Summary
Im vorliegenden Protokoll demonstrieren wir, wie die DNA-Doppelstrang-Endsektion während der S/G2-Phase des Zellzyklus mit einer immunfluoreszenzbasierten Methode visualisiert werden kann.
Abstract
Die Untersuchung der DNA-Schadensantwort (DDR) ist ein komplexes und essentielles Feld, das durch den Einsatz von DDR-targeting-Medikamenten zur Krebsbehandlung nur noch wichtiger geworden ist. Diese Ziele sind Poly(ADP-Ribose)-Polymerasen (PARPs), die verschiedene Formen der DNA-Reparatur initiieren. Die Hemmung dieser Enzyme mit PARP-Inhibitoren (PARPi) erreicht eine synthetische Letalität, indem eine therapeutische Verwundbarkeit in homologen Rekombinations- (HR)-defizienten Zellen aufgrund von Mutationen bei Brustkrebs Typ 1 (BRCA1), BRCA2 oder Partner und Lokalisierer von BRCA2 (PALB2) verliehen wird.
Zellen, die mit PARPi behandelt werden, akkumulieren DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs). Diese Brüche werden von der DNA-Endresektionsmaschinerie verarbeitet, was zur Bildung von einzelsträngiger (ss) DNA und anschließender DNA-Reparatur führt. In einem BRCA1-defizienten Kontext verursacht die Wiederbelebung der DNA-Resektion durch Mutationen in DNA-Resektionsinhibitoren wie 53BP1 und DYNLL1 eine PARPi-Resistenz. Daher ist die Möglichkeit, die DNA-Resektion in Cellulo zu überwachen, entscheidend für ein klareres Verständnis der DNA-Reparaturwege und die Entwicklung neuer Strategien zur Überwindung der PARPi-Resistenz. Immunfluoreszenz (IF)-basierte Techniken ermöglichen die Überwachung der globalen DNA-Resektion nach DNA-Schäden. Diese Strategie erfordert eine langpulsige genomische DNA-Markierung mit 5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU). Nach DNA-Schäden und DNA-Endresektion wird die resultierende einzelsträngige DNA von einem Anti-BrdU-Antikörper unter nativen Bedingungen spezifisch nachgewiesen. Darüber hinaus kann die DNA-Resektion auch mit Hilfe von Zellzyklusmarkern untersucht werden, um zwischen verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu unterscheiden. Zellen in der S /G2-Phase ermöglichen die Untersuchung der Endresektion innerhalb der HR, während G1-Zellen zur Untersuchung des nicht-homologen Endzusammenfügens (NHEJ) verwendet werden können. Ein detailliertes Protokoll für diese IF-Methode, gekoppelt an die Zellzyklusunterscheidung, wird in diesem Artikel beschrieben.
Introduction
Die Modulation von DNA-Reparaturfaktoren ist eine sich ständig weiterentwickelnde Methode für die Krebstherapie, insbesondere in DNA-DSB-Reparatur-defizienten Tumorumgebungen. Die Hemmung spezifischer Reparaturfaktoren ist eine der genialen Strategien, um Krebszellen für DNA-schädigende Wirkstoffe zu sensibilisieren. Jahrzehntelange Forschung führte zur Identifizierung verschiedener Mutationen von DNA-Reparaturgenen als Biomarker für therapeutische Strategieentscheidungen1. Infolgedessen ist das DNA-Reparaturfeld zu einem Zentrum für die Arzneimittelentwicklung geworden, um eine breite Palette von Behandlungen zu gewährleisten und das Konzept der personalisierten Medizin zu stärken.
DSBs werden durch zwei Hauptwege repariert: NHEJ und HR2. Der NHEJ-Signalweg ist fehleranfällig, indem er die beiden DNA-Enden mit wenig bis gar keiner DNA-Endverarbeitung schnell ligariert und die Proteinkinase (DNA-PKcs), den Ku70/80-Komplex, 53BP1 und RIF1-Proteine3 umfasst. Im Gegensatz dazu ist HR ein treuer Mechanismus, der von BRCA14 initiiert wurde. Ein wesentlicher Schritt bei der HR-Reparatur ist der DNA-Endresektionsprozess, bei dem es sich um den Abbau der gebrochenen Enden handelt, der zu einzelsträngiger (ss) DNA mit 3'-OH-Enden führt. BRCA1 erleichtert die Rekrutierung der nachgeschalteten Proteine, die das Resektosom MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1 bilden, die an der 5' bis 3' DNA-Resektion beteiligt sind5.
Die anfängliche Endresektion wird durch die Endonukleaseaktivität von MRE11 erreicht, was eine weitere Verarbeitung durch die DNA2- und EXO1-Nukleasen ermöglicht. Die erzeugten ssDNA-Überhänge werden schnell mit Replikationsprotein A (RPA) beschichtet, um sie vor einer weiteren Verarbeitung zu schützen. Anschließend setzen BRCA2, PALB2 und BRCA1 ein, um die Verschiebung von RPA und die Montage des RAD51-Nukleofilaments zu vermitteln, das für den homologiegesteuerten Reparaturmechanismus erforderlich ist. Eine feine Balance zwischen der Verwendung von NHEJ und HR ist für die optimale Aufrechterhaltung der genomischen Integrität notwendig. Die Wahl des Weges hängt von der Zellzyklusphase ab. HR wird bevorzugt während der S- bis G2-Phasen verwendet, in denen die DNA-Resektion auf höchstem Niveau ist und die Schwesterchromatiden zur Verfügung stehen, um eine ordnungsgemäße Reparatur zu gewährleisten.
Poly (ADP-ribose) Polymerase 1 (PARP-1) ist eines der frühesten Proteine, die für das DSB rekrutiert wurden. Es regelt sowohl die Resektionsaktivität als auch die Montage von nachgeschalteten Effektoren, die am NHEJ5,6 beteiligt sind. PARP-1 wird auch für die Reparatur von DNA-Einzelsträngelbrüchen während der Replikation benötigt7,8. Aufgrund seiner wichtigen Rolle bei der DNA-Reparatur werden PARP-Inhibitoren (PARPi) als Krebstherapien eingesetzt. Bei mehreren HR-defizienten Krebsarten führt die PARPi-Behandlung zu einer synthetischen tödlichen Reaktion aufgrund der Unfähigkeit von HR-defizienten Zellen, den akkumulierten Schaden über einen alternativen Weg zu reparieren9,10. Derzeit gibt es vier von der FDA zugelassene PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib und Talazoparib (auch BMN 673 genannt), die für verschiedene Brust- und Eierstockkrebsbehandlungen eingesetzt werden11. PARPi-Resistenzen sind jedoch häufig, und eine mögliche Ursache entsteht durch den Erneuterwerb von HR-Kenntnissen12. Der Verlust oder die Hemmung von PARP-1 in Gegenwart von Bestrahlung dysreguliert die Resektosom-Maschinerie, was zur Anhäufung längerer ssDNA-Trakte führt13. Daher ist eine eingehende Untersuchung der DNA-Resektion in vivo entscheidend für ein klareres Verständnis der DNA-Reparaturwege und die anschließende Entwicklung neuer Strategien zur Behandlung von Krebs und zur Überwindung der PARPi-Resistenz.
Es wurden mehrere Methoden verwendet, um DNA-Resektionsereignisse nachzuweisen5. Eine solche Methode ist die klassische IF-basierte Technik, die eine indirekte Färbung und Visualisierung der resezierten DNA nach stressinduziertem DSB unter Verwendung eines Anti-RPA-Antikörpers ermöglicht. Die Markierung genomischer DNA mit 5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU) und der Nachweis von nur ssDNA ist eine direkte Messung von DNA-Resektionsereignissen. Es umgeht die Überwachung von RPA, die an mehreren zellulären Prozessen wie der DNA-Replikation beteiligt ist. Bei der hier beschriebenen Methode ermöglichen zellen, die mit BrdU für einen einzelnen Zellzyklus inkubiert wurden, dass BrdU in einen Strang der replizierenden zellulären DNA eingebaut wird. Nach der Resektion wird die IF-Färbung unter Bedingungen durchgeführt, die einen BrdU-Nachweis nur in der ssDNA-Form unter Verwendung eines Anti-BrdU-Antikörpers ermöglichen. Dieser Antikörper kann nur auf exponierte BrdU-Nukleotide zugreifen und erkennt keine in doppelsträngige DNA integrierten Nukleotide. Mittels Fluoreszenzmikroskopie kann die resezierte DNA in Form von punktförmigen BrdU/ssDNA-Herden sichtbar gemacht werden. Die Kernintensität dieser Herde kann als Auslesung verwendet werden, um die Resektion nach DNA-Schäden zu quantifizieren. Diese Arbeit beschreibt Schritt für Schritt die Prozesse dieser Methode, die auf die meisten Säugetierzelllinien angewendet werden kann. Diese Methode sollte als einfache Möglichkeit zur Überwachung der DNA-Endresektion in Cellulo als Proof of Concept von großem Nutzen sein.
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Protocol
1. Zellkultur, Behandlungen und Deckglasvorbereitung
HINWEIS: Alle Zellplattierungen, Transfektionen und Behandlungen, mit Ausnahme der Bestrahlung, sollten unter einer sterilen Zellkulturhaube stattfinden.
- Tag 1
- Legen Sie in eine 6-Well-Platte einen einzelnen Deckglas in jeden Brunnen für so viele Bedingungen wie nötig. Platte ~ 150.000 HeLa-Zellen für die Transfektion oder medikamentöse Behandlung, je nach Wunsch.
HINWEIS: Bei der Transfektion wird empfohlen, zum Zeitpunkt der Beschichtung eine umgekehrte Transfektion durchzuführen, oder es ist möglich, einige Stunden nach der Beschichtung eine Vorwärtstransfektion durchzuführen, um die Haftung zu ermöglichen. Eine umgekehrte Transfektion wird erreicht, indem die Transfektionsmischung zum Deckglas gegeben wird, bevor die Zellen hinzugefügt werden; Somit beginnt die Transfektion, bevor die Zellen zu kleben beginnen. Eine Vorwärtstransfektion hingegen ist die Zugabe der Transfektionsmischung nach der Haftung an der Oberfläche in der Regel am folgenden Tag. Es ist jedoch möglich, dies am selben Tag zu tun, vorausgesetzt, es wird genügend Zeit für die Zellen gegeben, um zu haften. - Verwenden Sie für diese Methode 4 Vertiefungen: Vertiefung 1: siRNA-Kontrolle (siCTRL genannt); Gut 2: siRNA gegen PARP-1 (siPARP-1); Brunnen 3: unbehandelt; Vertiefung 4: Zellen, die 1 h vor der Bestrahlung mit 5 μM BMN673 behandelt werden sollen.
ANMERKUNG: In diesem Protokoll wurden alle Prüfungen unter bestrahlten Bedingungen durchgeführt (siehe Abschnitt 1.3). - Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5% CO2 befeuchteten Inkubator über Nacht, obwohl das Transfektionsprotokoll eine Inkubation von bis zu 3 Tagen ermöglicht. Die Inkubationszeit vor der BrdU-Behandlung hängt von der siRNA-Transfektionseffizienz ab. Wenn es keine Transfektion gibt, reicht die Inkubation für 16 h aus, um die Einhaltung des Deckglases und ein gewisses Zellwachstum zu ermöglichen.
HINWEIS: Die Bedingungen des Inkubators können je nach verwendeter Zelllinie geändert werden.
- Legen Sie in eine 6-Well-Platte einen einzelnen Deckglas in jeden Brunnen für so viele Bedingungen wie nötig. Platte ~ 150.000 HeLa-Zellen für die Transfektion oder medikamentöse Behandlung, je nach Wunsch.
- Tag 2
- BrdU in einer Endkonzentration von 10 μM in das entsprechende Kulturmedium geben und 16 h lang inkubieren (ein Zellzyklus).
ANMERKUNG: Die BrdU-Lösung wird in Dimethylsulfoxid hergestellt; die verwendete Stammlösung beträgt 10 mM und wird in Aliquots bei -20 °C gelagert.
- BrdU in einer Endkonzentration von 10 μM in das entsprechende Kulturmedium geben und 16 h lang inkubieren (ein Zellzyklus).
- Tag 3
- Bestrahlen Sie die Platten mit einer Gesamtdosis von 5 Gy Röntgenbestrahlung (variieren Sie die Dosis der Bestrahlung je nach Bestrahlungstyp, z. B. Kleintierbestrahlungsgeräte vs. Tischbestrahlungsgeräte). Siehe die Materialtabelle für die Marke und das Modell des verwendeten Bestrahlungsgeräts.
- Bringen Sie die Platten zum Inkubator zurück und geben Sie die Zellen für 3 h frei.
- Bereiten Sie während der 3-stündigen Inkubationszeit die beiden Puffer A und B sowie 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor.
HINWEIS: Die Puffer A und B und die Saccharose sollten am Tag der Fixierung frisch zubereitet werden, wobei frische Saccharoselösung verwendet wird, um eine Kontamination zu vermeiden.- Bereiten Sie Puffer A (Pre-Extraction Buffer) gemäß der in Tabelle 1 beschriebenen Reihenfolge (30 ml) vor.
HINWEIS: Die 1M Saccharose sollte am Tag der Anwendung vorbereitet werden, um eine Kontamination zu vermeiden. - Puffer B (Cytoskeleton Stripping Buffer) gemäß der in Tabelle 1 (30 ml) beschriebenen Reihenfolge herstellen.
HINWEIS: Puffer B muss in der angegebenen Reihenfolge hergestellt werden, um die Ausfällung von Tween-20 und Natriumdesoxycholatlösung zu verhindern. - Bereiten Sie 4% PFA, 2 ml pro Zustand (10 ml), unter einer chemischen Haube vor (Tabelle 1).
- Bereiten Sie Puffer A (Pre-Extraction Buffer) gemäß der in Tabelle 1 beschriebenen Reihenfolge (30 ml) vor.
2. Vorextraktion und Fixierung
HINWEIS: Alle Vorextraktionen und Fixierungen werden mit den Deckgläsern durchgeführt, die in der Gewebekulturplatte auf Eis oder bei 4 °C verbleiben. der Deckglas wird erst im letzten Schritt der Montage angehoben (siehe Diskussion).
- Vorextraktion
- Aspirieren Sie das Medium, waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit 1x PBS und entfernen Sie das PBS. 2 ml Vorextraktionspuffer A zugeben und sofort bei 4 °C für 10 min inkubieren.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Inkubationszeit in Puffer A nicht verlängert wird. Eine verlängerte Inkubation in den Vorextraktionspuffern führt zu einer erhöhten Anzahl von abgelösten Zellen aus dem Deckglas. Alternativ kann anstelle der Inkubation bei 4 °C die Inkubation auf Eis erfolgen. - Puffer A durch Aspiration entfernen.
HINWEIS: Waschen Sie die Deckgläser nicht, nachdem Sie Puffer A entfernt haben. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. - 2 ml Cytoskeleton Stripping Buffer B zugeben und sofort bei 4 °C für 10 min inkubieren. Puffer B vorsichtig absaugen und die Zellen einmal vorsichtig mit 1x PBS waschen. Saugen Sie die 1x PBS vorsichtig ab.
- Aspirieren Sie das Medium, waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit 1x PBS und entfernen Sie das PBS. 2 ml Vorextraktionspuffer A zugeben und sofort bei 4 °C für 10 min inkubieren.
- Fixierung
- Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 2 ml 4% PFA unter die chemische Haube geben.
HINWEIS: PFA ist giftig und muss unter einer chemischen Haube manipuliert werden. - Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 20 min. Waschen Sie die Deckgläser zweimal mit 1x PBS und saugen Sie den Überschuss ab.
- Die Deckgläser mit 100% kaltem Methanol bedecken und die Deckgläser bei -20 °C für 5 min inkubieren. Zweimal mit 1x PBS waschen.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Deckgläser können bei 4 °C in 1x PBS gelagert und die Platte bei Bedarf in Alufolie eingewickelt werden. Die Zellen sollten nicht länger als 5 Tage vor der Fortsetzung des IF-Protokolls aufbewahrt werden.
- Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 2 ml 4% PFA unter die chemische Haube geben.
3. Permeabilisierung
- Inkubieren Sie die Zellen mit 2 ml 1x PBS, die 0,5% Triton X-100 enthalten, bei Raumtemperatur für 15 min. Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit 2 ml 1x PBS.
4. Immunfärbung
- Blockierender Schritt
- Bereiten Sie genügend frischen Blockierpuffer (3% BSA in 1x PBS) vor, um 2 ml pro Deckglas zu verwenden.
HINWEIS: Bereiten Sie einen zusätzlichen 5 ml Blockierungspuffer vor, um die Antikörperlösungen herzustellen. - Geben Sie 2 ml Blockierpuffer in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 1 h.
- Bereiten Sie genügend frischen Blockierpuffer (3% BSA in 1x PBS) vor, um 2 ml pro Deckglas zu verwenden.
- Primäre Antikörper-Inkubation
- Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung in frischem Blockierungspuffer vor: BrdU RPN202 1:1000 und Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) 1:500, 100 μL pro Deckglas.
HINWEIS: Um den Antikörper zu erhalten, kann ein kleineres Volumen verwendet werden, 75-100 μL für einen 22 x 22 mm Deckglas, 50-75 μL für einen 18 x 18 mm Deckglas. - Auf jedem Deckglas werden 100 μL primäre Antikörperlösung zugegeben. Decken Sie die Deckgläser mit einem Quadrat Parafilm mit einer Pinzette ab und positionieren Sie den Parafilm vorsichtig, um keine Blasen zu erzeugen.
- Decken Sie die Platte mit Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie den primären Antikörper über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer.
- Entfernen Sie die Parafilmquadrate und waschen Sie die Deckgläser dreimal mit 2 ml sterilem 1x PBS.
- Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung in frischem Blockierungspuffer vor: BrdU RPN202 1:1000 und Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) 1:500, 100 μL pro Deckglas.
- Sekundäre Antikörper-Inkubation
- Bereiten Sie genügend sekundäre Antikörperlösung in frischem Blockierungspuffer vor: Anti-Maus 488 fluoreszierende sekundäre A11011 (für BrdU) Verdünnung 1:800 und Anti-Kaninchen 568 fluoreszierende sekundäre A11011 (für PCNA) Verdünnung 1:800.
HINWEIS: Die verwendeten Farben können an die experimentellen Bedürfnisse angepasst werden. Die verwendete Marke finden Sie in der Materialtabelle. - Fügen Sie auf jedem Deckglas 100 μL sekundäre Antikörperlösung hinzu, bedecken Sie die Deckgläser mit einem Quadrat Parafilm mit einer Pinzette und positionieren Sie den Parafilm vorsichtig ohne Blasen.
- Inkubieren Sie den sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für 1 h mit der Platte, die mit Aluminiumfolie bedeckt ist.
- Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit 2 ml 1x PBS.
- Bereiten Sie genügend sekundäre Antikörperlösung in frischem Blockierungspuffer vor: Anti-Maus 488 fluoreszierende sekundäre A11011 (für BrdU) Verdünnung 1:800 und Anti-Kaninchen 568 fluoreszierende sekundäre A11011 (für PCNA) Verdünnung 1:800.
- Nukleare Färbung
- Bereiten Sie ein Volumen von 2 ml pro Deckglas von 1x PBS mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in einer Endkonzentration von 1 μg/ml (1:1000) vor.
- Fügen Sie auf jedem Deckglas 2 ml der DAPI-Lösung hinzu. Die Deckgläser bei Raumtemperatur für 10 min mit der platte mit Alufolie bedecken. Waschen Sie die Deckgläser zweimal mit 1x PBS.
- Decken Sie die Deckgläser mit 1x PBS ab und verwenden Sie entweder eine Nadel oder eine feine Pinzette, um den Deckglas von der Unterseite des Brunnens zu heben. Tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit vorsichtig ab, indem Sie eine Kante vorsichtig auf ein Papiertuch klopfen.
HINWEIS: Achten Sie darauf, den Objektträger nicht fallen zu lassen oder die flache Oberfläche mit den anhaftenden Zellen das Papier berühren zu lassen. - Montieren Sie die Deckgläser auf Dias mit 10-20 μL ZF-spezifischen Montagemedien.
5. Bildaufnahme und -analyse
HINWEIS: Die Bildaufnahme kann auf verschiedenen Arten von Fluoreszenzmikroskopen erfolgen. Ein Epifluoreszenzmikroskop mit einem 63-fachen Ölobjektiv wurde verwendet; siehe die Materialtabelle für die Marke und das Modell. Z-Stacks sind nicht erforderlich, obwohl sie je nach Zelllinie und Grad der mitochondrialen Färbung von Nutzen sein können.
- Bildanalyse
- Erstellen Sie für jedes Bild mehrere TIFF-Dateien. Verschmelzen Sie alle Ebenen, aber halten Sie die Farbkanäle getrennt. Importieren Sie diese Dateien in Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) und analysieren Sie sie mithilfe der Speckle Counting-Pipeline (Supplemental Video 1).
- Laden Sie die Bilder hoch (ergänzende Abbildung S1A).
- Um mit der Erstellung des Projekts zu beginnen, laden Sie die Speckle-Zählpipeline in das Programm und die zu analysierenden Bilder im bereitgestellten Bereich.
- Verwenden Sie das NamesAndTypes-Modul , um jedem Bild einen aussagekräftigen Namen zuzuweisen, mit dem andere Module auf it-C01: Darstellung des BRDU-Kanals verweisen. C02: Darstellung des PCNA-Kanals; C03: Darstellung des DAPI-Kanals.
HINWEIS: Diese Identifikatoren hängen vom Mikroskop ab. Der Dateiname sollte einen Bezeichner enthalten, um zwischen den Kanälen zu unterscheiden.
- Identifizieren Sie, welche Datei verwendet werden soll, um die Kerne zu identifizieren, und benennen Sie sie (ändern Sie diesen Namen nach Bedarf) (siehe Ergänzende Abbildung S1B und Ergänzende Abbildung S1C).
- Wählen Sie den Durchmesser des Objekts zwischen 50 und 300 Pixeleinheiten aus, was der akzeptable Größenbereich für Kerne ist, aber ändern Sie den Wert so, dass er zu den Kernen im Bild passt.
HINWEIS: Es kann sein, dass 50 ein zu großer Wert ist und verhindert, dass kleinere Kerne identifiziert werden; Ebenso kann 300 es ermöglichen, große Gruppierungen von Kernen als 1 zu zählen. - Verwerfen Sie Objekte außerhalb des Durchmesserbereichs, um sicherzustellen, dass nur Objekte gezählt werden, die den Kriterien entsprechen.
- Verwerfen Sie Objekte, die Rahmen berühren, um Zellen zu entfernen, die sich möglicherweise nur teilweise im Feld befinden.
- Wenden Sie den Schwellenwert an, um ihn an die spezifischen Bilder anzupassen. Beachten Sie die folgenden Einstellungen als Beispiel. Ändern Sie den Schwellenwertkorrekturfaktor basierend darauf, wie streng die Schwellenwertstrategie sein wird. Zu den weiteren Einstellungen gehören die Schwellenwertstrategie: Global; Schwellenwertmethode: Otsu; Schwellenwerte für zwei Klassen oder drei Klassen: Zwei Klassen; Schwellenwert-Glättungsskala: 1; Schwellenwert-Glättungsfaktor: 1; untere und obere Grenzen des Schwellenwerts: 0,0 und 1,0; Methode zur Unterscheidung verklumpter Objekte: Shape; und Methode zum Zeichnen von Trennlinien zwischen verklumpten Objekten: Propagate.
HINWEIS: Für jeden Parameter bietet der Zellenprofiler ergänzende Definitionen und verfügbare Möglichkeiten für die Variableneinstellung.
- Wählen Sie den Durchmesser des Objekts zwischen 50 und 300 Pixeleinheiten aus, was der akzeptable Größenbereich für Kerne ist, aber ändern Sie den Wert so, dass er zu den Kernen im Bild passt.
- Identifizieren Sie das primäre Objekt, um die Herde zu identifizieren (ergänzende Abbildung S2A).
- Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Wählen Sie das Eingabebild aus: Maskedgreen; benannte das primäre Objekt, das identifiziert werden soll: BrdUFoci; typischer Durchmesser des Objekts: 1-15; Verwerfen Sie das Objekt außerhalb des Durchmesserbereichs: Ja; Verwerfen Sie das Objekt, das den Rand des Bildes berührt: Nein; Schwellenwertstrategie: Adaptiv; Schwellenwertmethode: Otsu; Schwellenwerte für zwei Klassen oder drei Klassen: Drei Klassen; Schwellenwert-Glättungsskala: 1; Schwellenwert-Glättungsfaktor: 3; und Größe des Glättungsfilters: 4.
- Messen Sie die Intensität (ergänzende Abbildung S2B).
- Wählen Sie das zu messende Bild aus: OrigGreen.
- Klicken Sie auf Weiteres Bild hinzufügen. Wählen Sie das zu messende Bild aus: PCNA. Wählen Sie die zu messenden Objekte aus: Kerne.
HINWEIS: Dies wird verwendet, um die BrdU- und PCNA-Intensität zu messen - die endgültigen Daten, die grafisch dargestellt werden.
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Representative Results
In diesem Protokoll wurde der Bromodeoxyuridin (BrdU)-basierte Assay verwendet, um die Resektionsreaktion von HeLa-Zellen auf bestrahlungsinduzierte Schäden quantitativ zu messen. Die erzeugten ssDNA-Spuren werden nach der Immunfluoreszenzfärbung als unterschiedliche Herde visualisiert (Abbildung 1A). Die identifizierten Herde wurden dann quantifiziert und als integrierte Gesamtintensität der BrdU-Färbung in den Kernen ausgedrückt (Abbildung 1B, Ergänzende Abbildung S1, Ergänzende Abbildung S2 und Ergänzende Abbildung S3). Es ist möglich, die Foci-Zahl oder die mittlere Foci-Intensität zu messen, obwohl dies weniger zuverlässig sein kann als die gesamte Kernintensität, was weitgehend auf die variable Größe der BrdU-Foci zurückzuführen ist.
Um zwischen der Kurzstreckenresektion als Folge von NHEJ und der Langstreckenresektion von HR zu unterscheiden, wurde eine Co-Färbung mit einem Anti-PCNA-Antikörper durchgeführt, um Zellen zu identifizieren, die die S-Phase durchlaufen (Abbildung 1 und ergänzende Abbildung S4). PCNA bildet die DNA-Klemme, die als Prozessivitätsfaktor für die DNA-Polymerase fungiert und für die Replikation unerlässlich ist. PCNA ist im Zellkern prominent und erreicht die maximale Expression während der S-Phase des Zellzyklus. Daher ist das PCNA-Signal in der frühen S-Phase niedrig und hat eine granulare Verteilung. Im Gegensatz dazu ist die PCNA-Färbung in der späten S-Phase recht stark (Abbildung 1A). Bei der ersten Analyse des PCNA-Signals (S-Phase) müssen die Kerne identifiziert und die PCNA-Intensität gemessen werden.
Die resultierenden Werte werden dann als Streudiagramm dargestellt, um die Cut-off-Intensität zur Unterscheidung zwischen den PCNA-positiven und PCNA-negativen Kernen am besten zu bestimmen (ergänzende Abbildung S4A). Die PCNA-negativen Ergebnisse werden dann aus dem Datensatz entfernt, um die BrdU-Intensitätsanalyse aufgrund des niedrigen BRDU-Signals unabhängig von der Bedingung zu ermöglichen (ergänzende Abbildung S4B). Unter diesen experimentellen Bedingungen beherbergen die PCNA-negativen Kerne eine basal integrierte Intensität von BrdU-Brennpunkten von 900 beliebigen Einheiten (A.U.). Dieser Wert erreicht jedoch 1800 A.U. in PCNA-positiven Kernen (Abbildung 1B). Dies entspricht einer 100%igen Erhöhung der Menge des integrierten Signals der BrdU-Brennpunkte. Eine Erhöhung der BrdU-Intensität kann dann mit einer Zunahme der DNA-Resektion korreliert werden, die ausgeprägter und effizienter ist, wenn Zellen S- und G2-Phasen durchlaufen und bestrahlt werden.
In diesem Protokoll wurde die PARP-1-Aktivität entweder durch den Verlust von PARP-1 unter Verwendung einer siRNA-Knockdown-Bedingung oder nach starker Hemmung von PARP-1 unter Verwendung von Talazoparib (BMN673) moduliert, um eine Zunahme der DNA-Resektion nach Bestrahlung (5 Gy) nachzuweisen (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung S5). Die Mengen der resezierten DNA in jeder Bedingung wurden dann nach IF quantifiziert (Abbildung 2B). Im ungestörten Zustand (siCTRL) beträgt die integrierte Intensität der BrdU-Herde pro Kern in den PCNA-positiven Kernen etwa 1500 A.E. (Abbildung 2A,B). Nach einem effizienten Knockdown von PARP-1 unter Verwendung einer siRNA (Abbildung 2C) wurde ein signifikanter Anstieg der Intensität der BrdU-Herde auf etwa 1900 A.U. beobachtet, was einer Intensitätssteigerung von 26% entspricht (p ˂ 0,0001). In ähnlicher Weise stieg nach Der Hemmung von PARP-1 unter Verwendung von BMN673 (5 μM Endkonzentration) die Intensität der Herde von etwa 1750 auf 2500 A.E. an, was einer Erhöhung der Herdintensität um 43% entspricht (p ˂ 0,0001). Somit dysreguliert der Verlust von PARP-1 die DNA-Resektion, wie zuvor berichtet13.
Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass BMN-673 sowohl die Aktivität von PARP-1 hemmt als auch in der DNA einfängt, und die Wirkung dieser Behandlung ist viel schädlicher für die Zelle, was zu einer stärkeren Erhöhung der BrdU-Intensität führt als in siRNA-behandelten Zellen. Der geringfügige Unterschied zwischen unbehandelten und siCTRL-Intensitäten zeigt, wie sich eine Behandlung, wie z. B. die siRNA-Transfektion, auf das Ansprechen und die Ausgabe eines Assays auswirken kann. Es kann weiter zeigen, wie wichtig es ist, die richtigen Kontrollen für jede Bedingung zu verwenden.
Abbildung 1: Die Bildung von BrdU-Herden ist in PCNA-positiven Zellen anfälliger als in replizierenden Zellen. (A) Repräsentative Bilder der Bildung von BrdU-Herden und der PCNA-Färbung nach 5 Gy-Bestrahlung und 3 h Freisetzung. Ein vergrößertes Quadrat mit markierten BrdU-Brennpunkten ist in der Ecke jedes BrdU-Bildes vorhanden. Skalenbalken = 5 μm. (B) Quantifizierung der BrdU-Kernintensität in unbehandelten (ohne BMN-673) HeLa-Zellen. Die Daten zeigen die mittlere ± s.e.m (Mann-Whitney U-Test). Abkürzungen: BrdU = 5-Brom-2′-desoxyuridin; PCNA = proliferierendes Zellkernantigen; IR = Bestrahlung; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; A.U. = beliebige Einheiten; s.e.m. = Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Poly(ADP-ribose)polymerase-1 knockdown oder inhibition führt zu einer erhöhten BrdU-Herdebildung in replizierenden Zellen. (A) Repräsentative Bilder der Bildung von BrdU-Herden und der PCNA-Färbung in unbehandelten HeLa-Zellen, behandelt mit 5 μM BMN-673, siCTRL und siPARP-1, gefolgt von 5 Gy Bestrahlung und 3 h Freisetzung. Ein vergrößertes Quadrat mit markierten BrdU-Brennpunkten ist in der Ecke jedes BrdU-Bildes vorhanden. Skalenbalken = 5 μm. (B) Quantifizierung der BrdU-Kernintensität in unbehandelten HeLa-Zellen, behandelt mit 5 μM BMN-673, siCTRL und siPARP-1, gefolgt von 5 Gy Bestrahlung, die Daten zeigen die mittlere ± s.e.m (Mann-Whitney U-Test). (C) Western Blot zur Validierung des siRNA-Knockdowns von PARP-1. Der F1-23 PARP-1 Antikörper erkennt automodifiziertes PARP-1, was zum verschmierten Aussehen der siCTRL-Bande und zum festen Aussehen des katalytisch gehemmten PARP-1 in BMN-673-behandelten Proben führt. Abkürzungen: PARP-1 = Poly(ADP-ribose)polymerase 1; BrdU = 5-Brom-2′-desoxyuridin; PCNA = proliferierendes Zellkernantigen; IR = Bestrahlung; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; A.U. = beliebige Einheiten; siCTRL = siRNA-Kontrolle; siPARP-1 = siRNA zum Niederschlagen von PARP-1; s.e.m. = Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Puffer A (Vorextraktionspuffer) 30 mL | ||
| Reagenz | Volumen | Endgültige Konzentration |
| H2O | 18 ml | |
| ROHRE (pH 7, 500 mM) | 600 μL | 10 mM |
| NaCl (4 M) | 750 μL | 100 mM |
| MgCl2 (1 M) | 90 μL | 3 mM |
| EGTA (500 mM) | 60 μL | 1 mM |
| Trition X-100 (10%) | 1,5 ml | 0.50% |
| Saccharose (1 M) | 9 ml | 300 mM |
| Puffer B (Cytoskeleton Stripping Buffer) 30 ml | ||
| Reagenz | Volumen | Endgültige Konzentration |
| H2O | 25.035 ml | |
| Tris pH 7,5 (1 M) | 300 μL | 10 mM |
| NaCl (4 M) | 75 μL | 10 mM |
| MgCl2 (1 M) | 90 μL | 3 mM |
| Tween20 (10 %) | 3 ml | 1% |
| 10% Natriumdesoxycholitat | 1,5 ml | 0.50% |
| Reagenz | Volumen |
| 16% PFA | 2,5 ml |
| PBS 1x | 7,5 ml |
Tabelle 1.
Ergänzende Abbildung S1: Visuelle Darstellung der Cell Profiler Software und der Speckle-Zählpipeline Teil 1. (A) Screenshot zeigt das Fenster, das verwendet wird, um die verschiedenen Kanaldateien der zu analysierenden Bilder zu identifizieren. Diese Aufnahmen zeigen die Benutzeroberfläche des Zellenprofilers. (B) Screenshot des Menüs "Primäre Objekte identifizieren" zur Identifizierung der Kerne. Die hervorgehobenen Werte sind die häufig geänderten Werte, um Kerne am besten zu identifizieren. Abkürzungen: BrdU = 5-Brom-2′-desoxyuridin; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2: Visuelle Darstellung der Cell Profiler Software und der Speckle-Zählpipeline Teil 2. (A) Screenshot des Menüs "Primäre Objekte identifizieren", um die BrdU-Brennpunkte innerhalb der Kerne zu identifizieren. (B) Screenshot des Menüs Objektintensität messen zur Messung der BrdU- und PCNA-Kernintensität. Abkürzungen: BrdU = 5-Brom-2′-desoxyuridin; PCNA = proliferierendes Zellkernantigen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S3: Visuelle Darstellung der Cell Profiler Software und der Speckle-Zählpipeline Teil 3. (A) Darstellung der Kernidentifikation durch den Zellprofiler nach der Optimierung. (B) Darstellung der BrdU-Brennpunktkennzeichnung. (C) Screenshot ist ein Zoom-in auf eine Zelle innerhalb des Anfangsfensters. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S4: Streudiagramm von PCNA-positiven und PCNA-negativen Zellen. (A) Ein Beispiel für ein PCNA-Streudiagramm, das verwendet wird, um PCNA-positive von PCNA-negativen Zellen zu unterscheiden. Die PCNA-Intensität aus einer einzigen Bedingung wurde aufgetragen und die Unterscheidung zwischen den beiden Populationen identifiziert. Das Grün hebt die PCNA-positiven Zellen hervor, das Rot steht für die PCNA-negativen Zellen. Dies geschieht für jedes einzelne Experiment und jede Bedingung. B) Quantifizierung der BrdU-Kernintensität in PCNA-negativen unbehandelten HeLa-Zellen, die mit 5 μM BMN-673, siCTRL und siPARP-1 behandelt wurden; die Daten zeigen den Mittelwert ± s.e.m (Mann-Whitney U-Test). Abkürzungen: PARP-1 = Poly(ADP-ribose)polymerase 1; BrdU = 5-Brom-2′-desoxyuridin; IR = Bestrahlung; PCNA = proliferierendes Zellkernantigen; A.U. = beliebige Einheiten; siCTRL = siRNA-Kontrolle; siPARP-1 = siRNA zum Niederschlagen von PARP-1; s.e.m. = Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S5: BRDU-Signal ohne Bestrahlung. (A) Repräsentative Bilder der BrdU-Herdebildung und der PCNA-Färbung ohne Bestrahlung. Maßstabsbalken = 5 μm. Ein vergrößertes Quadrat mit markierten BrdU-Brennpunkten ist in der Ecke jedes BrdU-Bildes vorhanden. B) Quantifizierung der BrdU-Kernintensität in PCNA-positiven unbehandelten Hela-Zellen, die mit 5 μM BMN-673, siCTRL und siPARP-1 behandelt wurden; die Daten zeigen den Mittelwert ± s.e.m (Mann-Whitney U-Test). C) Quantifizierung der BrdU-Kernintensität in PCNA-negativen unbehandelten HeLa-Zellen, die mit 5 μM BMN-673, siCTRL und siPARP-1 behandelt wurden; die Daten zeigen den Mittelwert ± s.e.m (Mann-Whitney U-Test). Abkürzungen: PARP-1 = Poly(ADP-ribose)polymerase 1; BrdU = 5-Brom-2′-desoxyuridin; PCNA = proliferierendes Zellkernantigen; IR = Bestrahlung; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; A.U. = beliebige Einheiten; siCTRL = siRNA-Kontrolle; siPARP-1 = siRNA zum Niederschlagen von PARP-1; s.e.m. = Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzendes Video 1: Verwendung des Cell Profiler und der Speckle Counting-Pipeline zur Analyse der BrdU-Färbung zur Messung der DNA-Resektion. Dieses Video veranschaulicht die Verwendung von Cell Profiler und der Speckle-Zählpipeline. Es zeigt, wie Sie Bilder mit diesem Tool speziell für dieses Protokoll importieren und analysieren. Abkürzung: BrdU =5-Brom-2′-desoxyuridin. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Dieser Artikel beschreibt eine Methode, die die IF-Färbung nutzt, um Variationen in der DNA-Resektion in Cellulo zu messen. Der aktuelle Standard für die Beobachtung eines Effekts auf die DNA-Resektion ist die RPA-Färbung; Dies ist jedoch eine indirekte Methode, die durch DNA-Replikation beeinflusst werden kann. Zuvor wurde eine weitere BrdU-Inkorporations-basierte DNA-Resektions-IF-Technik zur Klassifizierung der resultierenden Intensitäten in BrdU-positiven und BrdU-negativen Zellen beschrieben. Diese Methode ermöglichte es, dass Zellen, die sich keiner HR unterziehen, aufgrund von Hintergrund- oder mitochondrialer Färbung als positiv gezählt wurden, was zu einer hohen BrdU-Intensität führte14,15,16. Die primäre Neuheit der in diesem Artikel beschriebenen Methode ist die Zugabe der PCNA-Färbung, die eine Selektivität für S- und G2-Phasen des Zellzyklus ermöglicht und sicherstellt, dass das resultierende BrdU-Signal auf eine Resektion und damit auf homologiegesteuerte Reparatur zurückzuführen ist.
Der kritische Schritt in diesem Protokoll ist die Vorextraktion; Andernfalls sind die BrdU-Herde nicht sichtbar, und wenn sie falsch gemacht werden, lösen sich die Zellen vollständig. Falsch vorbereitete Puffer führen zu einer unvollständigen Vorextraktion, wie z. B. einer teilweisen Entfernung des Zytoskeletts oder einem erhöhten Hintergrundsignal. Es ist sehr wichtig, die Dauer der Inkubation mit den Vorextraktionspuffern zu respektieren, eine erhöhte Dauer in den Puffern kann dazu führen, dass sich die Zellen vom Deckglas lösen. Wichtig ist, wenn dieses Protokoll mit schlecht adhärenten Zellen durchgeführt wird, behandeln Sie die Deckgläser mit Polylysin vor, um die Zellablösung während der Vorextraktion zu reduzieren. Anschließend ist das PCNA-Signal ohne Methanolfixierung nicht sichtbar.
Eine weitere wichtige Variable in diesem Protokoll ist der Blockierende Puffer: Inkompatible Blockpuffer führen zum Verlust des BRDU-Signals. Zum Beispiel funktioniert 10% fötales Rinderserum in 1x PBS-Blockierungspuffer, wenn es nicht mit Methanolfixierung kombiniert wird; In Kombination mit einer Methanolfixierung, wie sie für die PCNA-Färbung erforderlich ist, wird das BrdU-Signal jedoch erheblich reduziert. Es ist möglich, dass andere Blockierungsagenten und -methoden mit diesem Protokoll funktionieren. 3% BSA in 1x PBS lieferten die besten Ergebnisse. Eine letzte wesentliche Komponente dieser Technik ist die Verwendung einer DNA-Schadensquelle; Andernfalls wird es wenig bis gar kein nukleares BrdU-Signal geben (ergänzende Abbildung S5). Die Erfahrung hat gezeigt, dass die Bestrahlung eine ausgezeichnete Schadensquelle für diese Methode ist. Wenn jedoch kein Zugang zu einem Bestrahlungsgerät besteht, können stattdessen Radiomimetika wie Neocarzinostatin verwendet werden.
Cell Profiler ist ein nützliches und vielseitiges Werkzeug, das eine einfache und konsistente Analyse der bei dieser Technik erzeugten Bilder ermöglicht. Die Einstellungen können sowohl für die Größe der identifizierten Objekte als auch für den Schwellenwert, ab dem dies geschieht, angepasst werden (Ergänzendes Video 1). Da die Kernintensität der BrdU-Färbung die gewünschte Auslesung ist, liegt die wichtigste Anpassung in der Identifizierung der Kerne aus den DAPI-Dateien. Die Analyse der Bilder aus jeder Bedingung muss separat durchgeführt werden, da die Ergebnisse in Form einer einzigen CSV-Datei erhalten werden, die Zell- und Bildnummern, aber keine Bedingungsnamen enthält. Um festzustellen, ob die Analysebedingungen geeignet sind, verwenden Sie die Funktion Testmodus starten , und stellen Sie sicher, dass das Augensymbol in den gewünschten Schritten geöffnet ist. Schließen Sie dieses Symbol, wenn Sie die eigentliche Analyse ausführen, da dies zu Popup-Fenstern führt und das Programm verlangsamt. Im Starttestmodus können Benutzer hin und her gehen und die Einstellungen nach Bedarf ändern, um zuerst die Kerne und dann die BrdU-Brennpunkte richtig zu identifizieren.
Sobald Sie mit der resultierenden Identifizierung zufrieden sind, verwenden Sie die gleichen Einstellungen für jede Bedingung innerhalb desselben Experiments. Dies kann die Erfassung eines Testbildes für jede Bedingung erfordern, bevor der gesamte Batch analysiert wird, um sicherzustellen, dass die Einstellungen mit jeder Bedingung übereinstimmen. Es ist wichtig zu beachten, dass es je nach Bildaufnahme zu Schwankungen in den Cell Profiler-Einstellungen zwischen Benutzern und zwischen Softwareversionen kommen kann. Daher ist es wichtig, die Testphase zu durchlaufen, um die idealen Parameter für bestimmte Experimente zu bestimmen. Bei der Vorbereitung der grafischen Darstellung der Ergebnisse müssen die PCNA (S-Phase)-positiven Zellen identifiziert werden. Dazu wird die PCNA-Intensität auf die gleiche Weise wie die BrdU-Intensität gemessen und die resultierenden Werte als Streudiagramm dargestellt, um den Cut-off-Intensitätswert für PCNA-positive Zellen bestmöglich zu visualisieren. Die PCNA-negativen Ergebnisse werden dann aus dem Datensatz entfernt, um die BrdU-Intensitätsdiagramme zu ermöglichen. Die bereitgestellten ergänzenden Abbildungen zeigen Screenshots aus dem Programm, die die am besten optimierten Einstellungen hervorheben (Ergänzende Abbildung S1, Ergänzende Abbildung S2 und Ergänzende Abbildung S3).
Eine mögliche Modifikation des Protokolls ist der verwendete PCNA-Antikörper; Zwei verschiedene PCNA-Antikörper wurden erfolgreich getestet, der hier aufgeführte und ein anderer, der nicht mehr in Produktion ist - ein monoklonaler Antikörper der Ratte (Bulldog Bio PCA16D10). Schließlich sollten Benutzer die Deckgläser während der Antikörperinkubation mit Parafilm abdecken. Es ist nicht unbedingt notwendig, obwohl ein deutlich größeres Volumen an Antikörperlösung erforderlich wäre, um den Deckglas vollständig ohne dies abzudecken. Eine andere Methode besteht darin, eine Parafilmschicht um eine Glasplatte herum zu platzieren, Tropfen der Antikörperlösung auf den Parafilm zu legen und die Deckglaszellseite vorsichtig auf den Tropfen der Antikörperlösung zu legen. Diese Glasplatte kann dann in eine feuchte Kammer bei 4 °C über Nacht zur primären Inkubation und im Dunkeln bei Raumtemperatur zur sekundären Inkubation gestellt werden. Diese Methode ist voll funktionsfähig, obwohl sie die Zeit für die Handhabung der Deckgläser erheblich verlängert und dadurch die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass der Deckglas fällt oder gebrochen wird.
Eine alternative Methode zur Messung der Resektion ist die Verwendung der DNA-kämmenden SMART-Methode; Während diese Technik sehr klare Ergebnisse liefert, ist sie viel komplizierter, erfordert mehr Zeit und ist teurer17. Die SMART-Methode erfordert die Extraktion der DNA, ohne sie zu beschädigen, gefolgt von der Dehnung dieser DNA auf Deckgläser, gefolgt von einem IF. Die BrdU IF-Methode ist im Vergleich dazu sowohl einfach als auch kostengünstig und erfordert keine größere Investition als die Kosten des Antikörpers. Diese Methode bietet eine erste Möglichkeit, die Resektion zu messen, die genauer ist als die einfache Messung der RPA-Herdebildung, die mit ihren Auswirkungen auf viele Zellfunktionen zusammenhängen kann. RPA wird jedoch während der Resektion als Teil der DNA-Schadensreaktion auf spezifische Rückstände phosphoryliert.
Die Einzelmolekül-Bildgebung hat kürzlich phosphorylierte RPA (pRPA) als negativen Resektionsregulator gezeigt18. Langfristig könnte diese Methode durch die Kopplung der PCNA/phosphorylierten RPA-Färbung mit der BrdU-Bildgebung unter Verwendung geeigneter Antikörper und optimierter Färbebedingungen noch präzisiert werden. Die vorgestellte Methode liefert jedoch eine Darstellung der Resektion, die unabhängig von den am Resektionsprozess beteiligten Proteinen beobachtet wird, wodurch Verzerrungen negiert werden, die durch Änderungen ihres Signals als Reaktion auf die Behandlung auftreten können. Diese Technik bietet nicht nur eine Methode, um festzustellen, ob ein Protein an der Resektion beteiligt ist, sondern auch, um festzustellen, ob der Zelltod infolge einer medikamentösen Behandlung mit einer Hypo- / Hyperresektion zusammenhängt. Diese Informationen können nicht nur für das Verständnis der mechanistischen Aspekte der DNA-Reparatur von Vorteil sein, sondern auch für den biologischen Mechanismus, der dem medikamenteninduzierten Zelltod zugrunde liegt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Wir danken Marie-Christine Caron für die hervorragende technische Beratung. Diese Arbeit wird durch Mittel der Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879) unterstützt. J.-Y.M. hat einen Tier 1 Canada Research Chair in DNA Repair and Cancer Therapeutics inne. J.O'S ist ein FRQS PhD Student Fellow und S.Y.M ist ein FRQS Postdoctoral Fellow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
References
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