Summary
في البروتوكول الحالي ، نوضح كيفية تصور استئصال نهاية الحمض النووي المزدوج خلال مرحلة S / G2 من دورة الخلية باستخدام طريقة قائمة على التألق المناعي.
Abstract
تعد دراسة الاستجابة لتلف الحمض النووي (DDR) مجالا معقدا وأساسيا ، والذي أصبح أكثر أهمية فقط بسبب استخدام الأدوية التي تستهدف DDR لعلاج السرطان. هذه الأهداف هي البوليميراز البولي (ADP-ribose) (PARPs) ، والتي تبدأ أشكالا مختلفة من إصلاح الحمض النووي. إن تثبيط هذه الإنزيمات باستخدام مثبطات PARP (PARPi) يحقق الفتك الاصطناعي من خلال منح ضعف علاجي في الخلايا التي تعاني من نقص في إعادة التركيب المتماثل (HR) بسبب الطفرات في سرطان الثدي من النوع 1 (BRCA1) أو BRCA2 أو شريك وتوطين BRCA2 (PALB2).
الخلايا المعالجة ب PARPi تتراكم فواصل الحمض النووي مزدوجة الخيط (DSBs). تتم معالجة هذه الفواصل بواسطة آلية استئصال نهاية الحمض النووي ، مما يؤدي إلى تكوين الحمض النووي الأحادي (SS) وإصلاح الحمض النووي اللاحق. في سياق BRCA1 الناقص ، يؤدي تنشيط استئصال الحمض النووي من خلال الطفرات في مثبطات استئصال الحمض النووي ، مثل 53BP1 و DYNLL1 ، إلى مقاومة PARPi. لذلك ، فإن القدرة على مراقبة استئصال الحمض النووي في السيلولو أمر بالغ الأهمية لفهم أوضح لمسارات إصلاح الحمض النووي وتطوير استراتيجيات جديدة للتغلب على مقاومة PARPi. تسمح التقنيات القائمة على التألق المناعي (IF) بمراقبة استئصال الحمض النووي العالمي بعد تلف الحمض النووي. تتطلب هذه الاستراتيجية وضع علامات الحمض النووي الجينومي طويل النبض باستخدام 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU). بعد تلف الحمض النووي واستئصال نهاية الحمض النووي ، يتم الكشف عن الحمض النووي الناتج الذي تقطعت به السبل على وجه التحديد بواسطة جسم مضاد مضاد ل BrdU في ظل ظروف أصلية. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا دراسة استئصال الحمض النووي باستخدام علامات دورة الخلية للتمييز بين المراحل المختلفة لدورة الخلية. تسمح الخلايا في مرحلة S / G2 بدراسة الاستئصال النهائي داخل HR ، في حين يمكن استخدام خلايا G1 لدراسة الانضمام النهائي غير المتجانس (NHEJ). يتم وصف بروتوكول مفصل لطريقة IF هذه إلى جانب التمييز في دورة الخلية في هذه الورقة.
Introduction
يعد تعديل عوامل إصلاح الحمض النووي طريقة دائمة التطور لعلاج السرطان ، خاصة في بيئات الأورام التي تعاني من نقص في إصلاح الحمض النووي. يعد تثبيط عوامل إصلاح محددة أحد الاستراتيجيات البارعة المستخدمة لتوعية الخلايا السرطانية بالعوامل الضارة بالحمض النووي. أدت عقود من الأبحاث إلى تحديد طفرات مختلفة من جينات إصلاح الحمض النووي كمؤشرات حيوية لخيارات الاستراتيجية العلاجية1. ونتيجة لذلك، أصبح مجال إصلاح الحمض النووي مركزا لتطوير الأدوية لضمان مجموعة واسعة من العلاجات، وتمكين مفهوم الطب الشخصي.
يتم إصلاح DSBs من خلال مسارين رئيسيين: NHEJ و HR2. مسار NHEJ عرضة للخطأ ، حيث يربط بسرعة نهايتين من الحمض النووي مع القليل من المعالجة النهائية للحمض النووي أو لا يوجد على الإطلاق ويتضمن بروتين كيناز (DNA-PKcs) ، ومركب Ku70/80 ، و 53BP1 ، وبروتينات RIF1 3. في المقابل ، الموارد البشرية هي آلية مخلصة بدأتها BRCA14. خطوة أساسية في إصلاح الموارد البشرية هي عملية استئصال نهاية الحمض النووي ، وهي تدهور النهايات المكسورة مما يؤدي إلى الحمض النووي الأحادي (SS) مع نهايات 3'-OH. يسهل BRCA1 توظيف البروتينات النهائية التي تشكل MRN / RPA / BLM / DNA2 / EXO1 ، والتي تشارك في استئصال الحمض النووي من 5 إلى 3 أقدام5.
يتم إنجاز الاستئصال النهائي الأولي من خلال نشاط endonuclease لل MRE11 ، مما يسمح بمزيد من المعالجة بواسطة nucleases DNA2 و EXO1. يتم طلاء بقايا ssDNA المتولدة بسرعة بواسطة بروتين النسخ المتماثل A (RPA) لحمايتها من المعالجة الإضافية. بعد ذلك ، تشارك BRCA2 و PALB2 و BRCA1 في التوسط في إزاحة RPA وتجميع نواة RAD51 المطلوبة لآلية الإصلاح الموجهة بالتماثل. من الضروري وجود توازن دقيق بين استخدام NHEJ والموارد البشرية للحفاظ الأمثل على السلامة الجينومية. يعتمد اختيار المسار على مرحلة دورة الخلية. يتم استخدام الموارد البشرية بشكل تفضيلي خلال المراحل من S إلى G2 حيث يكون استئصال الحمض النووي على أعلى مستوى ، وتتوفر الكروماتيدات الشقيقة لضمان الإصلاح المناسب.
بوليميراز بولي (ADP-ribose) 1 (PARP-1) هو واحد من أوائل البروتينات التي تم تجنيدها في DSB. وهو ينظم كل من نشاط الاستئصال وتجميع المؤثرات النهائية المشاركة في NHEJ5,6. مطلوب PARP-1 أيضا لإصلاح كسر الحمض النووي أحادي الخيط أثناء النسخ المتماثل7,8. نظرا لدورها المهم في إصلاح الحمض النووي ، يتم استخدام مثبطات PARP (PARPi) كعلاجات للسرطان. في العديد من أنواع السرطان التي تعاني من نقص الموارد البشرية ، يؤدي علاج PARPi إلى استجابة قاتلة اصطناعية بسبب عجز الخلايا التي تعاني من نقص الموارد البشرية عن إصلاح الضرر المتراكم عبر مسار بديل9,10. يوجد حاليا أربعة PARPi معتمدين من إدارة الأغذية والعقاقير: أولاباريب ، روكاباريب ، نيريباريب ، وتالازوباريب (وتسمى أيضا BMN 673) ، والتي تستخدم لمختلف علاجات سرطان الثدي والمبيض11. ومع ذلك ، فإن مقاومة PARPi شائعة ، وينشأ أحد الأسباب المحتملة من خلال استعادة كفاءة الموارد البشرية 12. فقدان أو تثبيط PARP-1 في وجود خلل التشعيع ينظم آلية الاستئصال ، مما يؤدي إلى تراكم مساحات ssDNA أطول13. لذلك ، فإن إجراء دراسة متعمقة لاستئصال الحمض النووي في الجسم الحي أمر بالغ الأهمية لفهم أوضح لمسارات إصلاح الحمض النووي والتطوير اللاحق لاستراتيجيات جديدة لعلاج السرطان والتغلب على مقاومة PARPi.
كانت هناك عدة طرق مستخدمة للكشف عن أحداث استئصال الحمض النووي5. إحدى هذه الطرق هي التقنية الكلاسيكية القائمة على IF التي تسمح بالتلطيخ غير المباشر وتصور الحمض النووي المستأصل بعد DSB الناجم عن الإجهاد باستخدام جسم مضاد مضاد ل RPA. إن وضع العلامات على الحمض النووي الجيني باستخدام 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) والكشف عن ssDNA فقط هو قياس مباشر لأحداث استئصال الحمض النووي. إنه يتحايل على مراقبة RPA ، التي تشارك في عمليات خلوية متعددة مثل تكرار الحمض النووي. في الطريقة الموضحة هنا ، تسمح الخلايا المحتضنة ب BrdU لدورة خلية واحدة بدمج BrdU في خيط واحد من الحمض النووي الخلوي المكرر. بعد الاستئصال ، يتم إجراء تلطيخ IF في ظل ظروف تسمح باكتشاف BrdU فقط في شكل ssDNA ، باستخدام جسم مضاد مضاد ل BrdU. يمكن لهذا الجسم المضاد الوصول فقط إلى نيوكليوتيدات BrdU المكشوفة ولن يكتشف تلك المدمجة في الحمض النووي المزدوج العالق. باستخدام المجهر الفلوري ، يمكن تصور الحمض النووي المقطوع في شكل بؤر BrdU / ssDNA مثقوبة. يمكن استخدام الكثافة النووية لهذه البؤر كقراءة لتحديد كمية الاستئصال بعد تلف الحمض النووي. تصف هذه الورقة خطوة بخطوة عمليات هذه الطريقة ، والتي يمكن تطبيقها على معظم خطوط خلايا الثدييات. يجب أن تكون هذه الطريقة ذات فائدة واسعة كطريقة بسيطة لمراقبة استئصال نهاية الحمض النووي في السليلولو ، كدليل على المفهوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. زراعة الخلايا والعلاجات وإعداد الغطاء
ملاحظة: يجب أن تتم جميع عمليات طلاء الخلايا وعمليات النقل والعلاجات، بصرف النظر عن التشعيع، تحت غطاء معقم لزراعة الخلايا.
- اليوم 1
- في طبق مكون من 6 آبار ، ضع غطاء واحد في كل بئر لأكبر عدد ممكن من الظروف حسب الحاجة. لوحة ~ 150،000 خلايا HeLa لنقل الحمل أو العلاج من تعاطي المخدرات ، حسب الرغبة.
ملاحظة: في حالة النقل ، يوصى بإجراء نقل عكسي في وقت الطلاء ، أو من الممكن إجراء نقل أمامي بعد عدة ساعات من الطلاء للسماح بالالتصاق. يتم إجراء النقل العكسي عن طريق إضافة مزيج النقل إلى الغطاء قبل إضافة الخلايا ؛ وبالتالي ، يبدأ النقل قبل أن تبدأ الخلايا في الالتصاق. وعلى النقيض من ذلك، فإن النقل الأمامي هو إضافة مزيج النقل بعد الالتصاق بالسطح عادة في اليوم التالي. ومع ذلك ، من الممكن القيام بذلك في نفس اليوم ، شريطة إعطاء وقت كاف للخلايا للالتصاق. - لهذه الطريقة ، استخدم 4 آبار: البئر 1: التحكم في siRNA (يسمى siCTRL) ؛ البئر 2: siRNA ضد PARP-1 (siPARP-1) ؛ حسنا 3: غير معالج. البئر 4: الخلايا المراد معالجتها ب 5 ميكرومتر BMN673 1 ساعة قبل التشعيع.
ملاحظة: في هذا البروتوكول، أجريت جميع الاختبارات في ظل ظروف مشععة (انظر القسم 1-3). - احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة 5٪ CO2 بين عشية وضحاها ، على الرغم من أن بروتوكول النقل يسمح لمدة تصل إلى 3 أيام من الحضانة. يعتمد وقت الحضانة قبل علاج BrdU على كفاءة نقل siRNA. إذا لم يكن هناك نقل ، فإن الحضانة لمدة 16 ساعة كافية للسماح بالالتزام بالغطاء وبعض نمو الخلايا.
ملاحظة: يمكن تغيير ظروف الحاضنة وفقا لخط الخلية المستخدم.
- في طبق مكون من 6 آبار ، ضع غطاء واحد في كل بئر لأكبر عدد ممكن من الظروف حسب الحاجة. لوحة ~ 150،000 خلايا HeLa لنقل الحمل أو العلاج من تعاطي المخدرات ، حسب الرغبة.
- اليوم 2
- أضف BrdU بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر في وسائط الاستزراع المناسبة ، واحتضن لمدة 16 ساعة (دورة خلية واحدة).
ملاحظة: يتم تحضير محلول BrdU في ثنائي ميثيل سلفوكسيد. محلول المخزون المستخدم هو 10 mM ويتم تخزينه في aliquots عند -20 درجة مئوية.
- أضف BrdU بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر في وسائط الاستزراع المناسبة ، واحتضن لمدة 16 ساعة (دورة خلية واحدة).
- اليوم 3
- تشعيع الألواح بجرعة إجمالية قدرها 5 غراي من تشعيع الأشعة السينية (تختلف جرعة التشعيع اعتمادا على نوع التشعيع ، على سبيل المثال ، أجهزة تشعيع الحيوانات الصغيرة مقابل أجهزة التشعيع على الطاولة). انظر جدول المواد لمعرفة العلامة التجارية وطراز جهاز التشعيع المستخدم.
- أعد الألواح إلى الحاضنة ، وحرر الخلايا لمدة 3 ساعات.
- خلال فترة الحضانة لمدة 3 ساعات ، قم بإعداد المخزنين المؤقتين ، A و B ، و 4٪ paraformaldehyde (PFA) في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
ملاحظة: يجب تحضير المخازن المؤقتة A و B والسكروز طازجة في يوم التثبيت ، باستخدام محلول السكروز الطازج لمنع التلوث.- قم بإعداد المخزن المؤقت A (المخزن المؤقت قبل الاستخراج) ، وفقا للترتيب (30 مل) الموضح في الجدول 1.
ملاحظة: يجب تحضير السكروز 1M في يوم الاستخدام لمنع التلوث. - قم بإعداد المخزن المؤقت B (المخزن المؤقت لتجريد الهيكل الخلوي) وفقا للترتيب الموضح في الجدول 1 (30 مل).
ملاحظة: يجب إعداد المخزن المؤقت B بالترتيب المذكور لمنع هطول الأمطار من Tween-20 ومحلول ديوكسيكولات الصوديوم. - تحضير 4 ٪ PFA ، 2 مل لكل حالة (10 مل) ، تحت غطاء كيميائي (الجدول 1).
- قم بإعداد المخزن المؤقت A (المخزن المؤقت قبل الاستخراج) ، وفقا للترتيب (30 مل) الموضح في الجدول 1.
2. ما قبل الاستخراج والتثبيت
ملاحظة: يتم إجراء جميع عمليات الاستخراج والتثبيت المسبق مع بقاء الأغطية في صفيحة زراعة الأنسجة على الجليد أو عند 4 درجات مئوية. يتم رفع الغطاء فقط في الخطوة الأخيرة من التركيب (انظر المناقشة).
- ما قبل الاستخراج
- استنشاق الوسط ، واغسل الخلايا بعناية مرتين باستخدام 1x PBS ، وقم بإزالة PBS. أضف 2 مل من المخزن المؤقت A قبل الاستخراج واحتضنه على الفور عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: من المهم عدم تمديد وقت الحضانة في المخزن المؤقت A. الحضانة الموسعة في المخازن المؤقتة قبل الاستخراج ستؤدي إلى زيادة عدد الخلايا المنفصلة عن الغطاء الزجاجي. بدلا من ذلك ، بدلا من الحضانة عند 4 درجات مئوية ، يمكن إجراء الحضانة على الجليد. - قم بإزالة المخزن المؤقت A من خلال الطموح.
ملاحظة: لا تغسل الأغطية بعد إزالة المخزن المؤقت A. انتقل إلى الخطوة التالية. - أضف 2 مل من المخزن المؤقت لتجريد الهيكل الخلوي B واحتضنه على الفور عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. استنشق بعناية المخزن المؤقت B ، واغسل الخلايا بعناية مرة واحدة باستخدام 1x PBS. استنشق بعناية 1x PBS.
- استنشاق الوسط ، واغسل الخلايا بعناية مرتين باستخدام 1x PBS ، وقم بإزالة PBS. أضف 2 مل من المخزن المؤقت A قبل الاستخراج واحتضنه على الفور عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
- تثبيت
- إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 2 مل من 4٪ PFA تحت غطاء المحرك الكيميائي.
ملاحظة: PFA سامة ويجب التلاعب بها تحت غطاء كيميائي. - احتضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. اغسل الأغطية مرتين باستخدام 1x PBS ، واستنشق الفائض.
- قم بتغطية الأغطية بالميثانول البارد بنسبة 100٪ ، واحتضن الأغطية عند -20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. يغسل مرتين مع 1x PBS.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين الأغطية عند 4 درجات مئوية في 1x PBS واللوحة ملفوفة برقائق الألومنيوم إذا لزم الأمر. يجب عدم الاحتفاظ بالخلايا أكثر من 5 أيام قبل متابعة بروتوكول IF.
- إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 2 مل من 4٪ PFA تحت غطاء المحرك الكيميائي.
3. النفاذية
- احتضان الخلايا مع 2 مل من 1x PBS تحتوي على 0.5٪ Triton X-100 في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. اغسل الغطاء ثلاث مرات باستخدام 2 مل من 1x PBS.
4. تلطيخ المناعة
- خطوة الحظر
- قم بإعداد ما يكفي من المخزن المؤقت الطازج (3٪ BSA في 1x PBS) لاستخدام 2 مل لكل غطاء.
ملاحظة: قم بإعداد 5 مل إضافية من المخزن المؤقت للحجب لصنع محاليل الأجسام المضادة. - أضف 2 مل من المخزن المؤقت المانع إلى كل بئر واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- قم بإعداد ما يكفي من المخزن المؤقت الطازج (3٪ BSA في 1x PBS) لاستخدام 2 مل لكل غطاء.
- حضانة الأجسام المضادة الأولية
- قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الأساسي في مخزن مؤقت جديد للكتل: BrdU RPN202 1:1000 والمستضد النووي الخلوي المنتشر (PCNA) 1:500 ، 100 ميكرولتر لكل غطاء.
ملاحظة: للحفاظ على الجسم المضاد ، يمكن استخدام حجم أصغر ، 75-100 ميكرولتر لغطاء 22 × 22 مم ، 50-75 ميكرولتر لغطاء 18 × 18 مم. - على كل غطاء ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي. قم بتغطية الأغطية بمربع من البارافيلم باستخدام ملاقط ، ووضع البارافيلم بعناية لعدم إنشاء فقاعات.
- قم بتغطية اللوحة بورق الألومنيوم ، واحتضن الجسم المضاد الأساسي بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في غرفة رطبة.
- قم بإزالة مربعات البارافيلم ، واغسل الأغطية ثلاث مرات باستخدام 2 مل من 1x PBS المعقمة.
- قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الأساسي في مخزن مؤقت جديد للكتل: BrdU RPN202 1:1000 والمستضد النووي الخلوي المنتشر (PCNA) 1:500 ، 100 ميكرولتر لكل غطاء.
- حضانة الأجسام المضادة الثانوية
- تحضير ما يكفي من محلول الأجسام المضادة الثانوية في المخزن المؤقت المانع الطازج: مضاد الفأر 488 الفلورسنت الثانوي A11011 (ل BrdU) تخفيف 1: 800 ومكافحة الأرانب 568 الفلورسنت الثانوي A11011 (ل PCNA) تخفيف 1: 800.
ملاحظة: يمكن تغيير الألوان المستخدمة لتناسب الاحتياجات التجريبية. يمكن العثور على العلامة التجارية المحددة المستخدمة في جدول المواد. - أضف على كل غطاء 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي ، وقم بتغطية الأغطية بمربع من البارافيلم باستخدام ملاقط ، وضع البارافيلم بعناية دون فقاعات.
- احتضان الجسم المضاد الثانوي في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع لوحة مغطاة بورق الألومنيوم.
- اغسل الغطاء ثلاث مرات باستخدام 2 مل من 1x PBS.
- تحضير ما يكفي من محلول الأجسام المضادة الثانوية في المخزن المؤقت المانع الطازج: مضاد الفأر 488 الفلورسنت الثانوي A11011 (ل BrdU) تخفيف 1: 800 ومكافحة الأرانب 568 الفلورسنت الثانوي A11011 (ل PCNA) تخفيف 1: 800.
- تلطيخ نووي
- تحضير حجم 2 مل لكل غطاء من 1x PBS يحتوي على 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) بتركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / مل (1:1000).
- أضف على كل غطاء 2 مل من محلول DAPI. احتضن الأغطية في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق مع تغطية اللوحة بورق الألومنيوم. اغسل الغطاء مرتين باستخدام 1x PBS.
- قم بتغطية الأغطية ب 1x PBS ، واستخدم إما إبرة أو ملاقط دقيقة لرفع الغطاء من أسفل البئر. قم بمسح السائل الزائد بعناية عن طريق النقر على حافة واحدة بلطف على منشفة ورقية.
ملاحظة: احرص على عدم إسقاط الشريحة أو السماح للسطح المستوي مع الخلايا الملتصقة بلمس الورق. - قم بتركيب الأغطية على الشرائح باستخدام 10-20 ميكرولتر من وسائط التركيب الخاصة ب IF.
5. الحصول على الصور وتحليلها
ملاحظة: يمكن الحصول على الصور على عدة أنواع من المجاهر الفلورية. تم استخدام مجهر epifluorescence مع هدف النفط 63x. انظر جدول المواد للعلامة التجارية والطراز. مكدسات Z غير مطلوبة ، على الرغم من أنها قد تكون ذات فائدة اعتمادا على خط الخلية ومستوى تلطيخ الميتوكوندريا.
- تحليل الصور
- لكل صورة ، قم بإنشاء ملفات TIFF متعددة ؛ دمج جميع الطائرات، ولكن حافظ على قنوات الألوان منفصلة. قم باستيراد هذه الملفات إلى Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) وقم بتحليلها باستخدام خط أنابيب Speckle Count (الفيديو التكميلي 1).
- قم بتحميل الصور (الشكل التكميلي S1A).
- لبدء إنشاء المشروع ، قم بتحميل خط أنابيب عد البقع في البرنامج والصور المراد تحليلها في المنطقة المتوفرة.
- استخدم وحدة NamesAndTypes النمطية لتعيين اسم ذي معنى لكل صورة تشير من خلاله الوحدات الأخرى إليها-C01: تمثيل قناة BrdU ؛ C02: تمثيل قناة PCNA؛ C03: تمثيل قناة DAPI.
ملاحظة: تعتمد هذه المعرفات على المجهر؛ يجب أن يكون هناك معرف في اسم الملف للتمييز بين القنوات.
- حدد الملف الذي سيتم استخدامه لتحديد النوى وتسميتها (قم بتغيير هذا الاسم كما هو مطلوب) (انظر الشكل التكميلي S1B والشكل التكميلي S1C).
- حدد قطر الجسم بين 50 و 300 وحدة بكسل، وهو نطاق الحجم المقبول للنواة، ولكن قم بتغيير القيمة لتناسب النوى في الصورة.
ملاحظة: قد يكون 50 قيمة كبيرة جدا وتمنع تحديد النوى الأصغر؛ وبالمثل ، قد يسمح 300 باحتساب مجموعات كبيرة من النوى على أنها 1. - تخلص من الكائنات خارج نطاق القطر لضمان احتساب الكائنات التي تطابق المعايير فقط.
- تجاهل الكائنات التي تلامس الحدود لإزالة الخلايا التي قد تكون موجودة جزئيا فقط في الحقل.
- قم بتطبيق العتبة لتناسب الصور المحددة. لاحظ الإعدادات التالية كمثال. تغيير عامل تصحيح العتبة بناء على مدى صرامة استراتيجية العتبة. وتشمل الإعدادات الأخرى استراتيجية العتبة: العالمية. طريقة العتبة: أوتسو. فئتان أو ثلاث فئات عتبة: فئتان ؛ مقياس تجانس العتبة: 1 ؛ عامل تجانس العتبة: 1 ؛ الحدود الدنيا والعليا على العتبة: 0.0 و 1.0 ؛ طريقة لتمييز الكائنات المتكتلة: الشكل ؛ وطريقة رسم الخطوط الفاصلة بين الكائنات المتكتلة: نشر.
ملاحظة: لكل معلمة، يوفر ملف تعريف الخلية تعريفات تكميلية وإمكانية متاحة لإعداد المتغير.
- حدد قطر الجسم بين 50 و 300 وحدة بكسل، وهو نطاق الحجم المقبول للنواة، ولكن قم بتغيير القيمة لتناسب النوى في الصورة.
- تحديد الكائن الأساسي لتحديد البؤر (الشكل التكميلي S2A).
- استخدم الإعدادات التالية: حدد صورة الإدخال: Maskedgreen; تسمية الكائن الأساسي الذي سيتم تحديده: BrdUFoci ؛ القطر النموذجي للكائن: 1-15 ؛ تجاهل الجسم خارج نطاق القطر: نعم ؛ تجاهل الكائن الذي يلمس حدود الصورة: لا ؛ استراتيجية العتبة: التكيفية؛ طريقة العتبة: أوتسو. فئتان أو ثلاث فئات عتبة: ثلاث فئات ؛ مقياس تجانس العتبة: 1 ؛ عامل تجانس العتبة: 3 ؛ وحجم مرشح التنعيم: 4.
- قياس الشدة (الشكل التكميلي S2B).
- حدد الصورة المراد قياسها: OrigGreen.
- انقر على إضافة صورة أخرى. حدد الصورة المراد قياسها: PCNA. حدد الكائنات المراد قياسها: النوى.
ملاحظة: سيتم استخدام هذا لقياس كثافة BrdU و PCNA - البيانات النهائية التي سيتم رسمها بيانيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا البروتوكول ، تم استخدام الفحص القائم على بروموديوكسي يوريدين (BrdU) لقياس استجابة استئصال خلايا HeLa للضرر الناجم عن الإشعاع كميا. يتم تصور مسارات ssDNA المتولدة كبؤر متميزة بعد تلطيخ التألق المناعي (الشكل 1A). ثم تم تحديد البؤر المحددة كميا والتعبير عنها على أنها الكثافة المتكاملة الكلية لتلطيخ BrdU في النوى (الشكل 1B ، الشكل التكميلي S1 ، الشكل التكميلي S2 ، والشكل التكميلي S3). من الممكن قياس عدد البؤر أو متوسط كثافة البؤر ، على الرغم من أن هذا يمكن أن يكون أقل موثوقية من إجمالي الكثافة النووية ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الحجم المتغير لبؤر BrdU.
للتمييز بين الاستئصال قصير المدى نتيجة ل NHEJ والاستئصال بعيد المدى للموارد البشرية ، تم إجراء تلطيخ مشترك باستخدام جسم مضاد مضاد ل PCNA لتحديد الخلايا التي تمر بالمرحلة S (الشكل 1 والشكل التكميلي S4). يشكل PCNA مشبك الحمض النووي الذي يعمل كعامل عملية لبوليميراز الحمض النووي وهو ضروري للتكرار. PCNA بارز في النواة ويصل إلى أقصى تعبير خلال المرحلة S من دورة الخلية. وبالتالي ، في المرحلة S المبكرة ، تكون إشارة PCNA منخفضة ولها توزيع حبيبي. في المقابل ، في أواخر المرحلة S ، يكون تلطيخ PCNA قويا جدا (الشكل 1A). عند تحليل إشارة PCNA (الطور S) لأول مرة ، يجب تحديد النوى وقياس شدة PCNA.
ثم يتم رسم القيم الناتجة كمخطط مبعثر لتحديد شدة القطع بشكل أفضل للتمييز بين النوى الإيجابية PCNA وسالبة PCNA (الشكل التكميلي S4A). ستتم بعد ذلك إزالة النتائج السلبية ل PCNA من مجموعة البيانات للسماح بالتحليل القائم على كثافة BrdU بسبب إشارة BrdU المنخفضة بغض النظر عن الحالة (الشكل التكميلي S4B). في هذه الظروف التجريبية ، تؤوي النوى السالبة PCNA كثافة متكاملة قاعدية لبؤر BrdU من 900 وحدة تعسفية (A.U). ومع ذلك ، تصل هذه القيمة إلى 1800 وحدة علوية في النوى الموجبة PCNA (الشكل 1B). وهذا يمثل زيادة بنسبة 100٪ في كمية الإشارة المتكاملة لبؤر BrdU. يمكن بعد ذلك ربط الزيادة في شدة BrdU بزيادة في استئصال الحمض النووي ، والتي تكون أكثر وضوحا وكفاءة عندما تمر الخلايا بمراحل S و G2 ويتم تشعيعها.
في هذا البروتوكول ، لإثبات زيادة في استئصال الحمض النووي بعد التشعيع (5 Gy) ، تم تعديل نشاط PARP-1 إما من خلال فقدان PARP-1 باستخدام حالة ضربة قاضية siRNA أو بعد تثبيط قوي ل PARP-1 باستخدام Talazoparib (BMN673) (الشكل 2 والشكل التكميلي S5). ثم تم تحديد كميات الحمض النووي المستأصل في كل حالة بعد IF (الشكل 2B). في حالة غير مضطربة (siCTRL) ، تبلغ الكثافة المتكاملة لبؤر BrdU لكل نواة حوالي 1500 وحدة علوية في النوى الموجبة PCNA (الشكل 2A ، B). بعد ضربة قاضية فعالة ل PARP-1 باستخدام siRNA (الشكل 2C) ، لوحظت زيادة كبيرة في كثافة بؤر BrdU إلى حوالي 1900 A.U. ، وهو ما يتوافق مع زيادة بنسبة 26٪ في الكثافة (p ˂ 0.0001). وبالمثل ، بعد تثبيط PARP-1 باستخدام BMN673 (التركيز النهائي 5 ميكرومتر) ، زادت شدة البؤر من حوالي 1750 إلى 2500 وحدة مدارية أي ما يعادل زيادة بنسبة 43٪ في كثافة البؤر (p ˂ 0.0001). وبالتالي ، فإن فقدان PARP-1 ينظم استئصال الحمض النووي كما ذكر سابقا13.
من المهم أن نتذكر أن BMN-673 يمنع نشاط PARP-1 ويحبسه في الحمض النووي ، وتأثير هذا العلاج أكثر ضررا على الخلية ، مما يؤدي إلى زيادة أكبر في كثافة BrdU مقارنة بالخلايا المعالجة ب siRNA. يوضح الاختلاف الطفيف في كثافة siCTRL غير المعالجة و siCTRL كيف يمكن لأي علاج ، مثل نقل siRNA ، أن يؤثر على استجابة وإخراج الفحص. يمكن أن يوضح أيضا أهمية استخدام عناصر التحكم المناسبة لكل حالة.
الشكل 1: تكوين بؤر BrdU أكثر عرضة للحدوث في الخلايا الإيجابية PCNA منه في الخلايا المتماثلة. (أ) صور تمثيلية لتشكيل بؤر BrdU وتلطيخ PCNA بعد تشعيع 5 Gy وإطلاق 3 ساعات. يوجد مربع مكبر يظهر بؤر BrdU المميزة في زاوية كل صورة BrdU. قضبان المقياس = 5 ميكرومتر (ب) القياس الكمي للكثافة النووية BrdU في خلايا HeLa غير المعالجة (بدون BMN-673). تظهر البيانات متوسط ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). الاختصارات: BrdU = 5-bromo-2′-deoxyuridine; PCNA = مستضد نووي خلوي متتكاثر ؛ الأشعة تحت الحمراء = التشعيع. DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول; A.U. = الوحدات التعسفية; s.e.m. = الخطأ المعياري للمتوسط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بوليميراز البوليميراز (ADP-ribose) بالضربة القاضية أو تثبيط يؤدي إلى زيادة تكوين بؤر BrdU في الخلايا المتماثلة. (أ) صور تمثيلية لتشكيل بؤر BrdU وتلطيخ PCNA في خلايا HeLa غير المعالجة ، تعامل مع 5 μM BMN-673 ، siCTRL ، و siPARP-1 ، تليها 5 تشعيع Gy وإطلاق 3 ساعات. يوجد مربع مكبر يظهر بؤر BrdU المميزة في زاوية كل صورة BrdU. قضبان المقياس = 5 ميكرومتر (B) القياس الكمي للكثافة النووية BrdU في خلايا HeLa غير المعالجة ، المعالجة ب 5 ميكرومتر BMN-673 ، siCTRL ، و siPARP-1 متبوعة ب 5 Gy التشعيع ، تظهر البيانات متوسط ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). (ج) لطخة غربية للتحقق من صحة ضربة siRNA القاضية ل PARP-1. يتعرف الجسم المضاد F1-23 PARP-1 على PARP-1 المعدل تلقائيا مما يؤدي إلى المظهر الملطخ لنطاق siCTRL والمظهر الصلب ل PARP-1 المثبط بشكل محفز في العينات المعالجة BMN-673. الاختصارات: PARP-1 = بوليميراز (ADP-ribose) 1 ؛ BrdU = 5-برومو-2′-ديوكسي يوريدين; PCNA = مستضد نووي خلوي متتكاثر ؛ الأشعة تحت الحمراء = التشعيع. DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول; A.U. = الوحدات التعسفية; siCTRL = التحكم siRNA; siPARP-1 = siRNA لهدم PARP-1 ؛ s.e.m. = الخطأ المعياري للمتوسط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المخزن المؤقت A (المخزن المؤقت قبل الاستخراج) 30 مل | ||
| الكاشف | حجم | التركيز النهائي |
| H2O | 18 مل | |
| الأنابيب (درجة الحموضة 7 ، 500 ملليمتر) | 600 ميكرولتر | 10 مللي متر |
| كلوريد الصوديوم (4 م) | 750 ميكرولتر | 100 مللي متر |
| MgCl2 (1 م) | 90 ميكرولتر | 3 مللي متر |
| EGTA (500 ملليمتر) | 60 ميكرولتر | 1 مللي متر |
| تريشن X-100 (10٪) | 1.5 مل | 0.50% |
| السكروز (1 م) | 9 مل | 300 مللي متر |
| المخزن المؤقت B (الهيكل الخلوي تجريد المخزن المؤقت) 30 مل | ||
| الكاشف | حجم | التركيز النهائي |
| H2O | 25.035 مل | |
| تريس الرقم الهيدروجيني 7.5 (1 م) | 300 ميكرولتر | 10 مللي متر |
| كلوريد الصوديوم (4 م) | 75 ميكرولتر | 10 مللي متر |
| MgCl2 (1 م) | 90 ميكرولتر | 3 مللي متر |
| Tween20 (10٪) | 3 مل | 1% |
| 10٪ ديوكسي كولكات الصوديوم | 1.5 مل | 0.50% |
| الكاشف | حجم |
| 16٪ PFA | 2.5 مل |
| PBS 1x | 7.5 مل |
الجدول 1.
الشكل التكميلي S1: التمثيل المرئي لبرنامج Cell Profiler وخط أنابيب عد البقع الجزء 1. (أ) تعرض لقطة الشاشة النافذة المستخدمة لتحديد ملفات القنوات المختلفة للصور المراد تحليلها. تظهر هذه اللقطات واجهة ملف تعريف الخلية. (ب) لقطة شاشة لقائمة تحديد الكائنات الأولية لتحديد النوى. القيم المميزة هي القيم التي يتم تغييرها بشكل شائع لتحديد النوى بشكل أفضل. الاختصارات: BrdU = 5-bromo-2′-deoxyuridine; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2: التمثيل المرئي لبرنامج Cell Profiler والجزء 2 من خط أنابيب عد البقع . (أ) لقطة شاشة لقائمة تحديد الكائنات الأولية لتحديد بؤر BrdU داخل النوى. (ب) لقطة شاشة لقائمة قياس كثافة الجسم لقياس الكثافة النووية BrdU و PCNA. الاختصارات: BrdU = 5-bromo-2′-deoxyuridine; PCNA = مستضد نووي خلوي منتشر. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S3: التمثيل المرئي لبرنامج Cell Profiler وخط أنابيب عد البقع الجزء 3. (أ) تمثيل تحديد النوى بواسطة ملف تعريف الخلية بعد التحسين. (ب) تمثيل تحديد بؤر BrdU. (C) لقطة الشاشة عبارة عن تكبير لخلية واحدة داخل النافذة الأولية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S4: مخطط مبعثر للخلايا الإيجابية PCNA و PCNA السلبية. (أ) مثال على مخطط مبعثر PCNA يستخدم للتمييز بين الخلايا الإيجابية PCNA والخلايا السالبة PCNA. تم رسم كثافة PCNA من حالة واحدة وتم تحديد التمييز بين المجموعتين السكانيتين. الأخضر يسلط الضوء على الخلايا الإيجابية PCNA ، والأحمر يمثل الخلايا السلبية PCNA. يتم ذلك لكل تجربة وحالة فردية. (ب) التحديد الكمي للكثافة النووية BrdU في خلايا HeLa غير المعالجة سالبة PCNA، المعالجة ب 5 ميكرومتر BMN-673 و siCTRL و siPARP-1؛ تظهر البيانات متوسط ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). الاختصارات: PARP-1 = بوليميراز (ADP-ribose) 1 ؛ BrdU = 5-برومو-2′-ديوكسي يوريدين; الأشعة تحت الحمراء = التشعيع. PCNA = مستضد نووي خلوي متتكاثر ؛ A.U. = الوحدات التعسفية; siCTRL = التحكم siRNA; siPARP-1 = siRNA لهدم PARP-1 ؛ s.e.m. = الخطأ المعياري للمتوسط. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S5: إشارة BrdU بدون تشعيع. (أ) صور تمثيلية لتشكيل بؤر BrdU وتلطيخ PCNA دون تشعيع. أشرطة المقياس = 5 ميكرومتر. يوجد مربع مكبر يظهر بؤر BrdU المميزة في زاوية كل صورة BrdU. (ب) التحديد الكمي للكثافة النووية BrdU في خلايا هيلا غير المعالجة إيجابية PCNA، المعالجة ب 5 ميكرومتر BMN-673 و siCTRL و siPARP-1؛ تظهر البيانات متوسط ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). (ج) التحديد الكمي للكثافة النووية BrdU في خلايا HeLa غير المعالجة سالبة PCNA، المعالجة ب 5 ميكرومتر BMN-673 و siCTRL و siPARP-1؛ تظهر البيانات متوسط ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). الاختصارات: PARP-1 = بوليميراز (ADP-ribose) 1 ؛ BrdU = 5-برومو-2′-ديوكسي يوريدين; PCNA = مستضد نووي خلوي متتكاثر ؛ الأشعة تحت الحمراء = التشعيع. DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول; A.U. = الوحدات التعسفية; siCTRL = التحكم siRNA; siPARP-1 = siRNA لهدم PARP-1 ؛ s.e.m. = الخطأ المعياري للمتوسط. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
فيديو تكميلي 1: استخدام Cell Profiler وخط أنابيب Speckle Count لتحليل تلطيخ BrdU لقياس استئصال الحمض النووي. يوضح هذا الفيديو استخدام Cell Profiler وخط أنابيب عد Speckle. يوضح كيفية استيراد الصور وتحليلها باستخدام هذه الأداة خصيصا لهذا البروتوكول. اختصار: BrdU = 5-bromo-2′-deoxyuridine. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصف هذه الورقة طريقة تستخدم تلطيخ IF لقياس الاختلافات في استئصال الحمض النووي في السليلولو. المعيار الحالي لمراقبة تأثير على استئصال الحمض النووي هو من خلال تلطيخ RPA. ومع ذلك ، هذه طريقة غير مباشرة قد تتأثر بتكرار الحمض النووي. في السابق ، تم وصف تقنية أخرى لاستئصال الحمض النووي القائم على دمج BrdU IF لتصنيف الشدة الناتجة في الخلايا الإيجابية BrdU و BrdU السلبية. سمحت هذه الطريقة للخلايا التي لا تخضع للموارد البشرية أن تحسب على أنها إيجابية بسبب الخلفية أو تلطيخ الميتوكوندريا مما يؤدي إلى كثافة BrdU عالية14،15،16. الجدة الأساسية للطريقة الموصوفة في هذه الورقة هي إضافة تلطيخ PCNA ، والذي يسمح بالانتقائية لمراحل S و G2 من دورة الخلية ، مما يضمن أن إشارة BrdU الناتجة ترجع إلى الاستئصال وبالتالي إلى الإصلاح الموجه بالتماثل.
الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول هي ما قبل الاستخراج. بدون هذا ، لن تكون بؤر BrdU مرئية ، وإذا تم ذلك بشكل غير صحيح ، فسوف تنفصل الخلايا تماما. ستؤدي المخازن المؤقتة المعدة بشكل غير صحيح إلى عدم اكتمال الاستخراج المسبق ، مثل الإزالة الجزئية للهيكل الخلوي أو زيادة إشارة الخلفية. من المهم جدا احترام مدة الحضانة مع المخازن المؤقتة قبل الاستخراج ، ويمكن أن تؤدي المدة المتزايدة في المخازن المؤقتة إلى انفصال الخلايا عن الغطاء الزجاجي. الأهم من ذلك ، إذا تم تنفيذ هذا البروتوكول مع خلايا ملتصقة بشكل سيئ ، فقم بمعالجة الأغطية مسبقا باستخدام البوليليسين لتقليل انفصال الخلايا أثناء ما قبل الاستخراج. في وقت لاحق ، بدون تثبيت الميثانول ، لن تكون إشارة PCNA مرئية.
متغير آخر مهم في هذا البروتوكول هو المخزن المؤقت للحظر: ستؤدي المخازن المؤقتة غير المتوافقة للحظر إلى فقدان إشارة BrdU. على سبيل المثال ، سيعمل مصل الأبقار الجنيني بنسبة 10٪ في المخزن المؤقت لحجب PBS 1x عندما لا يتم دمجه مع تثبيت الميثانول ؛ ومع ذلك ، عند دمجها مع تثبيت الميثانول كما هو مطلوب لتلطيخ PCNA ، يتم تقليل إشارة BrdU بشكل كبير. من الممكن أن تعمل عوامل وطرق حظر أخرى مع هذا البروتوكول ؛ 3٪ BSA في 1x PBS قدمت أفضل النتائج. المكون الأساسي الأخير لهذه التقنية هو استخدام مصدر تلف الحمض النووي. بدون هذا ، لن يكون هناك سوى القليل من إشارة BrdU النووية أو لا توجد إشارة (الشكل التكميلي S5). وقد أظهرت التجربة أن التشعيع هو مصدر ممتاز للضرر لهذه الطريقة. ومع ذلك ، إذا لم يكن هناك وصول إلى جهاز تشعيع ، فيمكن استخدام الأدوية الإشعاعية مثل neocarzinostatin بدلا من ذلك.
Cell profiler هي أداة مفيدة ومتعددة الاستخدامات تسمح بتحليل سهل ومتسق للصور المنتجة في هذه التقنية. يمكن تخصيص الإعدادات لكل من حجم الكائنات المحددة والعتبة التي تقوم بها بذلك (الفيديو التكميلي 1). نظرا لأن الكثافة النووية لتلطيخ BrdU هي القراءة المطلوبة ، فإن التخصيص الرئيسي هو في تحديد النوى من ملفات DAPI. يجب أن يتم تحليل الصور من كل شرط بشكل منفصل حيث يتم الحصول على النتائج في شكل ملف csv واحد يحتوي على أرقام الخلايا والصور ، ولكن ليس أسماء الشروط. لتحديد ما إذا كانت ظروف التحليل مناسبة، استخدم ميزة بدء وضع الاختبار ، وتأكد من فتح رمز العين في الخطوات المطلوبة. أغلق هذا الرمز عند تشغيل التحليل الفعلي لأنه سيؤدي إلى نوافذ منبثقة وإبطاء البرنامج. في وضع اختبار Start ، يمكن للمستخدمين الانتقال ذهابا وإيابا ، وتغيير الإعدادات حسب الحاجة لتحديد النوى أولا بشكل صحيح ثم بؤر BrdU.
بمجرد الرضا عن التعريف الناتج ، استخدم نفس الإعدادات لكل حالة داخل نفس التجربة ؛ قد يتطلب ذلك الحصول على صورة اختبار لكل شرط قبل تحليل الدفعة بأكملها للتأكد من أن الإعدادات تتوافق مع كل شرط. من المهم ملاحظة أنه ، اعتمادا على اكتساب الصور ، قد يكون هناك تباين في إعدادات ملف تعريف الخلية بين المستخدمين وبين إصدارات البرامج. وبالتالي ، من الضروري المرور بمرحلة الاختبار لتحديد المعلمات المثالية لتجارب محددة. عند التحضير لرسم النتائج بيانيا ، يجب تحديد الخلايا الإيجابية PCNA (المرحلة S). للقيام بذلك ، يتم قياس شدة PCNA ، بنفس طريقة شدة BrdU ، ويتم رسم القيم الناتجة كمخطط مبعثر لتصور قيمة كثافة القطع للخلايا الإيجابية PCNA بشكل أفضل. ستتم بعد ذلك إزالة النتائج السلبية ل PCNA من مجموعة البيانات للسماح بالرسم البياني لكثافة BrdU. تظهر الأرقام التكميلية المقدمة لقطات شاشة من البرنامج تسلط الضوء على الإعدادات الأكثر تحسينا (الشكل التكميلي S1 والشكل التكميلي S2 والشكل التكميلي S3).
التعديل المحتمل على البروتوكول هو الجسم المضاد PCNA المستخدم. تم اختبار اثنين من الأجسام المضادة PCNA المختلفة بنجاح ، واحدة مدرجة هنا وأخرى لم تعد قيد الإنتاج - جسم مضاد وحيد النسيلة للفئران (Bulldog Bio PCA16D10). أخيرا ، يجب على المستخدمين تغطية الأغطية بالبارافيلم أثناء حضانة الأجسام المضادة. ليس من الضروري للغاية ، على الرغم من أن هناك حاجة إلى حجم أكبر بكثير من محلول الأجسام المضادة لتغطية الغطاء بالكامل دون ذلك. طريقة أخرى هي وضع ورقة من البارافيلم تحيط بصفيحة زجاجية ، ووضع قطرات من محلول الأجسام المضادة على البارافيلم ، ووضع جانب خلية الغطاء بعناية على قطرة محلول الأجسام المضادة. يمكن بعد ذلك وضع هذه اللوحة الزجاجية في غرفة رطبة عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها للحضانة الأولية وفي الظلام في درجة حرارة الغرفة للحضانة الثانوية. هذه الطريقة تعمل بشكل كامل على الرغم من أنها تزيد بشكل كبير من وقت التعامل مع أغطية الغطاء ونتيجة لذلك ، تزيد من احتمال إسقاط أو كسر الغطاء الزجاجي.
وهناك طريقة بديلة لقياس الاستئصال من خلال استخدام طريقة SMART لتمشيط الحمض النووي؛ في حين أن هذه التقنية توفر نتائج واضحة للغاية ، إلا أنها أكثر تعقيدا بكثير ، وتتطلب المزيد من الوقت ، وهي أكثر تكلفة17. تتطلب طريقة SMART استخراج الحمض النووي دون إتلافه ، يليه تمديد هذا الحمض النووي على أغطية لتتبعه IF. طريقة BrdU IF ، بالمقارنة ، بسيطة وفعالة من حيث التكلفة ، ولا تتطلب استثمارا أكبر من تكلفة الجسم المضاد. توفر هذه الطريقة طريقة أولية لقياس الاستئصال أكثر دقة من مجرد قياس تكوين بؤر RPA ، والتي يمكن أن تكون مرتبطة بآثارها على العديد من الوظائف الخلوية. ومع ذلك، يتم فسفور تقنية RPA على بقايا محددة أثناء الاستئصال كجزء من الاستجابة لتلف الحمض النووي.
كشف التصوير أحادي الجزيء مؤخرا عن RPA المفسفرة (pRPA) كمنظم استئصال سلبي18. وبالتالي ، على المدى الطويل ، يمكن جعل هذه الطريقة أكثر دقة عن طريق اقتران تلطيخ PCNA / RPA المفسفرة مع تصوير BrdU باستخدام الأجسام المضادة المناسبة وظروف التلطيخ المحسنة. ومع ذلك ، فإن الطريقة المقدمة توفر تمثيلا للاستئصال الذي يتم ملاحظته بشكل مستقل عن البروتينات المشاركة في عملية الاستئصال ، وبالتالي نفي التحيز الذي يمكن أن يحدث من التغيرات في إشارتها استجابة للعلاج. لا توفر هذه التقنية طريقة لتحديد ما إذا كان البروتين متورطا في الاستئصال فحسب ، بل توفر أيضا لتحديد ما إذا كان موت الخلايا الناتج عن العلاج الدوائي مرتبطا بنقص / فرط الاستئصال. يمكن أن تكون هذه المعلومات مفيدة في فهم ليس فقط الجوانب الميكانيكية لإصلاح الحمض النووي ، ولكن أيضا الآلية البيولوجية الكامنة وراء موت الخلايا الناجم عن المخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر ماري كريستين كارون على المشورة الفنية المتميزة. يتم دعم هذا العمل بتمويل من المعاهد الكندية للبحوث الصحية J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. يحمل كرسي أبحاث كندا من المستوى 1 في إصلاح الحمض النووي وعلاجات السرطان. J.O'S هو زميل طالب دكتوراه FRQS ، و S.Y.M هو زميل ما بعد الدكتوراه FRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
References
- Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J.
- Ronato, D. A., et al. Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection. Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).
- Hu, Y., et al. PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair. Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).
- Satoh, M. S., Lindahl, T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).
- Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).
- Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
- Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy. Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).
- Noordermeer, S. M., van Attikum, H. PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells. Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).
- Caron, M. C., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks. Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).
- Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells. Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).
- Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).
- Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
- Huertas, P., Cruz-García, A. Single molecule analysis of resection tracks. Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).
- Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. RPA phosphorylation inhibits DNA resection. Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).
