Summary
L’imagerie in vivo à haute résolution du pancréas a été facilitée par la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique.
Abstract
L’imagerie directe in vivo à résolution cellulaire du pancréas dans un modèle vivant de petit animal a été techniquement difficile. Une étude récente d’imagerie intravitale, avec une fenêtre d’imagerie abdominale, a permis de visualiser la dynamique cellulaire dans les organes abdominaux in vivo. Cependant, en raison de l’architecture molle en forme de feuille du pancréas de la souris qui peut être facilement influencée par le mouvement physiologique (par exemple, le péristaltisme et la respiration), il était difficile d’effectuer une imagerie longitudinale in vivo stabilisée sur plusieurs semaines au niveau cellulaire pour identifier, suivre et quantifier les îlots ou les cellules cancéreuses dans le pancréas de la souris. Nous décrivons ici une méthode d’implantation d’une nouvelle base de support, une fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique intégrée, qui peut séparer spatialement le pancréas de l’intestin pour l’imagerie intravitale longitudinale time-lapse de la microstructure du pancréas. L’imagerie longitudinale in vivo avec la fenêtre d’imagerie permet une visualisation stable, permettant le suivi des îlots sur une période de 3 semaines et l’imagerie tridimensionnelle à haute résolution de la microstructure, comme en témoigne ici un modèle orthotopique de cancer du pancréas. Avec notre méthode, d’autres études d’imagerie intravitale peuvent élucider la physiopathologie de diverses maladies impliquant le pancréas au niveau cellulaire.
Introduction
Le pancréas est un organe abdominal avec une fonction exocrine dans le tube digestif et une fonction endocrinienne de sécrétion d’hormones dans la circulation sanguine. L’imagerie cellulaire à haute résolution du pancréas pourrait révéler la physiopathologie de diverses maladies impliquant le pancréas, y compris la pancréatite, le cancer du pancréas et le diabète sucré1. Les outils d’imagerie diagnostique conventionnels tels que la tomodensitométrie, l’imagerie à résolution magnétique et l’échographie sont largement disponibles dans le domaine clinique1,2. Cependant, ces modalités d’imagerie se limitent à visualiser uniquement les changements structurels ou anatomiques, tandis que les altérations au niveau cellulaire ou moléculaire ne peuvent pas être déterminées. Étant donné que les changements moléculaires dans le diabète sucré ou le cancer du pancréas chez l’homme peuvent commencer plus de 10 ans avant le diagnostic3,4, la détection des maladies du pancréas à partir de leur transition moléculaire pendant la période de latence a le potentiel de fournir un diagnostic précoce et une intervention rapide. Ainsi, l’imagerie qui surmontera les limites de la résolution et fournira des informations précieuses sur la fonction attirera remarquablement l’attention en fournissant un diagnostic précoce du cancer du pancréas ou une identification avancée de l’altération des îlots au cours de la progression du diabète sucré5.
En particulier avec les îlots, l’imagerie nucléaire, l’imagerie par bioluminescence et la tomographie par cohérence optique ont été suggérées comme techniques d’imagerie non invasive des îlots6. Cependant, la résolution de ces méthodes est considérablement faible, avec des valeurs typiques allant de plusieurs dizaines à des centaines de micromètres, offrant une capacité limitée à détecter les changements au niveau cellulaire dans les îlots. D’autre part, des études antérieures à haute résolution sur les îlots ont été réalisées dans des conditions ex vivo7,8 (par exemple, tranchage ou digestion du pancréas), non physiologiques9 (par exemple, extériorisation du pancréas) et hétérotopiques10,11,12 (par exemple, implantation sous la capsule rénale, à l’intérieur du foie et dans la chambre antérieure de l’œil), ce qui limite leur interprétation et leurs implications cliniques. Si un modèle in vivo,physiologique et orthotopique d’imagerie à haute résolution peut être établi, ce sera une plate-forme critique pour l’étude des îlots pancréatiques.
L’imagerie intravitale, qui révèle la physiopathologie à un niveau de résolution microscopique chez un animal vivant, a récemment fait l’objet d’une grande attention13. Parmi les méthodes d’imagerie in vivo, le développement d’une fenêtre d’imagerie abdominale14,qui implante une fenêtre dans l’abdomen d’une souris, a permis de découvrir de nouvelles découvertes (c’est-à-dire un stade pré-micrométastase de la métastase hépatique précoce15 et un mécanisme de maintien des cellules souches dans l’épithélium intestinal16). Bien que la fenêtre d’imagerie abdominale fournisse des résultats précieux, les applications de cette fenêtre pour le pancréas et la recherche d’imagerie intravitale qui en résulte basée sur les maladies impliquant le pancréas n’ont pas été étudiées de manière approfondie.
Contrairement aux caractéristiques bien définies des organes solides du pancréas humain, le pancréas d’une souris est une structure semblable à des tissus mous distribués de manière diffuse17. Par conséquent, il est sans cesse affecté par les mouvements physiologiques, y compris le péristaltisme et la respiration. Une étude antérieure sur l’application d’une fenêtre d’imagerie abdominale pour le pancréas a démontré que l’errance se produisait en raison d’artefacts de mouvement induits par les selles18. Un flou sévère a été observé dans l’image moyenne résultante, ce qui a entravé la visualisation et l’identification des structures à l’échelle microscopique.
Ici, nous décrivons l’utilisation d’une nouvelle fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique intégrée à la base de soutien combinée à la microscopie intravitale19,20 pour étudier les événements au niveau cellulaire longitudinal dans les maladies impliquant le pancréas. En plus d’une description détaillée de la méthodologie de l’étude précédente18, l’application étendue de la fenêtre d’imagerie pancréatique pour diverses maladies impliquant le pancréas sera abordée dans cet article. Dans ce protocole, un système de microscopie confocale à balayage laser à débit vidéo sur mesure a été utilisé comme système de microscopie intravitale. Quatre modules laser (longueurs d’onde à 405, 488, 561 et 640 nm) ont été utilisés comme source d’excitation, et quatre canaux de signaux d’émission ont été détectés par des tubes photomultiplicateurs (PMT) à travers des filtres passe-bande (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Le balayage laser se composait d’un miroir polygonal rotatif (axe X) et d’un miroir à balayage galvanométrique (axe Y) qui permettait le balayage à débit vidéo (30 images par seconde). Des informations détaillées sur la microscopie intravitale ont été décrites dans les études précédentes10,18,19,20,21,22,23.
Dans notre étude précédente sur les îlots18,nous avons imagé avec succès et de manière stable les îlots chez des souris vivantes à l’aide d’un modèle murin transgénique (MIP-GFP)24 dans lequel les îlots ont été marqués avec GFP. La méthode a permis une visualisation haute résolution des changements dans les îlots sur une période de 1 semaine. Il a également facilité l’imagerie des mêmes îlots jusqu’à 3 semaines, ce qui suggère la faisabilité d’études à long terme des îlots pancréatiques pour le suivi fonctionnel ou la surveillance pendant la pathogenèse du diabète sucré18. De plus, nous avons développé un modèle de cancer du pancréas orthotopique dans lequel des cellules fluorescentes cancéreuses du pancréas (PANC-1 NucLight Red)25 ont été directement implantées dans le pancréas de la souris. Avec l’application de la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique, ce modèle pourrait être utilisé comme plate-forme pour étudier la physiopathologie cellulaire et moléculaire dans le microenvironnement tumoral du cancer du pancréas et pour la surveillance thérapeutique de nouveaux candidats médicaments.
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Protocol
Toutes les procédures décrites dans le présent document ont été menées conformément à la 8e édition du Guide pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire (2011)26 et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Institut avancé coréen des sciences et de la technologie (KAIST) et de l’Hôpital Bundang de l’Université nationale de Séoul (SNUBH).
1. Préparation de la fenêtre et d’autres matériaux
- Conception personnalisée de la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique pour isoler le pancréas de l’intestin dans la cavité abdominale18 (Figure 1A, B). Un plan détaillé de la fenêtre est décrit dans une figure supplémentaire d’une étude précédente18.
- Utilisez des souris C57BL/6N, des mâles âgés de 8 à 12 semaines, pour l’imagerie pancréatique intravitale. Injecter un anticorps anti-CD31 conjugué avec un fluorophore Alexa 647, 2 h avant l’imagerie, aux fins du marquage des vaisseaux18.
- Pour l’étude des îlots, préparez un modèle murin transgénique dans lequel les îlots sont marqués avec une protéine rapporteure fluorescente. Ici, nous avons utilisé MIP-GFP, où la protéine fluorescente verte a été exprimée sous le contrôle du promoteur du gène de l’insuline 1 de la souris, qui est active dans les cellules bêta de tous les îlots de la souris24.
- Pour l’étude sur le cancer du pancréas, préparez des cellules cancéreuses transgéniques marquées avec une protéine rapporteur fluorescente et des souris nues BALB / C. Dans cette étude, les globules rouges PANC-1 NucLight ont été utilisés. Les cellules cancéreuses PANC-125 ont été étiquetées avec la sonde fluorescente NucLight Red.
- Stérilisez tous les outils chirurgicaux, couvrez le verre (avec du PEG ou non) et imagez les fenêtres à l’aide d’un autoclave.
- Appliquez un revêtement PEG sur le verre de couverture pour prévenir la réponse inflammatoire et augmenter la biocompatibilité, ce qui convient à l’imagerie à long terme.
2. Chirurgie
- Préparez une plate-forme chirurgicale stérile et stérilisez les surfaces avec 70% d’éthanol.
REMARQUE: Pour les séances d’imagerie longitudinale, la technique aseptique est essentielle. - Anesthésier les souris avec un mélange de tiletamine/zolazépam (30 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg).
REMARQUE: L’utilisation de tiletamine / zolazépam est recommandée au lieu de la kétamine en raison de son effet indésirable de l’hyperglycémie. L’anesthésie optimale doit être choisie pour les besoins de l’expérience9,27. - Surveillez la température corporelle à l’aide d’une sonde rectale avec un coussin chauffant à commande homéotherme.
- Rasez le flanc gauche de la souris et appliquez trois cycles de gommage alterné à base d’alcool et d’iode.
REMARQUE: Si une crème dépilatoire est utilisée, ne laissez pas plus de 1 minute pour éviter les brûlures chimiques. - Faites une incision de 1,5 cm sur le flanc gauche de la souris et disséquez la peau et les muscles.
- Effectuez une suture de cordon de bourse avec une suture noire ou en nylon 4-0 dans la marge d’incision.
- Utilisez un micro-rétracteur sur l’incision et exposez doucement la rate.
- Remettez soigneusement la rate en commun avec une pince annulaire et identifiez le pancréas.
- Placez la fenêtre sur le flanc de la souris et passez la rate et le pancréas à travers l’espace ouvert de la fenêtre. La manipulation du pancréas doit être très gentille car elle peut provoquer des saignements ou une pancréatite
- Placez doucement le pancréas sur la plaque de la fenêtre d’imagerie; la rate sera placée sur l’espace ouvert de la fenêtre.
- Pour l’étude des cellules cancéreuses, injectez PANC-1 NucLight Red (1,0 x 106 cellules) directement dans le pancréas.
REMARQUE: Pour l’imagerie des xénogreffes orthotopiques du cancer du pancréas humain, l’implantation directe de cellules cancéreuses telles que PANC-1 ou d’autres cellules cancéreuses du pancréas humain pourrait être facilitée28. Pour visualiser avec la microscopie à fluorescence intravitale, les cellules PANC-1 ont été transduies avec une protéine fluorescente rouge à l’aide du réactif lentiviral NucLight Red qui marque le noyau29. Bien que le volume maximal d’injection soit incertain, diminuez le volume autant que possible pour éviter l’effet de pression dans le pancréas. - Appliquez des gouttes de colle cyanoacrylate de N-butyle sur la marge de la fenêtre d’imagerie.
- Pour minimiser la quantité de colle appliquée, utilisez une aiguille de cathéter de 31 G pour l’application. Si la quantité de goutte est importante, le tissu adhérera involontairement à la fenêtre ou au verre de couverture.
- Appliquez doucement un verre de couverture rond de 12 mm sur la marge de la fenêtre d’imagerie.
- Tirez sur la boucle de suture pour l’insérer dans la rainure latérale de la fenêtre et attachez-la trois fois.
- Coupez le site proximal maximal du nœud pour éviter l’interruption des points de suture serrés lorsque ces souris sont éveillées.
- Laissez les souris récupérer de l’anesthésie (2-3 heures) et injecter du kétoprofène (5 mg / kg, sous-cutané dans la peau lâche à la base du cou ou de la hanche de l’animal) pour soulager la douleur. Réévaluer les signes de douleur toutes les 12 heures et le kétoprofène doit être envisagé toutes les 24 heures pendant 1 à 3 jours.
REMARQUE: L’analgésie influence la sécrétion d’insuline en réponse au glucose9. Le choix et le moment de l’analgésie doivent être individualisés à des fins expérimentales. - Accommodez la souris dans la cage avec une literie suffisante pour éviter le contact de la fenêtre avec la cage. Évitez de loger la maison avec les souris sans la chirurgie de la fenêtre.
3. Imagerie intravitale
- Allumez le microscope intravital, y compris la puissance laser.
- Allumez le coussin chauffant et réglez la régulation homéotherme à 37 °C.
REMARQUE: Alternativement, utilisez un coussin chauffant passif ou une lampe avec un contrôle fréquent s’il n’y a pas de régulation homéotherme. - Effectuer une anesthésie intramusculaire avec un mélange de tiletamine/zolazépam (30 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg).
REMARQUE: L’utilisation de tiletamine / zolazépam est recommandée au lieu de la kétamine en raison de son effet indésirable de l’hyperglycémie. L’anesthésie optimale doit être choisie pour les besoins des expériences9,27. - Insérez un cathéter vasculaire pour l’injection.
- Appliquez une pression sur le côté proximal de la queue avec l’index et le troisième doigt comme alternative à une application de garrot. Chauffez la queue avec une lampe si nécessaire.
- Stériliser la veine de la queue avec un spray à 70% d’éthanol.
- Insérez un cathéter de 30 G dans la veine latérale de la queue. La régurgitation du sang sera visualisée dans le tube PE10.
- Appliquez un ruban de soie sur le cathéter pour le stabiliser.
- Injecter du dextran FITC/TMR ou d’autres sondes fluorescentes (25 μg d’anti-CD31 conjugué avec Alexa 647), selon le cas, selon la combinaison de sondes fluorescentes18.
REMARQUE: Pour les sondes d’anticorps conjugués fluorescents, injecter 2 h avant la séance d’imagerie.
- Transférez la souris de la plate-forme chirurgicale à l’étape d’imagerie.
- Insérez une sonde rectale pour contrôler automatiquement la température corporelle avec le système de coussin chauffant homéotherme.
- Insérez la fenêtre d’imagerie pancréatique dans le support de fenêtre préparé lors de la configuration de la microscopie intravitale (Figure 2). Pour un microscope inversé, un support de fenêtre peut ne pas être nécessaire.
- Effectuer une imagerie intravitale.
- Pour l’imagerie du pancréas, commencez par une lentille d’objectif à faible grossissement (par exemple, 4x) pour scanner toute la vue du pancréas dans la fenêtre d’imagerie pancréatique (champ de vision recommandé: 2500 x 2500 μm).
- Après avoir déterminé la région d’intérêt, passez à un objectif à grossissement plus élevé (20x ou 40x) pour effectuer l’imagerie au niveau cellulaire (champ de vision recommandé: 500 x 500 μm ou 250 x 250 μm). Dans cette expérience, la résolution latérale et axiale était d’environ 0,5 μm et 3 μm, respectivement.
- Effectuez une imagerie z-stack ou time-lapse pour observer la structure 3D ou la dynamique au niveau cellulaire, telle que la migration cellulaire.
REMARQUE: Pour l’imagerie des cellules exprimant les protéines fluorescentes d’animaux transgéniques (MIP-GFP), 30 s d’exposition intermittente au laser de 488 nm avec une puissance allant jusqu’à 0,43 mW étaient tolérables sans photobleachage notable ou lésions tissulaires. Pour l’imagerie des protéines fluorescentes étiquetées avec Alexa 647, la puissance laser de 640 nm jusqu’à 0,17 mW était tolérable sans photoblage notable ou lésion tissulaire. Une exposition prolongée au laser d’excitation avec une puissance supérieure à ce réglage peut entraîner un photobleaching ou des lésions tissulaires par phototoxicité. Ajustez le gain et la puissance adéquats pour imager correctement la région d’intérêt. Le réglage détaillé des paramètres en microscopie intravitale doit être individualisé pour chaque microscopie intravitale préparée dans l’institut.
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Representative Results
La microscopie intravitale combinée à la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique intégrée à la base de support permet une imagerie longitudinale au niveau cellulaire du pancréas chez une souris. Ce protocole avec la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique assure une stabilité tissulaire à long terme qui permet l’acquisition d’une imagerie à haute résolution pour suivre les îlots individuels jusqu’à 3 semaines. En conséquence, l’imagerie en mosaïque pour un champ de vision étendu, la reconstruction tridimensionnelle (3D) de l’imagerie z-stack et le suivi longitudinal de la même position peuvent être réalisés. De plus, notre microscopie intravitale fournit quatre canaux (405, 488, 561 et 647 nm) d’acquisition, ce qui permet une visualisation simultanée de plusieurs cellules avec leurs interactions.
Pour l’imagerie préliminaire, la fenêtre a été implantée chez une souris C57BL/6N avec un anticorps anti-CD31 injecté par voie intraveineuse conjugué à un fluorophore Alexa 647. L’imagerie en zone étendue (Figure 3A) et l’imagerie 3D agrandie (Figure 3B-D, Vidéo supplémentaire 1) du pancréas ont été facilitées avec ce système. Le tissu pancréatique a été visualisé avec une autofluorescence et le système vasculaire adjacent marqué avec l’anticorps anti-CD31 a été identifié. L’oscillation due au péristaltisme ou à la respiration n’a pas été identifiée, ce qui a entraîné une imagerie moyenne avec un rapport signal/bruit élevé(figure 4). Les cellules acineuses, qui nécessitent une visualisation à une résolution microscopique dans le pancréas, ont été clairement visualisées dans les images moyennes.
Pour l’imagerie des îlots, une souris MIP-GFP a été utilisée. En utilisant la méthode d’imagerie en mosaïque, une vue à grand champ avec imagerie à haute résolution a permis la visualisation des îlots avec la vascularisation adjacente (Figure 5). Environ 40 à 50 îlots ont été identifiés dans la vue à grand champ. Cette méthode d’imagerie stable pourrait faciliter davantage le suivi des îlots jusqu’à 3 semaines, comme le montre une étude précédente(Figure 6)18.
Pour l’imagerie des cellules cancéreuses, les globules rouges PANC-1 NucLight ont été directement implantés dans le pancréas de la souris pendant la chirurgie (Figure 7). Une stratégie de double étiquetage a été utilisée, composée de cellules rouges PANC-1 NucLight et de vaisseaux voisins colorés avec un anti-CD31 conjugué avec Alexa 647. Avec notre protocole, l’imagerie à grand champ du cancer du pancréas (Figure 7A), qui délimite la marge de la tumeur, et l’imagerie 3D haute résolution au niveau de la cellule unique, ont été réalisées (Figure 7B-D, Vidéo supplémentaire 2).
Figure 1: Conception et photographie de la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique. (A) Vue 3D et transversale de la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique. Un plan détaillé de la taille et du diamètre est décrit dans l’article précédent18. (B) Photographie antérieure et postérieure de la fenêtre d’imagerie pancréatique. Copyright 2020 Association coréenne du diabète de Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Reproduit avec la permission de l’Association coréenne du diabète. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Photographie de la mise en œuvre de la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique. Une fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique est implantée dans la souris dans l’étape translationnelle XYZ et le support de chambre d’imagerie fixé au support inclinable est connecté à la fenêtre d’imagerie pancréatique. Copyright 2020 Association coréenne du diabète de Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Reproduit avec la permission de l’Association coréenne du diabète. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Imagerie pancréatique intravitale représentative chez la souris C57BL/6N. (A) Image à grande surface et (B) image 3D agrandie du pancréas (vert) et de sa microvascularisation (rouge) chez la souris C57BL/6N. Les vaisseaux sont marqués avec un anticorps anti-CD31 conjugué avec le fluorophore Alexa 647. (C) Image reconstruite en 3D et (D) image de rendu de surface du pancréas de la souris. Barre d’échelle : 200 μm (A) et 50 μm (B-D). Voir aussi la vidéo supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Imagerie intravitale de la cellule acineuse et du système vasculaire adjacent. Cellules acineuses (vert) et vasculaire adjacente (rouge) chez la souris C57BL/6N. Les vaisseaux sont marqués avec un anticorps anti-CD31 conjugué avec le fluorophore Alexa 647. La stabilité tissulaire réalisée avec la fenêtre d’imagerie pancréatique fournit une image à rapport signal/bruit élevé. Barre d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Imagerie intravitale représentative des îlots pancréatiques chez la souris MIP-GFP. Mosaïque à large surface et image agrandie des îlots (vert) et de la vascularisation adjacente (rouge) traitée avec la méthode de projection d’intensité maximale dans le pancréas de la souris MIP-GFP. Les vaisseaux sont marqués avec un anticorps anti-CD31 conjugué avec le fluorophore Alexa 647. Barre d’échelle : 500 μm (large surface) et 50 μm (agrandi). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6: Imagerie intravitale longitudinale des îlots dans le pancréas de la souris MIP-GFP. Image longitudinale des îlots jusqu’à 3 semaines dans le pancréas chez la souris MIP-GFP. Chaque pointe de flèche de couleurs différentes indique les mêmes îlots. Barre d’échelle: 100 μm. Copyright 2020 Association coréenne du diabète de Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Reproduit avec la permission de l’Association coréenne du diabète. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7: Imagerie intravitale représentative du modèle de cancer du pancréas. (A) Image à grande surface et (B) image 3D agrandie des globules rouges PANC-1 NucLight implantés (rouge) chez la souris BALB/c Nude. Les vaisseaux (bleu) sont marqués avec un anticorps anti-CD31 conjugué avec le fluorophore Alexa 647. (C) Image reconstruite en 3D et (D) image de rendu de surface du cancer du pancréas dans le modèle murin. Barre d’échelle : 500 μm (A) et 50 μm (B-D). Voir aussi la vidéo supplémentaire 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo supplémentaire 1 : Imagerie pancréatique 3D in vivo chez la souris C57BL/6N. Imagerie 3D in vivo du pancréas (vert) d’une souris C57BL/6N injectée par voie intraveineuse avec un anticorps anti-CD31 conjugué avec le fluorophore Alexa 647 (rouge). La barre d’échelle est représentée dans la vidéo. Cette vidéo correspond à la Figure 3C,D. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo supplémentaire 2 : Imagerie in vivo du cancer du pancréas 3D (PANC-1 NucLight Red) chez une souris NUE BALB/C. Imagerie 3D in vivo du cancer du pancréas (rouge) implantée chez une souris NUE BALB/C injectée par voie intraveineuse avec un anticorps anti-CD31 conjugué avec le fluorophore Alexa 647 (bleu). La barre d’échelle est représentée dans la vidéo. Cette vidéo correspond à la Figure 7C,D. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Le protocole décrit ici consiste en une imagerie intravitale du pancréas à l’aide d’une nouvelle fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique intégrée à la base de support modifiée à partir d’une fenêtre d’imagerie abdominale. Parmi les protocoles décrits ci-dessus, la première étape critique est l’implantation de la fenêtre d’imagerie pancréatique intravitale chez la souris. Pour l’application de la colle dans la fenêtre, il est important d’appliquer la colle entre la marge de la fenêtre et le verre de couverture, mais pas sur le tissu pancréatique, car cela peut interrompre considérablement l’imagerie intravitale. Non seulement la colle elle-même entre le verre et le tissu, mais aussi les particules de poussière auxiliaires peuvent induire une diffusion de la lumière pendant l’imagerie si la colle est directement appliquée sur le tissu. En outre, l’application de l’adhésif peut avoir des effets toxiques et non physiologiques sur le pancréas.
La deuxième étape est la quantité de tissu pancréatique placée sur la plaque de base de support métallique. Parce que le tissu pancréatique est une structure en forme de feuille, le volume de tissu pancréatique sur la plaque doit être contrôlé. Si un volume trop important est placé sur la plaque, la colle appliquée sur la marge de l’anneau peut adhérer au tissu et l’effet de masse peut entraver la perfusion du pancréas. D’autre part, si un volume trop petit y est placé, le champ de vision qui peut être visualisé peut être limité. Ce protocole de chirurgie sur la fenêtre peut nécessiter plusieurs essais pour répondre à une norme cohérente.
Pour l’imagerie à long terme sur une période de 3 semaines, le problème le plus préoccupant était les dommages potentiels à la fenêtre d’imagerie pancréatique. La destruction involontaire du verre de couverture dans la fenêtre d’imagerie pancréatique pourrait se produire pendant la période d’observation à long terme. Pour éviter cela, la souris avec la fenêtre doit être logée séparément et les objets durs avec des bords tranchants doivent être retirés de la cage. L’euthanasie des souris doit être envisagée si la vitre de couverture se brise, s’il y a des signes graves d’inflammation près de la fenêtre ou si l’animal semble être en détresse. D’après notre expérience, les souris avec la fenêtre d’imagerie pancréatique ont pu manger et faire de l’exercice normalement lorsque la récupération après la chirurgie était appropriée et qu’aucune autre complication n’a été développée.
Dans notre expérience précédente avec la fenêtre d’imagerie abdominale, nous n’avons pas réussi à acquérir une imagerie de haut niveau cellulaire ainsi qu’un suivi longitudinal des mêmes taches sur plusieurs jours. Par rapport à la fenêtre d’imagerie abdominale, qui fournit une plate-forme diversifiée pour divers organes abdominaux, la fenêtre d’imagerie pancréatique est également spécifiée pour l’imagerie du pancréas ainsi que d’autres organes mous et facilement influencés par des mouvements tels que le mésentère, la rate et l’intestin grêle. Cependant, le foie et les reins peuvent être irréalisables dans la fenêtre d’imagerie pancréatique en raison de l’espace limité.
Alors que la combinaison d’une souris fluorescente, de cellules et de sondes d’anticorps permet de visualiser les interactions dynamiques entre les cellules endothéliales et les îlots ou les cellules cancéreuses, le protocole décrit ici pourrait être reproduit avec d’autres compositions de cellules fluorescentes ou de sondes moléculaires adaptées à chaque condition respective. En outre, des applications étendues intégrées à notre méthode sont attendues, telles que la souris rapporteure CpepSfGFP avec sécrétiond’insuline 9,30,l’administration de gènes médiés par AAV8 ciblant les espèces réactives de l’oxygène (ROS)31,ou le modèle de tumeur orthotopique32,33,34 dans lequel la tumeur in situ peut stimuler pleinement le microenvironnement tumoral, y compris la tumorigenèse, le développement et les métastases35. En outre, les modèles de xénogreffes dérivés du patient peuvent également être étudiés à l’aide de notre plate-forme36.
Il y a quelques limites à aborder dans cette étude. Tout d’abord, même lorsque nous avons utilisé la base métallique pour la stabilisation, nous n’avons pas été en mesure de déterminer le stress mécanique induit sur le tissu par la base et le verre de couverture, ce qui pourrait affecter le flux sanguin. Cependant, comme le montrent les figures ci-dessus, l’injection intraveineuse d’un anticorps conjugué par fluorescence (CD31) ou de dextran a correctement marqué le vaisseau sans zone non perfusée distinguable, suggérant un impact minimal du stress mécanique sur le flux sanguin normal à l’intérieur du tissu pancréatique. Deuxièmement, les effets indésirables dus à l’adhésif n’ont pas pu être évalués dans le tissu pancréatique. Néanmoins, nous avons essayé d’éviter de toucher le pancréas avec des adhésifs aussi soigneusement que possible pour éviter tout effet supplémentaire. Troisièmement, comme nous l’avons vu plus haut, l’impact involontaire des agents anesthésiques pourrait affecter la sensibilité et la sécrétion d’insuline, comme décrit dans l’étude précédente9,27. D’après notre expérience, un mélange de kétamine et de xylazine a induit une hyperglycémie par rapport au mélange de carélamine, de zolazépam et de xylazine. Une autre étude portant sur l’effet de l’anesthésie sur la sécrétion d’insuline doit être réalisée et une anesthésie appropriée avec un minimum d’effets indésirables doit être sélectionnée en fonction de chaque expérience. Quatrièmement, l’imagerie du pancréas est concentrée sur la partie de la queue, et l’imagerie de la partie de la tête du pancréas pourrait être limitée avec notre fenêtre.
En résumé, une imagerie longitudinale stabilisée du pancréas au niveau cellulaire jusqu’à plusieurs semaines a été facilitée par notre système d’imagerie intégré à la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique optimisée pour l’imagerie in vivo du pancréas. Parce que l’imagerie intravitale fournit des informations dynamiques sur la biologie cellulaire, l’immunologie et la biologie tumorale, ce protocole pourrait être une méthode utile pour étudier la physiopathologie de diverses maladies impliquant le pancréas.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par la subvention n ° 14-2020-002 du Fonds de recherche SNUBH et par la subvention de la Fondation nationale de recherche de Corée (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window - custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder - custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
References
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