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Biology

लक्ष्य और टैगमेंटेशन के तहत दरार का उपयोग करके पौधों में H3K4me3 संशोधन की प्रोफाइलिंग

Published: April 22, 2022 doi: 10.3791/62534
Automatic Translation
*1,2, *3, *1, 1,4
1College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, 2Central Laboratory, State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 3State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Cotton Hybrid R & D Engineering Center (the Ministry of Education), College of Agriculture, Nanjing Agricultural University, 4Hainan Institute of Zhejiang University
* These authors contributed equally

Summary

लक्ष्य और टैगमेंटेशन (CUT&Tag) के तहत दरार एक कुशल क्रोमैटिन epigenomic प्रोफाइलिंग रणनीति है। यह प्रोटोकॉल पौधों में हिस्टोन संशोधनों की प्रोफाइलिंग के लिए एक परिष्कृत कट एंड टैग रणनीति प्रस्तुत करता है।

Abstract

डीएनए और हिस्टोन संशोधनों, प्रतिलेखन कारकों के व्यवहार, और उनके भर्ती प्रोटीन के साथ गैर-कोडिंग आरएनए सहित रंगीन स्तर पर एपिजीनोमिक विनियमन, जीन अभिव्यक्ति के अस्थायी और स्थानिक नियंत्रण का कारण बनता है। लक्ष्य और टैगमेंटेशन (CUT&Tag) के तहत दरार एक एंजाइम-टेदरिंग विधि है जिसमें विशिष्ट क्रोमैटिन प्रोटीन को पहले इसके विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा पहचाना जाता है, और फिर एंटीबॉडी एक प्रोटीन ए-ट्रांसपोसेज (पीए-टीएन 5) संलयन प्रोटीन को टेथर्स करता है, जो मैग्नीशियम आयनों के सक्रियण द्वारा सीटू में लक्षित क्रोमैटिन को क्लीव करता है। यहां, हम संशोधन के साथ एलोर्टट्राप्लॉइड कपास की पत्तियों से अलग अक्षुण्ण नाभिक का उपयोग करके अपना पहले प्रकाशित कट एंड टैग प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का उपयोग पौधों में एपिजीनोमिक अनुसंधान के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, पौधे नाभिक अलगाव के लिए पर्याप्त संशोधन महत्वपूर्ण टिप्पणियों के साथ प्रदान किए जाते हैं।

Introduction

प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी डीएनए साइटों और हिस्टोन संशोधन चिह्नों से जुड़े खुले क्रोमैटिन जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने में महत्वपूर्ण कार्यात्मक भूमिका निभाते हैं और एपिजेनेटिक शोध 1 के प्रमुख फोकस हैं। परंपरागत रूप से, क्रोमैटिन immunoprecipitation परख (CHIP) गहरी अनुक्रमण (CHIP-seq) के साथ युग्मित विशिष्ट क्रोमैटिन हिस्टोन संशोधन या विशिष्ट प्रोटीन के साथ डीएनए लक्ष्यों की जीनोम-वाइड पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया है, और व्यापक रूप से epigenetics2 के क्षेत्र में अपनाया जाता है। लक्ष्य और टैगमेंटेशन (CUT &Tag) तकनीक के तहत दरार मूल रूप से Henikoff लैब द्वारा विकसित किया गया था ताकि जीनोम 5 में प्रोटीन से जुड़े डीएनए टुकड़ों पर कब्जा किया जा सके। जब CHIP की तुलना में, CUT &Tagcan उच्च रिज़ॉल्यूशन और असाधारण रूप से कम पृष्ठभूमि पर डीएनए पुस्तकालयों को एक सरलीकृत प्रक्रिया के साथ कोशिकाओं की एक छोटी संख्या का उपयोग करके उत्पन्न कर सकता है3। आज तक, CUT &Tag का उपयोग करके विशिष्ट हिस्टोन संशोधनों के साथ क्रोमैटिन क्षेत्रों के विश्लेषण के लिए विधियां पशु कोशिकाओं 4,5 में स्थापित की गई हैं। विशेष रूप से, एकल-सेल CUT &Tag (scCUT &Tag) को मानव ऊतकों और कोशिकाओं के लिए सफलतापूर्वक विकसित किया गया है। हालांकि, सेल की दीवार और माध्यमिक चयापचयों की जटिलता के कारण, CUT & Tag अभी भी पौधे के ऊतकों के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है।

इससे पहले, हमने एलोटेट्राप्लॉइड कपास के पत्तों से अलग अक्षुण्ण नाभिक का उपयोग करके एक CUT &Tag प्रोटोकॉल की सूचना दी थी4। पौधे के ऊतकों का उपयोग करके नाभिक अलगाव और डीएनए कैप्चर की दक्षता का प्रदर्शन करने के लिए, प्रोफाइलिंग प्रक्रिया यहां प्रस्तुत की गई है। प्रमुख चरणों में बरकरार नाभिक अलगाव, सीटू में क्रोमैटिन संशोधन के लिए एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन, ट्रांसपोसेज इनक्यूबेशन, एडेप्टर एकीकरण और डीएनए लाइब्रेरी की तैयारी शामिल है। समस्या निवारण संयंत्र नाभिक अलगाव और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए CUT &Tag लाइब्रेरी तैयारी पर केंद्रित है।

इस अध्ययन में, हम पौधों के लिए एक परिष्कृत कट और टैग रणनीति प्रस्तुत करते हैं। न केवल हम कपास की पत्तियों में H3K4me3 प्रोफाइलिंग के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, बल्कि हम पौधे नाभिक अलगाव के लिए एक अनुकूलित पद्धति भी प्रदान करते हैं, जिसमें उचित सेल लाइसिस के लिए डिटर्जेंट की एकाग्रता का चयन करने की रणनीति और नाभिक को फ़िल्टर करने की रणनीति शामिल है। महत्वपूर्ण टिप्पणियों के साथ विस्तृत चरण भी इस अद्यतन प्रोटोकॉल में शामिल हैं।

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Protocol

1. Transposase और स्टॉक समाधान तैयार करें (दिन 1)

नोट:: इस भाग में, oligonucleotide एडाप्टर सक्रिय transposase बनाने के लिए Tn5 transposase के साथ जटिल हैं।

  1. पतला प्राइमरों (प्राइमर ए, प्राइमर बी, और प्राइमर सी) को एनीलिंग बफर (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) का उपयोग करके 100 μM एकाग्रता के लिए (प्राइमर A, प्राइमर B, और प्राइमर C) को पतला करें (प्राइमरों की अनुक्रम जानकारी के लिए तालिका 1 को देखें और काम करने वाले समाधानों के लिए व्यंजनों के लिए तालिका 2 )। उपयोग करने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. पीसीआर ट्यूबों में निम्नलिखित दो प्रतिक्रियाओं को सेट करें: प्रतिक्रिया 1 (एडाप्टर एबी), 100 μM प्राइमर ए का 10 μL, 100 μM प्राइमर बी का 10 μL; प्रतिक्रिया 2 (एडाप्टर एसी), 100 μM प्राइमर A का 10 μL, μL 100 μM प्राइमर C का 10।
  3. निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करके पीसीआर मशीन में एडाप्टर को अनील करें: गर्मी ढक्कन (102 डिग्री सेल्सियस), 15 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस।
    नोट: एडाप्टर आंशिक रूप से डबल-फंसे हुए डीएनए अणु हैं (एकाग्रता = 50 pmol / μL)।
  4. एक 1.5 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में निम्नलिखित प्रतिक्रिया सेट करें: पीए-टीएन 5 ट्रांसपोसेज के 10 μL (500 ng / μL या 7.5 pmol / μL), एडाप्टर AB (50 pmol / μL) के 0.75 μL, एडेप्टर एसी (50 pmol / μL) के 7 μL, युग्मन बफर के 7 μL। पिपेट 20x धीरे से अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए और 1 घंटे के लिए एक पानी के स्नान में 30 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन करने के लिए। Transposase की अंतिम सांद्रता = 4 pmol / μL उपयोग करने तक -20 °C पर स्टोर करें।
    नोट: एडेप्टर AB का दाढ़ अनुपात: एडाप्टर एसी: ट्रांसपोसेज = 0.5: 0.5: 1।
  5. तालिका 2 में प्रदान किए गए व्यंजनों के अनुसार स्टॉक समाधान तैयार करें और आटोक्लेव करें या स्टरलाइज़ करने के लिए स्टॉक समाधानों को फ़िल्टर करें।
  6. आटोक्लेव और स्टरलाइज़ कैंची, फिल्टर पेपर, एक स्टेनलेस स्टील छलनी, एक मोर्टार, पेस्टल्स, आदि।

2. नाभिक अलगाव (दिन 2)

  1. सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस तक प्री-कूल करें। प्रारंभिक सामग्री (कपास की पत्तियों) के प्रत्येक 1 ग्राम के लिए, परमाणु अलगाव बफर A (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 mL परमाणु अलगाव बफर B (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL परमाणु धोने के बफर (10 mM Tris pH 8.0) तैयार करें। 150 mM NaCl, 0.5 mM spermidine, प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल 0.1%), एंटीबॉडी बफर के 1 mL (50 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.5 mM spermidine, 1 mg/ mL BSA, प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल 0.1%, 0.05% w/ v digitonin)। ट्यूबों को उपयोग करने तक बर्फ पर बैठने दें।
  2. तरल नाइट्रोजन में ताजा पत्तियों (~ 1 ग्राम) को एक ठीक पाउडर में पीसें और 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 25 मिलीलीटर ठंडा परमाणु अलगाव बफर ए होता है।
  3. बफर समाधान को धीरे से मिलाएं और सामग्री को समान रूप से फैलाने के लिए कोमल मिलाते हुए 5 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
  4. सेल गोली बनाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 आरसीएफ पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  5. Supernatant decant और 0.5% Triton X-100 के साथ पूरक ठंडा परमाणु अलगाव बफर बी के 20 mL के साथ गोली resuspend. गोली को पूरी तरह से फिर से निलंबित करने के लिए ट्यूब को धीरे से उलटें।
    नोट:: 20 mL परमाणु अलगाव बफ़र B 1 g प्रारंभिक सामग्री के लिए लागू होता है, और इस मात्रा तदनुसार स्केल किया जा सकता है।
    1. Triton X-100 की श्रृंखला एकाग्रता के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एक पायलट परख प्रदर्शन (उदाहरण के लिए, 2 मिलीलीटर परमाणु अलगाव बफर बी, 0.1%, 0.25%, 0.5%, और 1% Triton X-100 पीस ऊतकों के 100 मिलीग्राम के लिए प्रत्येक के साथ). ट्राइटन एक्स -100 की उपयुक्त एकाग्रता को नीचे सफेद / ग्रे नाभिक के संचय और कम गति पर लाइसिस और सेंट्रीफ्यूजिंग के बाद एक गहरे हरे रंग के supernatant द्वारा इंगित किया जाता है (4 मिनट के लिए 500 rcf <)।
  6. दो छलनी के संयोजन के साथ परिणामी सेल लिसेट को फ़िल्टर करें: बड़े ऊतक मलबे को हटाने के लिए शीर्ष पर एक 500-जाल छलनी और नाभिक को इकट्ठा करने के लिए नीचे एक 1000-जाल छलनी।
    नोट: पौधों के नाभिक आकार के आधार पर छलनी के लिए एक उपयुक्त जाल आकार चुनें।
  7. लाइसेट में छोटे सेल मलबे को अवशोषित करने के लिए छलनी के पीछे की ओर बाँझ फिल्टर पेपर का उपयोग करें।
  8. 1000-जाल छलनी के शीर्ष पक्ष पर लिसेट युक्त शेष नाभिक को चार ताजा 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  9. नाभिक को इकट्ठा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 आरसीएफ पर 4 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  10. एक पिपेट टिप का उपयोग करके जितना संभव हो उतना supernatant निकालें और परमाणु धोने बफर के साथ गोली को धोएं।
  11. परमाणु धोने बफर के 800 μL जोड़ें और गोली resuspend करने के लिए धीरे से ट्यूबों उलटा. ट्यूब को फिर से 4 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 आरसीएफ पर स्पिन करें।
  12. कुल 3 वॉश करें।
  13. (वैकल्पिक) DAPI धुंधला करने के लिए एक माइक्रोस्कोप के तहत नाभिक छवि.
    1. चरण 2.11 से परमाणु वॉश बफर में नाभिक निलंबन के 100 μL हस्तांतरण। एक नई 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए। DAPI के लिए 2 μg/mL की अंतिम कार्यशील सांद्रता बनाने के लिए परमाणु वॉश बफर के 900 μL और DAPI स्टॉक समाधान (1 mg/mL) के 2 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
    2. धुंधला होने के बाद, नाभिक को इकट्ठा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 आरसीएफ पर 4 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    3. एक पिपेट टिप का उपयोग करके जितना संभव हो उतना supernatant निकालें। परमाणु धोने बफर के 800 μL के साथ 3 बार धोएं।
    4. जितना संभव हो उतना supernatant निकालें और नाभिक को परमाणु धोने के बफर के 100 μL के साथ पुन: निलंबित करें।
    5. DAPI चैनल का उपयोग कर एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत नाभिक छवि.
  14. दो ट्यूबों से नाभिक को संयोजित करें (प्रत्येक 1.5 मिली ट्यूब में आयतन में नाभिक के ~ 50 μL)। 4 °C पर 300 rcf पर 4 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। एक पिपेट टिप का उपयोग करके जितना संभव हो उतना शेष बफर निकालें।

3. एंटीबॉडी इनक्यूबेशन

  1. एंटीबॉडी बफर के 1 मिलीलीटर के साथ एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में नाभिक के प्रत्येक 50 μL को फिर से निलंबित करें।
  2. 1.5 mL ट्यूबों में निम्नलिखित प्रतिक्रियाओं को स्थापित करें: नाभिक के 150 μL (~ क्रोमैटिन के 1 μg) और प्रत्येक ट्यूब में IgG (1 mg/ mL) के 2 μL के साथ IgG नियंत्रण समूहों की दो जैविक प्रतिकृतियों, H3K4me3 परख समूहों के दो जैविक प्रतिकृतियों नाभिक के 150 μL और प्रत्येक ट्यूब में एंटी-H3K4me3 एंटीबॉडी (1 mg / mL) के 2 μL के साथ।
  3. समाधान को धीरे से मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस और 12 आरपीएम पर रात भर संकरण के लिए एक क्षैतिज शेकर पर ट्यूबों को छोड़ दें।
  4. सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस तक प्री-कूल करें। एक 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में immunoprecipitation (आईपी) धोने बफर (10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5 mM spermidine, प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल 0.1%, ,0.05% w / v digitonin) के ताजा 50 mL तैयार करें। ट्यूब को बर्फ पर बैठने दें।
  5. 4 °C पर 300 rcf पर 4 मिनट के लिए ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। प्रत्येक ट्यूब से एंटीबॉडी बफर निकालें।
  6. प्रत्येक ट्यूब के लिए आईपी धोने बफर के 800 μL जोड़ें और धीरे से मिश्रण। कमरे के तापमान और 12 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए एक क्षैतिज शेकर पर ट्यूबों को छोड़ दें।
  7. धोने के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 आरसीएफ पर 4 मिनट के लिए ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। एक पिपेट टिप का उपयोग करके supernatant निकालें।
    नोट: नाभिक गोली के किसी भी गड़बड़ी से बचने के लिए, नाभिक के साथ बफर के ~ 50-80 μL छोड़ दें।
  8. चरण 3.6.-3.7 दोहराएँ। दो बार और।
  9. तीसरे धोने के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 आरसीएफ पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। शेष बफ़र को जितना संभव हो उतना निकालें।

4. Transposase इनक्यूबेशन

  1. 5 M NaCl के 30 μL के साथ IP वॉश बफर इनक्यूबेशन के 1 mL मिश्रण द्वारा (10 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5 mM spermidine, प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल 0.1%, 0.05% w / v digitonin) के 1 mL IP वॉश बफर के 1 mL को मिलाकर 5 M NaCl के 30 μL के साथ ताजा 1 mL बनाएं।
  2. इनक्यूबेशन के लिए Tn5 transposase मिश्रण तैयार करने के लिए, ट्रांसपोसेज़ इनक्यूबेशन बफर के प्रत्येक 150 μL के लिए transposase के 1 μL जोड़ें।
    नोट: प्रतिक्रियाओं की संख्या के अनुसार पहले transposase समाधान मिश्रण तैयार करें, और उसके बाद प्रत्येक ट्यूब के लिए 150 μL का एक ऐलीकोट जोड़ें।
  3. ट्रांसपोसेज समाधान के 150 μL के साथ नाभिक को फिर से निलंबित कर दिया।
  4. कमरे के तापमान पर 2-3 घंटे के लिए 12 आरपीएम पर एक क्षैतिज शेकर पर ट्यूबों को छोड़ दें और हर 10-15 मिनट में मिलाएं।
  5. ट्रांसपोसेज इनक्यूबेशन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 आरसीएफ पर 4 मिनट के लिए ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। प्रत्येक ट्यूब में ट्रांसपोज़ इनक्यूबेशन बफर निकालें।
  6. आईपी वॉश बफर के साथ ट्यूबों को धोएं। ऐसा करने के लिए, प्रत्येक ट्यूब में आईपी वॉश बफर के 800 μL जोड़ें, धीरे से मिलाएं, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 12 आरपीएम पर क्षैतिज शेकर पर ट्यूबों को छोड़ दें।
  7. 4 °C पर 300 rcf पर 4 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। एक पिपेट टिप का उपयोग करके supernatant निकालें।
  8. चरण 4.6.-4.7 दोहराएँ। दो बार और।
  9. तीसरे धोने के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 आरसीएफ पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। शेष बफ़र को जितना संभव हो उतना निकालें।

5. टैगमेंटेशन

  1. ताजा टैगमेंटेशन बफर के 2 एमएल (10 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5 mM spermidine, प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल 0.1%, 10 mM MgCl2, 0.05% w / v digitonin) 5 M NaCl के 60 μL और 1 M MgCl2 के 20 μL के साथ IP वॉश बफर के 2 mL मिश्रण द्वारा बनाते हैं।
  2. टैगमेंटेशन बफर के 300 μL के साथ नाभिक को फिर से निलंबित कर दिया।
  3. समाधान मिश्रण और टैगमेंटेशन के लिए 1 ज के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में incubate.
  4. 0.5 M EDTA (अंतिम एकाग्रता ~ 15 mM) के 10 μL और 10% SDS (अंतिम एकाग्रता 1%) के 30 μL के साथ टैगमेंटेशन रोकें।

6. डीएनए निष्कर्षण और NGS पुस्तकालय निर्माण

  1. CTAB डीएनए निष्कर्षण बफर के 300 μL जोड़ें के रूप में वर्णित 7. 30 मिनट के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूबों incubate. हर ~ 10 मिनट मिश्रण करने के लिए उलटा।
  2. फिनोल के 600 μL जोड़ें: क्लोरोफॉर्म: प्रत्येक ट्यूब के लिए isoamyl अल्कोहल (25: 24: 1)। अच्छी तरह से मिलाएं।
  3. पूर्व सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,000 rcf पर 2 मिनट के लिए चरण लॉक जेल ट्यूब. चरण ताला जेल ट्यूबों के लिए उपरोक्त समाधान स्थानांतरित करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,000 आरसीएफ पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  5. Supernatant (~ 600 μL) एक नया 1.5 mL ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
  6. प्रत्येक ट्यूब में क्लोरोफॉर्म के 600 μL जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,000 आरसीएफ पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  8. supernatant (~ 600 μL) एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
  9. 100% इथेनॉल के 12 μL और GlycoBlue Coprecipitant के 2 μL जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं और 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,000 आरसीएफ पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  11. supernatant decant. 75% (v / v) इथेनॉल और सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके डीएनए पैलेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,000 आरसीएफ पर 5 मिनट के लिए धोएं।
  12. supernatant decant. डीएनए गोली को हवा से सुखाएं और ddH2O के 25 μL में डीएनए को फिर से निलंबित करें।
  13. पीसीआर प्रतिक्रिया को निम्नानुसार सेट करें। प्रतिक्रिया के कुल 50 μL के लिए, DNA के 24 μL, ddH2O के 11 μL, 5x TAE बफर के 10 μL, P5 प्राइमर (10 μM) के 2 μL, P7 प्राइमर (10 μM) के 2 μL, और TruePrep Amplify एंजाइम के 1 μL जोड़ें। पीसीआर कार्यक्रम: 3 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस; फिर 30 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 14 चक्र, 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, इसके बाद 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
    नोट:: एक्सटेंशन के लिए 3 मिनट के लिए पहले 72 °C को छोड़ा नहीं जा सकता । पुस्तकालय के अतिप्रदर्शन से एनजीएस में पीसीआर डुप्लिकेट का एक उच्च स्तर होगा। प्रत्येक प्रतिक्रिया में क्रोमैटिन के ~ 1 μg का उपयोग करते समय H3K4me3 के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया में 12-14 पीसीआर चक्रों से शुरू करें।
  14. वैद्युतकणसंचलन के लिए 1.5% agarose जेल पर पीसीआर उत्पादों के 2 μL लोड करें।
  15. वाणिज्यिक डीएनए शुद्धिकरण चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें।
  16. एक फ्लोरोमीटर और agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ पुस्तकालय की मात्रा निर्धारित करें।
    नोट: पुस्तकालय की प्रभावी एकाग्रता अच्छी गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए qPCR द्वारा >2 nM किया जाना चाहिए।
  17. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) और डेटा विश्लेषण करें।

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Representative Results

चित्र 1 CUT&Tag वर्कफ़्लो को दर्शाता है. चित्र 2 बरकरार नाभिक के DAPI धुंधला से पता चलता है. "नाभिक अलगाव" चरण का लक्ष्य बाद के CUT & Tag प्रतिक्रिया के लिए पर्याप्त मात्रा में बरकरार नाभिक प्राप्त करना था। चित्रा 3 पीसीआर उत्पादों के agarose जेल वैद्युतकणसंचलन से पता चलता है. प्रयोग की स्थापना करते समय समानांतर में IgG नकारात्मक नियंत्रण की आवश्यकता होती है। IgG नियंत्रण समूह की तुलना में, H3K4me3 एंटीबॉडी नमूने के साथ खींचे गए डीएनए टुकड़ों का बड़ा हिस्सा ~ 280 से 500 आधार जोड़े तक था। चित्रा 4 IgG नकारात्मक नियंत्रण समूहों की तुलना में एंटी-H3K4me3 एंटीबॉडी के लिए परिणामी अगली पीढ़ी के अनुक्रमण को दर्शाता है।

Figure 1
चित्रा 1: CUT&Tag का वर्कफ़्लो. यह आंकड़ा ताओ एट अल.4 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: कपास की पत्तियों से अलग अक्षुण्ण नाभिक के डीएपीआई धुंधला. स्केल बार = 20 μM. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: पीसीआर उत्पादों के 2 μL का Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: H3K4me3 संकेतों के लिए प्रतिनिधि IGV स्क्रीनशॉट. (A) एक बड़े जीनोम क्षेत्र में CUT&Tag संकेतों के प्रतिनिधि IGV सिंहावलोकन. ~ 1500 केबी जीनोम क्षेत्रों को यादृच्छिक रूप से चुना गया था। (बी) विभिन्न अभिव्यक्ति के स्तर वाले जीन के लिए प्रतिनिधि आईजीवी स्क्रीनशॉट ने कट एंड टैग संकेतों के उच्च रिज़ॉल्यूशन को दिखाया। उपचार बाम फ़ाइल (CUT&Tag एंटी-H3K4me3 प्रतिक्रिया) और नियंत्रण बाम फ़ाइल (IgG) की तुलना करके bamCompare से उत्पन्न सामान्यीकृत bigWig फ़ाइलों का उपयोग किया गया था। TPM, प्रति मिलियन मैप किए गए पढ़ने के लिए एक्सन मॉडल के प्रति किलोबेस टेप। इस आंकड़े को ताओ एट अल.4 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: प्राइमर अनुक्रम। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: बफर और समाधान व्यंजनों. इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां, हमने CUT &Tag का वर्णन किया है, क्रोमैटिन immunoprecipitation (CHIP) की तुलना में एक सरलीकृत प्रक्रिया के साथ कोशिकाओं की एक छोटी संख्या का उपयोग करके उच्च रिज़ॉल्यूशन और असाधारण रूप से कम पृष्ठभूमि पर डीएनए पुस्तकालयों को उत्पन्न करने के लिए एक तकनीक। कपास की पत्तियों में H3K4me3 प्रोफाइलिंग के साथ हमारी सफलता से पता चलता है कि CUT &Tag, जिसे पहली बार पशु कोशिकाओं के लिए डिज़ाइन किया गया था, का उपयोग पौधों की कोशिकाओं के लिए भी किया जा सकता है। दोनों Tris बफर प्रणाली आमतौर पर CHIP assay8 के लिए इस्तेमाल किया और HEPES बफर प्रणाली पशु CUT&Tag के लिए उपयोग किया जाता है और पेड़ nuclei4,9 का उपयोग कर CUT&Tag के लिए काम करते हैं. बरकरार संयंत्र नाभिक का अलगाव पौधों में CUT & Tag के सफल अनुप्रयोग के लिए महत्वपूर्ण कदम है। नाभिक अलगाव 4 के लिए पहले से रिपोर्ट की गई पद्धति में, पीसे गए ऊतकों के समाधान को सेल लाइसिस से पहले मिराक्लॉथ की दो परतों के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था। हमने पाया कि अपेक्षाकृत वृद्ध पत्तियों (उदाहरण के लिए, 2 महीने के कपास के पौधों से पत्तियां) और कपास फाइबर (जैसे, 20-डीपीए फाइबर) का उपयोग करते समय पर्याप्त नाभिक प्राप्त करने की दक्षता कम हो जाती है क्योंकि मिराक्लॉथ अधिकांश पीसे हुए ऊतकों को बनाए रखता है। इस वीडियो प्रोटोकॉल में, संयंत्र नाभिक अलगाव एक 500-जाल (20 μM ताकना आकार) स्टेनलेस स्टील छलनी के माध्यम से सेल lysate फ़िल्टरिंग द्वारा अनुकूलित किया गया था। इस परिवर्तित ऑपरेशन ने बड़े ऊतक मलबे को हटाने और बाद की प्रतिक्रिया के लिए पर्याप्त नाभिक प्राप्त करने की दक्षता में काफी सुधार किया।

पुस्तकालय निर्माण के लिए पीसीआर के बाद (चरण 6.13.), डीएनए टुकड़ों को शुद्ध किया जा सकता है और फिर एनजीएस द्वारा प्रोफ़ाइल किया जा सकता है। हालांकि, यदि आईजीजी नियंत्रण समूह भी छोटे टुकड़ों में एक संवर्धन को दर्शाता है, तो यह ट्रांसपोसेज़ द्वारा यादृच्छिक डीएनए काटने की एक मजबूत पृष्ठभूमि को इंगित करता है, जो अनबाउंड एंटीबॉडी या ट्रांसपोसेस को हटाने के लिए क्षतिग्रस्त नाभिक या अपर्याप्त धोने के कारण हो सकता है। इस मामले में, विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए समानांतर नमूनों को आगे के एनजीएस के लिए अनुशंसित नहीं किया गया था।

हाल ही में, ड्रॉपलेट-आधारित 10x जीनोमिक्स सिंगल-सेल ATAC-seq प्लेटफ़ॉर्म को अनुकूलित करके एकल-सेल CUT&Tag को विकसित किया गया है और H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac और H3K36me3 हिस्टोन संशोधनों की प्रोफाइलिंग में लागू किया गया है। प्रतिलेखन कारक OLIG2 के क्रोमैटिन अधिभोग पर एक अध्ययन में, माउस मस्तिष्क में कोहेसिन जटिल घटक RAD21 ने केंद्रीय तंत्रिका तंत्र 6 में एपिजीनोमिक परिदृश्य में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान की। इस प्रकार, CUT &Tag को थोक हिस्टोन संशोधन और कम इनपुट आवश्यकताओं के साथ विशिष्ट TFs दोनों के लिए epigenomic परिदृश्य की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है9, यहां तक कि एकल-सेल स्तर 6 पर भी। CUT &Tag के इन अनुप्रयोगों से संकेत मिलता है कि विकास और पर्यावरणीय प्रतिक्रियाओं की गतिशीलता के दौरान जीन कार्यात्मक नेटवर्क के समन्वय में पौधे एपिजेनेटिक विनियमन का अध्ययन अस्थायी और स्थानिक पैटर्न में सटीक हो सकता है।

CUT &Tag एक ऐसी विधि है जो अभी भी विकास प्रक्रियाओं के तहत है जिसमें समस्याओं को संबोधित करने की आवश्यकता है। प्रतिलेखन कारकों के लिए जो बहुतायत से व्यक्त नहीं किए जाते हैं या कमजोर, क्षणिक रूप से, या अप्रत्यक्ष रूप से क्रोमैटिन 10 से बंधे होते हैं, कट एंड टैग में क्रॉसलिंक्ड और देशी नाभिक के बीच के अंतर की तुलना करने की आवश्यकता होती है। कम बहुतायत में प्रतिलेखन कारकों के साथ प्रोफाइलिंग के लिए कट एंड टैग रणनीति अभी भी तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। इसके अलावा, प्रोटीन एपिटोप की सीमित उपलब्धता के कारण, क्रॉसलिंकिंग स्थितियों के साथ काम करने के लिए मान्य अधिकांश सीआईपी एंटीबॉडी कट एंड टैग में देशी स्थितियों के साथ अच्छी तरह से काम नहीं कर सकते हैं; एंटीबॉडी की संवेदनशीलता और विशिष्टता को मान्य करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, CUT &Tag में उपयोग किए जाने वाले Tn5 ट्रांसपोसेज़ में ओपन-क्रोमैटिन क्षेत्रों 11 के लिए उच्च आत्मीयता है, इस प्रकार CUT & Tag पूर्वाग्रह का परिचय दे सकता है, जिसे भविष्य के अध्ययनों में भी संबोधित करने की आवश्यकता है।

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Disclosures

सभी लेखकों के पास ऊपर उल्लिखित उत्पादों में से एक का व्यापार करने वाली किसी भी कंपनी के साथ हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी, 31900395, 31971985, 31901430) और केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान कोष, हैनान याझोउ बे सीड लैब (जेबीजीएस, बी 21 एचजे0403), चीन के हैनान प्रांतीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (320एलएच002), और जेसीआईसी-एमसीपी परियोजना के अनुदान द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody
Anti-H3K4me3 Millipore 07-473
Normal rabbit IgG Millipore 12-370
Chemicals
Bovine Serum Albumin (BSA) Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C
digitonin (~50% (TLC) Sigma-Aldrich D141 Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C
dimethyl sulfoxide (DMSO)
chloroform
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH
ethanol
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) Invitrogen AM9516
magnesium chloride (MgCl2) Make 1 M MgCl2 stock solution
protease inhibitor cocktail Calbiochem 539133-1SET
potassium chloride (KCl) Make 1 M KCl stock solution
phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v)
sodium chloride (NaCl) Make 5 M NaCl stock solution
spermidine Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C.
sodium dodecyl sulfate (SDS) Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter
Tris base Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution
Triton X-100 Make 20% Triton X-100 stock solution
Enzyme
Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag Vazyme S602/S603 Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody.
TruePrep Amplify Enzyme Vazyme TD601
Equipment
Centrifuge Eppendorf 5424R
PCR machine Applied Biosystems ABI9700
Orbital shaker MIULAB HS-25
NanoDrop One  spectrophotometer Thermo Scientific ND-ONE-W

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References

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  2. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
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जीव विज्ञान अंक 182
लक्ष्य और टैगमेंटेशन के तहत दरार का उपयोग करके पौधों में H3K4me3 संशोधन की प्रोफाइलिंग
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Tao, X., Gao, M., Wang, S., Guan, X. … More

Tao, X., Gao, M., Wang, S., Guan, X. Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation. J. Vis. Exp. (182), e62534, doi:10.3791/62534 (2022).

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