Summary
In vivo beeldvorming met hoge resolutie van de alvleesklier werd vergemakkelijkt met het pancreas intravital imaging venster.
Abstract
Directe in vivo cellulaire resolutie beeldvorming van de alvleesklier in een levend klein diermodel is technisch uitdagend geweest. Een recente intravital imaging studie, met een abdominale imaging window, maakte visualisatie van de cellulaire dynamiek in buikorganen in vivomogelijk . Vanwege de zachte bladachtige architectuur van de muisalvleesklier die gemakkelijk kan worden beïnvloed door fysiologische beweging (bijv. peristaltiek en ademhaling), was het echter moeilijk om gestabiliseerde longitudinale in vivo beeldvorming gedurende enkele weken op cellulair niveau uit te voeren om eilandjes of kankercellen in de muisalvleesklier te identificeren, te volgen en te kwantificeren. Hierin beschrijven we een methode voor het implanteren van een nieuwe ondersteunende basis, een geïntegreerd pancreas intravital imaging venster, dat de alvleesklier ruimtelijk van de darm kan scheiden voor longitudinale time-lapse intravital imaging van de alvleesklier microstructuur. Longitudinale in vivo beeldvorming met het beeldvormingsvenster maakt stabiele visualisatie mogelijk, waardoor eilandjes over een periode van 3 weken kunnen worden gevolgd en driedimensionale beeldvorming met hoge resolutie van de microstructuur, zoals hier blijkt uit een orthotopisch pancreaskankermodel. Met onze methode kunnen verdere intravital imaging studies de pathofysiologie van verschillende ziekten waarbij de alvleesklier op cellulair niveau betrokken is, verduidelijken.
Introduction
De alvleesklier is een buikorgaan met een exocriene functie in het spijsverteringskanaal en een endocriene functie van het afscheiden van hormonen in de bloedbaan. Hoge resolutie cellulaire beeldvorming van de alvleesklier kan de pathofysiologie onthullen van verschillende ziekten waarbij de alvleesklier betrokken is, waaronder pancreatitis, alvleesklierkanker en diabetes mellitus1. Conventionele diagnostische beeldvormingstools zoals computertomografie, magnetische resolutiebeeldvorming en ultrasonografie zijn op grote schaal beschikbaar in het klinische veld1,2. Deze beeldvormingsmodaliteiten zijn echter beperkt tot het visualiseren van alleen structurele of anatomische veranderingen, terwijl veranderingen op cellulair of moleculair niveau niet kunnen worden bepaald. Gezien het feit dat moleculaire veranderingen in diabetes mellitus of alvleesklierkanker bij mensen meer dan 10 jaar voorafgaand aan de diagnose3,4kunnen initiëren, heeft de detectie van pancreasziekten uit hun moleculaire overgang tijdens de latente periode het potentieel om een vroege diagnose en een tijdige interventie te bieden. Beeldvorming die de beperkingen van de resolutie zal overwinnen en waardevolle inzichten in de functie zal bieden, zal dus opmerkelijk veel aandacht krijgen door een vroege diagnose van alvleesklierkanker of geavanceerde identificatie van de verandering van de eilandjes tijdens de progressie van diabetes mellitus5.
Met name met de eilandjes zijn nucleaire beeldvorming, bioluminescentiebeeldvorming en optische coherentietomografie voorgesteld als niet-invasieve eilandjesbeeldvormingstechnieken6. De resolutie van deze methoden is echter aanzienlijk laag, met typische waarden variërend van enkele tientallen tot honderden micrometers, die een beperkte mogelijkheid bieden om veranderingen op cellulair niveau in de eilandjes te detecteren. Aan de andere kant werden eerdere studies met hoge resolutie van eilandjes uitgevoerd onder ex vivo7,8 (bijv. snijden of vertering van de alvleesklier), niet-fysiologische9 (bijv. exteriorisatie van de alvleesklier) en heterotone aandoeningen10,11,12 (bijv. implantatie onder de niercapsule, in de lever en in de voorste kamer van het oog), wat hun interpretatie en klinische implicaties beperkt. Als in vivo,fysiologisch en orthotopisch model van hoge resolutie beeldvorming kan worden vastgesteld, zal het een cruciaal platform zijn voor het onderzoek van pancreas eilandjes.
Intravital imaging, die de pathofysiologie op microscopisch resolutieniveau bij een levend dier onthult, heeft onlangs veel aandacht gekregen13. Van de in vivo beeldvormingsmethoden heeft de ontwikkeling van een abdominale beeldvormingsvenster14, dat een venster in de buik van een muis implanteert, de ontdekking van nieuwe bevindingen mogelijk maken (d.w.z. een premicrometastasestadium van vroege levermetastase15 en mechanisme van stamcelonderhoud in het darmepitheel16). Hoewel het abdominale beeldvormingsvenster waardevolle resultaten oplevert, zijn de toepassingen van dit venster voor de alvleesklier en het resulterende intravital imaging-onderzoek op basis van ziekten waarbij de alvleesklier betrokken is, niet uitgebreid onderzocht.
In tegenstelling tot de goed gedefinieerde solide orgaankenmerken van de menselijke alvleesklier, is de alvleesklier van een muis een diffuus verdeelde zachte weefselachtige structuur17. Daarom wordt het onophoudelijk beïnvloed door fysiologische bewegingen, waaronder peristaltiek en ademhaling. Een eerdere studie over de toepassing van een abdominale beeldvormingsvenster voor de alvleesklier toonde aan dat dwalen plaatsvond als gevolg van bewegingsartefacten veroorzaakt door stoelgang18. Ernstige vervaging werd waargenomen in het resulterende gemiddelde beeld, wat de visualisatie en identificatie van de microschaalstructuren belemmerde.
Hierin beschrijven we het gebruik van een nieuw ondersteunend basis geïntegreerd pancreas intravital imaging venster gecombineerd met intravital microscopie19,20 om de longitudinale cellulaire niveau gebeurtenissen bij ziekten waarbij de alvleesklier betrokken is te onderzoeken. Naast een gedetailleerde beschrijving van de methodologie in de vorige studie18, zal de uitgebreide toepassing van pancreasbeeldvormingsvenster voor verschillende ziekten waarbij de alvleesklier betrokken is, in dit document worden behandeld. In dit protocol werd een op maat gemaakt videosnelheidslaserscansysteem voor confocale microscopie gebruikt als een intravital microscopiesysteem. Vier lasermodules (golflengten bij 405, 488, 561 en 640 nm) werden gebruikt als excitatiebron en vier kanalen van emissiesignalen werden gedetecteerd door fotomultiplicatorbuizen (PMT) via bandpassfilters (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Laserscanning bestond uit een roterende veelhoekige spiegel (X-as) en een galvanometerscanspiegel (Y-as) die het scannen van videosnelheid mogelijk maakte (30 frames per seconde). Gedetailleerde informatie over intravitale microscopie is beschreven in de vorige studies10,18,19,20,21,22,23.
In onze vorige eilandjesstudie18hebben we met succes en stabiel de eilandjes in levende muizen in beeld brengen met behulp van een transgeen muismodel (MIP-GFP)24 waarin de eilandjes werden getagd met GFP. De methode maakte visualisatie met hoge resolutie van de wijzigingen in de eilandjes over een periode van 1 week mogelijk. Het vergemakkelijkte ook de beeldvorming van dezelfde eilandjes gedurende maximaal 3 weken, wat de haalbaarheid suggereert van langetermijnstudies van de pancreas eilandjes voor het functioneel volgen of monitoren tijdens de pathogenese van diabetes mellitus18. Verder ontwikkelden we een orthotopisch pancreaskankermodel waarbij fluorescerende alvleesklierkankercellen (PANC-1 NucLight Red)25 direct in de alvleesklier van de muis werden geïmplanteerd. Met de toepassing van het pancreas intravital imaging venster, dit model kan worden gebruikt als een platform voor het onderzoeken van de cellulaire en moleculaire pathofysiologie in de tumor micro-omgeving van alvleesklierkanker en voor de therapeutische monitoring van nieuwe drug kandidaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die in dit document worden beschreven, zijn uitgevoerd in overeenstemming met de8e editie van de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (2011)26 en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) en seoul National University Bundang Hospital (SNUBH).
1. Voorbereiding van het raam en andere materialen
- Aangepast ontwerp van het pancreas intravital beeldvormingsvenster om de alvleesklier van de darm in de buikholte af te scheiden18 (Figuur 1A,B). Een gedetailleerde blauwdruk van het venster wordt beschreven in een aanvullende figuur van een eerdere studie18.
- Gebruik C57BL/6N muizen, 8-12 weken oude mannetjes, voor intravitale pancreas beeldvorming. Injecteer anti-CD31 antilichaam geconjugeerd met een Alexa 647 fluorofoor, 2 uur voorafgaand aan de beeldvorming, met het oog op vaatetikettering18.
- Bereid voor de eilandjesstudie een transgeen muismodel voor waarin de eilandjes zijn getagd met een fluorescerend reporter-eiwit. Hier gebruikten we MIP-GFP, waar groene fluorescerende eiwitten werden uitgedrukt onder de controle van de muis insuline 1 genpromotor, die actief is in de bètacellen van alle eilandjes in de muis24.
- Bereid voor de alvleesklierkankerstudie transgene kankercellen voor die zijn getagd met een fluorescerend reporter-eiwit en BALB/C naaktmuizen. In deze studie werden de PANC-1 NucLight Red cellen gebruikt. PANC-1 kankercellen25 werden gelabeld met de NucLight Red fluorescerende sonde.
- Steriliseer alle chirurgische hulpmiddelen, bedek glas (met PEG of niet) en beeldvensters met behulp van een autoclaaf.
- Breng PEG-coating aan op het afdekglas om ontstekingsreactie te voorkomen en de biocompatibiliteit te verhogen, die geschikt is voor langdurige beeldvorming.
2. Chirurgie
- Bereid een steriel chirurgisch platform voor en steriliseer de oppervlakken met 70% ethanol.
OPMERKING: Voor longitudinale beeldvormingssessies is aseptische techniek essentieel. - Verdoof muizen met een mengsel van tiletamine/zolazepam (30 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg).
OPMERKING: Het gebruik van tiletamine/zolazepam wordt aanbevolen in plaats van ketamine vanwege het nadelige effect van hyperglykemie. Optimale anesthesie moet worden geselecteerd voor het doel van het experiment9,27. - Bewaak de lichaamstemperatuur met behulp van een rectale sonde met een homeothermisch geregeld verwarmingskussen.
- Scheer de linkerflank van de muis en breng drie rondes afwisselend alcohol en scrub op basis van jodium aan.
OPMERKING: Als ontharingscrème wordt gebruikt, laat dan niet langer dan 1 minuut staan om chemische verbranding te voorkomen. - Maak een incisie van 1,5 cm op de linkerflank van de muis en ontleed de huid en spieren.
- Voer een ringsnaar hechtdraad uit met een zwarte of nylon 4-0 hechtdraad in de incisiemarge.
- Gebruik een micro-oprolmechanisme op de incisie en stel de milt voorzichtig bloot.
- Pool de milt voorzichtig met ringdarm en identificeer de alvleesklier.
- Plaats het raam op de flank van de muis en passeer de milt en alvleesklier door de open ruimte van het raam. Manipulatie van de alvleesklier moet zeer heidens zijn omdat het bloedingen of pancreatitis kan veroorzaken
- Plaats de alvleesklier voorzichtig op de plaat van het beeldvenster; de milt wordt op de open ruimte van het raam geplaatst.
- Injecteer voor de kankercelstudie PANC-1 NucLight Red (1,0 x 106 cellen) rechtstreeks in de alvleesklier.
OPMERKING: Voor beeldvorming van de orthotopische xenograften van menselijke alvleesklierkanker kan directe implantatie van kankercel zoals PANC-1 of andere menselijke pancreaskankercel worden vergemakkelijkt28. Om te visualiseren met intravitale fluorescentiemicroscopie, werden PANC-1 cellen getransduceerd met rood fluorescerend eiwit met behulp van het NucLight Red lentiviral reagens dat de kernlabelt 29. Hoewel het maximale injectievolume onzeker is, vermindert u het volume zo veel mogelijk om het drukeffect in de alvleesklier te voorkomen. - Breng druppels N-butylcyanoacrylaatlijm aan op de rand van het beeldvenster.
- Gebruik voor de toepassing een katheternaald van 31 G om de hoeveelheid aangebrachte lijm te minimaliseren. Als de hoeveelheid van de druppel groot is, zal het weefsel zich onbedoeld aan het raam of afdekglas hechten.
- Breng voorzichtig een 12 mm rond afdekglas aan op de rand van het beeldvenster.
- Trek aan de hechtlus om in de laterale groef van het raam te passen en bind deze drie keer vast.
- Snijd de maximale proximale plaats van de knoop om de onderbreking van strakke hechtingen te voorkomen wanneer deze muizen wakker zijn.
- Laat muizen herstellen van anesthesie (2-3 uur) en injecteer ketoprofen (5 mg/kg, onderhuids in de losse huid aan de basis van nek of heup van het dier) voor pijnverlichting. Herbeoordeling op tekenen van pijn om de 12 uur en ketoprofen moet elke 24 uur gedurende 1-3 dagen worden overwogen.
OPMERKING: Analgesie beïnvloedt de insulinesecretie als reactie op glucose9. De keuze en timing van analgesie moeten worden geïndividualiseerd voor het experimentele doel. - Accomodate de muis in de kooi met voldoende beddengoed om het contact van het raam met de kooi te voorkomen. Vermijd het huis te huisvesten met de muizen zonder de raamoperatie.
3. Intravital beeldvorming
- Schakel de intravitale microscoop in, inclusief de laserkracht.
- Zet het verwarmingskussen aan en stel de homeothermische regeling in op 37 °C.
OPMERKING: U kunt ook een passief verwarmingskussen of lamp met frequente controle gebruiken als er geen homeothermische regeling is. - Voer intramusculaire anesthesie uit met een mengsel van tiletamine/zolazepam (30 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg).
OPMERKING: Het gebruik van tiletamine/zolazepam wordt aanbevolen in plaats van ketamine vanwege het nadelige effect van hyperglykemie. Optimale anesthesie moet worden geselecteerd voor de experimenten9,27. - Plaats een vasculaire katheter voor de injectie.
- Oefen druk uit op de proximale kant van de staart met de wijs- en derde vinger als alternatief voor een tourniquettoepassing. Verwarm de staart indien nodig met een lamp.
- Steriliseer de staartader met een 70% ethanolspray.
- Steek een katheter van 30 G in de laterale staartader. Regurgitatie van bloed zal worden gevisualiseerd in de PE10 buis.
- Breng een zijden tape aan op de katheter om deze te stabiliseren.
- Injecteer FITC/TMR dextran of andere fluorescerende sondes (25 μg anti-CD31 geconjugeerd met Alexa 647), naargelang het geval, volgens de combinatie van fluorescentiesondes18.
OPMERKING: Voor fluorescerende geconjugeerde antilichaamsondes moet u 2 uur voor de beeldvormingssessie injecteren.
- Breng de muis over van het operatieplatform naar de beeldvormingsfase.
- Plaats een rectale sonde om de lichaamstemperatuur automatisch te regelen met het homeothermische verwarmingskussensysteem.
- Plaats het pancreasbeeldvormingsvenster in de vensterhouder die is voorbereid tijdens de intravitale microscopie(figuur 2). Voor een omgekeerde microscoop is een raamhouder mogelijk niet nodig.
- Intravital imaging uitvoeren.
- Voor het weergeven van de alvleesklier begint u met een lens met een lage vergrotingsdoelstelling (bijv. 4x) voor het scannen van het hele beeld van de alvleesklier in het beeldvormingsvenster van de pancreas (aanbevolen gezichtsveld: 2500 x 2500 μm).
- Schakel na bepaling van het interessegebied over op een lens met een hogere vergrotingsdoelstelling (20x of 40x) om de beeldvorming op cellulair niveau uit te voeren (aanbevolen gezichtsveld: 500 x 500 μm of 250 x 250 μm). In dit experiment was de laterale en axiale resolutie respectievelijk ongeveer 0,5 μm en 3 μm.
- Voer z-stack- of timelapse-beeldvorming uit om de 3D-structuur of dynamiek op cellulair niveau te observeren, zoals celmigratie.
OPMERKING: Voor beeldvorming van het fluorescerende eiwit dat cellen van transgene dieren uitdrukt (MIP-GFP), was 30 s intermitterende laserblootstelling van 488 nm met een vermogen tot 0,43 mW aanvaardbaar zonder merkbare fotobleaching of weefselschade. Voor het weergeven van de fluorescerende eiwitten gelabeld met Alexa 647, was het laservermogen van 640 nm tot 0,17 mW aanvaardbaar zonder merkbare fotobleaching of weefselschade. Langdurige excitatielaserblootstelling met een vermogen boven deze instelling kan leiden tot fotobleaching of weefselschade door fototoxiciteit. Pas de juiste versterking en kracht aan om de interesseregio op de juiste manier in beeld te krijgen. Gedetailleerde instelling van parameters in intravitale microscopie moet worden geïndividualiseerd voor elke intravitale microscopie die in het instituut wordt voorbereid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intravitale microscopie in combinatie met de ondersteunende basis geïntegreerde pancreas intravital imaging venster maakt longitudinale cellulaire niveau beeldvorming van de alvleesklier in een muis mogelijk. Dit protocol met het pancreas intravital imaging venster biedt op lange termijn weefselstabiliteit die het mogelijk maakt om beeldvorming met hoge resolutie te verkrijgen om individuele eilandjes tot 3 weken te volgen. Als gevolg hiervan kan mozaïekbeeldvorming voor een uitgebreid gezichtsveld, driedimensionale (3D) reconstructie van z-stack imaging en longitudinale tracking van dezelfde positie worden bereikt. Bovendien biedt onze intravitale microscopie vier kanalen (405, 488, 561 en 647 nm) acquisitie, waardoor gelijktijdige meervoudige celvisualisatie met hun interacties mogelijk is.
Voor de voorlopige beeldvorming werd het venster geïmplanteerd in een C57BL/6N-muis met intraveneus geïnjecteerd anti-CD31-antilichaam geconjugeerd met een Alexa 647-fluorofoor. Beeldvorming in het hele gebied (figuur 3A) en vergrote 3D-beeldvorming (figuur 3B-D, aanvullende video 1) van de alvleesklier werden met dit systeem vergemakkelijkt. Pancreasweefsel werd gevisualiseerd met autofluorescentie en het aangrenzende vasculatuur gelabeld met het anti-CD31-antilichaam werd geïdentificeerd. Oscillatie als gevolg van peristaltiek of ademhaling werd niet geïdentificeerd, wat resulteerde in gemiddelde beeldvorming met een hoge signaal-ruisverhouding (figuur 4). Acinaire cellen, die visualisatie vereisen met een microschaalresolutie in de alvleesklier, werden duidelijk gevisualiseerd in de gemiddelde beelden.
Voor de beeldvorming van de eilandjes werd een MIP-GFP muis gebruikt. Met behulp van de mozaïekbeeldvormingsmethode maakte een breedveldweergave met beeldvorming met hoge resolutie de visualisatie van de eilandjes met het aangrenzende vasculatuur mogelijk (figuur 5). Ongeveer 40-50 eilandjes werden geïdentificeerd in het brede veldbeeld. Deze stabiele beeldvormingsmethode zou het volgen van de eilandjes tot 3 weken verder kunnen vergemakkelijken , zoals blijkt uit een eerdere studie (figuur 6)18.
Voor de beeldvorming van kankercellen werden PANC-1 NucLight Red-cellen tijdens de operatie direct in de alvleesklier van de muis geïmplanteerd (figuur 7). Er werd een dual-labeling strategie gebruikt, bestaande uit PANC-1 NucLight Red cellen en nabijgelegen vaten bevlekt met anti-CD31 geconjugeerd met Alexa 647. Met ons protocol werd wide-field imaging van alvleesklierkanker (figuur 7A), die de marge van de tumor afbakent, en hoge resolutie 3D-beeldvorming op eencellig niveau bereikt (Figuur 7B-D, Aanvullende Video 2).
Figuur 1: Ontwerp en foto van het pancreas intravital imaging venster. (A) Een 3D- en dwarsdoorsnede van het pancreas intravital imaging venster. Een gedetailleerde blauwdruk van de grootte en diameter wordt beschreven in het vorige document18. (B) Voorste en achterste foto van het pancreasbeeldvenster. Copyright 2020 Koreaanse diabetesvereniging van Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Herdrukt met toestemming van The Korean Diabetes Association. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Foto van de implementatie van het pancreas intravital imaging venster. Een pancreas intravital imaging venster wordt geïmplanteerd in de muis in de XYZ translationele fase en de imaging kamer houder bevestigd aan de kantelbare mount is verbonden met de pancreas imaging venster. Copyright 2020 Koreaanse diabetesvereniging van Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Herdrukt met toestemming van The Korean Diabetes Association. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Representatieve intravitale pancreas beeldvorming bij C57BL/6N muis. (A) Breedbeeld en (B) vergroot 3D-beeld van de alvleesklier (groen) en zijn microvasculatuur (rood) in de C57BL/6N muis. Vaten zijn gelabeld met een anti-CD31-antilichaam dat is geconjugeerd met de Alexa 647-fluorofoor. (C) 3D gereconstrueerd beeld en (D) oppervlakte-rendering beeld van de muis alvleesklier. Schaalbalk: 200 μm (A) en 50 μm (B-D). Zie ook Aanvullende video 1. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Intravital imaging van acinaire cel en aangrenzende vasculatuur. Acinaire cellen (groen) en aangrenzende vasculatuur (rood) in de C57BL/6N muis. Vaten zijn gelabeld met Anti-CD31 antilichaam geconjugeerd met de Alexa 647 fluorofoor. Weefselstabiliteit bereikt met het pancreasbeeldvenster zorgt voor een beeld met een hoge signaal-ruisverhouding. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Representatieve intravitale beeldvorming van pancreas eilandjes in de MIP-GFP muis. Breed mozaïek en vergroot beeld van de eilandjes (groen) en aangrenzende vasculatuur (rood) verwerkt met maximale intensiteit projectiemethode in de alvleesklier van de MIP-GFP muis. Vaten zijn gelabeld met een anti-CD31-antilichaam dat is geconjugeerd met de Alexa 647-fluorofoor. Schaalbalk: 500 μm (breed oppervlak) en 50 μm (vergroot). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Longitudinale intravitale beeldvorming van eilandjes in de alvleesklier van de MIP-GFP muis. Longitudinale afbeelding van de eilandjes voor maximaal 3 weken in de alvleesklier in de MIP-GFP muis. Elke pijlpunt met verschillende kleuren geeft dezelfde eilandjes aan. Schaalbalk: 100 μm. Copyright 2020 Koreaanse diabetesvereniging van Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Herdrukt met toestemming van The Korean Diabetes Association. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Representatieve intravitale beeldvorming van het alvleesklierkankermodel. (A) Breedbeeld en (B) vergroot 3D-beeld van de geïmplanteerde PANC-1 NucLight Red cellen (rood) in de BALB/c Nude muis. Vaten (blauw) zijn gelabeld met een anti-CD31-antilichaam geconjugeerd met de Alexa 647 fluorofoor. (C) 3D gereconstrueerd beeld en (D) oppervlakte-rendering beeld van alvleesklierkanker in het muismodel. Schaalbalk: 500 μm (A) en 50 μm (B-D). Zie ook Aanvullende video 2. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullende video 1: In vivo 3D pancreas beeldvorming in C57BL/6N muis. In vivo 3D-beeldvorming van alvleesklier (groen) van C57BL/6N muis intraveneus geïnjecteerd met een anti-CD31 antilichaam geconjugeerd met de Alexa 647 fluorofoor (rood). De schaalbalk wordt weergegeven in de video. Deze video komt overeen met figuur 3C,D. Klik hier om deze Video te downloaden.
Aanvullende video 2: In vivo 3D alvleesklierkanker (PANC-1 NucLight Red) beeldvorming in BALB/C Naaktmuis. In vivo 3D-beeldvorming van alvleesklierkanker (rood) geïmplanteerd in BALB/C Naaktmuis intraveneus geïnjecteerd met een anti-CD31 antilichaam geconjugeerd met de Alexa 647 fluorofoor (blauw). De schaalbalk wordt weergegeven in de video. Deze video komt overeen met figuur 7C,D. Klik hier om deze Video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven protocol bestaat uit intravitale beeldvorming van de alvleesklier met behulp van een nieuw ondersteunend basis geïntegreerd pancreas intravital imaging venster aangepast vanuit een abdominale imaging venster. Onder de hierboven beschreven protocollen is de eerste kritieke stap de implantatie van het intravitale pancreasbeeldvormingsvenster in de muis. Voor het aanbrengen van de lijm in het raam is het belangrijk om de lijm tussen de rand van het raam en het afdekglas aan te brengen, maar niet op het pancreasweefsel, omdat het intravitale beeldvorming aanzienlijk kan onderbreken. Niet alleen de lijm zelf tussen het glas en het weefsel, maar ook de stofdeeltjes kunnen lichtverstrooiing veroorzaken tijdens de beeldvorming als de lijm rechtstreeks op het weefsel wordt aangebracht. Bovendien kan het aanbrengen van de lijm toxische en niet-fysiologische effecten hebben op de alvleesklier.
De tweede stap is de hoeveelheid pancreasweefsel die op de metalen basisplaat wordt geplaatst. Omdat het pancreasweefsel een plaatachtige structuur is, moet het volume pancreasweefsel op de plaat worden gecontroleerd. Als er een te groot volume op de plaat wordt geplaatst, kan de lijm die op de rand van de ring wordt aangebracht zich aan het weefsel hechten en kan het massa-effect de perfusie van de alvleesklier belemmeren. Aan de andere kant, als er een te klein volume op wordt geplaatst, kan het gezichtsveld dat kan worden gevisualiseerd, beperkt zijn. Dit protocol van chirurgie op het venster kan verschillende proeven vereisen om aan een consistente standaard te voldoen.
Voor langdurige beeldvorming over een periode van 3 weken was het meest zorgwekkende probleem potentiële schade aan het pancreasbeeldvormingsvenster. Onbedoelde vernietiging van het afdekglas in het pancreasbeeldvenster kan optreden tijdens de lange observatieperiode. Om dit te voorkomen, moet de muis met het raam apart worden gehuisvest en moeten harde voorwerpen met scherpe randen uit de kooi worden verwijderd. De euthanasie van muizen moet worden overwogen als het afdekglas breekt, als er ernstige tekenen van ontsteking bij het raam zijn of als het dier in nood lijkt te zijn. In onze ervaring konden muizen met het pancreasbeeldvormingsvenster normaal eten en sporten wanneer het herstel na de operatie geschikt was en er geen andere complicatie werd ontwikkeld.
In onze eerdere ervaring met het abdominale beeldvormingsvenster slaagden we er niet in om beeldvorming op cellulair niveau van hoge kwaliteit te verkrijgen, evenals longitudinale tracking van dezelfde vlekken over meerdere dagen. In vergelijking met het abdominale beeldvormingsvenster, dat een divers platform biedt voor verschillende buikorganen, wordt het pancreasbeeldvormingsvenster verder gespecificeerd voor beeldvorming van de alvleesklier en andere organen die zacht zijn en gemakkelijk kunnen worden beïnvloed door bewegingen zoals mesenterie, milt en dunne darm. De lever en nieren kunnen echter onhaalbaar zijn in het beeldvormingsvenster van de pancreas vanwege de beperkte ruimte.
Hoewel de combinatie van een fluorescerende muis, cellen en antilichaamsondes de visualisatie mogelijk maakt van de dynamische interacties tussen endotheelcellen en de eilandjes of kankercellen, kan het hier beschreven protocol worden gereproduceerd met andere samenstellingen van fluorescerende cellen of moleculaire sondes die geschikt zijn voor elke respectieve aandoening. Verder worden uitgebreide toepassingen verwacht die zijn geïntegreerd met onze methode, zoals de CpepSfGFP-reportermuis met insulinesecretie9,30, AAV8-gemedieerde genafgifte gericht op reactieve zuurstofsoorten (ROS)31, of orthotopische tumormodel32,33,34 waarin de tumor in situ de tumormicromilieu volledig kan stimuleren, inclusief tumorigenese, ontwikkeling en metastase35. Bovendien kunnen patiënt-afgeleide xenograftmodellen ook worden bestudeerd met behulp van ons platform36.
Er zijn een paar beperkingen die in deze studie moeten worden aangepakt. Ten eerste, zelfs toen we de metalen basis gebruikten voor stabilisatie, waren we niet in staat om de mechanische spanning te bepalen die door de basis op het weefsel werd veroorzaakt en glas bedekte, wat de bloedstroom kon beïnvloeden. Zoals in de bovenstaande cijfers is afgebeeld, heeft intraveneuze injectie van een fluorescentiegeconjugeerd antilichaam (CD31) of dextran het vat echter voldoende gelabeld zonder te onderscheiden niet-perfused gebied, wat wijst op een minimale impact van mechanische belasting op de normale bloedstroom in het pancreasweefsel. Ten tweede konden bijwerkingen als gevolg van de lijm niet worden beoordeeld in het pancreasweefsel. Toch hebben we geprobeerd om het aanraken van alvleesklier met lijmen zo zorgvuldig mogelijk te voorkomen om extra effecten te voorkomen. Ten derde kan, zoals hierboven besproken, de onbedoelde impact van verdovende middelen de insulinegevoeligheid en secretie beïnvloeden, zoals beschreven in de vorige studie9,27. Onze ervaring is dat een mengsel van ketamine en xylazine hyperglykemie veroorzaakte in vergelijking met het mengsel van tiletamine, zolazepam en xylazine. Een verder onderzoek naar het effect van anesthesie op insulinesecretie moet worden uitgevoerd en de juiste anesthesie met minimale nadelige effecten moet worden geselecteerd op basis van elk experiment. Ten vierde is de beeldvorming van de alvleesklier gericht op het staartgedeelte en kan de beeldvorming van het hoofdgedeelte van de alvleesklier worden beperkt met ons venster.
Kortom, een gestabiliseerde longitudinale beeldvorming van de alvleesklier op cellulair niveau gedurende maximaal enkele weken werd vergemakkelijkt door ons beeldvormingssysteem geïntegreerd met het pancreas intravital imaging venster geoptimaliseerd voor in vivo alvleesklier beeldvorming. Omdat intravitale beeldvorming dynamische inzichten biedt in celbiologie, immunologie en tumorbiologie, kan dit protocol een nuttige methode zijn voor het onderzoeken van de pathofysiologie van verschillende ziekten waarbij de alvleesklier betrokken is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidie nr. 14-2020-002 van het SNUBH Research Fund en door de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window - custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder - custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
References
- Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A.
- Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. Technologies for imaging the normal and diseased pancreas. Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed. Diabetes Care. 31, Suppl 2 165-169 (2008).
- Baetens, D., et al. Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice. Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Ravier, M. A., Rutter, G. A. Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes. Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).
- Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose. Science Reports. 11 (1), 603 (2021).
- Lee, E. M., et al. Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice. Islets. 10 (1), 25-39 (2018).
- Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. In vivo imaging of islet transplantation. Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).
- Mojibian, M., et al. Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R.
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), 1024405 (2015).
- Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Park, I., et al. Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model. Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).
- Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy. Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Hwang, Y., et al. In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver. Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas. International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).
- National Institutes of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).
- Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice. Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Cichocki, F., et al. GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity. Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
- Reissaus, C. A., et al. A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).
- Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma. Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).
- Bisht, S., Feldmann, G. Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L.
- Feig, C., et al.
- Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models. Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).
