Summary
Nel presente protocollo, dimostriamo come visualizzare la resezione finale a doppio filamento del DNA durante la fase S/ G2 del ciclo cellulare utilizzando un metodo basato sull'immunofluorescenza.
Abstract
Lo studio della risposta al danno al DNA (DDR) è un campo complesso ed essenziale, che è diventato più importante solo a causa dell'uso di farmaci mirati alla DDR per il trattamento del cancro. Questi bersagli sono poli(ADP-ribosio) polimerasi (PARP), che avviano varie forme di riparazione del DNA. L'inibizione di questi enzimi utilizzando inibitori PARP (PARPi) raggiunge una letalità sintetica conferendo una vulnerabilità terapeutica nelle cellule carenti di ricombinazione omologa (HR) a causa di mutazioni nel cancro al seno di tipo 1 (BRCA1), BRCA2 o partner e localizzatore di BRCA2 (PALB2).
Le cellule trattate con PARPi accumulano rotture a doppio filamento di DNA (DSB). Queste rotture vengono elaborate dal meccanismo di resezione finale del DNA, portando alla formazione di DNA a singolo filamento (ss) e alla successiva riparazione del DNA. In un contesto carente di BRCA1, la resezione rinvigorente del DNA attraverso mutazioni in inibitori della resezione del DNA, come 53BP1 e DYNLL1, causa resistenza al PARPi. Pertanto, essere in grado di monitorare la resezione del DNA nel cellulo è fondamentale per una comprensione più chiara dei percorsi di riparazione del DNA e lo sviluppo di nuove strategie per superare la resistenza al PARPi. Le tecniche basate sull'immunofluorescenza (IF) consentono il monitoraggio della resezione globale del DNA dopo il danno al DNA. Questa strategia richiede l'etichettatura del DNA genomico a impulsi lunghi con 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU). Dopo il danno al DNA e la resezione finale del DNA, il DNA a singolo filamento risultante viene specificamente rilevato da un anticorpo anti-BrdU in condizioni native. Inoltre, la resezione del DNA può anche essere studiata utilizzando marcatori del ciclo cellulare per differenziare tra le varie fasi del ciclo cellulare. Le cellule nella fase S/G2 consentono lo studio della resezione finale all'interno di HR, mentre le cellule G1 possono essere utilizzate per studiare l'unione finale non omologa (NHEJ). Un protocollo dettagliato per questo metodo IF accoppiato alla discriminazione del ciclo cellulare è descritto in questo documento.
Introduction
La modulazione dei fattori di riparazione del DNA è un metodo in continua evoluzione per la terapia del cancro, in particolare negli ambienti tumorali carenti di riparazione del DNA DSB. L'inibizione di specifici fattori di riparazione è una delle strategie ingegnose utilizzate per sensibilizzare le cellule tumorali agli agenti dannosi per il DNA. Decenni di ricerca hanno portato all'identificazione di varie mutazioni dei geni di riparazione del DNA come biomarcatori per le scelte di strategia terapeutica1. Di conseguenza, il campo della riparazione del DNA è diventato un hub per lo sviluppo di farmaci per garantire una vasta gamma di trattamenti, potenziando il concetto di medicina personalizzata.
I DSB vengono riparati da due percorsi principali: NHEJ e HR2. La via NHEJ è soggetta a errori, legando rapidamente le due estremità del DNA con poca o nessuna elaborazione finale del DNA e coinvolgendo la proteina chinasi (DNA-PKcs), il complesso Ku70/80, le proteine 53BP1 e RIF13. Al contrario, HR è un meccanismo fedele avviato da BRCA14. Un passo essenziale nella riparazione delle risorse umane è il processo di resezione dell'estremità del DNA, che è la degradazione delle estremità rotte che porta al DNA a singolo filamento (ss) con estremità 3'-OH. BRCA1 facilita il reclutamento delle proteine a valle che formano il resectosoma MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, che sono coinvolte nella resezione del DNA da 5' a 3'5.
La resezione finale iniziale viene effettuata attraverso l'attività endonucleasi di MRE11, consentendo un'ulteriore elaborazione da parte delle nucleasi DNA2 ed EXO1. Gli sbalzi di ssDNA generati vengono rapidamente rivestiti dalla proteina di replicazione A (RPA) per proteggerli da ulteriori elaborazioni. Successivamente, BRCA2, PALB2 e BRCA1 si impegnano a mediare lo spostamento di RPA e l'assemblaggio del nucleofilamento RAD51 necessario per il meccanismo di riparazione diretto all'omologia. Un buon equilibrio tra l'uso di NHEJ e HR è necessario per il mantenimento ottimale dell'integrità genomica. La scelta del percorso dipende dalla fase del ciclo cellulare. L'HR viene utilizzato preferenzialmente durante le fasi da S a G2 in cui la resezione del DNA è al più alto livello e i cromatidi fratelli sono disponibili per garantire una corretta riparazione.
La poli (ADP-ribosio) polimerasi 1 (PARP-1) è una delle prime proteine reclutate nel DSB. Regola sia l'attività di resezione che l'assemblaggio di effettori a valle coinvolti nel NHEJ5,6. PARP-1 è anche necessario per la riparazione della rottura a singolo filamento del DNA durante la replicazione7,8. A causa del suo importante ruolo nella riparazione del DNA, gli inibitori PARP (PARPi) sono usati come terapie contro il cancro. In diversi tumori con deficit di HR, il trattamento con PARPi porta a una risposta letale sintetica a causa dell'incapacità delle cellule carenti di HR di riparare il danno accumulato attraverso un percorso alternativo9,10. Attualmente ci sono quattro PARPi approvati dalla FDA: Olaparib, Rucaparib, Niriparib e Talazoparib (chiamato anche BMN 673), che vengono utilizzati per vari trattamenti per il cancro al seno e alle ovaie11. Tuttavia, la resistenza PARPi è comune e una potenziale causa sorge attraverso la riacquisizione della competenza HR12. La perdita o l'inibizione di PARP-1 in presenza di irradiazione disregola il meccanismo del resettosoma, portando all'accumulo di tratti ssDNA più lunghi13. Pertanto, uno studio approfondito della resezione del DNA in vivo è fondamentale per una comprensione più chiara dei percorsi di riparazione del DNA e il successivo sviluppo di nuove strategie per trattare il cancro e superare la resistenza al PARPi.
Ci sono stati diversi metodi impiegati per rilevare gli eventi di resezione del DNA5. Uno di questi metodi è la classica tecnica basata su IF che consente la colorazione indiretta e la visualizzazione del DNA resecato dopo DSB indotto da stress utilizzando un anticorpo anti-RPA. Etichettare il DNA genomico con 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU) e rilevare solo ssDNA è una misura diretta degli eventi di resezione del DNA. Aggira il monitoraggio dell'RPA, che è coinvolto in più processi cellulari come la replicazione del DNA. Nel metodo qui descritto, le cellule incubate con BrdU per un singolo ciclo cellulare consentono a BrdU di essere incorporato in un filamento del DNA cellulare replicante. Dopo la resezione, la colorazione IF viene eseguita in condizioni che consentono il rilevamento di BrdU solo nella forma ssDNA, con l'uso di un anticorpo anti-BrdU. Questo anticorpo può accedere solo ai nucleotidi BrdU esposti e non rileverà quelli integrati nel DNA a doppio filamento. Utilizzando la microscopia a fluorescenza, il DNA resecato può essere visualizzato sotto forma di focolai puntati brdU / ssDNA. L'intensità nucleare di questi fuochi può essere utilizzata come lettura per quantificare la resezione a seguito di danno al DNA. Questo documento descrive passo dopo passo i processi di questo metodo, che può essere applicato alla maggior parte delle linee cellulari di mammiferi. Questo metodo dovrebbe essere di ampia utilità come un modo semplice per monitorare la resezione finale del DNA nel cellulo, come prova di concetto.
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Protocol
1. Coltura cellulare, trattamenti e preparazione del coverslip
NOTA: Tutte le placcature cellulari, le trasfezioni e i trattamenti, a parte l'irradiazione, dovrebbero avvenire sotto una cappa sterile di coltura cellulare.
- Giorno 1
- In una piastra a 6 pozzetti, posizionare un singolo coperchio in ciascun pozzetto per tutte le condizioni necessarie. Piastra ~ 150.000 cellule HeLa per la trasfezione o il trattamento farmacologico, come desiderato.
NOTA: In caso di trasfezione, si consiglia di eseguire una trasfezione inversa al momento della placcatura, oppure è possibile eseguire una trasfezione in avanti diverse ore dopo la placcatura per consentire l'aderenza. Una trasfezione inversa si ottiene aggiungendo la miscela di trasfezione al coverslip prima che le cellule vengano aggiunte; quindi, la trasfezione inizia prima che le cellule inizino ad aderire. Una trasfezione in avanti, al contrario, è l'aggiunta della miscela di trasfezione post-aderenza alla superficie di solito il giorno successivo. Tuttavia, è possibile farlo lo stesso giorno, a condizione che venga dato abbastanza tempo affinché le cellule aderiscano. - Per questo metodo, utilizzare 4 pozzi: Pozzo 1: controllo del siRNA (chiamato siCTRL); Pozzo 2: siRNA contro PARP-1 (siPARP-1); Bene 3: non trattato; Pozzo 4: Cellule da trattare con 5 μM BMN673 1 h prima dell'irradiazione.
NOTA: In questo protocollo, tutti i test sono stati condotti in condizioni irradiate (vedere paragrafo 1.3). - Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 durante la notte, sebbene il protocollo di trasfezione consenta fino a 3 giorni di incubazione. Il tempo di incubazione prima del trattamento con BrdU dipenderà dall'efficienza di trasfezione del siRNA. Se non c'è trasfezione, l'incubazione per 16 ore è sufficiente per consentire l'aderenza al coverslip e una certa crescita cellulare.
NOTA: le condizioni dell'incubatore possono essere modificate in base alla linea cellulare utilizzata.
- In una piastra a 6 pozzetti, posizionare un singolo coperchio in ciascun pozzetto per tutte le condizioni necessarie. Piastra ~ 150.000 cellule HeLa per la trasfezione o il trattamento farmacologico, come desiderato.
- Giorno 2
- Aggiungere BrdU ad una concentrazione finale di 10 μM nel terreno di coltura appropriato e incubare per 16 ore (un ciclo cellulare).
NOTA: La soluzione di BrdU è preparata in dimetilsolfossido; la soluzione madre utilizzata è di 10 mM ed è conservata in aliquote a -20 °C.
- Aggiungere BrdU ad una concentrazione finale di 10 μM nel terreno di coltura appropriato e incubare per 16 ore (un ciclo cellulare).
- Giorno 3
- Irradiare le piastre con una dose totale di 5 Gy di irradiazione a raggi X (variare la dose di irradiazione a seconda del tipo di irradiatore, ad esempio, piccoli irradiatori animali vs irradiatori da banco). Vedere la tabella dei materiali per la marca e il modello di irradiatore utilizzato.
- Riportare le piastre nell'incubatore e rilasciare le celle per 3 ore.
- Durante il periodo di incubazione di 3 ore, preparare i due tamponi, A e B, e il 4% di paraformaldeide (PFA) in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
NOTA: I tamponi A e B e il saccarosio devono essere preparati freschi il giorno della fissazione, utilizzando una soluzione di saccarosio fresco per prevenire la contaminazione.- Preparare il buffer A (Pre-Extraction Buffer), secondo l'ordine (30 ml) descritto nella Tabella 1.
NOTA: Il saccarosio 1M deve essere preparato il giorno dell'uso per evitare contaminazioni. - Preparare il tampone B (Cytoskeleton Stripping Buffer) secondo l'ordine descritto nella Tabella 1 (30 ml).
NOTA: il tampone B deve essere preparato nell'ordine citato per evitare la precipitazione di Tween-20 e della soluzione di desossicolato di sodio. - Preparare il 4% di PFA, 2 ml per condizione (10 ml), sotto una cappa chimica (Tabella 1).
- Preparare il buffer A (Pre-Extraction Buffer), secondo l'ordine (30 ml) descritto nella Tabella 1.
2. Pre-estrazione e fissazione
NOTA: Tutte le pre-estrazioni e le fissazioni vengono eseguite con i coperchi rimanenti nella piastra di coltura tissutale su ghiaccio o a 4 °C; il coperchio viene sollevato solo nell'ultima fase di montaggio (vedi discussione).
- Pre-estrazione
- Aspirare il mezzo, lavare accuratamente le cellule due volte con 1x PBS e rimuovere il PBS. Aggiungere 2 mL di Tampone di Pre-estrazione A e incubare immediatamente a 4 °C per 10 min.
NOTA: è importante che il tempo di incubazione nel buffer A non venga esteso. L'incubazione prolungata nei tamponi di pre-estrazione comporterà un aumento del numero di cellule staccate dal coverslip. In alternativa, invece dell'incubazione a 4°C, l'incubazione può essere fatta su ghiaccio. - Rimuovere il buffer A attraverso l'aspirazione.
NOTA: non lavare le coperture dopo aver rimosso il tampone A. Procedere al passaggio successivo. - Aggiungere 2 mL di Cytoskeleton Stripping Buffer B e incubare immediatamente a 4 °C per 10 min. Aspirare accuratamente il tampone B e lavare accuratamente le cellule una volta con 1x PBS. Aspirare con cura il PBS 1x.
- Aspirare il mezzo, lavare accuratamente le cellule due volte con 1x PBS e rimuovere il PBS. Aggiungere 2 mL di Tampone di Pre-estrazione A e incubare immediatamente a 4 °C per 10 min.
- Fissazione
- Fissare le celle aggiungendo 2 ml di PFA al 4% sotto il cappuccio chimico.
NOTA: il PFA è tossico e deve essere manipolato sotto un cappuccio chimico. - Incubare le celle a temperatura ambiente per 20 min. Lavare le coperture due volte con 1x PBS e aspirare l'eccesso.
- Coprire i coverslip con metanolo freddo al 100% e incubare i coverslips a -20 °C per 5 minuti. Lavare due volte con 1x PBS.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. I coverslip possono essere conservati a 4 °C in 1x PBS e la piastra avvolta in un foglio di alluminio, se necessario. Le cellule non devono essere conservate più di 5 giorni prima di continuare il protocollo IF.
- Fissare le celle aggiungendo 2 ml di PFA al 4% sotto il cappuccio chimico.
3. Permeabilizzazione
- Incubare le cellule con 2 mL di 1x PBS contenente lo 0,5% di Triton X-100 a temperatura ambiente per 15 min. Lavare le coverslip tre volte con 2 mL di 1x PBS.
4. Immunocolorazione
- Fase di blocco
- Preparare abbastanza tampone di blocco fresco (3% BSA in 1x PBS) per utilizzare 2 ml per coverslip.
NOTA: Preparare un ulteriore tampone bloccante di 5 ml per produrre le soluzioni anticorpali. - Aggiungere 2 ml di tampone bloccante a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
- Preparare abbastanza tampone di blocco fresco (3% BSA in 1x PBS) per utilizzare 2 ml per coverslip.
- Incubazione di anticorpi primari
- Preparare la soluzione anticorpale primaria in un tampone di blocco fresco: BrdU RPN202 1:1000 e antigene nucleare cellulare proliferante (PCNA) 1:500, 100 μL per coverslip.
NOTA: Per preservare l'anticorpo, è possibile utilizzare un volume più piccolo, 75-100 μL per un coverslip 22 x 22 mm, 50-75 μL per un coverslip 18 x 18 mm. - Su ogni coverslip, aggiungere 100 μL di soluzione anticorpale primaria. Coprire le coperture con un quadrato di parafilm usando una pinzetta e posizionare con attenzione il parafilm per non creare bolle.
- Coprire la piastra in un foglio di alluminio e incubare l'anticorpo primario durante la notte a 4 °C in una camera umidificata.
- Rimuovere i quadrati parafilm e lavare i coverslip tre volte con 2 ml di PBS sterile 1x.
- Preparare la soluzione anticorpale primaria in un tampone di blocco fresco: BrdU RPN202 1:1000 e antigene nucleare cellulare proliferante (PCNA) 1:500, 100 μL per coverslip.
- Incubazione di anticorpi secondari
- Preparare una soluzione anticorpale secondaria sufficiente in un tampone di blocco fresco: diluizione secondaria fluorescente A11011 (per BrdU) anti-topo 488 (per BrdU) 1:800 e diluizione secondaria fluorescente A11011 (per PCNA) anti-coniglio 568 1:800.
NOTA: I colori utilizzati possono essere modificati in base alle esigenze sperimentali. Il marchio specifico utilizzato può essere trovato nella Tabella dei materiali. - Aggiungere su ogni coverslip 100 μL di soluzione anticorpale secondaria, coprire i coverslip con un quadrato di parafilm usando una pinzetta e posizionare con attenzione il parafilm senza bolle.
- Incubare l'anticorpo secondario a temperatura ambiente per 1 ora con la piastra ricoperta di foglio di alluminio.
- Lavare le coverslip tre volte con 2 mL di 1x PBS.
- Preparare una soluzione anticorpale secondaria sufficiente in un tampone di blocco fresco: diluizione secondaria fluorescente A11011 (per BrdU) anti-topo 488 (per BrdU) 1:800 e diluizione secondaria fluorescente A11011 (per PCNA) anti-coniglio 568 1:800.
- Colorazione nucleare
- Preparare un volume di 2 mL per coverslip di 1x PBS contenente 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) ad una concentrazione finale di 1 μg/mL (1:1000).
- Aggiungere su ogni coverslip 2 mL della soluzione DAPI. Incubare i coverslip a temperatura ambiente per 10 minuti con la piastra ricoperta di foglio di alluminio. Lavare le coperture due volte con 1x PBS.
- Coprire le coperture con 1x PBS e utilizzare un ago o una pinzetta fine per sollevare la coverslip dal fondo del pozzo. Asciugare accuratamente il liquido in eccesso picchiettando delicatamente un bordo su un tovagliolo di carta.
NOTA: fare attenzione a non far cadere la diapositiva o lasciare che la superficie piana con le celle aderenti tocchi la carta. - Montare i coperchi su guide utilizzando 10-20 μL di supporti di montaggio specifici per IF.
5. Acquisizione e analisi delle immagini
NOTA: l'acquisizione di immagini può essere eseguita su diversi tipi di microscopi fluorescenti. È stato utilizzato un microscopio a epifluorescenza con un obiettivo di olio 63x; vedi la Tabella dei materiali per la marca e il modello. Gli Z-stack non sono necessari, anche se possono essere utili a seconda della linea cellulare e del livello di colorazione mitocondriale.
- Analisi delle immagini
- Per ogni immagine, creare più file tiff; unire tutti i piani, ma mantenere separati i canali di colore. Importare questi file in Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) e analizzarli utilizzando la pipeline Speckle Counting (Video supplementare 1).
- Caricare le immagini (Figura supplementare S1A).
- Per iniziare a creare il progetto, caricare la pipeline di conteggio delle macchie nel programma e le immagini da analizzare nell'area fornita.
- Utilizzare il modulo NamesAndTypes per assegnare un nome significativo a ciascuna immagine con cui altri moduli faranno riferimento ad essa-C01: Representing BrdU Channel; C02: Rappresentare il canale PCNA; C03: Rappresenta il canale DAPI.
NOTA: questi identificatori dipenderanno dal microscopio; dovrebbe esserci un identificatore nel nome del file per distinguere tra i canali.
- Identificare quale file verrà utilizzato per identificare i nuclei e denominarlo (modificare questo nome come richiesto) (vedere figura supplementare S1B e figura supplementare S1C).
- Selezionare il diametro dell'oggetto compreso tra 50 e 300 unità di pixel, che è l'intervallo di dimensioni accettabile per i nuclei, ma modificare il valore per adattarlo ai nuclei nell'immagine.
NOTA: è possibile che 50 sia un valore troppo grande e impedisca l'identificazione di nuclei più piccoli; allo stesso modo, 300 può consentire di contare grandi raggruppamenti di nuclei come 1. - Scartare gli oggetti al di fuori dell'intervallo di diametri per garantire che vengano conteggiati solo quelli che corrispondono ai criteri.
- Scartare gli oggetti che toccano i bordi per rimuovere le celle che potrebbero trovarsi solo parzialmente nel campo.
- Applicare la soglia per adattarla alle immagini specifiche. Si notino le seguenti impostazioni come esempio. Modificare il fattore di correzione della soglia in base alla rigorosità della strategia di soglia. Altre impostazioni includono la strategia di soglia: Globale; metodo di soglia: Otsu; soglia di due o tre classi: due classi; scala di livellamento della soglia: 1; fattore di livellamento della soglia: 1; limiti inferiore e superiore sulla soglia: 0,0 e 1,0; metodo per distinguere gli oggetti raggruppati: Forma; e metodo per disegnare linee divisorie tra oggetti raggruppati: Propaga.
NOTA: per ogni parametro, cell profiler fornisce definizioni complementari e possibilità disponibili per l'impostazione della variabile.
- Selezionare il diametro dell'oggetto compreso tra 50 e 300 unità di pixel, che è l'intervallo di dimensioni accettabile per i nuclei, ma modificare il valore per adattarlo ai nuclei nell'immagine.
- Identificare l'oggetto primario per identificare i fuochi (Figura supplementare S2A).
- Utilizzare le seguenti impostazioni: selezionare l'immagine di input: Maskedgreen; denominato l'oggetto primario da identificare: BrdUFoci; diametro tipico dell'oggetto: 1-15; scartare l'oggetto al di fuori dell'intervallo di diametro: Sì; scartare l'oggetto toccando il bordo dell'immagine : No; strategia di soglia: adattativa; metodo di soglia: Otsu; soglia di due o tre classi: tre classi; scala di livellamento della soglia: 1; fattore di livellamento della soglia: 3; e dimensione del filtro lisciante: 4.
- Misurare l'intensità (Figura supplementare S2B).
- Seleziona l'immagine da misurare: OrigGreen.
- Clicca su Aggiungi un'altra immagine. Selezionare l'immagine da misurare: PCNA. Selezionare gli oggetti da misurare: Nuclei.
NOTA: Questo verrà utilizzato per misurare l'intensità di BrdU e PCNA, i dati finali che verranno rappresentati graficamente.
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Representative Results
In questo protocollo, il saggio basato sulla bromodeossiuridina (BrdU) è stato utilizzato per misurare quantitativamente la risposta di resezione delle cellule HeLa al danno indotto dall'irradiazione. Le tracce di ssDNA generate vengono visualizzate come focolai distinti dopo la colorazione di immunofluorescenza (Figura 1A). I focolai identificati sono stati quindi quantificati ed espressi come l'intensità totale integrata della colorazione BrdU nei nuclei (Figura 1B, Figura supplementare S1, Figura supplementare S2 e Figura supplementare S3). È possibile misurare il numero di focolai o l'intensità media dei fuochi, anche se questo può essere meno affidabile dell'intensità nucleare totale, in gran parte in parte per la dimensione variabile dei fuochi BrdU.
Per distinguere tra la resezione a corto raggio come risultato di NHEJ e la resezione a lungo raggio di HR, la co-colorazione è stata eseguita utilizzando un anticorpo anti-PCNA per identificare le cellule che attraversano la fase S (Figura 1 e Figura supplementare S4). Il PCNA costituisce il morsetto del DNA che agisce come fattore di processività per la DNA polimerasi ed è essenziale per la replicazione. Il PCNA è prominente nel nucleo e raggiunge la massima espressione durante la fase S del ciclo cellulare. Quindi, nella fase S iniziale, il segnale PCNA è basso e ha una distribuzione granulare. Al contrario, nella fase S tardiva, la colorazione PCNA è piuttosto forte (Figura 1A). Quando si analizza per la prima volta il segnale PCNA (fase S), i nuclei devono essere identificati e l'intensità PCNA misurata.
I valori risultanti vengono quindi tracciati come un grafico a dispersione per determinare al meglio l'intensità di cut-off per discriminare tra i nuclei PCNA-positivi e PCNA-negativi (Figura supplementare S4A). I risultati PCNA-negativi verranno quindi rimossi dal set di dati per consentire l'analisi basata sull'intensità BrdU a causa del basso segnale BrdU indipendentemente dalla condizione (Figura supplementare S4B). In queste condizioni sperimentali, i nuclei PCNA-negativi ospitano un'intensità integrata basale di focolai BrdU di 900 unità arbitrarie (U.A.). Tuttavia, questo valore raggiunge 1800 U.A. nei nuclei PCNA-positivi (Figura 1B). Ciò rappresenta un aumento del 100% della quantità del segnale integrato dei fuochi BrdU. L'aumento dell'intensità di BrdU può quindi essere correlato ad un aumento della resezione del DNA, che è più pronunciato ed efficiente quando le cellule attraversano le fasi S e G2 e vengono irradiate.
In questo protocollo, per dimostrare un aumento della resezione del DNA dopo irradiazione (5 Gy), l'attività di PARP-1 è stata modulata attraverso la perdita di PARP-1 utilizzando una condizione di knockdown del siRNA o dopo una potente inibizione di PARP-1 usando Talazoparib (BMN673) (Figura 2 e Figura supplementare S5). Le quantità di DNA resecato in ciascuna condizione sono state poi quantificate dopo IF (Figura 2B). In condizioni non perturbate (siCTRL), l'intensità integrata dei focolai di BrdU per nucleo è di circa 1500 U.A. nei nuclei PCNA-positivi (Figura 2A,B). Dopo un efficiente abbattimento di PARP-1 utilizzando un siRNA (Figura 2C), è stato osservato un aumento significativo dell'intensità dei fuochi BrdU a circa 1900 U.A., che corrisponde ad un aumento del 26% dell'intensità (p ˂ 0,0001). Allo stesso modo, dopo l'inibizione di PARP-1 utilizzando BMN673 (concentrazione finale di 5 μM), l'intensità dei fuochi è aumentata da circa 1750 a 2500 U.A. corrispondente ad un aumento del 43% dell'intensità dei fuochi (p ˂ 0,0001). Pertanto, la perdita di PARP-1 disregola la resezione del DNA come riportato in precedenza13.
È importante ricordare che BMN-673 inibisce l'attività di PARP-1 e lo intrappola nel DNA, e l'effetto di questo trattamento è molto più dannoso per la cellula, con conseguente aumento maggiore dell'intensità di BrdU rispetto alle cellule trattate con siRNA. La leggera differenza tra intensità non trattate e siCTRL dimostra come qualsiasi trattamento, come la trasfezione di siRNA, possa influenzare la risposta e l'output di un test. Può ulteriormente dimostrare l'importanza di utilizzare i controlli appropriati per ogni condizione.
Figura 1: La formazione di focolai di BrdU è più incline a verificarsi nelle cellule PCNA-positive che nelle cellule replicanti. (A) Immagini rappresentative della formazione di focolai di BrdU e della colorazione del PCNA dopo irradiazione a 5 Gy e rilascio di 3 ore. Un quadrato ingrandito che mostra i fuochi BrdU marcati è presente nell'angolo di ogni immagine BrdU. Barre di scala = 5 μm. (B) Quantificazione dell'intensità nucleare BrdU in cellule HeLa non trattate (senza BMN-673). I dati mostrano la media ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). Abbreviazioni: BrdU = 5-bromo-2′-deossiuridina; PCNA = antigene nucleare cellulare proliferante; IR = irradiazione; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; U.A. = unità arbitrarie; s.e.m. = errore standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: L'abbattimento o l'inibizione della poli(ADP-ribosio) polimerasi-1 provoca un aumento della formazione di focolai di BrdU nelle cellule replicanti. (A) Immagini rappresentative della formazione di focolai di BrdU e della colorazione pcNA in cellule HeLa non trattate, trattate con BMN-673, siCTRL e siPARP-1 da 5 μM, seguite da irradiazione di 5 Gy e rilascio di 3 ore. Un quadrato ingrandito che mostra i fuochi BrdU marcati è presente nell'angolo di ogni immagine BrdU. Barre di scala = 5 μm. (B) Quantificazione dell'intensità nucleare BrdU in cellule HeLa non trattate, trattate con 5 μM BMN-673, siCTRL e siPARP-1 seguite da irradiazione 5 Gy, i dati mostrano la media ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). (C) Western blot per convalidare il knockdown del siRNA di PARP-1. L'anticorpo F1-23 PARP-1 riconosce PARP-1 automodificato con conseguente aspetto imbrattato della banda siCTRL e aspetto solido del PARP-1 cataliticamente inibito nei campioni trattati con BMN-673. Abbreviazioni: PARP-1 = poli(ADP-ribosio) polimerasi 1; BrdU = 5-bromo-2′-deossiuridina; PCNA = antigene nucleare cellulare proliferante; IR = irradiazione; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; U.A. = unità arbitrarie; siCTRL = controllo siRNA; siPARP-1 = siRNA per abbattere PARP-1; s.e.m. = errore standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Buffer A (Buffer di pre-estrazione) 30 mL | ||
| Reagente | Volume | Concentrazione finale |
| H2O · | 18 ml | |
| TUBI (pH 7, 500 mM) | 600 μL | 10 mM |
| NaCl (4 M) | 750 μL | 100 metri |
| MgCl2 (1 M) | 90 μL | 3 mM |
| EGTA (500 mM) | 60 μL | 1 mM |
| Trizione X-100 (10%) | 1,5 ml | 0.50% |
| Saccarosio (1 M) | 9 ml | 300 metri quadrati |
| Tampone B (Cytoskeleton Stripping Buffer) 30 mL | ||
| Reagente | Volume | Concentrazione finale |
| H2O · | 25,035 ml | |
| Tris pH 7,5 (1 M) | 300 μL | 10 mM |
| NaCl (4 M) | 75 μL | 10 mM |
| MgCl2 (1 M) | 90 μL | 3 mM |
| Tween20 (10%) | 3 ml | 1% |
| 10% Desossicolcato di sodio | 1,5 ml | 0.50% |
| Reagente | Volume |
| 16% PFA | 2,5 ml |
| PBS 1x | 7,5 ml |
Tabella 1.
Figura supplementare S1: Rappresentazione visiva del software Cell Profiler e della pipeline di conteggio Speckle parte 1. (A) Lo screenshot mostra la finestra utilizzata per identificare i diversi file di canale delle immagini da analizzare. Questi scatti mostrano l'interfaccia del profiler cellulare. (B) Screenshot del menu Identifica oggetti primari per identificare i nuclei. I valori evidenziati sono i valori comunemente alterati per identificare al meglio i nuclei. Abbreviazioni: BrdU = 5-bromo-2′-deossiuridina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Rappresentazione visiva del software Cell Profiler e della pipeline di conteggio Speckle parte 2. (A) Screenshot del menu Identifica oggetti primari per identificare i fuochi BrdU all'interno dei nuclei. (B) Screenshot del menu Misura intensità oggetto per misurare l'intensità nucleare BrdU e PCNA. Abbreviazioni: BrdU = 5-bromo-2′-deossiuridina; PCNA = antigene nucleare cellulare proliferante. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S3: Rappresentazione visiva del software Cell Profiler e della pipeline di conteggio Speckle parte 3. (A) Rappresentazione dell'identificazione dei nuclei da parte del profilatore cellulare dopo ottimizzazione. (B) Rappresentazione dell'identificazione dei fuochi BrdU. (C) Lo screenshot è uno zoom-in su una cella all'interno della finestra iniziale. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S4: Grafico a dispersione di cellule PCNA-positive e PCNA-negative. (A) Un esempio di grafico a dispersione PCNA utilizzato per distinguere le cellule PCNA-positive da PCNA-negative. È stata tracciata l'intensità del PCNA da una singola condizione e identificata la distinzione tra le due popolazioni. Il verde evidenzia le cellule PCNA-positive, il rosso rappresenta le cellule PCNA-negative. Questo viene fatto per ogni singolo esperimento e condizione. (B) Quantificazione dell'intensità nucleare di BrdU in cellule HeLa PCNA-negative non trattate, trattate con BMN-673, siCTRL e siPARP-1 da 5 μM; i dati mostrano la media ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). Abbreviazioni: PARP-1 = poli(ADP-ribosio) polimerasi 1; BrdU = 5-bromo-2′-deossiuridina; IR = irradiazione; PCNA = antigene nucleare cellulare proliferante; U.A. = unità arbitrarie; siCTRL = controllo siRNA; siPARP-1 = siRNA per abbattere PARP-1; s.e.m. = errore standard della media. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S5: Segnale BrdU senza irradiazione. (A) Immagini rappresentative della formazione di focolai brdU e della colorazione PCNA senza irradiazione. Barre di scala = 5 μm. Un quadrato ingrandito che mostra i fuochi BrdU marcati è presente nell'angolo di ogni immagine BrdU. (B) Quantificazione dell'intensità nucleare di BrdU in cellule Hela NON trattate PCNA-positive, trattate con BMN-673, siCTRL e siPARP-1 da 5 μM; i dati mostrano la media ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). (C) Quantificazione dell'intensità nucleare BrdU in cellule HeLa PCNA-negative non trattate, trattate con 5 μM BMN-673, siCTRL e siPARP-1; i dati mostrano la media ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). Abbreviazioni: PARP-1 = poli(ADP-ribosio) polimerasi 1; BrdU = 5-bromo-2′-deossiuridina; PCNA = antigene nucleare cellulare proliferante; IR = irradiazione; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; U.A. = unità arbitrarie; siCTRL = controllo siRNA; siPARP-1 = siRNA per abbattere PARP-1; s.e.m. = errore standard della media. Fare clic qui per scaricare questo file.
Video supplementare 1: Uso del Cell Profiler e della pipeline Speckle Counting per analizzare la colorazione BrdU per la misurazione della resezione del DNA. In questo video viene illustrato l'utilizzo di Cell Profiler e della pipeline di conteggio Speckle. Mostra come importare e analizzare le immagini con questo strumento specifico per questo protocollo. Abbreviazione: BrdU =5-bromo-2′-deoxyuridine. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Questo documento descrive un metodo che utilizza la colorazione IF per misurare le variazioni nella resezione del DNA nel cellulo. Lo standard attuale per osservare un effetto sulla resezione del DNA è attraverso la colorazione RPA; tuttavia, questo è un metodo indiretto che può essere influenzato dalla replicazione del DNA. In precedenza, è stata descritta un'altra tecnica IF di resezione del DNA basata sull'incorporazione di BrdU per classificare le intensità risultanti nelle cellule BrdU-positive e BrdU-negative. Questo metodo ha permesso alle cellule che non sono sottoposte a HR di essere conteggiate come positive a causa della colorazione di fondo o mitocondriale con conseguente elevata intensità di BrdU14,15,16. La principale novità del metodo descritto in questo articolo è l'aggiunta della colorazione PCNA, che consente la selettività per le fasi S e G2 del ciclo cellulare, assicurando che il segnale BrdU risultante sia dovuto alla resezione e, quindi, alla riparazione diretta dall'omologia.
Il passaggio critico in questo protocollo è la pre-estrazione; senza questo, i fuochi BrdU non saranno visibili e, se eseguiti in modo errato, le cellule si staccheranno completamente. Tamponi preparati in modo errato comporteranno una pre-estrazione incompleta, come la rimozione parziale del citoscheletro o l'aumento del segnale di fondo. È molto importante rispettare la durata dell'incubazione con i tamponi di pre-estrazione, una maggiore durata nei tamponi può comportare il distacco delle cellule dal coverslip. È importante sottolineare che, se questo protocollo viene eseguito con cellule scarsamente aderenti, pre-trattare i coverslip con polilisina per ridurre il distacco cellulare durante la pre-estrazione. Successivamente, senza fissazione del metanolo, il segnale PCNA non sarà visibile.
Un'altra variabile importante in questo protocollo è il buffer di blocco: buffer di blocco incompatibili comporteranno la perdita del segnale BrdU. Ad esempio, il 10% di siero bovino fetale in 1x tampone di blocco PBS funzionerà se non combinato con la fissazione del metanolo; tuttavia, se combinato con la fissazione del metanolo come richiesto per la colorazione PCNA, il segnale BrdU è notevolmente ridotto. È possibile che altri agenti e metodi di blocco funzionino con questo protocollo; Il 3% di BSA in 1x PBS ha fornito i migliori risultati. Un'ultima componente essenziale di questa tecnica è l'uso di una fonte di danno al DNA; senza questo, ci sarà poco o nessun segnale brdU nucleare (Figura supplementare S5). L'esperienza ha dimostrato che l'irradiazione è un'ottima fonte di danni per questo metodo. Tuttavia, se non vi è accesso a un irradiatore, possono essere utilizzati farmaci radiomimetici come la neocarzinostatina.
Cell profiler è uno strumento utile e versatile che consente un'analisi facile e coerente delle immagini prodotte in questa tecnica. Le impostazioni possono essere personalizzate sia per la dimensione degli oggetti identificati che per la soglia alla quale lo fa (Video supplementare 1). Poiché l'intensità nucleare della colorazione BrdU è la lettura desiderata, la personalizzazione chiave è nell'identificazione dei nuclei dai file DAPI. L'analisi delle immagini di ciascuna condizione deve essere eseguita separatamente in quanto i risultati sono ottenuti sotto forma di un singolo file csv contenente numeri di cella e immagine, ma non nomi di condizioni. Per determinare se le condizioni di analisi sono appropriate, utilizzare la funzione Avvia modalità test e assicurarsi che l'icona dell'occhio sia aperta nei passaggi desiderati. Chiudi questa icona quando esegui l'analisi effettiva in quanto si tradurrà in finestre pop-up e rallenterà il programma. Nella modalità Start test, gli utenti possono andare avanti e indietro, modificando le impostazioni in base alle esigenze per identificare correttamente prima i nuclei e poi i fuochi BrdU.
Una volta soddisfatti dell'identificazione risultante, utilizzare le stesse impostazioni per ogni condizione all'interno dello stesso esperimento; ciò potrebbe richiedere l'acquisizione di un'immagine di prova per ogni condizione prima di analizzare l'intero lotto per garantire che le impostazioni siano conformi a ciascuna condizione. È importante notare che, a seconda dell'acquisizione delle immagini, potrebbe esserci variabilità nelle impostazioni del profiler di cella tra gli utenti e tra le versioni del software. Quindi, è essenziale passare attraverso la fase di test per determinare i parametri ideali per esperimenti specifici. Quando ci si prepara a rappresentare graficamente i risultati, è necessario identificare le cellule POSITIVE ALLA PCNA (fase S). Per fare ciò, viene misurata l'intensità PCNA, allo stesso modo dell'intensità BrdU, e i valori risultanti tracciati come un grafico a dispersione per visualizzare al meglio il valore di intensità di cut-off per le cellule PCNA-positive. I risultati PCNA-negativi verranno quindi rimossi dal set di dati per consentire la rappresentazione grafica dell'intensità BrdU. Le figure supplementari fornite mostrano schermate del programma che evidenziano le impostazioni più ottimizzate (Figura supplementare S1, Figura supplementare S2 e Figura supplementare S3).
Una possibile modifica al protocollo è l'anticorpo PCNA utilizzato; due diversi anticorpi PCNA sono stati testati con successo, quello elencato qui e un altro che non è più in produzione: un anticorpo monoclonale di ratto (Bulldog Bio PCA16D10). Infine, gli utenti dovrebbero coprire i coverslip con parafilm durante l'incubazione degli anticorpi. Non è strettamente necessario, anche se sarebbe necessario un volume significativamente maggiore di soluzione anticorpale per coprire completamente il coverslip senza questo. Un altro metodo consiste nel posizionare un foglio di parafilm che circonda una lastra di vetro, posizionare gocce della soluzione anticorpale sul parafilm e posizionare con attenzione il lato della cellula di copertura verso il basso sulla goccia di soluzione anticorpale. Questa lastra di vetro può quindi essere collocata in una camera umida a 4 °C durante la notte per l'incubazione primaria e al buio a temperatura ambiente per l'incubazione secondaria. Questo metodo è completamente funzionale anche se aumenta significativamente il tempo di gestione dei coverslip e, di conseguenza, aumenta la probabilità di far cadere o rompere il coverslip.
Un metodo alternativo per misurare la resezione è attraverso l'uso del metodo SMART di combinazione del DNA; mentre questa tecnica fornisce risultati molto chiari, è molto più complicata, richiede più tempo ed è più costosa17. Il metodo SMART richiede l'estrazione del DNA senza danneggiarlo, seguito dall'allungamento di questo DNA su coverslips per essere seguito da un IF. Il metodo BrdU IF, in confronto, è sia semplice che conveniente, non richiedendo un investimento maggiore rispetto al costo dell'anticorpo. Questo metodo fornisce un modo iniziale per misurare la resezione che è più accurato della semplice misurazione della formazione di focolai di RPA, che può essere correlata ai suoi effetti su molte funzioni cellulari. Tuttavia, l'RPA viene fosforilato su residui specifici durante la resezione come parte della risposta al danno al DNA.
L'imaging a singola molecola ha recentemente rivelato l'RPA fosforilato (pRPA) come regolatore di resezione negativo18. Quindi, a lungo termine, questo metodo potrebbe essere reso ancora più preciso accoppiando la colorazione PCNA / RPA fosforilata con l'imaging BrdU con l'uso di anticorpi appropriati e condizioni di colorazione ottimizzate. Tuttavia, il metodo presentato fornisce una rappresentazione della resezione che viene osservata indipendentemente dalle proteine coinvolte nel processo di resezione, annullando così i pregiudizi che possono verificarsi da cambiamenti nel loro segnale in risposta al trattamento. Questa tecnica fornisce non solo un metodo per determinare se una proteina è coinvolta nella resezione, ma anche per determinare se la morte cellulare derivante dal trattamento farmacologico è correlata all'ipo / iper-resezione. Queste informazioni possono essere utili per comprendere non solo gli aspetti meccanicistici della riparazione del DNA, ma anche il meccanismo biologico alla base della morte cellulare indotta da farmaci.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Marie-Christine Caron per l'eccellente consulenza tecnica. Questo lavoro è supportato da finanziamenti del Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. detiene una cattedra di ricerca canadese di livello 1 in riparazione del DNA e terapie del cancro. J.O'S è uno studente di dottorato FRQS e S.Y.M è un borsista post-dottorato FRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
References
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