Summary
In vivo wurde die hochauflösende Bildgebung der Bauchspeicheldrüse mit dem pankreasinen intravitalen Bildgebungsfenster erleichtert.
Abstract
Die direkte in vivo zelluläre Bildgebung der Bauchspeicheldrüse in einem lebenden Kleintiermodell war technisch anspruchsvoll. Eine kürzlich durchgeführte intravitale Bildgebungsstudie mit einem abdominalen Bildgebungsfenster ermöglichte die Visualisierung der zellulären Dynamik in Bauchorganen in vivo. Aufgrund der weichen blattartigen Architektur der Bauchspeicheldrüse der Maus, die leicht durch physiologische Bewegungen (z. B. Peristaltik und Atmung) beeinflusst werden kann, war es jedoch schwierig, eine stabilisierte longitudinale In-vivo-Bildgebung über mehrere Wochen auf zellulärer Ebene durchzuführen, um Inselchen oder Krebszellen in der Bauchspeicheldrüse der Maus zu identifizieren, zu verfolgen und zu quantifizieren. Hierin beschreiben wir eine Methode zur Implantation einer neuartigen Stützbasis, einem integrierten pankreatischen intravitalen Bildgebungsfenster, das die Bauchspeicheldrüse räumlich vom Darm trennen kann, um die intravitalen Bildgebung der Bauchspeicheldrüse in Längsschnitt zu drehen. Die longitudinale In-vivo-Bildgebung mit dem Bildgebungsfenster ermöglicht eine stabile Visualisierung, die die Verfolgung von Inseln über einen Zeitraum von 3 Wochen und eine hochauflösende dreidimensionale Abbildung der Mikrostruktur ermöglicht, wie hier in einem orthotopen Bauchspeicheldrüsenkrebsmodell gezeigt. Mit unserer Methode können weitere intravitalen bildgebenden Untersuchungen die Pathophysiologie verschiedener Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene aufklären.
Introduction
Die Bauchspeicheldrüse ist ein Bauchorgan mit einer exokrinen Funktion im Verdauungstrakt und einer endokrinen Funktion, Hormone in den Blutkreislauf zu sezernieren. Hochauflösende zelluläre Bildgebung der Bauchspeicheldrüse könnte die Pathophysiologie verschiedener Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse aufdecken, darunter Pankreatitis, Bauchspeicheldrüsenkrebs und Diabetes mellitus1. Herkömmliche diagnostische Bildgebungswerkzeuge wie Computertomographie, Bildgebung mit magnetischer Auflösung und Ultraschall sind im klinischen Bereich weit verbreitet1,2. Diese Bildgebungsmodalitäten beschränken sich jedoch darauf, nur strukturelle oder anatomische Veränderungen zu visualisieren, während Veränderungen auf zellulärer oder molekularer Ebene nicht bestimmt werden können. Da molekulare Veränderungen bei Diabetes mellitus oder Bauchspeicheldrüsenkrebs beim Menschen mehr als 10 Jahre vor der Diagnose3,4beginnenkönnen,hat die Erkennung von Pankreaserkrankungen aus ihrem molekularen Übergang während der Latenzzeit das Potenzial, eine frühzeitige Diagnose und eine rechtzeitige Intervention zu ermöglichen. So wird eine Bildgebung, die die Einschränkungen der Auflösung überwindet und wertvolle Einblicke in die Funktion liefert, bemerkenswert aufmerksamkeitserregen, indem sie eine frühzeitige Diagnose von Bauchspeicheldrüsenkrebs oder eine fortgeschrittene Identifizierung der Veränderung der Inseln während des Fortschreitens von Diabetes mellitus5ermöglicht.
Insbesondere bei den Inseln wurden die nukleare Bildgebung, die Biolumineszenzbildgebung und die optische Kohärenztomographie als nicht-invasive Inselbildgebungsverfahren vorgeschlagen6. Die Auflösung dieser Methoden ist jedoch im Wesentlichen niedrig, mit typischen Werten von mehreren zehn bis hunderten Mikrometern, die eine begrenzte Fähigkeit bieten, Veränderungen auf zellulärer Ebene in den Inseln zu erkennen. Auf der anderen Seite wurden frühere hochauflösende Studien von Inseln unter ex vivo7,8 (z. B. Schneiden oder Verdauung der Bauchspeicheldrüse), nicht-physiologischen9 (z. B. Exteriorisierung der Bauchspeicheldrüse) und heterotopenZuständen 10,11,12 (z. B. Implantation unter der Nierenkapsel, in der Leber und in der vorderen Augenkammer) durchgeführt, was ihre Interpretation und klinischen Auswirkungen einschränkt. Wenn in vivoein physiologisches und orthotopisches Modell der hochauflösenden Bildgebung etabliert werden kann, wird es eine kritische Plattform für die Untersuchung von Pankreasinseln sein.
Die intravitale Bildgebung, die die Pathophysiologie bei einer mikroskopischen Auflösung bei einem lebenden Tier aufzeigen, hat kürzlich große Aufmerksamkeit erhalten13. Von den in vivo bildgebenden Verfahren hat die Entwicklung eines abdominalen Bildgebungsfensters14, das ein Fenster in den Bauch einer Maus implantiert, die Entdeckung neuer Erkenntnisse ermöglicht (d.h. ein Prä-Mikrometastasierungsstadium der frühen Lebermetastasierung15 und Mechanismus der Stammzellerhaltung im Darmepithel16). Obwohl das abdominale Bildgebungsfenster wertvolle Ergebnisse liefert, wurden die Anwendungen dieses Fensters für die Bauchspeicheldrüse und die daraus resultierende intravitale Bildgebungsforschung auf der Grundlage von Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse nicht umfassend untersucht.
Im Gegensatz zu den gut definierten festen Organeigenschaften der menschlichen Bauchspeicheldrüse ist die Bauchspeicheldrüse einer Maus eine diffus verteilte weichteilartige Struktur17. Daher wird es unaufhörlich durch physiologische Bewegungen einschließlich Peristaltik und Atmung beeinflusst. Eine frühere Studie über die Anwendung eines abdominalen Bildgebungsfensters für die Bauchspeicheldrüse zeigte, dass das Wandern aufgrund von Bewegungsartefakten auftrat, die durch Stuhlgang induziert wurden18. Im resultierenden gemittelten Bild wurden starke Unschärfen beobachtet, die die Visualisierung und Identifizierung der mikroskaligen Strukturen behinderten.
Hierin beschreiben wir die Verwendung eines neuartigen unterstützenden basenintegrierten pankreasintevitalen intravitalen Bildgebungsfensters in Kombination mit der intravitalenMikroskopie 19,20, um die longitudinalen zellulären Ereignisse bei Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse zu untersuchen. Neben einer detaillierten Beschreibung der Methodik in der vorangegangenen Studie18wird in diesem Beitrag die erweiterte Anwendung des Pankreas-Bildgebungsfensters für verschiedene Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse behandelt. In diesem Protokoll wurde ein speziell angefertigtes videorates Laser-Scanning-konfokale Mikroskopiesystem als intravitale Mikroskopiesystem verwendet. Vier Lasermodule (Wellenlängen bei 405, 488, 561 und 640 nm) wurden als Anregungsquelle verwendet, und vier Kanäle von Emissionssignalen wurden durch Photomultiplierröhren (PMT) durch Bandpassfilter (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Laserscanning bestand aus einem rotierenden polygonalen Spiegel (X-Achse) und einem Galvanometer-Scanning-Spiegel (Y-Achse), der das Scannen der Videorate (30 Bilder pro Sekunde) ermöglichte. Detaillierte Informationen über die intravitalen Mikroskopie wurden in den vorherigen Studien10,18,19,20,21,22,23beschrieben.
In unserer vorherigen Inselstudie18haben wir die Inseln in lebenden Mäusen mit einem transgenen Mausmodell (MIP-GFP)24, in dem die Inseln mit GFP markiert wurden, erfolgreich und stabil abgebildet. Die Methode ermöglichte eine hochauflösende Visualisierung der Veränderungen in den Inseln über einen Zeitraum von 1 Woche. Es erleichterte auch die Bildgebung der gleichen Inseln für bis zu 3 Wochen, was auf die Machbarkeit von Langzeitstudien der Pankreasinseln für die funktionelle Verfolgung oder Überwachung während der Pathogenese von Diabetes mellitus18hindeutet. Des Weiteren entwickelten wir ein orthotopes Bauchspeicheldrüsenkrebsmodell, bei dem fluoreszierende Bauchspeicheldrüsenkrebszellen (PANC-1 NucLight Red)25 direkt in die Bauchspeicheldrüse der Maus implantiert wurden. Mit der Anwendung des pankreatischen intravitalen Bildgebungsfensters könnte dieses Modell als Plattform zur Untersuchung der zellulären und molekularen Pathophysiologie in der Tumormikroumgebung von Bauchspeicheldrüsenkrebs und zur therapeutischen Überwachung neuartiger Wirkstoffkandidaten genutzt werden.
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Protocol
Alle in diesem Artikel beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der8. Ausgabe des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (2011)26 durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee am Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) und dem Seoul National University Bundang Hospital (SNUBH) genehmigt.
1. Vorbereitung des Fensters und anderer Materialien
- Entwerfen Sie das intravitale Bildgebungsfenster der Bauchspeicheldrüse individuell, um die Bauchspeicheldrüse vom Darm in der Bauchhöhle abzuschöpfen18 (Abbildung 1A, B). Ein detaillierter Bauplan des Fensters ist in einer ergänzenden Abbildung einer früheren Studiebeschrieben 18.
- Verwenden Sie C57BL / 6N-Mäuse, 8-12 Wochen alte Männchen, für die intravitale Pankreasbildgebung. Injizieren Sie Anti-CD31-Antikörper, konjugiert mit einem Alexa 647-Fluorophor, 2 h vor der Bildgebung, zum Zwecke der Gefäßmarkierung18.
- Bereiten Sie für die Inselchenstudie ein transgenes Mausmodell vor, bei dem die Inseln mit einem fluoreszierenden Reporterprotein markiert werden. Hier verwendeten wir MIP-GFP, bei dem grün fluoreszierendes Protein unter der Kontrolle des Insulin-1-Genpromotors der Maus exprimiert wurde, der in den Betazellen aller Inseln der Maus aktiv ist24.
- Bereiten Sie für die Bauchspeicheldrüsenkrebsstudie transgene Krebszellen vor, die mit einem fluoreszierenden Reporterprotein und BALB / C-Nacktmäusen markiert sind. In dieser Studie wurden die PANC-1 NucLight Red-Zellen verwendet. PANC-1 Krebszellen25 wurden mit der NucLight Red Fluoreszenzsonde markiert.
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge, Deckglas (mit PEG oder nicht) und Bildfenster mit einem Autoklaven.
- Tragen Sie die PEG-Beschichtung auf das Deckglas auf, um Entzündungsreaktionen zu verhindern und die Biokompatibilität zu erhöhen, die für die Langzeitbildgebung geeignet ist.
2. Chirurgie
- Bereiten Sie eine sterile chirurgische Plattform vor und sterilisieren Sie die Oberflächen mit 70% Ethanol.
HINWEIS: Für longitudinale Bildgebungssitzungen ist eine aseptische Technik unerlässlich. - Anästhesie von Mäusen mit einer Mischung aus Tiletamin/Zolazepam (30 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg).
HINWEIS: Die Verwendung von Tiletamin / Zolazepam wird anstelle von Ketamin wegen seiner nachteiligen Wirkung von Hyperglykämie empfohlen. Optimale Anästhesie sollte für den Zweck des Experiments9,27ausgewählt werden. - Überwachen Sie die Körpertemperatur mit einer Rektalsonde mit einem homöothermisch gesteuerten Heizkissen.
- Rasieren Sie die linke Flanke der Maus und tragen Sie drei Runden abwechselnd Alkohol und Jod-basiertes Peeling auf.
HINWEIS: Wenn Enthaarungscreme verwendet wird, lassen Sie nicht länger als 1 Minute, um chemische Verbrennungen zu vermeiden. - Machen Sie einen 1,5 cm großen Schnitt an der linken Flanke der Maus und sezieren Sie Haut und Muskeln.
- Führen Sie eine Geldbörsen-Saitennäht mit einer schwarzen oder Nylon-4-0-Naht am Schnittrand durch.
- Verwenden Sie einen Mikroretraktor auf dem Schnitt und legen Sie die Milz vorsichtig frei.
- Die Milz vorsichtig mit einer Ringzette zusammenlegen und die Bauchspeicheldrüse identifizieren.
- Platzieren Sie das Fenster an der Flanke der Maus und führen Sie Milz und Bauchspeicheldrüse durch den offenen Raum des Fensters. Die Manipulation der Bauchspeicheldrüse muss sehr nichtjüdisch sein, da sie Blutungen oder Pankreatitis verursachen kann
- Legen Sie die Bauchspeicheldrüse vorsichtig auf die Platte des Bildfensters; Die Milz wird auf den offenen Raum des Fensters gelegt.
- Für die Krebszellstudie injizieren Sie PANC-1 NucLight Red (1,0 x10 6 Zellen) direkt in die Bauchspeicheldrüse.
HINWEIS: Für die Bildgebung der orthotopen humanen Bauchspeicheldrüsenkrebs-Xenotransplantate könnte die direkte Implantation von Krebszellen wie PANC-1 oder anderen menschlichen Bauchspeicheldrüsenkrebszellen erleichtert werden28. Zur Visualisierung mit intravitaler Fluoreszenzmikroskopie wurden PANC-1-Zellen mit rot fluoreszierendem Protein unter Verwendung des linsiviralen Reagenziens NucLight Red transduziert, das den Kern29markiert. Obwohl das maximale Injektionsvolumen unsicher ist, verringern Sie das Volumen so gut wie möglich, um den Druckeffekt in der Bauchspeicheldrüse zu vermeiden. - Tragen Sie Tropfen N-Butylcyanoacrylatkleber auf den Rand des Bildfensters auf.
- Um die Menge des aufgetragenen Klebstoffs zu minimieren, verwenden Sie eine 31 G Katheternadel für die Anwendung. Wenn die Menge des Tropfens groß ist, haftet das Gewebe unbeabsichtigt am Fenster oder Deckglas.
- Tragen Sie vorsichtig ein 12 mm rundes Deckglas auf den Rand des Bildfensters auf.
- Ziehen Sie die Nahtschlaufe, um in die seitliche Nut des Fensters zu passen, und binden Sie sie dreimal.
- Schneiden Sie die maximale proximale Stelle des Knotens ab, um die Unterbrechung enger Stiche zu verhindern, wenn diese Mäuse wach sind.
- Lassen Sie Mäuse sich von der Anästhesie erholen (2-3 Stunden) und injizieren Sie Ketoprofen (5 mg / kg, subkutan in die lose Haut an der Basis des Halses oder der Hüfte des Tieres) zur Schmerzlinderung. Neubewertung auf Anzeichen von Schmerzen alle 12 Stunden und Ketoprofen sollte alle 24 Stunden für 1-3 Tage in Betracht gezogen werden.
HINWEIS: Analgesie beeinflusst die Insulinsekretion als Reaktion auf Glukose9. Die Wahl und der Zeitpunkt der Analgesie müssen für den experimentellen Zweck individualisiert werden. - Unterbringung der Maus im Käfig mit ausreichender Einstreu, um den Kontakt des Fensters zum Käfig zu vermeiden. Vermeiden Sie es, das Haus mit den Mäusen ohne die Fensteroperation zu beherbergen.
3. Intravitalen Bildgebung
- Schalten Sie das Intravitalenmikroskop einschließlich der Laserleistung ein.
- Schalten Sie das Heizkissen ein und stellen Sie die homöotherme Regelung auf 37 °C ein.
HINWEIS: Alternativ können Sie ein passives Heizkissen oder eine Lampe mit häufiger Steuerung verwenden, wenn keine homöotherme Regelung vorhanden ist. - Führen Sie eine intramuskuläre Anästhesie mit einer Mischung aus Tiletamin/Zolazepam (30 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) durch.
HINWEIS: Die Verwendung von Tiletamin / Zolazepam wird anstelle von Ketamin wegen seiner nachteiligen Wirkung von Hyperglykämie empfohlen. Optimale Anästhesie sollte für den Zweck der Experimente9,27ausgewählt werden. - Führen Sie einen Gefäßkatheter für die Injektion ein.
- Drücken Sie mit dem Zeigefinger und dem dritten Finger als Alternative zu einer Tourniquet-Anwendung auf die proximale Seite des Schwanzes. Erhitzen Sie den Schwanz bei Bedarf mit einer Lampe.
- Sterilisieren Sie die Schwanzvene mit einem 70% Ethanolspray.
- Führen Sie einen 30 G Katheter in die seitliche Schwanzvene ein. Das Aufstoßen des Blutes wird in der PE10-Röhre visualisiert.
- Tragen Sie ein Seidenband auf den Katheter auf, um ihn zu stabilisieren.
- Injizieren Sie FITC/TMR-Dextran oder andere fluoreszierende Sonden (25 μg Anti-CD31 konjugiert mit Alexa 647), je nach Bedarf, entsprechend der Kombination der fluoreszierenden Sonden18.
HINWEIS: Für fluoreszierende konjugierte Antikörpersonden 2 h vor der Bildgebungssitzung injizieren.
- Übertragen Sie die Maus von der operationsigen Plattform in die bildgebungsgebende Phase.
- Setzen Sie eine Rektalsonde ein, um die Körpertemperatur mit dem homöothermischen Heizkissensystem automatisch zu steuern.
- Setzen Sie das Pankreasbildfenster in den Fensterhalter ein, der während der IntravitalenMikroskopie vorbereitet wurde (Abbildung 2). Für ein invertiertes Mikroskop ist möglicherweise kein Fensterhalter erforderlich.
- Führen Sie eine intravitalen Bildgebung durch.
- Für die Abbildung der Bauchspeicheldrüse beginnen Sie mit einer Objektivlinse mit niedriger Vergrößerung (z. B. 4x), um die gesamte Ansicht der Bauchspeicheldrüse im Pankreasbildfenster zu scannen (empfohlenes Sichtfeld: 2500 x 2500 μm).
- Nach der Bestimmung des interessierenden Bereichs wechseln Sie zu einem Objektiv mit höherer Vergrößerung (20x oder 40x), um die Bildgebung auf zellulärer Ebene durchzuführen (empfohlenes Sichtfeld: 500 x 500 μm oder 250 x 250 μm). In diesem Experiment betrug die laterale und axiale Auflösung etwa 0,5 μm bzw. 3 μm.
- Führen Sie Z-Stack- oder Zeitrafferbilder durch, um die 3D-Struktur oder die Dynamik auf zellulärer Ebene, wie z. B. die Zellmigration, zu beobachten.
HINWEIS: Für die Bildgebung der fluoreszierenden Protein-exprimierenden Zellen transgener Tiere (MIP-GFP) waren 30 s intermittierende 488 nm Laserbelichtung mit einer Leistung von bis zu 0,43 mW ohne merkliche Photobleachung oder Gewebeschädigung tolerierbar. Für die Abbildung der mit Alexa 647 markierten fluoreszierenden Proteine war die 640 nm Laserleistung bis 0,17 mW ohne merkliche Photobleaching oder Gewebeschädigung tolerierbar. Eine längere Erregungslaserbelichtung mit einer Leistung oberhalb dieser Einstellung kann zu Photobleaching oder Gewebeschäden durch Phototoxizität führen. Passen Sie die angemessene Verstärkung und Leistung an, um den interessierenden Bereich angemessen abbilden zu können. Die detaillierte Einstellung der Parameter in der Intravitalmikroskopie muss für jede im Institut erstellte Intravitalenmikroskopie individualisiert werden.
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Representative Results
Die Intravitalenmikroskopie in Kombination mit dem unterstützenden Basen-integrierten pankreasinen intravitalen Bildgebungsfenster ermöglicht die longitudinale zelluläre Bildgebung der Bauchspeicheldrüse in einer Maus. Dieses Protokoll mit dem intravitalen Bildgebungsfenster der Bauchspeicheldrüse bietet eine langfristige Gewebestabilität, die die Erfassung einer hochauflösenden Bildgebung ermöglicht, um einzelne Inseln für bis zu 3 Wochen zu verfolgen. Dadurch können Mosaikbilder für ein erweitertes Sichtfeld, dreidimensionale (3D) Rekonstruktion der Z-Stack-Bildgebung und Längsverfolgung der gleichen Position erreicht werden. Darüber hinaus bietet unsere intravitalen Mikroskopie vier Erfassungskanäle (405, 488, 561 und 647 nm), die eine gleichzeitige Visualisierung mehrerer Zellen mit ihren Wechselwirkungen ermöglichen.
Für die vorläufige Bildgebung wurde das Fenster in eine C57BL/6N-Maus mit intravenös injiziertem Anti-CD31-Antikörper implantiert, der mit einem Alexa 647-Fluorophor konjugiert ist. Die Großflächige Bildgebung (Abbildung 3A) und die vergrößerte 3D-Bildgebung (Abbildung 3B-D, Ergänzendes Video 1) der Bauchspeicheldrüse wurden mit diesem System erleichtert. Pankreasgewebe wurde mit Autofluoreszenz visualisiert und das benachbarte Gefäßsystem, das mit dem Anti-CD31-Antikörper markiert war, identifiziert. Schwingungen aufgrund von Peristaltik oder Atmung wurden nicht identifiziert, was zu einer gemittelten Bildgebung mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis führte (Abbildung 4). Acinarzellen, die eine Visualisierung mit mikroskaliger Auflösung in der Bauchspeicheldrüse erfordern, wurden in den gemittelten Bildern deutlich visualisiert.
Für die Bildgebung der Inseln wurde eine MIP-GFP-Maus verwendet. Mit dem Mosaik-Bildgebungsverfahren ermöglichte eine Weitfeldansicht mit hochauflösender Bildgebung die Visualisierung der Inseln mit dem angrenzenden Gefäßsystem (Abbildung 5). Ungefähr 40-50 Inseln wurden in der Weitfeldansicht identifiziert. Diese stabile bildgebende Methode könnte die Verfolgung der Inseln für bis zu 3 Wochen weiter erleichtern, wie in einer früheren Studie (Abbildung 6)18gezeigt.
Für die Bildgebung von Krebszellen wurden PANC-1 NucLight Red-Zellen während der Operation direkt in die Bauchspeicheldrüse der Maus implantiert (Abbildung 7). Es wurde eine Dual-Labeling-Strategie verwendet, die aus PANC-1 NucLight Red-Zellen und nahe gelegenen Gefäßen bestand, die mit Anti-CD31 gefärbt waren, die mit Alexa 647 konjugiert waren. Mit unserem Protokoll wurde eine Weitfeldbildgebung von Bauchspeicheldrüsenkrebs (Abbildung 7A), die den Rand des Tumors abgrenzt, und eine hochauflösende 3D-Bildgebung auf Einzelzellebene erreicht (Abbildung 7B-D, Ergänzendes Video 2).
Abbildung 1: Design und Foto des intravitalen Bildgebungsfensters der Bauchspeicheldrüse. (A) Eine 3D- und Querschnittsansicht des intravitalen Bildgebungsfensters der Bauchspeicheldrüse. Ein detaillierter Bauplan der Größe und des Durchmessers ist in der vorherigen Arbeit18beschrieben. (B) Vorderes und hinteres Foto des Pankreas-Bildgebungsfensters. Copyright 2020 Korean Diabetes Association von Diabetes Metab J. 2020 44: 1: 193-198. Nachdruck mit Genehmigung der Korean Diabetes Association. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Foto der Implementierung des intravitalen Bildgebungsfensters der Bauchspeicheldrüse. Ein pankreasinales intravitasales Bildgebungsfenster wird in der Maus im XYZ-Translationsstadium implantiert und der an der Kipphalterung befestigte Bildgebungskammerhalter wird mit dem Pankreasbildgebungsfenster verbunden. Copyright 2020 Korean Diabetes Association von Diabetes Metab J. 2020 44: 1: 193-198. Nachdruck mit Genehmigung der Korean Diabetes Association. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative intravitale Pankreasbildgebung bei C57BL/6N-Maus. (A) Weitbereichsbild und (B) vergrößertes 3D-Bild der Bauchspeicheldrüse (grün) und ihrer Mikrovaskulatur (rot) in der C57BL/6N-Maus. Gefäße werden mit einem Anti-CD31-Antikörper markiert, der mit dem Alexa 647-Fluorophor konjugiert ist. (C) 3D rekonstruiertes Bild und (D) Oberflächen-Rendering-Bild der Maus-Bauchspeicheldrüse. Maßstabsbalken: 200 μm (A) und 50 μm (B-D). Siehe auch Ergänzendes Video 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Intravitalen Bildgebung von Acinarzellen und benachbarten Gefäßen. Acinarzellen (grün) und angrenzende Gefäße (rot) in der C57BL/6N-Maus. Gefäße sind mit Anti-CD31-Antikörpern markiert, die mit dem Alexa 647-Fluorophor konjugiert sind. Die Gewebestabilität, die mit dem Pankreas-Bildgebungsfenster erreicht wird, liefert ein Bild mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis. Maßstabsleiste: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative intravitale Bildgebung von Pankreasinseln in der MIP-GFP-Maus. Großflächiges Mosaik und vergrößertes Bild der Inseln (grün) und angrenzenden Gefäße (rot), die mit maximaler Intensitätsprojektionsmethode in der Bauchspeicheldrüse der MIP-GFP-Maus verarbeitet werden. Gefäße werden mit einem Anti-CD31-Antikörper markiert, der mit dem Alexa 647-Fluorophor konjugiert ist. Maßstabsleiste: 500 μm (großer Bereich) und 50 μm (vergrößert). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Longitudinale intravitale Bildgebung von Inselchen in der Bauchspeicheldrüse der MIP-GFP-Maus. Längsbild der Inseln für bis zu 3 Wochen in der Bauchspeicheldrüse bei der MIP-GFP-Maus. Jede Pfeilspitze mit unterschiedlichen Farben zeigt die gleichen Inseln an. Maßstabsleiste: 100 μm. Copyright 2020 Korean Diabetes Association von Diabetes Metab J. 2020 44: 1: 193-198. Nachdruck mit Genehmigung der Korean Diabetes Association. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Repräsentative intravitale Bildgebung des Bauchspeicheldrüsenkrebsmodells. (A) Weitbereichsbild und (B) vergrößertes 3D-Bild der implantierten PANC-1 NucLight Red-Zellen (rot) in der BALB/c Nude Maus. Gefäße (blau) sind mit einem Anti-CD31-Antikörper gekennzeichnet, der mit dem Alexa 647-Fluorophor konjugiert ist. (C) 3D rekonstruiertes Bild und (D) oberflächenrenderndes Bild von Bauchspeicheldrüsenkrebs im Mausmodell. Maßstabsbalken: 500 μm (A) und 50 μm (B-D). Siehe auch Ergänzendes Video 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzendes Video 1: In vivo 3D Pankreasbildgebung in C57BL/6N Maus. In vivo 3D-Bildgebung der Bauchspeicheldrüse (grün) der C57BL/6N-Maus intravenös injiziert mit einem Anti-CD31-Antikörper, der mit dem Alexa 647-Fluorophor (rot) konjugiert ist. Die Maßstabsleiste ist im Video dargestellt. Dieses Video entspricht Abbildung 3C,D. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzendes Video 2: In vivo 3D Bauchspeicheldrüsenkrebs (PANC-1 NucLight Red) Bildgebung in BALB/C Nude Maus. In vivo 3D-Bildgebung von Bauchspeicheldrüsenkrebs (rot) implantiert in BALB/C Nude Maus intravenös injiziert mit einem Anti-CD31-Antikörper, der mit dem Alexa 647 Fluorophor (blau) konjugiert ist. Die Maßstabsleiste ist im Video dargestellt. Dieses Video entspricht Abbildung 7C,D. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll besteht aus der intravitalen Bildgebung der Bauchspeicheldrüse unter Verwendung eines neuartigen unterstützenden integrierten pankreatischen intravitalen Bildgebungsfensters, das von einem abdominalen Bildgebungsfenster modifiziert wurde. Unter den oben beschriebenen Protokollen ist der erste kritische Schritt die Implantation des intravitalen Pankreas-Bildgebungsfensters in die Maus. Für das Auftragen des Klebstoffs im Fenster ist es wichtig, den Kleber zwischen dem Rand des Fensters und dem Deckglas aufzutragen, jedoch nicht auf das Pankreasgewebe, da dies die intravitalen Bildgebung erheblich unterbrechen kann. Nicht nur der Kleber selbst zwischen Glas und Gewebe, sondern auch zusatzartige Staubpartikel können bei der Bildgebung Eine Lichtstreuung induzieren, wenn der Kleber direkt auf das Gewebe aufgetragen wird. Darüber hinaus kann das Auftragen des Klebstoffs toxische und nicht physiologische Auswirkungen auf die Bauchspeicheldrüse haben.
Der zweite Schritt ist die Menge an Pankreasgewebe, die auf die metallunterstützende Grundplatte gelegt wird. Da das Pankreasgewebe eine blattartige Struktur ist, muss das Volumen des Pankreasgewebes auf der Platte kontrolliert werden. Wenn ein zu großes Volumen auf die Platte gelegt wird, kann der am Rand des Rings aufgetragene Klebstoff am Gewebe haften, und der Masseneffekt kann die Durchblutung der Bauchspeicheldrüse behindern. Auf der anderen Seite, wenn ein zu kleines Volumen darauf gelegt wird, kann das Sichtfeld, das visualisiert werden kann, begrenzt sein. Dieses Protokoll der Operation am Fenster kann mehrere Studien erfordern, um einen einheitlichen Standard zu erfüllen.
Bei der Langzeitbildgebung über einen Zeitraum von 3 Wochen war das besorgniserregendste Problem eine mögliche Schädigung des Pankreas-Bildgebungsfensters. Während des Langzeitbeobachtungszeitraums kann es zu einer unbeabsichtigten Zerstörung des Deckglases im Pankreas-Bildgebungsfenster kommen. Um dies zu verhindern, muss die Maus mit dem Fenster separat untergebracht werden, und harte Gegenstände mit scharfen Kanten sollten aus dem Käfig entfernt werden. Die Euthanasie von Mäusen sollte in Betracht gezogen werden, wenn das Deckglas bricht, wenn es in der Nähe des Fensters schwere Anzeichen einer Entzündung gibt oder wenn das Tier in Not zu sein scheint. Nach unserer Erfahrung konnten Mäuse mit dem Pankreas-Bildgebungsfenster normal essen und trainieren, wenn die Genesung nach der Operation angemessen war und keine andere Komplikation entwickelt wurde.
In unseren bisherigen Erfahrungen mit dem abdominalen Bildgebungsfenster haben wir es versäumt, qualitativ hochwertige Bildgebung auf zellulärer Ebene sowie eine longitudinale Verfolgung derselben Flecken über mehrere Tage hinweg zu erfassen. Im Vergleich zum abdominalen Bildgebungsfenster, das eine vielfältige Plattform für verschiedene Bauchorgane bietet, ist das Pankreasbildgebungsfenster für die Bildgebung der Bauchspeicheldrüse sowie anderer Organe, die weich sind und leicht durch Bewegungen wie Mesenterie, Milz und Dünndarm beeinflusst werden können, spezifiziert. Leber und Niere können jedoch aufgrund des begrenzten Platzes im Pankreas-Bildgebungsfenster nicht durchführbar sein.
Während die Kombination aus fluoreszierender Maus, Zellen und Antikörpersonden die Visualisierung der dynamischen Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen und entweder den Inseln oder Krebszellen ermöglicht, könnte das hier beschriebene Protokoll mit anderen Zusammensetzungen von fluoreszierend markierten Zellen oder molekularen Sonden reproduziert werden, die für den jeweiligen Zustand geeignet sind. Darüber hinaus werden umfangreiche Anwendungen erwartet, die in unsere Methode integriert sind, wie die CpepSfGFP-Reportermaus mit Insulinsekretion9,30, AAV8-vermittelter Genabgabe, die auf reaktive Sauerstoffspezies (ROS)31abzielt , oder orthotopisches Tumormodell32,33,34, bei dem der Tumor in situ die Tumormikroumgebung einschließlich Tumorgenese, Entwicklung und Metastasierung vollständig stimulieren kann35. Darüber hinaus können auch patientenbezogene Xenograft-Modelle mit unserer Plattform36untersucht werden.
Es gibt einige Einschränkungen, die in dieser Studie angesprochen werden müssen. Erstens, selbst wenn wir die Metallbasis zur Stabilisierung verwendeten, konnten wir die mechanische Belastung des Gewebes durch die Basis und das Deckglas nicht bestimmen, was den Blutfluss beeinflussen könnte. Wie in den obigen Abbildungen dargestellt, markierte die intravenöse Injektion eines fluoreszenzkonjugierten Antikörpers (CD31) oder Dextrans das Gefäß jedoch ausreichend ohne unterscheidbaren, nicht durchbluteten Bereich, was auf einen minimalen Einfluss mechanischer Belastung auf den normalen Blutfluss im Pankreasgewebe hindeutet. Zweitens konnten Nebenwirkungen aufgrund des Klebstoffs im Pankreasgewebe nicht beurteilt werden. Dennoch haben wir versucht, das Berühren der Bauchspeicheldrüse mit Klebstoffen so sorgfältig wie möglich zu vermeiden, um zusätzliche Effekte zu vermeiden. Drittens, wie oben diskutiert, kann die unbeabsichtigte Wirkung von Anästhetika die Insulinsensitivität und -sekretion beeinflussen, wie in der vorherigen Studie9,27beschrieben . Nach unserer Erfahrung induzierte eine Mischung aus Ketamin und Xylazin Hyperglykämie im Vergleich zu der Mischung von Tiletamin, Zolazepam und Xylazin. Eine weitere Studie, die die Wirkung der Anästhesie auf die Insulinsekretion untersucht, sollte durchgeführt werden, und die richtige Anästhesie mit minimalen Nebenwirkungen sollte nach jedem Experiment ausgewählt werden. Viertens konzentriert sich die Bildgebung der Bauchspeicheldrüse auf den Schwanzteil, und die Bildgebung des Kopfteils der Bauchspeicheldrüse könnte mit unserem Fenster eingeschränkt sein.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine stabilisierte longitudinale Bildgebung der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene über bis zu mehrere Wochen durch unser Bildgebungssystem ermöglicht wurde, das in das für die in vivo Pankreas-Bildgebungsfenster optimierte intravitastische Bildgebungsfenster integriert ist. Da die intravitalen Bildgebung dynamische Einblicke in die Zellbiologie, Immunologie und Tumorbiologie bietet, könnte dieses Protokoll eine nützliche Methode zur Untersuchung der Pathophysiologie verschiedener Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch den Zuschuss Nr. 14-2020-002 des SNUBH Research Fund und durch den von der koreanischen Regierung (MSIT) finanzierten Zuschuss der National Research Foundation of Korea (NRF) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window - custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder - custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
References
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