Summary
In vivo høj opløsning billeddannelse af bugspytkirtlen blev lettet med bugspytkirtlen intravital billeddannelse vindue.
Abstract
Direkte in vivo cellulær opløsning billeddannelse af bugspytkirtlen i en levende lille dyr model har været teknisk udfordrende. En nylig intravital billeddannelse undersøgelse, med en abdominal billeddannelse vindue, aktiveret visualisering af den cellulære dynamik i abdominal organer in vivo. Men på grund af den bløde ark-lignende arkitektur i musen bugspytkirtel, der let kan påvirkes af fysiologisk bevægelse (f.eks peristalsis og respiration), var det vanskeligt at udføre stabiliseret langsgående in vivo imaging over flere uger på cellulært niveau for at identificere, spore og kvantificere holme eller kræftceller i musen bugspytkirtel. Heri beskriver vi en metode til implantering af en ny understøttende base, en integreret pancreas intravital billeddannelse vindue, der kan rumligt adskille bugspytkirtlen fra tarmen for langsgående time-lapse intravital billeddannelse af bugspytkirtlen mikrostruktur. Langsgående in vivo billeddannelse med billeddannelse vinduet muliggør stabil visualisering, der giver mulighed for sporing af holme over en periode på 3 uger og høj opløsning tre-dimensionelle billeddannelse af mikrostrukturen, som det fremgår her i en orthotopic kræft i bugspytkirtlen model. Med vores metode kan yderligere intravitale billeddiagnostiske undersøgelser belyse patofysiologien af forskellige sygdomme, der involverer bugspytkirtlen på celleniveau.
Introduction
Bugspytkirtlen er et abdominalt organ med en exokrine funktion i fordøjelseskanalen og en endokrine funktion af udskille hormoner i blodbanen. Høj opløsning cellulære billeddannelse af bugspytkirtlen kunne afsløre patofysiologi af forskellige sygdomme, der involverer bugspytkirtlen, herunder pancreasitis, kræft i bugspytkirtlen, og diabetes mellitus1. Konventionelle diagnostiske billedbehandlingsværktøjer som computertomografi, magnetisk opløsningsbilleddannelse og ultralyd er bredt tilgængelige i det kliniske felt1,2. Disse billeddannelsesmetoder er dog begrænset til kun at visualisere strukturelle eller anatomiske ændringer, mens ændringer på cellulært eller molekylært niveau ikke kan bestemmes. I betragtning af at molekylære ændringer i diabetes mellitus eller kræft i bugspytkirtlen hos mennesker kan indlede mere end 10 år før diagnosen3,4, har påvisning af bugspytkirtelsygdomme fra deres molekylære overgang i den latente periode potentialet til at give en tidlig diagnose og en rettidig intervention. Således vil billeddannelse, der vil overvinde begrænsningerne i opløsningen og give værdifuld indsigt i funktionen bemærkelsesværdigt få opmærksomhed ved at give tidlig diagnose af kræft i bugspytkirtlen eller avanceret identifikation af ændringen af holmene under udviklingen af diabetes mellitus5.
Især med holme, nuklear billeddannelse, bioluminescens imaging, og optisk sammenhæng tomografi er blevet foreslået som ikke-invasive holm billeddannelse teknikker6. Opløsningen af disse metoder er imidlertid væsentligt lav med typiske værdier, der spænder fra flere tiere til hundreder af mikrometer, hvilket giver en begrænset evne til at opdage ændringer på celleniveau i holmene. På den anden side blev tidligere højopløsningsundersøgelser af holme udført under ex vivo7,8 (f.eks. udskæring eller fordøjelse af bugspytkirtlen), ikke-fysiologisk9 (f.eks ydrering af bugspytkirtlen), og heterotopiske tilstande10,11,12 (f.eks implantation under nyrekapslen, inde i leveren, og i den forreste kammer i øjet), som begrænser deres fortolkning og kliniske konsekvenser. Hvis in vivo, fysiologisk, og orthotopic model af høj opløsning billeddannelse kan etableres, vil det være en kritisk platform for undersøgelse af bugspytkirtel holme.
Intravital billeddannelse, som afslører patofysiologien på et mikroskopisk opløsningsniveau hos et levende dyr, har for nylig fået stor opmærksomhed13. Af in vivo imaging metoder, udvikling af en abdominal imaging vindue14, som implantater et vindue ind i maven af en mus, har gjort det muligt at opdage nye fund (dvs. en præ-micrometastase fase af tidlig levermetastase15 og mekanisme for stamcellevedligeholdelse i tarmepitelet16). Selv om abdominal billeddannelse vinduet giver værdifulde resultater, anvendelserne af dette vindue til bugspytkirtlen og den deraf følgende intravital billeddannelse forskning baseret på sygdomme, der involverer bugspytkirtel, er ikke blevet grundigt undersøgt.
I modsætning til de veldefinerede faste organegenskaber i den menneskelige bugspytkirtel er bugspytkirtlen hos en mus en diffust distribueret blødt vævslignende struktur17. Derfor påvirkes det uophørligt af fysiologiske bevægelser, herunder peristalsis og åndedræt. En tidligere undersøgelse af anvendelsen af en abdominal billeddannelse vindue til bugspytkirtlen viste, at vandrer fandt sted på grund af bevægelse-artefakter induceret af afføring18. Der blev observeret alvorlig sløring i det resulterende gennemsnitlige billede, som hindrede visualiseringen og identifikationen af mikroskalastrukturerne.
Heri beskriver vi brugen af en ny støtte base integreret pancreas intravital imaging vindue kombineret med intravital mikroskopi19,20 til at undersøge langsgående cellulære niveau begivenheder i sygdomme, der involverer bugspytkirtlen. Ud over en detaljeret beskrivelse af metoden i den foregående undersøgelse18, den udvidede anvendelse af pancreas imaging vindue for forskellige sygdomme, der involverer bugspytkirtlen vil blive behandlet i dette papir. I denne protokol blev et specialbygget video-rate laserscanningskonfokalt mikroskopisystem brugt som et intravitalt mikroskopisystem. Fire lasermoduler (bølgelængder ved 405, 488, 561 og 640 nm) blev brugt som en excitationskilde, og fire kanaler af emissionssignaler blev opdaget af fotomultiplier rør (PMT) gennem bandpass filtre (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Laserscanning bestod af et roterende polygonalt spejl (X-akse) og et galvanometerscanningsspejl (Y-akse), der muliggjorde videohastighedsscanningen (30 billeder i sekundet). Detaljerede oplysninger om intravital mikroskopi er beskrevet i de tidligere undersøgelser10,18,19,20,21,22,23.
I vores tidligere holmeundersøgelse18,vi med succes og stabilt afbildede holmene i levende mus ved hjælp af en transgen musemodel (MIP-GFP)24, hvor holmene blev mærket med GFP. Metoden muliggjorde visualisering i høj opløsning af ændringerne i holmene over en periode på 1 uge. Det lettede også billeddannelse af de samme holme i op til 3 uger, hvilket tyder på gennemførligheden af langsigtede undersøgelser af bugspytkirteløsehullerne til funktionel sporing eller overvågning under patogenese af diabetes mellitus18. Desuden har vi udviklet en orthotopic kræft i bugspytkirtlen model, hvor fluorescerende kræft i bugspytkirtlen celler (PANC-1 NucLight Red)25 blev direkte implanteret i bugspytkirtlen af musen. Med anvendelsen af bugspytkirtlen intravital billeddannelse vindue, denne model kunne bruges som en platform for at undersøge den cellulære og molekylære patofysiologi i tumor mikromiljø af kræft i bugspytkirtlen og for den terapeutiske overvågning af nye lægemiddel kandidater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de procedurer, der er beskrevet i dette dokument, blev udført i overensstemmelse med den8. udgave af vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr (2011)26 og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) og Seoul National University Bundang Hospital (SNUBH).
1. Tilberedning af vinduet og andre materialer
- Custom design bugspytkirtlen intravital billeddannelse vindue til at afsondre bugspytkirtlen fra tarmen i bughulen18 (Figur 1A,B). En detaljeret plan over vinduet er beskrevet i et supplerende tal for en tidligere undersøgelse18.
- Brug C57BL/6N mus, 8-12-uger gamle mænd, til intravital bugspytkirtel billeddannelse. Anti-CD31-antistof, der er konjugeret med en Alexa 647-fluorrør, 2 timer før billeddannelsen, indsprøjtes med henblik på mærkning af beholderen18.
- Til islets-undersøgelsen skal du forberede en transgen musemodel, hvor holmene er mærket med et fluorescerende reporterprotein. Her udnyttede vi MIP-GFP, hvor grønt fluorescerende protein blev udtrykt under kontrol af musen insulin 1 genpromotor, som er aktiv i betacellerne af alle holme i musen24.
- For kræft i bugspytkirtlen undersøgelse, forberede transgene kræftceller mærket med en fluorescerende reporter protein og BALB / C nøgen mus. I denne undersøgelse blev PANC-1 NucLight Red-cellerne brugt. PANC-1 kræftceller25 blev mærket med NucLight Red fluorescerende sonde.
- Steriliser alle kirurgiske værktøjer, dækglas (med PEG eller ej), og billedvinduer ved hjælp af en autoklave.
- Påfør PEG-belægning på dækglasset for at forhindre inflammatorisk respons og øge biokompatibiliteten, som er velegnet til langtidsbilleddannelse.
2. Kirurgi
- Forbered en steril kirurgisk platform og steriliser overfladerne med 70% ethanol.
BEMÆRK: Til billedbehandling i længderetningen er aseptisk teknik afgørende. - Bedøve mus med en blanding af tiletamin/zolazepam (30 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg).
BEMÆRK: Brug af tiletamin/zolazepam anbefales i stedet for ketamin på grund af dens negative virkning af hyperglykæmi. Optimal anæstesi skal vælges med henblik på eksperimentet9,27. - Overvåg kropstemperaturen ved hjælp af en rektal sonde med en homeothermic kontrolleret varmepude.
- Barber musens venstre flanke og påfør tre runder skiftevis alkohol og jodbaseret krat.
BEMÆRK: Hvis der anvendes depilatorisk creme, må du ikke efterlade mere end 1 minut for at undgå kemisk forbrænding. - Lav et 1,5 cm snit på musens venstre flanke og disseker huden og musklen.
- Udfør en pung-streng sutur med en sort eller nylon 4-0 sutur i snit margin.
- Brug en mikro retractor på snittet og forsigtigt udsætte milten.
- Saml forsigtigt milten med ring pincet og identificere bugspytkirtlen.
- Placer vinduet på musens flanke og passere milten og bugspytkirtlen gennem det åbne rum i vinduet. Manipulation af bugspytkirtlen skal være meget ikke-jøder, da det kan forårsage blødning eller pancreatitis
- Placer forsigtigt bugspytkirtlen på pladen i billedvinduet; milten placeres på vinduets åbne rum.
- For kræft celle undersøgelse, injicere PANC-1 NucLight Red (1,0 x 106 celler) direkte ind i bugspytkirtlen.
BEMÆRK: For billeddannelse orthotopic humane kræft i bugspytkirtlen xenografts, direkte implantation af kræft celle såsom PANC-1 eller andre menneskelige kræft i bugspytkirtlen celle kunne lettes28. For at visualisere med intravital fluorescensmikroskopi blev PANC-1-celler transduceret med rødt fluorescerende protein ved hjælp af NucLight Red lentiviral reagens, der mærker kernen29. Selvom maksimal injektionsvolumen er usikker, skal du reducere lydstyrken som muligt for at undgå trykeffekten i bugspytkirtlen. - Påfør dråber N-butyl cyanoacrylat lim på kanten af billedvinduet.
- For at minimere mængden af den påførte lim skal du bruge en 31 G kateternål til applikationen. Hvis mængden af dråben er stor, vil vævet utilsigtet klæbe til vinduet eller dække glas.
- Påfør forsigtigt et 12 mm rundt dækglas på billedvinduets margen.
- Træk sutursløjfen for at passe ind i vinduets siderille og binde den tre gange.
- Skær knudens maksimale proksimale sted for at forhindre afbrydelse af stramme sting, når disse mus er vågne.
- Lad mus komme sig efter anæstesi (2-3 timer) og injicere ketoprofen (5 mg/kg, subkutan i løs hud i bunden af dyrets hals eller hofte) for smertelindring. Revurdere for tegn på smerte hver 12. time, og ketoprofen bør overvejes hver 24. time i 1-3 dage.
BEMÆRK: Analgesi påvirker insulinsekretionen som reaktion på glukose9. Valget og timingen af smertestillende midler skal individualiseres til forsøgsformål. - Accomodate musen i buret med tilstrækkelig strøelse for at undgå kontakt af vinduet til buret. Undgå at huse huset med musene uden vindueskirurgi.
3. Intravital billeddannelse
- Tænd for intravital mikroskop, herunder laser magt.
- Tænd for varmepuden, og sæt den hjemlige regulering til 37 °C.
BEMÆRK: Alternativt kan du bruge en passiv varmepude eller lampe med hyppig kontrol, hvis der ikke er nogen hjemmemodal regulering. - Udfør intramuskulær anæstesi med en blanding af tiletamin/zolazepam (30 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg).
BEMÆRK: Brug af tiletamin/zolazepam anbefales i stedet for ketamin på grund af dens negative virkning af hyperglykæmi. Optimal anæstesi bør vælges med henblik på forsøgene9,27. - Indsæt et vaskulært kateter til injektionen.
- Tryk på den proksimale side af halen med indekset og tredje finger som et alternativ til en årepresseapplikation. Varm halen med en lampe, hvis det er nødvendigt.
- Steriliser halen vene med en 70% ethanol spray.
- Sæt et kateter på 30 G i sideåren. Regurgitation af blod vil blive visualiseret i PE10-røret.
- Påfør et silkebånd på kateteret for at stabilisere det.
- Der injiceres FITC/TMR dextran eller andre fluorescerende sonder (25 μg anti-CD31 konjugeret med Alexa 647), alt efter hvad der er relevant, i henhold til kombinationen af lysstofrørsonder18.
BEMÆRK: For fluorescerende konjugerede antistofsonder injiceres 2 timer før billedbehandlingssessionen.
- Overfør musen fra den kirurgiske platform til billedbehandlingsstadiet.
- Indsæt en rektal sonde for automatisk at styre kropstemperaturen med det hjemmetermiske varmepudesystem.
- Indsætning af vinduet til pancreas imaging i vinduesholderen, der er forberedt under opsætningen af intravital mikroskopi (Figur 2). For et omvendt mikroskop er en vinduesholder muligvis ikke påkrævet.
- Udfør intravital billeddannelse.
- Til billeddannelse i bugspytkirtlen skal du starte med en objektiv linse med lav forstørrelse (f.eks. 4x) til scanning af hele visningen af bugspytkirtlen i vinduet til billeddannelse i bugspytkirtlen (anbefalet synsfelt: 2500 x 2500 μm).
- Efter bestemmelse af interesseområdet skal du skifte til højere forstørrelsesmållinse (20x eller 40x) for at udføre billeddannelse på cellulært niveau (anbefalet synsfelt: 500 x 500 μm eller 250 x 250 μm). I dette eksperiment var den laterale og aksiale opløsning henholdsvis ca. 0,5 μm og 3 μm.
- Udfør z-stack- eller time-lapse-billedbehandling for at observere 3D-strukturen eller dynamikken på cellulært niveau, f.eks.
BEMÆRK: Ved billeddannelse var det fluorescerende protein, der udtrykker celler hos transgene dyr (MIP-GFP), 30 s intermitterende 488 nm lasereksponering med effekt op til 0,43 mW acceptabel uden mærkbar fotobleaching eller vævsskader. Til billeddannelse af fluorescerende proteiner mærket med Alexa 647 var 640 nm laserkraften op til 0,17 mW tålelig uden mærkbar fotobleaching eller vævsskader. Langvarig excitationslasereksponering med en effekt over denne indstilling kan føre til fotobleaching eller vævsskader ved fototoksicitet. Juster tilstrækkelig gevinst og magt til passende billede regionen af interesse. Detaljeret indstilling af parametre i intravital mikroskopi skal individualiseres for hver intravital mikroskopi udarbejdet i instituttet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intravital mikroskopi kombineret med den understøttende base integreret pancreas intravital imaging vindue muliggør langsgående cellulære niveau billeddannelse af bugspytkirtlen i en mus. Denne protokol med pancreas intravital imaging vindue giver langsigtet væv stabilitet, der gør det muligt at erhverve høj opløsning billeddannelse til at spore de enkelte holme i op til 3 uger. Som et resultat kan mosaikbilleddannelse til et udvidet synsfelt, tredimensionel (3D) rekonstruktion af z-stack imaging og langsgående sporing af samme position opnås. Derudover giver vores intravitale mikroskopi fire kanaler (405, 488, 561 og 647 nm) erhvervelse, hvilket muliggør samtidig multicellevisualisering med deres interaktioner.
Til den foreløbige billeddannelse blev vinduet implanteret i en C57BL/6N-mus med intravenøst injiceret anti-CD31 antistof konjugeret med en Alexa 647 fluorophore. Billeddannelse i store områder (figur 3A) og forstørret 3D-billeddannelse (Figur 3B-D, Supplerende Video 1) i bugspytkirtlen blev lettet med dette system. Pancreas væv blev visualiseret med autofluorescens, og den tilstødende vaskulatur mærket med anti-CD31 antistof blev identificeret. Svingning på grund af enten peristalsis eller åndedræt blev ikke identificeret, hvilket resulterede i gennemsnitlig billeddannelse med et højt signal-til-støj-forhold (figur 4). Acinar celler, som kræver visualisering på en mikroskala opløsning i bugspytkirtlen, blev klart visualiseret i den gennemsnitlige billeder.
Til billedbehandling af holmene blev en MIP-GFP-mus udnyttet. Ved hjælp af mosaikbilleddannelsesmetoden gjorde en bredfeltsvisning med billeddannelse med høj opløsning det muligt at visualiseringere holmene med den tilstødende vaskulatur (Figur 5). Omkring 40-50 holme blev identificeret i bredfeltsvisningen. Denne stabile billeddannelsesmetode kan yderligere lette sporingen af holmene i op til 3 uger, som det fremgår af en tidligere undersøgelse (figur 6)18.
For kræft celle billeddannelse, PANC-1 NucLight Røde celler blev direkte implanteret i musen bugspytkirtel under operationen (Figur 7). Der blev anvendt en dobbeltmærkningsstrategi bestående af PANC-1 NucLight Red-celler og nærliggende fartøjer, der var plettet med anti-CD31 konjugeret med Alexa 647. Med vores protokol, wide-field imaging af kræft i bugspytkirtlen (Figur 7A), som afgrænser margenen af tumor, og høj opløsning 3D-billeddannelse på enkelt-celle niveau, blev opnået (Figur 7B-D, Supplerende Video 2).
Figur 1: Design og fotografi af vinduet til intravital billeddannelse i bugspytkirtlen. (A) Et 3D- og tværsnit af vinduet til intravital billeddannelse i bugspytkirtlen. En detaljeret plan over størrelse og diameter er beskrevet i det forrige papir18. (B) Forreste og bageste fotografi af pancreas imaging vindue. Copyright 2020 Korean Diabetes Association fra Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Genoptrykt med tilladelse fra Den Koreanske Diabetesforening. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:Fotografi af implementeringen af vinduettil intravital billeddannelse i bugspytkirtlen. En pancreas intravital billeddannelse vindue er implanteret i musen i XYZ translationelle fase og billedbehandling kammerholder knyttet til vippe mount er forbundet til bugspytkirtel billeddannelse vinduet. Copyright 2020 Korean Diabetes Association fra Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Genoptrykt med tilladelse fra Den Koreanske Diabetesforening. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentativ intravital bugspytkirtelbilleddannelse i C57BL/6N-mus. (A) Wide-area image og (B) forstørret 3D-billede af bugspytkirtlen (grøn) og dens mikrovasculature (rød) i C57BL/6N musen. Beholdere er mærket med et anti-CD31 antistof konjugeret med Alexa 647 fluorophore. (C) 3D rekonstrueret billede og (D) overfladegengivelse billede af musen bugspytkirtel. Skalastang: 200 μm (A) og 50 μm (B-D). Se også Supplerende Video 1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:Intravital billeddannelse af acinarcelle og tilstødende vaskulatur. Acinarceller (grøn) og tilstødende vaskulatur (rød) i C57BL/6N-musen. Beholdere er mærket med Anti-CD31 antistof konjugeret med Alexa 647 fluorophore. Vævsstabilitet opnået med pancreas imaging vinduet giver et højt signal-til-støj-forhold billede. Skalalinje: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentativ intravital billeddannelse af bugspytkirteløse holme i MIP-GFP-musen. Wide-area mosaik og forstørret billede af holme (grøn) og tilstødende vaskulatur (rød) behandles med maksimal intensitet projektion metode i bugspytkirtlen af MIP-GFP mus. Beholdere er mærket med et anti-CD31 antistof konjugeret med Alexa 647 fluorophore. Skalastang: 500 μm (stort areal) og 50 μm (forstørret). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Intravital billeddannelse i længderetningen af holme i MIP-GFP-musens bugspytkirtel. Langsgående billede af holmene i op til 3 uger i bugspytkirtlen i MIP-GFP-musen. Hver pilespids med forskellige farver angiver de samme holme. Skalastang: 100 μm. Copyright 2020 Korean Diabetes Association fra Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Genoptrykt med tilladelse fra Den Koreanske Diabetesforening. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Repræsentativ intravital billeddannelse af kræftmodellen i bugspytkirtlen. (A) Billede i bredområdet og (B) forstørret 3D-billede af de implanterede PANC-1 NucLight Red-celler (rød) i BALB/c Nøgenmusen. Beholdere (blå) er mærket med et anti-CD31 antistof konjugeret med Alexa 647 fluorophore. (C) 3D rekonstrueret billede og (D) overflade-rendering billede af kræft i bugspytkirtlen i musen model. Skalastang: 500 μm (A) og 50 μm (B-D). Se også Supplerende Video 2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende video 1: In vivo 3D bugspytkirtel billeddannelse i C57BL/6N mus. In vivo 3D-billeddannelse af bugspytkirtel (grøn) af C57BL/6N mus intravenøst injiceres med en anti-CD31 antistof konjugeret med Alexa 647 fluorophore (rød). Skalalinjen er afbildet i videoen. Denne video svarer til Figur 3C, D. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende video 2: In vivo 3D kræft i bugspytkirtlen (PANC-1 NucLight Red) billeddannelse i BALB / C Nøgen mus. In vivo 3D-billeddannelse af kræft i bugspytkirtlen (rød) implanteret i BALB / C Nøgen mus intravenøst injiceres med en anti-CD31 antistof konjugeret med Alexa 647 fluorophore (blå). Skalalinjen er afbildet i videoen. Denne video svarer til Figur 7C, D. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen er beskrevet her består af intravital billeddannelse af bugspytkirtlen ved hjælp af en ny støtte base integreret pancreas intravital imaging vindue modificeret fra en abdominal billeddannelse vindue. Blandt de protokoller, der er beskrevet ovenfor, er det første kritiske skridt implantationen af det intravitale pancreas imaging vindue i musen. Til påføring af limen i vinduet er det vigtigt at anvende limen mellem vinduets margen og dækglasset, men ikke på bugspytkirtelvævet, da det kan afbryde intravital billeddannelse betydeligt. Ikke kun limen selv mellem glas og væv, men også adjungeret støv partikler kan fremkalde lys spredning under billeddannelse, hvis limen er direkte anvendt på vævet. Derudover kan anvendelsen af klæbemidlet have toksiske og ikke-fysiologiske virkninger på bugspytkirtlen.
Det andet trin er mængden af bugspytkirtelvæv placeret på metal-støtte bundpladen. Fordi bugspytkirtelvævet er et ark-lignende struktur, mængden af bugspytkirtelvæv på pladen skal kontrolleres. Hvis der er for stort et volumen på pladen, kan limen, der påføres ringens margen, klæbe til vævet, og masseeffekten kan hæmme perfusionen af bugspytkirtlen. På den anden side, hvis der er placeret for lille en diskenhed der, kan det synsfelt, der kan visualiseres, være begrænset. Denne protokol for kirurgi på vinduet kan kræve flere forsøg for at opfylde en ensartet standard.
For langsigtede billeddannelse over en periode på 3 uger, den mest om spørgsmålet var potentielle skader på bugspytkirtlen billeddannelse vindue. Utilsigtet ødelæggelse af dækglasset i vinduet til billeddannelse i bugspytkirtlen kan forekomme i den langsigtede observationsperiode. For at forhindre dette skal musen med vinduet placeres separat, og hårde genstande med skarpe kanter skal fjernes fra buret. Aktiv dødshjælp af mus bør overvejes, hvis dækglasset går i stykker, hvis der er alvorlige tegn på betændelse nær vinduet, eller hvis dyret ser ud til at være i nød. Det er vores erfaring, mus med pancreas imaging vindue var i stand til at spise og udøve normalt, når inddrivelsen efter operationen var passende, og ingen andre komplikationer blev udviklet.
I vores tidligere erfaring med abdominal imaging vinduet, har vi undladt at erhverve høj kvalitet cellulære niveau billeddannelse samt langsgående sporing af de samme pletter over flere dage. Sammenlignet med abdominal imaging vindue, som giver en forskelligartet platform for forskellige abdominal organer, pancreas imaging vinduet er yderligere specificeret for billeddannelse bugspytkirtlen samt andre organer, der er bløde og let påvirket af bevægelser som mesenteri, milt, og tyndtarm. Men, leveren og nyrerne kan være umuligt i bugspytkirtlen billeddannelse vindue på grund af den begrænsede plads.
Mens kombinationen af en fluorescerende mus, celler og antistofsonder gør det muligt at visualisering af de dynamiske interaktioner mellem endotelceller og enten holme eller kræftceller, kan den protokol, der er beskrevet her, gengives med andre sammensætninger af fluorescerende-mærkede celler eller molekylære sonder, der passer til hver enkelt tilstand. Desuden forventes ekspansive applikationer integreret med vores metode, såsom CpepSfGFP reportermus med insulinsekretion9,30, AAV8-medieret genlevering rettet mod reaktive iltarter (ROS)31, eller ortopisk tumormodel32,33,34, hvor tumoren in situ fuldt ud kan stimulere tumormikroenvironmentet, herunder tumorigenesis, udvikling og metastase35. Desuden kan patient-afledte xenograft modeller også studeres ved hjælp af vores platform36.
Der er et par begrænsninger, der skal behandles i denne undersøgelse. For det første, selv når vi udnyttede metalbasen til stabilisering, var vi ikke i stand til at bestemme den mekaniske stress, der blev induceret på vævet af basen og dækglas, hvilket kunne påvirke blodgennemstrømningen. Som afbildet i ovenstående tal, intravenøs injektion af et fluorescenskonjugeret antistof (CD31) eller dextran betegnede imidlertid fartøjet tilstrækkeligt uden noget andet ikke-perfunderet område, hvilket tyder på en minimal påvirkning af mekanisk belastning på den normale blodgennemstrømning inde i bugspytkirtelvævet. For det andet kunne bivirkninger som følge af klæbemidlet ikke vurderes i bugspytkirtelvævet. Ikke desto mindre forsøgte vi at undgå at røre bugspytkirtlen med klæbemidler så omhyggeligt som muligt for at undgå yderligere virkninger. For det tredje, som beskrevet ovenfor, kan den utilsigtede virkning af bedøvelsesmidler påvirke insulinfølsomheden og sekretionen, som beskrevet i den foregående undersøgelse9,27. Det er vores erfaring, en blanding af ketamin og xylazin induceret hyperglykæmi i forhold til blandingen af tiletamin, zolazepam og xylazin. En yderligere undersøgelse, der undersøger anæstesiens virkning på insulinsekretionen, bør udføres, og korrekt anæstesi med minimale bivirkninger bør vælges i henhold til hvert forsøg. For det fjerde, billeddannelse af bugspytkirtlen er fokuseret på halen del, og billeddannelse af hovedet del af bugspytkirtlen kunne være begrænset med vores vindue.
Sammenfattende blev en stabiliseret langsgående billeddannelse af bugspytkirtlen på cellulært niveau i op til flere uger lettet af vores billeddannelse system integreret med bugspytkirtlen intravital billeddannelse vindue optimeret til in vivo bugspytkirtel billeddannelse. Fordi intravital billeddannelse giver dynamisk indsigt i cellebiologi, immunologi og tumorbiologi, kan denne protokol være en nyttig metode til at undersøge patofysiologien af forskellige sygdomme, der involverer bugspytkirtlen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud nr. 14-2020-002 fra SNUBH Research Fund og af National Research Foundation of Korea (NRF) tilskud finansieret af Koreas regering (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window - custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder - custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
References
- Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A.
- Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. Technologies for imaging the normal and diseased pancreas. Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed. Diabetes Care. 31, Suppl 2 165-169 (2008).
- Baetens, D., et al. Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice. Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Ravier, M. A., Rutter, G. A. Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes. Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).
- Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose. Science Reports. 11 (1), 603 (2021).
- Lee, E. M., et al. Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice. Islets. 10 (1), 25-39 (2018).
- Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. In vivo imaging of islet transplantation. Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).
- Mojibian, M., et al. Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R.
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), 1024405 (2015).
- Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Park, I., et al. Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model. Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).
- Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy. Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Hwang, Y., et al. In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver. Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas. International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).
- National Institutes of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).
- Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice. Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Cichocki, F., et al. GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity. Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
- Reissaus, C. A., et al. A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).
- Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma. Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).
- Bisht, S., Feldmann, G. Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L.
- Feig, C., et al.
- Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models. Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).
