מערבבים היטב ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
- צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 13,000 rcf ב 4 °C (4 °F).
- דקאנט הסופר-ננטנט. לשטוף את גלולה DNA באמצעות 75% (v / v) אתנול וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 13,000 rcf ב 4 °C (4 °F).
- דקאנט הסופר-ננטנט. ייבשו את כדור הדנ"א ויצרו מחדש את הדנ"א ב-25 μL של ddH2O.
- הגדר את תגובת ה- PCR באופן הבא. עבור סך של 50 μL של תגובה, להוסיף 24 μL של DNA, 11 μL של ddH2O, 10 μL של 5x מאגר TAE, 2 μL של P5 פריימר (10 מיקרומטר), 2 μL של פריימר P7 (10 μM), ו 1 μL של TruePrep להגביר אנזים. תוכנית PCR: 72 °C (50 °F) במשך 3 דקות, 98 °C (50 °F) עבור 30 s; ואז 14 מחזורים של 98 °C (98 °F) עבור 30 s, 60 °C (60 °F) עבור 30 s, ואחריו 72 °C (5 °F) במשך 5 דקות.
הערה: לא ניתן לדלג על 72 °C (72 °F) הראשונים למשך 3 דקות להרחבה. פשטנות יתר של הספרייה תוביל לרמה גבוהה של כפילויות PCR ב- NGS. התחל מ 12-14 מחזורי PCR בתגובת PCR עבור H3K4me3 בעת שימוש ~ 1 מיקרוגרם של כרומטין בכל תגובה. - טען 2 μL של מוצרי PCR על 1.5% ג'ל agarose עבור אלקטרופורזה.
- לטהר את מוצרי PCR באמצעות חרוזים מגנטיים טיהור DNA מסחרי.
- לכמת את הספרייה עם פלואורומטר ואלקטרופורזה ג'ל אגרוז.
הערה: ריכוז יעיל של הספרייה צריך להיות >2 nM על ידי qPCR כדי להבטיח איכות טובה. - בצע רצף הדור הבא (NGS) וניתוח נתונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מתאר את זרימת העבודה של CUT&Tag. איור 2 מראה את הכתמת DAPI של הגרעינים השלמים. מטרת שלב "בידוד הגרעינים" הייתה להשיג את הגרעינים השלמים בכמות מספקת לתגובת CUT&Tag הבאה. איור 3 מציג את האלקטרופורזה של ג'ל האגרוז של מוצרי PCR. השליטה השלילית של IgG נדרשת במקביל בעת הגדרת הניסוי. בהשוואה לקבוצת הביקורת של IgG, עיקר שברי הדנ"א שנמשכו עם דגימת נוגדנים H3K4me3 נעו בין כ-280 ל-500 זוגות בסיסים. איור 4 מציג את רצף הדור הבא שנוצר עבור נוגדן האנטי-H3K4me3 בהשוואה לקבוצות הביקורת השליליות של IgG.
איור 1: זרימת העבודה של CUT&Tag. נתון זה שונה מטאו ואח' 4. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: כתמי DAPI של גרעינים שלמים המבודדים מעלי כותנה. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של 2 מיקרומטר של מוצרי PCR. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: צילום מסך מייצג של IGV עבור אותות H3K4me3. (A) סקירה מייצגת של IGV של אותות CUT&Tag על פני אזור גנום גדול. ~ 1500 kb אזורי גנום נבחרו באופן אקראי. (B) צילום מסך IGV מייצג עבור גנים עם רמות ביטוי מגוונות הראה רזולוציה גבוהה של אותות CUT&Tag. הקבצים הגדולים המנורמלים שנוצרו מ- bamCompare על ידי השוואת קובץ bam הטיפול (CUT&Tag anti-H3K4me3 תגובה) ואת קובץ bam השליטה (IgG) שימשו. TPM, תמלילים לכל בסיס קילו-בסיס של דגם אקסון למיליון קריאות ממופות. נתון זה משתנה מ- Tao et al.4. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: רצפי פריימר. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: מתכוני חוצץ ופתרון. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, תיארנו את CUT&Tag, טכנולוגיה ליצירת ספריות DNA ברזולוציה גבוהה ורקע נמוך במיוחד באמצעות מספר קטן של תאים עם הליך פשוט יותר בהשוואה לאימונופרציפציה כרומטין (ChIP). ההצלחה שלנו עם פרופיל H3K4me3 בעלי כותנה מצביעה על כך ש- CUT&Tag, שתוכננה לראשונה לתאי בעלי חיים, יכולה לשמש גם לתאי צמחים. הן מערכת החיץ Tris המשמשת בדרך כלל עבור ChIP assay8 והן מערכת חיץ HEPES המשמשת לעבודת CUT&Tag של בעלי חיים עבור CUT&Tag באמצעות גרעיני צמחים4,9. הבידוד של גרעיני צמחים שלמים הוא הצעד הקריטי ליישום המוצלח של CUT&Tag בצמחים. במתודולוגיה שדווחה בעבר לבידוד גרעינים4, הפתרון של רקמות טחונות סונן דרך שתי שכבות של Miracloth לפני תמוגה תאים. מצאנו את היעילות של השגת גרעינים נאותים מופחתת בעת שימוש בעלים מיושנים יחסית (למשל, עלים מצמחי כותנה בני חודשיים) וסיבי כותנה (למשל, סיבי 20-DPA) מכיוון שמירקלות' שומרת על רוב הרקמות הטחונות. בפרוטוקול וידאו זה, בידוד גרעיני הצמח היה אופטימיזציה על ידי סינון lysate התא דרך מסננת 500-רשת (20 μM נקבוביות) מסננת נירוסטה. פעולה זו שונתה שיפרה באופן משמעותי את היעילות של הסרת פסולת רקמות גדולה יותר וקבלת גרעינים נאותים לתגובה הבאה.
לאחר PCR לבניית הספרייה (שלב 6.13.), ניתן לטהר את שברי ה- DNA ולאחר מכן לתייג אותם בפרופיל על-ידי NGS. עם זאת, אם קבוצת הביקורת IgG מתארת גם העשרה בשברים קטנים, היא מצביעה על רקע חזק של חיתוך DNA אקראי על ידי transposase, אשר עלול להיגרם על ידי גרעינים פגומים או כביסה לא מספקת להסרת נוגדן מאוגד או טרנספוזאז. במקרה זה, הדגימות המקבילות לנוגדנים ספציפיים לא הומלצו עבור NGS נוסף.
לאחרונה, CUT&Tag חד-תאית על-ידי התאמת פלטפורמת ATAC-seq בעלת תא יחיד המבוססת על טיפות 10x Genomics פותחה ויושמה ביצירת פרופילים H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac ו- H3K36me3 שינויי הייסטון. במחקר על תפוסת הכרומטין של גורם שעתוק OLIG2, הרכיב המורכב של הקוהסין RAD21 במוח העכבר סיפק תובנות ייחודיות על נופים אפיגנומיים במערכת העצבים המרכזית6. לכן, CUT&Tag ניתן ליישם כדי לבחון את הנופים האפיגנומיים עבור שינוי histone בתפזורת ואת TFs ספציפי עם דרישות קלט נמוכות9, אפילו ברמה של תא יחיד6. יישומים אלה של CUT&Tag מצביעים על כך שחקר הרגולציה האפיגנטית הצמחית בתיאום רשתות פונקציונליות של גנים במהלך הדינמיקה של התפתחות ותגובות סביבתיות יכול להיות מדויק בתבנית הזמנית והמרחבית.
CUT&Tag היא שיטה שעדיין נמצאת בתהליכים התפתחותיים עם בעיות שיש לטפל בהן. עבור גורמי שעתוק שאינם באים לידי ביטוי בשפע או חלשים, ארעיים, או בעקיפין קשורים לכרומטין10, יש להשוות את ההבדלים בין גרעינים מקושרים לגרעינים מקומיים ב- CUT&Tag. אסטרטגיית CUT&Tag ליצירת פרופילים עם גורמי תמלול בשפע נמוך עדיין מאתגרת מבחינה טכנית. בנוסף, בשל הזמינות המוגבלת של אפיטופ חלבון, רוב נוגדני ChIP המאומתים לעבודה עם תנאי crosslinking לא יכול לעבוד טוב עם התנאים הטבעיים CUT&Tag; יש לאמת את הרגישות והייחודיות של הנוגדנים. יתר על כן, טרנספוזאז Tn5 המשמש CUT&Tag יש זיקה גבוהה לאזורים פתוחים כרומטין11, ולכן CUT&Tag עשוי להציג הטיה, אשר יש לטפל גם במחקרים עתידיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לכל המחברים אין ניגודי עניינים עם כל חברה המסחר באחד המוצרים שהוזכרו לעיל.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה כלכלית בחלקה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430), וקרנות מחקר בסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות, מעבדת הזרעים של מפרץ היינאן יאזו (JBGS, B21HJ0403), הקרן למדעי הטבע המחוזית של היינאן בסין (320LH002) ופרויקט JCIC-MCP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
- Abascal, F., et al.
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120 (2020).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
- Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
- Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).
- Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).
- Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).
