Summary
Визуализация поджелудочной железы in vivo с высоким разрешением облегчалась с помощью окна приживитой визуализации поджелудочной железы.
Abstract
Прямая визуализация поджелудочной железы с клеточным разрешением in vivo в живой модели мелкого животного была технически сложной. Недавнее исследование прижизальной визуализации с окном абдоминальной визуализации позволило визуализировать клеточную динамику в органах брюшной полости in vivo. Однако из-за мягкой листовой архитектуры поджелудочной железы мыши, на которую можно легко повлиять физиологическим движением (например, перистальтикой и дыханием), было трудно выполнять стабилизированную продольную визуализацию in vivo в течение нескольких недель на клеточном уровне для идентификации, отслеживания и количественной оценки островков или раковых клеток в поджелудочной железе мыши. Здесь мы описываем способ имплантации нового поддерживающего основания, интегрированного окна прижизной визуализации поджелудочной железы, которое может пространственно отделять поджелудочную железу от кишечника для продольной покадровой прижизной визуализации микроструктуры поджелудочной железы. Продольная визуализация in vivo с окном визуализации обеспечивает стабильную визуализацию, позволяющую отслеживать островки в течение 3 недель и трехмерную визуализацию микроструктуры с высоким разрешением, о чем свидетельствует ортотопическая модель рака поджелудочной железы. С помощью нашего метода дальнейшие исследования прижизневой визуализации могут прояснить патофизиологию различных заболеваний, связанных с поджелудочной железой на клеточном уровне.
Introduction
Поджелудочная железа является брюшным органом с экзокринным органом в пищеварительном тракте и эндокринной функцией секретирования гормонов в кровоток. Клеточная визуализация поджелудочной железы с высоким разрешением может выявить патофизиологию различных заболеваний, связанных с поджелудочной железой, включая панкреатит, рак поджелудочной железы и сахарный диабет1. Обычные диагностические инструменты визуализации, такие как компьютерная томография, визуализация магнитного разрешения и ультрасонография, широко доступны в клиническойобласти 1,2. Однако эти методы визуализации ограничены визуализацией только структурных или анатомических изменений, в то время как изменения на клеточном или молекулярном уровне не могут быть определены. Учитывая, что молекулярные изменения при сахарном диабете или раке поджелудочной железы у человека могут инициироваться более чем за 10 лет до постановки диагноза3,4,выявление заболеваний поджелудочной железы от их молекулярного перехода в латентный период имеет потенциал для обеспечения ранней диагностики и своевременного вмешательства. Таким образом, визуализация, которая преодолеет ограничения разрешения и даст ценную информацию о функции, замечательно привлекает внимание, обеспечивая раннюю диагностику рака поджелудочной железы или расширенную идентификацию изменения островков во время прогрессирования сахарного диабета5.
В частности, с островками, ядерная визуализация, биолюминесцентная визуализация и оптическая когерентная томография были предложены в качестве неинвазивных методов визуализации островков6. Однако разрешение этих методов существенно низкое, с типичными значениями в диапазоне от нескольких десятков до сотен микрометров, что предлагает ограниченную способность обнаруживать изменения на клеточном уровне в островках. С другой стороны, предыдущие исследования островков с высоким разрешением проводились при ex vivo7,8 (например, нарезка или переваривание поджелудочной железы), нефизиологических9 (например, экстериоризация поджелудочной железы) и гетеротопных состояниях10,11,12 (например, имплантация под почечную капсулу, внутри печени и в передней камере глаза), что ограничивает их интерпретацию и клинические последствия. Если in vivo,физиологическая и ортотопическая модель визуализации высокого разрешения может быть установлена, это станет критической платформой для исследования островков поджелудочной железы.
Прижизальная визуализация, которая выявляет патофизиологию на уровне микроскопического разрешения у живого животного, недавно получила большое внимание13. Из методов визуализации in vivo разработка окна абдоминальной визуализации14,которое имплантирует окно в брюшную полость мыши, позволила обнаружить новые результаты (т.е. стадию премикрометастаза раннего метастазирования в печени15 и механизм поддержания стволовых клеток в кишечном эпителии16). Хотя окно абдоминальной визуализации дает ценные результаты, применение этого окна для поджелудочной железы и результирующее исследование прижизальной визуализации, основанное на заболеваниях, связанных с поджелудочной железой, не были широко исследованы.
В отличие от четко определенных характеристик твердых органов поджелудочной железы человека, поджелудочная железа мыши представляет собой диффузно распределенную мягкую тканевую структуру17. Поэтому на него постоянно влияют физиологические движения, включая перистальтику и дыхание. Предыдущее исследование по применению окна абдоминальной визуализации для поджелудочной железы показало, что блуждание происходило из-за артефактов движения, вызванных дефекациями18. В полученном усредненном изображении наблюдалось сильное размытие, что затрудняло визуализацию и идентификацию микромасштабных структур.
Здесь мы описываем использование нового вспомогательного базового интегрированного окна визуализации прижизной поджелудочной железы в сочетании с прижизальной микроскопией19,20 для исследования событий продольного клеточного уровня при заболеваниях, связанных с поджелудочной железой. В дополнение к подробному описанию методологии в предыдущем исследовании18,расширенное применение окна визуализации поджелудочной железы для различных заболеваний, связанных с поджелудочной железой, будет рассмотрено в этой статье. В этом протоколе в качестве системы прижизностной микроскопии использовалась специально разработанная система лазерного сканирования с частотой видеоснабжений. В качестве источника возбуждения использовались четыре лазерных модуля (длины волн 405, 488, 561 и 640 нм), а четыре канала сигналов излучения были обнаружены фотоумноживательными трубками (PMT) через полосовые фильтры (BPF1: FF01-442/46; БНФ2: ФФ02-525/50; БНФ3: FF01-600/37; БНФ4: FF01-685/40). Лазерное сканирование состояло из вращающегося полигонального зеркала (ось X) и сканирующего зеркала гальванометра (ось Y), что позволяло сканировать видео со скоростью (30 кадров в секунду). Подробная информация о прижизальной микроскопии была описана в предыдущих исследованиях10,18,19,20,21,22,23.
В нашем предыдущем исследованииостровков 18мы успешно и стабильно визуализировали островки у живых мышей, используя трансгенную модель мыши (MIP-GFP)24, в которой островки были помечены GFP. Метод позволил визуализировать изменения в островках с высоким разрешением в течение 1 недели. Это также облегчило визуализацию одних и тех же островков в течение 3 недель, что говорит о целесообразности долгосрочных исследований островков поджелудочной железы для функционального отслеживания или мониторинга во время патогенеза сахарного диабета18. Кроме того, мы разработали ортотопическую модель рака поджелудочной железы, в которой флуоресцентные раковые клетки поджелудочной железы (PANC-1 NucLight Red)25 были непосредственно имплантированы в поджелудочную железу мыши. С применением окна прижизной визуализации поджелудочной железы эта модель может быть использована в качестве платформы для исследования клеточной и молекулярной патофизиологии в микроокружении опухоли рака поджелудочной железы и для терапевтического мониторинга новых кандидатов на лекарства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, описанные в настоящем документе, были проведены в соответствии с8-м изданием Руководства по уходу и использованию лабораторных животных (2011)26 и одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных при Корейском передовом институте науки и техники (KAIST) и больнице Бундан Сеульского национального университета (SNUBH).
1. Подготовка окна и других материалов
- Индивидуальная конструкция окна визуализации прижизненной полости поджелудочной железы для изоляции поджелудочной железы от кишечника в брюшной полости18 (Рисунок 1A,B). Подробный чертеж окна описан в дополнительном рисунке предыдущего исследования18.
- Используйте мышей C57BL/6N, 8-12-недельных самцов, для прижизненно-поджелудочной железы. Вводят антитело против CD31, конъюгированное с флуорофором Alexa 647, за 2 ч до визуализации, с целью маркировки сосудов18.
- Для исследования островков подготовьте трансгенную модель мыши, в которой островки помечены флуоресцентным репортерным белком. Здесь мы использовали MIP-GFP, где зеленый флуоресцентный белок экспрессировался под контролем промотора гена инсулина 1 мыши, который активен в бета-клетках всех островков у мыши24.
- Для исследования рака поджелудочной железы подготовьте трансгенные раковые клетки, помеченные флуоресцентным репортерным белком и обнаженными мышами BALB / C. В этом исследовании использовались красные клетки PANC-1 NucLight. Раковые клетки PANC-125 были помечены флуоресцентным зондом NucLight Red.
- Стерилизуйте все хирургические инструменты, накройте стекло (с ПЭГ или нет) и визуализируйте окна с помощью автоклава.
- Нанесите покрытие PEG на покровное стекло для предотвращения воспалительной реакции и повышения биосовместимости, что подходит для долгосрочной визуализации.
2. Хирургия
- Подготовьте стерильную хирургическую платформу и стерилизуйте поверхности 70% этанолом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сеансов продольной визуализации необходим асептический метод. - Обезболивать мышей смесью тиетамина/золазепама (30 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать тиетамин/золазепам вместо кетамина из-за его неблагоприятного эффекта гипергликемии. Оптимальная анестезия должна быть подобрана с целью проведения эксперимента9,27. - Контролируйте температуру тела с помощью ректального зонда с гомеотермически управляемой грелкой.
- Побрейте левый бок мыши и нанесите три раунда чередующегося скраба на спиртовой и йодной основе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется крем для депиляции, не оставляйте дольше 1 минуты, чтобы избежать химического ожога. - Сделайте разрез 1,5 см на левом боку мыши и рассекли кожу и мышцы.
- Выполните пушок-струнный шов черным или нейлоновым швом 4-0 в разрезе разреза.
- Используйте микровтягивающий разрез на разрезе и осторожно обнажите селезенку.
- Тщательно усойте селезенку кольцевыми щипцами и определите поджелудочную железу.
- Поместите окно по бокам мыши и пропустите селезенку и поджелудочную железу через открытое пространство окна. Манипуляции с поджелудочной железой должны быть очень нееврейными, так как это может вызвать кровотечение или панкреатит.
- Аккуратно поместите поджелудочную железу на пластину окна визуализации; селезенка будет размещена на открытом пространстве окна.
- Для исследования раковых клеток вводят PANC-1 NucLight Red (1,0 х 106 клеток) непосредственно в поджелудочную железу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации ортотопических ксенотрансплантатов рака поджелудочной железы человека может быть облегчена прямая имплантация раковой клетки, такой как PANC-1 или другая раковая клетка поджелудочной железычеловека28. Для визуализации с помощью приживитой флуоресцентной микроскопии клетки PANC-1 трансдуцировали красным флуоресцентным белком с использованием лентивирусного реагента NucLight Red, который маркирует ядро29. Хотя максимальный объем инъекции неопределен, уменьшите объем как можно больше, чтобы избежать эффекта давления в поджелудочной железе. - Нанесите капли N-бутилцианоакрилатного клея на край окна визуализации.
- Чтобы свести к минимуму количество наносимого клея, используйте для нанесения иглу катетера 31 г. Если количество капли большое, то ткань будет непреднамеренно прилипать к окну или закрывать стекло.
- Аккуратно нанесите 12-миллиметровую круглую крышку на край окна для визуализации.
- Потяните шовную петлю, чтобы она вписалась в боковую канавку окна и завяжите ее три раза.
- Разрежьте максимально проксимальный участок узла, чтобы предотвратить прерывание плотных швов, когда эти мыши бодрствуют.
- Дайте мышам восстановиться после анестезии (2-3 часа) и вводят кетопрофен (5 мг/кг, подкожно в дряблую кожу у основания шеи или бедра животного) для облегчения боли. Переоценивайте признаки боли каждые 12 часов, а кетопрофен следует рассматривать каждые 24 часа в течение 1-3 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анальгезия влияет на секрецию инсулина в ответ на глюкозу9. Выбор и сроки обезболивания должны быть индивидуализированы для экспериментальных целей. - Разместите мышь в клетке с достаточным количеством подстилки, чтобы избежать контакта окна с клеткой. Избегайте размещения дома с мышами без операции на окне.
3. Приживитая визуализация
- Включите приживитый микроскоп, включая мощность лазера.
- Включите грелку и установите гомеотермическую регулировку на 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы используйте пассивную грелку или лампу с частым контролем, если нет гомеотермического регулирования. - Выполняют внутримышечную анестезию смесью тилитамина/золазепама (30 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать тиетамин/золазепам вместо кетамина из-за его неблагоприятного эффекта гипергликемии. Оптимальная анестезия должна быть подобрана с целью проведения экспериментов9,27. - Вставьте сосудистый катетер для инъекции.
- Надавите на проксимальную сторону хвоста указательным и третьим пальцем в качестве альтернативы наложению жгута. При необходимости нагреть хвост лампой.
- Стерилизуйте хвостовую вену с помощью 70% этанолового спрея.
- Вставьте катетер 30 г в боковую хвостовую вену. Регургитация крови будет визуализироваться в трубке PE10.
- Нанесите шелковую ленту на катетер, чтобы стабилизировать его.
- Впрыскивайте декстран FITC/TMR или другие флуоресцентные зонды (25 мкг анти-CD31, сопряженного с Alexa 647), в зависимости от обстоятельств, в соответствии с комбинацией флуоресцентных зондов18.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для флуоресцентных конъюгированных датчиков антител вводите за 2 ч до сеанса визуализации.
- Перенесите мышь с хирургической платформы на стадию визуализации.
- Вставьте ректальный зонд для автоматического контроля температуры тела с помощью системы гомеотермических грелок.
- Вставьте окно визуализации поджелудочной железы в оконный держатель, подготовленный во время установки приживитой микроскопии(рисунок 2). Для инвертированного микроскопа держатель окна может не потребоваться.
- Выполните приживитую визуализацию.
- Для визуализации поджелудочной железы начните с объектива с низким увеличением (например, 4x) для сканирования всего вида поджелудочной железы в окне визуализации поджелудочной железы (рекомендуемое поле зрения: 2500 x 2500 мкм).
- После определения интересуемой области переключитесь на объектив с более высоким увеличением (20x или 40x) для выполнения визуализации на клеточном уровне (рекомендуемое поле зрения: 500 x 500 мкм или 250 x 250 мкм). В этом эксперименте боковое и осевое разрешение составляли примерно 0,5 мкм и 3 мкм соответственно.
- Выполняйте z-стек или покадровую визуализацию для наблюдения за 3D-структурой или динамикой на клеточном уровне, такой как миграция клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации флуоресцентных белковых экспрессивных клеток трансгенных животных (MIP-GFP) 30 с прерывистого лазерного воздействия 488 нм мощностью до 0,43 мВт было переносимо без заметного фотоотбеливания или повреждения тканей. Для визуализации флуоресцентных белков, помеченных Alexa 647, лазер мощностью 640 нм до 0,17 мВт был терпимым без заметного фотоотбеливания или повреждения тканей. Длительное воздействие лазера возбуждения с мощностью выше этой настройки может привести к фотоотбеливанию или повреждению тканей фототоксичностью. Отрегулируйте достаточный коэффициент усиления и мощности, чтобы соответствующим образом представить интересуемую область. Детальная настройка параметров при прижизальной микроскопии должна быть индивидуализирована для каждой приживитой микроскопии, подготовленной в институте.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Приживитая микроскопия в сочетании с поддерживающей базой, интегрированной в окно прижизной визуализации поджелудочной железы, позволяет получать продольную визуализацию поджелудочной железы на клеточном уровне у мыши. Этот протокол с окном прижизной визуализации поджелудочной железы обеспечивает долгосрочную стабильность тканей, что позволяет получать изображения с высоким разрешением для отслеживания отдельных островков в течение 3 недель. В результате может быть достигнута мозаичная визуализация для расширенного поля зрения, трехмерная (3D) реконструкция z-стековой визуализации и продольное отслеживание одного и того же положения. Кроме того, наша приживитая микроскопия обеспечивает четыре канала (405, 488, 561 и 647 нм) сбора, что позволяет одновременно визуализировать несколько клеток с их взаимодействиями.
Для предварительной визуализации окно имплантировали мыши C57BL/6N с внутривенно введенным антителом анти-CD31, конъюгированной с флуорофором Alexa 647. Широкополустная визуализация(рисунок 3A)и увеличенная 3D-визуализация(рисунок 3B-D,дополнительное видео 1)поджелудочной железы были облегчены с помощью этой системы. Ткань поджелудочной железы визуализировали с помощью аутофлуоресценции, и была идентифицирована соседняя сосудистая ткань, помеченная антителом против CD31. Колебание из-за перистальтики или дыхания не было идентифицировано, что привело к усредненной визуализации с высоким отношением сигнал/шум(рисунок 4). Ацинарные клетки, которые требуют визуализации на микроуровне в поджелудочной железе, были четко визуализированы на усредненных изображениях.
Для визуализации островков использовалась мышь MIP-GFP. Используя мозаичный метод визуализации, широкоугольный вид с изображением высокого разрешения позволил визуализировать островки с прилегающей сосудистой сетью(рисунок 5). Приблизительно 40-50 островков были идентифицированы на широкоугольном виде. Этот стабильный метод визуализации может дополнительно облегчить отслеживание островков в течение 3 недель, как показано в предыдущем исследовании(рисунок 6)18.
Для визуализации раковых клеток красные клетки PANC-1 NucLight были непосредственно имплантированы в поджелудочную железу мыши во время операции(рисунок 7). Была использована стратегия двойной маркировки, состоящая из красных клеток PANC-1 NucLight и близлежащих сосудов, окрашенных анти-CD31, сопряженным с Alexa 647. С помощью нашего протокола была достигнута широкоугольная визуализация рака поджелудочнойжелезы (рисунок 7A),которая очерчивает край опухоли, и 3D-визуализация с высоким разрешением на уровне одной клетки(рисунок 7B-D, дополнительное видео 2).
Рисунок 1:Дизайн и фотография окна приживитой визуализации поджелудочной железы. (A)3D и поперечное сечение окна визуализации приживитой поджелудочной железы. Подробный чертеж размера и диаметра описан в предыдущей статье18. (B) Передняя и задняя фотография окна визуализации поджелудочной железы. Copyright 2020 Корейская диабетическая ассоциация от Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Перепечатано с разрешения Корейской диабетической ассоциации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Фотография осуществления приживитой поджелудочной железы приживного окна визуализации. Окно прижизной визуализации поджелудочной железы имплантируется мыши на трансляционной стадии XYZ, а держатель камеры визуализации, прикрепленный к наклонному креплению, подключен к окну визуализации поджелудочной железы. Copyright 2020 Корейская диабетическая ассоциация от Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Перепечатано с разрешения Корейской диабетической ассоциации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Репрезентативная прижизненная визуализация поджелудочной железы у мышей C57BL/6N. (A)Широкое изображение и(B)увеличенное 3D-изображение поджелудочной железы (зеленый) и ее микроциркулятуры (красный) у мыши C57BL/6N. Сосуды помечены антителом против CD31, конъюгированной с флуорофором Alexa 647. (C)3D-реконструированное изображение и(D)поверхностно-рендерингное изображение поджелудочной железы мыши. Шкала: 200 мкм (A) и 50 мкм (B-D). Также смотрите Дополнительное видео 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Приживитая визуализация ацинарной клетки и прилегающей сосудистой клетки. Ацинарные клетки (зеленый) и прилегающая сосудистая (красная) у мыши C57BL/6N. Сосуды помечены антителом Anti-CD31, конъюгированной с флуорофором Alexa 647. Стабильность тканей, достигаемая с помощью окна визуализации поджелудочной железы, обеспечивает высокое соотношение сигнал/шум изображения. Шкала: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Репрезентативная прижизальная визуализация островков поджелудочной железы у мыши MIP-GFP. Широкоформатное мозаичное и увеличенное изображение островков (зеленый) и прилегающих сосудов (красный) обработано методом проекции максимальной интенсивности в поджелудочной железе мыши MIP-GFP. Сосуды помечены антителом против CD31, конъюгированной с флуорофором Alexa 647. Шкала: 500 мкм (широкая площадь) и 50 мкм (увеличенная). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Продольная прижизальная визуализация островков в поджелудочной железе мыши MIP-GFP. Продольное изображение островков на срок до 3 недель в поджелудочной железе у мыши MIP-GFP. Каждая стрелка с разными цветами указывает на одни и те же островки. Шкала: 100 мкм. Copyright 2020 Корейская диабетическая ассоциация от Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Перепечатано с разрешения Корейской диабетической ассоциации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7:Репрезентативная прижизальная визуализация модели рака поджелудочной железы. (A) Широкое изображение и(B)увеличенное 3D-изображение имплантированных panc-1 NucLight красных клеток (красный) у обнаженной мыши BALB / c. Сосуды (синий) помечены антителом против CD31, конъюгированной с флуорофором Alexa 647. (C)3D-реконструированное изображение и(D)поверхностно-рендерингное изображение рака поджелудочной железы в мышиной модели. Шкала: 500 мкм (A) и 50 мкм (B-D). Также смотрите Дополнительное видео 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительное видео 1: In vivo 3D визуализация поджелудочной железы у мыши C57BL/6N. In vivo 3D-визуализация поджелудочной железы (зеленый) мыши C57BL/6N внутривенно вводится антитело против CD31, конъюгированное с флуорофором Alexa 647 (красный). Шкала изображена на видео. Это видео соответствует рисунку 3C,D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Дополнительное видео 2: In vivo 3D-визуализация рака поджелудочной железы (PANC-1 NucLight Red) у обнаженной мыши BALB/C. In vivo 3D-визуализация рака поджелудочной железы (красный), имплантированная в BALB/C Nude мыши внутривенно с антителом анти-CD31, конъюгированной с флуорофором Alexa 647 (синий). Шкала изображена на видео. Это видео соответствует рисунку 7C,D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, состоит из прижизальной визуализации поджелудочной железы с использованием нового вспомогательного базового интегрированного окна визуализации прижизной поджелудочной железы, модифицированного из окна абдоминальной визуализации. Среди протоколов, описанных выше, первым критическим шагом является имплантация приживного окна визуализации поджелудочной железы в мышь. Для нанесения клея в окно важно наносить клей между краем окна и покровным стеклом, но не на ткань поджелудочной железы, так как это может значительно прервать приживитую визуализацию. Не только сам клей между стеклом и тканью, но и вспомогательные частицы пыли могут вызывать рассеяние света во время визуализации, если клей непосредственно наносится на ткань. Кроме того, нанесение клея может оказывать токсическое и нефизиологическое воздействие на поджелудочную железу.
Второй этап - это количество ткани поджелудочной железы, помещенной на металлическую опорную опорную пластину. Поскольку ткань поджелудочной железы представляет собой листовую структуру, объем ткани поджелудочной железы на пластине необходимо контролировать. Если на пластину поместить слишком большой объем, клей, нанесенный на край кольца, может прилипнуть к ткани, а массовый эффект может затруднить перфузию поджелудочной железы. С другой стороны, если поместить туда слишком маленький объем, поле зрения, которое можно визуализировать, может быть ограничено. Этот протокол операции на окне может потребовать нескольких испытаний для соответствия последовательному стандарту.
Для долгосрочной визуализации в течение 3 недель наиболее тревожной проблемой было потенциальное повреждение окна визуализации поджелудочной железы. Непреднамеренное разрушение покровного стекла в окне визуализации поджелудочной железы может произойти в течение длительного периода наблюдения. Чтобы этого не допустить, мышь с окном необходимо разместить отдельно, а из клетки удалить твердые предметы с острыми краями. Эвтаназию мышей следует рассматривать, если стекло крышки разобьется, если есть серьезные признаки воспаления возле окна, или если животное, по-видимому, находится в бедственном положении. По нашему опыту, мыши с окном визуализации поджелудочной железы могли нормально питаться и тренироваться, когда восстановление после операции было целесообразным и не развивалось никакого другого осложнения.
В нашем предыдущем опыте с окном абдоминальной визуализации мы не смогли получить высококачественную визуализацию клеточного уровня, а также продольное отслеживание одних и тех же пятен в течение нескольких дней. По сравнению с окном визуализации брюшной полости, которое обеспечивает разнообразную платформу для различных органов брюшной полости, окно визуализации поджелудочной железы дополнительно указывается для визуализации поджелудочной железы, а также других органов, которые мягкие и легко поддаются влиянию таких движений, как брыжейка, селезенка и тонкая кишечка. Тем не менее, печень и почки могут быть неосуществимы в окне визуализации поджелудочной железы из-за ограниченного пространства.
В то время как комбинация флуоресцентной мыши, клеток и зондов антител позволяет визуализировать динамические взаимодействия между эндотелиальными клетками и островками или раковыми клетками, протокол, описанный здесь, может быть воспроизведен с другими композициями флуоресцентно-меченых клеток или молекулярных зондов, подходящих для каждого соответствующего состояния. Кроме того, ожидаются экспансивные приложения, интегрированные с нашим методом, такие как мышь-репортер CpepSfGFP с секрецией инсулина9,30,AAV8-опосредованная доставка генов, нацеленная на активные формы кислорода (АФК)31,или ортотопическая модель опухоли32,33,34, в которой опухоль in situ может полностью стимулировать микроокружение опухоли, включая опухолевое генез, развитие и метастазирование35. Кроме того, модели ксенотрансплантатов, полученные от пациента, также могут быть изучены с использованием нашей платформы36.
В этом исследовании необходимо рассмотреть несколько ограничений. Во-первых, даже когда мы использовали металлическую основу для стабилизации, мы не смогли определить механическое напряжение, вызванное на ткань основанием и покровным стеклом, которое может повлиять на кровоток. Однако, как показано на приведенных выше рисунках, внутривенное введение флуоресцентно-конъюгированного антитела (CD31) или декстрана адекватно маркировало сосуд без различимой нетрансфузированной области, предполагая минимальное влияние механического напряжения на нормальный кровоток внутри ткани поджелудочной железы. Во-вторых, побочные реакции из-за адгезивного не могли быть оценены в ткани поджелудочной железы. Тем не менее, мы старались избегать прикосновения к поджелудочной железе с клеями как можно тщательнее, чтобы избежать каких-либо дополнительных эффектов. В-третьих, как обсуждалось выше, непреднамеренное воздействие анестетиков может повлиять на чувствительность и секрецию инсулина, как описано в предыдущем исследовании9,27. По нашему опыту, смесь кетамина и ксилазина индуцировала гипергликемию по сравнению со смесью тиетамина, золазепама и ксилазина. Следует провести дальнейшее исследование, изучающее влияние анестезии на секрецию инсулина, и в соответствии с каждым экспериментом следует выбрать надлежащую анестезию с минимальными побочными эффектами. В-четвертых, визуализация поджелудочной железы сосредоточена на хвостовой части, и визуализация головной части поджелудочной железы может быть ограничена нашим окном.
Таким образом, стабилизированная продольная визуализация поджелудочной железы на клеточном уровне в течение нескольких недель была облегчена нашей системой визуализации, интегрированной с окном приживной визуализации поджелудочной железы, оптимизированным для визуализации поджелудочной железы in vivo. Поскольку прижизневая визуализация обеспечивает динамическое понимание клеточной биологии, иммунологии и биологии опухолей, этот протокол может быть полезным методом для исследования патофизиологии различных заболеваний, связанных с поджелудочной железой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом No 14-2020-002 исследовательского фонда SNUBH и грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым правительством Кореи (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window - custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder - custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
References
- Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A.
- Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. Technologies for imaging the normal and diseased pancreas. Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed. Diabetes Care. 31, Suppl 2 165-169 (2008).
- Baetens, D., et al. Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice. Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Ravier, M. A., Rutter, G. A. Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes. Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).
- Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose. Science Reports. 11 (1), 603 (2021).
- Lee, E. M., et al. Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice. Islets. 10 (1), 25-39 (2018).
- Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. In vivo imaging of islet transplantation. Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).
- Mojibian, M., et al. Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R.
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), 1024405 (2015).
- Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Park, I., et al. Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model. Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).
- Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy. Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Hwang, Y., et al. In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver. Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas. International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).
- National Institutes of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).
- Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice. Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Cichocki, F., et al. GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity. Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
- Reissaus, C. A., et al. A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).
- Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma. Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).
- Bisht, S., Feldmann, G. Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L.
- Feig, C., et al.
- Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models. Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).
