Summary
I den nuværende protokol demonstrerer vi, hvordan man visualiserer DNA-dobbeltstrenget enderesektion under S / G2-fasen af cellecyklussen ved hjælp af en immunofluorescensbaseret metode.
Abstract
Undersøgelsen af DNA-skaderesponsen (DDR) er et komplekst og essentielt felt, som kun er blevet vigtigere på grund af brugen af DDR-målrettede lægemidler til kræftbehandling. Disse mål er poly(ADP-ribose) polymeraser (PARP'er), som initierer forskellige former for DNA-reparation. Hæmning af disse enzymer ved hjælp af PARP-hæmmere (PARPi) opnår syntetisk dødelighed ved at give en terapeutisk sårbarhed i homologe rekombinationsceller (HR)-mangelfulde celler på grund af mutationer i brystkræft type 1 (BRCA1), BRCA2 eller partner og lokalisator af BRCA2 (PALB2).
Celler behandlet med PARPi akkumulerer DNA-dobbeltstrengsbrud (DSB'er). Disse brud behandles af DNA-enderesektionsmaskineriet, hvilket fører til dannelsen af enkeltstrenget (ss) DNA og efterfølgende DNA-reparation. I en BRCA1-mangelfuld sammenhæng forårsager genoplivning af DNA-resektion gennem mutationer i DNA-resektionshæmmere, såsom 53BP1 og DYNLL1, PARPi-resistens. Derfor er det afgørende at kunne overvåge DNA-resektion i cellulo for en klarere forståelse af DNA-reparationsvejene og udviklingen af nye strategier til at overvinde PARPi-resistens. Immunofluorescens (IF)-baserede teknikker muliggør overvågning af global DNA-resektion efter DNA-skade. Denne strategi kræver genomisk DNA-mærkning med lang puls med 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU). Efter DNA-skade og DNA-enderesektion påvises det resulterende enkeltstrengede DNA specifikt af et anti-BrdU-antistof under indfødte forhold. Desuden kan DNA-resektion også undersøges ved hjælp af cellecyklusmarkører for at skelne mellem forskellige faser af cellecyklussen. Celler i S/G2-fasen tillader undersøgelse af enderesektion inden for HR, mens G1-celler kan bruges til at studere ikke-homolog slutslutning (NHEJ). En detaljeret protokol for denne IF-metode koblet til cellecyklusdiskrimination er beskrevet i dette papir.
Introduction
Modulering af DNA-reparationsfaktorer er en stadigt udviklende metode til kræftbehandling, især i DNA DSB-reparationsmangelfulde tumormiljøer. Hæmningen af specifikke reparationsfaktorer er en af de geniale strategier, der bruges til at sensibilisere kræftceller til DNA-skadelige stoffer. Årtiers forskning førte til identifikation af forskellige mutationer af DNA-reparationsgener som biomarkører for terapeutiske strategivalg1. Derfor er DNA-reparationsfeltet blevet et knudepunkt for lægemiddeludvikling for at sikre en bred vifte af behandlinger, der styrker konceptet med personlig medicin.
DSB'er repareres af to hovedveje: NHEJ og HR2. NHEJ-vejen er fejlbehæftet og ligerer hurtigt de to DNA-ender med ringe eller ingen DNA-slutbehandling og involverer proteinkinase (DNA-PKcs), Ku70/80-komplekset, 53BP1 og RIF1-proteiner3. I modsætning hertil er HR en trofast mekanisme initieret af BRCA14. Et vigtigt skridt i HR-reparation er DNA-end-resektionsprocessen, som er nedbrydningen af de ødelagte ender, der fører til enkeltstrenget (ss) DNA med 3'-OH-ender. BRCA1 letter rekrutteringen af de downstream-proteiner, der danner resektosomet MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, som er involveret i 5' til 3' DNA-resektionen5.
Den indledende slutresektion opnås gennem endonukleaseaktiviteten af MRE11, hvilket muliggør yderligere behandling af DNA2- og EXO1-nukleaserne. De genererede ssDNA-udhæng er hurtigt belagt med replikationsprotein A (RPA) for at beskytte dem mod yderligere behandling. Derefter engagerer BRCA2, PALB2 og BRCA1 sig i at formidle forskydningen af RPA og samlingen af RAD51-nukleofilamentet, der kræves til homologistyret reparationsmekanisme. En fin balance mellem brugen af NHEJ og HR er nødvendig for optimal opretholdelse af genomisk integritet. Valget af vej afhænger af cellecyklusfasen. HR anvendes fortrinsvis i S til G2-faserne, hvor DNA-resektion er på højeste niveau, og søsterkromatider er tilgængelige for at sikre korrekt reparation.
Poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1) er et af de tidligste proteiner, der rekrutteres til DSB. Det regulerer både resektionsaktivitet og samling af downstream-effektorer, der er involveret i NHEJ5,6. PARP-1 er også påkrævet til DNA-enkeltstrenget brudreparation under replikation7,8. På grund af sin vigtige rolle i DNA-reparation anvendes PARP-hæmmere (PARPi) som kræftbehandlinger. I flere HR-mangelfulde kræftformer fører PARPi-behandling til et syntetisk dødeligt respons på grund af HR-mangelfulde cellers manglende evne til at reparere den akkumulerede skade via en alternativ vej9,10. Der er i øjeblikket fire FDA-godkendte PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib og Talazoparib (også kaldet BMN 673), som bruges til forskellige bryst- og æggestokkræftbehandlinger11. PARPi-resistens er imidlertid almindelig, og en potentiel årsag opstår gennem generhvervelsen af HR-færdigheder12. Tab eller hæmning af PARP-1 i nærvær af bestrålingsdysregulerer resektosommaskineriet, hvilket fører til akkumulering af længere ssDNA-kanaler13. Derfor er en tilgrundsgående undersøgelse af DNA-resektion in vivo afgørende for en klarere forståelse af DNA-reparationsvejene og den efterfølgende udvikling af nye strategier til behandling af kræft og til at overvinde PARPi-resistens.
Der har været anvendt flere metoder til at detektere DNA-resektionshændelser5. En sådan metode er den klassiske IF-baserede teknik, der muliggør indirekte farvning og visualisering af det resekteret DNA efter stressinduceret DSB ved anvendelse af et anti-RPA-antistof. Mærkning af genomisk DNA med 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU) og påvisning af kun ssDNA er en direkte måling af DNA-resektionshændelser. Det omgår overvågningen af RPA, som er involveret i flere cellulære processer såsom DNA-replikation. I den metode, der er beskrevet her, tillader celler inkuberet med BrdU for en enkelt cellecyklus, at BrdU inkorporeres i en streng af det replikerende cellulære DNA. Efter resektion udføres IF-farvning under forhold, der tillader brdU-detektion kun i ssDNA-form ved anvendelse af et anti-BrdU-antistof. Dette antistof kan kun få adgang til eksponerede BrdU-nukleotider og vil ikke detektere dem, der er integreret i dobbeltstrenget DNA. Ved hjælp af fluorescensmikroskopi kan det resekterede DNA visualiseres i form af punktere BrdU / ssDNA-foci. Den nukleare intensitet af disse foci kan bruges som en aflæsning til at kvantificere resektion efter DNA-skade. Dette papir beskriver trin for trin processerne i denne metode, som kan anvendes på de fleste pattedyrs cellelinjer. Denne metode bør være af bred nytte som en enkel måde at overvåge DNA-enderesektion i cellulo, som et bevis på konceptet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur, behandlinger og forberedelse af coverslip
BEMÆRK: Al cellebelægning, transfektioner og behandlinger, bortset fra bestråling, skal finde sted under en steril cellekulturhætte.
- Dag 1
- I en 6-brønds plade skal du placere et enkelt dækslip i hver brønd under så mange forhold som nødvendigt. Plade ~ 150.000 HeLa-celler til transfektion eller lægemiddelbehandling efter ønske.
BEMÆRK: Ved transfektering anbefales det at foretage en omvendt transfektion på pletteringstidspunktet, eller det er muligt at foretage en fremadgående transfektion flere timer efter plettering for at muliggøre vedhæftning. En omvendt transfektion opnås ved at tilsætte transfektionsblandingen til dæksedlen, før cellerne tilsættes; således begynder transfektion, før cellerne begynder at klæbe. En fremadrettet transfektion er derimod tilsætningen af transfektionsblandingen efter vedhæftning til overfladen normalt den følgende dag. Det er dog muligt at gøre dette samme dag, forudsat at der gives tilstrækkelig tid til, at cellerne kan klæbe. - Til denne metode skal du bruge 4 brønde: Nå 1: siRNA-kontrol (betegnet siCTRL); Nå 2: siRNA mod PARP-1 (siPARP-1); Nå 3: ubehandlet; Brønd 4: Celler, der skal behandles med 5 μM BMN673 1 time før bestråling.
BEMÆRK: I denne protokol blev alle testene udført under bestrålede forhold (se pkt. 1.3). - Inkuber cellerne ved 37 °C i en 5 % CO2-befugtet inkubator natten over, selv om transfektionsprotokollen giver mulighed for op til 3 dages inkubation. Inkubationstiden før BrdU-behandling afhænger af siRNA-transfektionseffektiviteten. Hvis der ikke er nogen transfektion, er inkubation i 16 timer tilstrækkelig til at muliggøre overholdelse af dæksedlen og en vis cellevækst.
BEMÆRK: Inkubatorbetingelserne kan ændres i henhold til den anvendte cellelinje.
- I en 6-brønds plade skal du placere et enkelt dækslip i hver brønd under så mange forhold som nødvendigt. Plade ~ 150.000 HeLa-celler til transfektion eller lægemiddelbehandling efter ønske.
- Dag 2
- BrdU tilsættes i en slutkoncentration på 10 μM i det relevante dyrkningsmedie, og der inkuberes i 16 timer (en cellecyklus).
BEMÆRK: BrdU-opløsningen fremstilles i dimethylsulfoxid; den anvendte stamopløsning er 10 mM og opbevares i alikvoter ved -20 °C.
- BrdU tilsættes i en slutkoncentration på 10 μM i det relevante dyrkningsmedie, og der inkuberes i 16 timer (en cellecyklus).
- Dag 3
- Bestråle pladerne med en samlet dosis på 5 Gy røntgenbestråling (varierer dosis af bestråling afhængigt af bestrålertypen, for eksempel smådyrsbestrålere vs. bænkbestrålere). Se tabellen over materialer for det anvendte mærke og model af bestråler.
- Returner pladerne til inkubatoren, og slip cellerne i 3 timer.
- I løbet af 3 timers inkubationsperioden forberedes de to buffere, A og B, og 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x phosphatbufret saltvand (PBS).
BEMÆRK: Buffere A og B og saccharose skal tilberedes frisk på fikseringsdagen ved hjælp af frisk saccharoseopløsning for at forhindre kontaminering.- Forbered buffer A (Pre-Extraction Buffer) i henhold til den rækkefølge (30 ml), der er beskrevet i tabel 1.
BEMÆRK: 1M saccharose skal forberedes på brugsdagen for at forhindre forurening. - Forbered buffer B (Cytoskeleton Stripping Buffer) i henhold til den rækkefølge, der er beskrevet i tabel 1 (30 ml).
BEMÆRK: Buffer B skal fremstilles i den nævnte rækkefølge for at forhindre udfældning af Tween-20 og natriumdeoxycholatopløsning. - Forbered 4% PFA, 2 ml pr. tilstand (10 ml), under en kemisk hætte (tabel 1).
- Forbered buffer A (Pre-Extraction Buffer) i henhold til den rækkefølge (30 ml), der er beskrevet i tabel 1.
2. Forekstraktion og fiksering
BEMÆRK: Al præekstraktion og fiksering udføres med dæksedlerne tilbage i vævskulturpladen på is eller ved 4 °C; dæksedlen løftes først i det sidste trin af monteringen (se diskussion).
- For-ekstraktion
- Aspirer mediet, vask forsigtigt cellerne to gange med 1x PBS, og fjern PBS. Der tilsættes 2 ml forekstraktionsbuffer A og inkuberes straks ved 4 °C i 10 minutter.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at inkubationstiden i buffer A ikke forlænges. Udvidet inkubation i pre-extraction bufferne vil resultere i et øget antal løsrevne celler fra dæksedlen. Alternativt kan inkubation i stedet for inkubation ved 4 ° C ske på is. - Fjern buffer A gennem aspiration.
BEMÆRK: Vask ikke dækslipsene efter fjernelse af buffer A. Fortsæt til næste trin. - Tilsæt 2 ml Cytoskeleton Stripping Buffer B og inkuber straks ved 4 °C i 10 min. Aspirer forsigtigt buffer B, og vask forsigtigt cellerne en gang med 1x PBS. Aspirer forsigtigt 1x PBS.
- Aspirer mediet, vask forsigtigt cellerne to gange med 1x PBS, og fjern PBS. Der tilsættes 2 ml forekstraktionsbuffer A og inkuberes straks ved 4 °C i 10 minutter.
- Fiksation
- Fastgør cellerne ved at tilsætte 2 ml 4% PFA under den kemiske hætte.
BEMÆRK: PFA er giftigt og skal manipuleres under en kemisk hætte. - Inkuber cellerne ved stuetemperatur i 20 minutter. Vask dæksedlerne to gange med 1x PBS, og aspirer det overskydende.
- Dæk dæksedlerne med 100% kold metanol, og inkuber dækslipsene ved -20 °C i 5 min. Vask to gange med 1x PBS.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Dækslipsene kan opbevares ved 4 °C i 1x PBS og pladen om nødvendigt pakkes ind i aluminiumsfolie. Cellerne bør ikke opbevares mere end 5 dage, før IF-protokollen fortsættes.
- Fastgør cellerne ved at tilsætte 2 ml 4% PFA under den kemiske hætte.
3. Permeabilisering
- Inkuber cellerne med 2 ml 1x PBS indeholdende 0,5% Triton X-100 ved stuetemperatur i 15 minutter. Vask dækslipsene tre gange med 2 ml 1x PBS.
4. Immunstaining
- Blokering trin
- Forbered nok frisk blokeringsbuffer (3% BSA i 1x PBS) til at bruge 2 ml pr. Dækseddel.
BEMÆRK: Forbered en ekstra 5 ml blokerende buffer til fremstilling af antistofopløsningerne. - Tilsæt 2 ml blokerende buffer til hver brønd og inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
- Forbered nok frisk blokeringsbuffer (3% BSA i 1x PBS) til at bruge 2 ml pr. Dækseddel.
- Primær antistofinkubation
- Den primære antistofopløsning fremstilles i frisk blokerende buffer: BrdU RPN202 1:1000 og prolifererende cellenukleart antigen (PCNA) 1:500, 100 μL pr. dækseddel.
BEMÆRK: For at bevare antistoffet kan der anvendes et mindre volumen, 75-100 μL til et dæksel på 22 x 22 mm, 50-75 μL til et dæksel på 18 x 18 mm. - På hvert dækslip tilsættes 100 μL primær antistofopløsning. Dæk dæksedlerne med en firkant af parafilm ved hjælp af pincet, og placer forsigtigt parafilmen for ikke at skabe bobler.
- Dæk pladen i aluminiumsfolie, og inkuber det primære antistof natten over ved 4 ° C i et befugtet kammer.
- Fjern parafilmfirkanterne, og vask dæksedlerne tre gange med 2 ml steril 1x PBS.
- Den primære antistofopløsning fremstilles i frisk blokerende buffer: BrdU RPN202 1:1000 og prolifererende cellenukleart antigen (PCNA) 1:500, 100 μL pr. dækseddel.
- Sekundær antistofinkubation
- Forbered nok sekundær antistofopløsning i frisk blokerende buffer: anti-mus 488 fluorescerende sekundær A11011 (til BrdU) fortynding 1:800 og anti-kanin 568 fluorescerende sekundær A11011 (til PCNA) fortynding 1:800.
BEMÆRK: De anvendte farver kan ændres, så de passer til de eksperimentelle behov. Det specifikke mærke, der anvendes, findes i materialetabellen. - Tilsæt på hvert dækslip 100 μL sekundær antistofopløsning, dæk dækslipsene med en firkant parafilm ved hjælp af pincet, og placer forsigtigt parafilmen uden bobler.
- Inkuber det sekundære antistof ved stuetemperatur i 1 time med pladen dækket af aluminiumsfolie.
- Vask dækslipsene tre gange med 2 ml 1x PBS.
- Forbered nok sekundær antistofopløsning i frisk blokerende buffer: anti-mus 488 fluorescerende sekundær A11011 (til BrdU) fortynding 1:800 og anti-kanin 568 fluorescerende sekundær A11011 (til PCNA) fortynding 1:800.
- Nuklear farvning
- Der fremstilles et volumen på 2 ml pr. dækseddel på 1x PBS indeholdende 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i en endelig koncentration på 1 μg/ml (1:1000).
- På hvert dækslip tilføjes 2 ml af DAPI-opløsningen. Inkuber dækslipsene ved stuetemperatur i 10 minutter med pladen dækket af aluminiumsfolie. Vask dæksedlerne to gange med 1x PBS.
- Dæk dæksedlerne med 1x PBS, og brug enten en nål eller en fin pincet til at løfte dæksedlen fra bunden af brønden. Tør forsigtigt den overskydende væske af ved at banke forsigtigt på den ene kant på et papirhåndklæde.
BEMÆRK: Pas på ikke at tabe glideren eller lade den flade overflade med de klæbende celler røre papiret. - Monter dækslipsene på dias ved hjælp af 10-20 μL IF-specifikke monteringsmedier.
5. Billedoptagelse og analyse
BEMÆRK: Billedoptagelse kan udføres på flere typer fluorescerende mikroskoper. Et epifluorescensmikroskop med et 63x oliemål blev anvendt; se materialetabellen for mærke og model. Z-stakke er ikke påkrævet, selvom de kan være til nytte afhængigt af cellelinjen og niveauet af mitokondriel farvning.
- Billede analyse
- For hvert billede skal du oprette flere tiff-filer; flet alle planer, men hold farvekanalerne adskilt. Importer disse filer til Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) og analysér ved hjælp af Speckle Counting-pipelinen (Supplemental Video 1).
- Upload billederne (supplerende figur S1A).
- For at begynde at oprette projektet skal du indlæse speckle counting pipeline i programmet og de billeder, der skal analyseres i det medfølgende område.
- Brug modulet NamesAndTypes til at tildele et meningsfuldt navn til hvert billede, hvormed andre moduler vil henvise til det-C01: Repræsenterer BrdU-kanal; C02: Repræsentation af PCNA-kanal; C03: Repræsenterer DAPI-kanalen.
BEMÆRK: Disse identifikatorer afhænger af mikroskopet; der skal være en identifikator i filnavnet for at skelne mellem kanalerne.
- Identificer, hvilken fil der skal bruges til at identificere kernerne og navngive den (skift dette navn efter behov) (se supplerende figur S1B og supplerende figur S1C).
- Vælg objektets diameter mellem 50 og 300 pixelenheder, hvilket er det acceptable størrelsesområde for kerner, men skift værdien, så den passer til kernerne i billedet.
BEMÆRK: Det kan være, at 50 er for stor en værdi og forhindrer mindre kerner i at blive identificeret; Ligeledes kan 300 gøre det muligt at tælle store grupper af kerner som 1. - Kassér objekter uden for diameterområdet for at sikre, at kun dem, der matcher kriterierne, tælles med.
- Kassér objekter, der rører ved kanter, for at fjerne celler, der måske kun er delvist i feltet.
- Anvend tærsklen, så den passer til de specifikke billeder. Bemærk følgende indstillinger som et eksempel. Ændre tærskelkorrektionsfaktoren baseret på, hvor streng tærskelstrategien vil være. Andre indstillinger omfatter tærskelstrategi: Global; tærskelmetode: Otsu; to klasse eller tre klasse tærskelværdier: To klasse; tærskeludjævningsskala: 1; tærskeludjævningsfaktor: 1; nedre og øvre grænser på tærskelværdien: 0,0 og 1,0; metode til at skelne klumpede genstande: Form; og metode til at tegne skillelinjer mellem klumpede objekter: Forplante sig.
BEMÆRK: For hver parameter giver celleprofilen komplementære definitioner og tilgængelig mulighed for variabelindstillingen.
- Vælg objektets diameter mellem 50 og 300 pixelenheder, hvilket er det acceptable størrelsesområde for kerner, men skift værdien, så den passer til kernerne i billedet.
- Identificer det primære objekt for at identificere foci (supplerende figur S2A).
- Brug følgende indstillinger: Vælg inputbilledet: Maskedgreen; navngivet det primære objekt, der skal identificeres: BrdUFoci; objektets typiske diameter: 1-15; kassér objektet uden for diameterområdet: Ja; kassér objektet, der berører billedets kant : Nej; tærskelstrategi: Adaptativ; tærskelmetode: Otsu; to klasse eller tre klasse tærskelværdier: Tre klasse; tærskeludjævningsskala: 1; tærskeludjævningsfaktor: 3; og størrelsen på udjævningsfilteret: 4.
- Måleintensiteten (supplerende figur S2B).
- Vælg det billede, der skal måles: OrigGreen.
- Klik på Tilføj et andet billede. Vælg det billede, der skal måles: PCNA. Vælg objekter, der skal måles: Kerner.
BEMÆRK: Dette vil blive brugt til at måle BrdU- og PCNA-intensiteten - de endelige data, der vil blive graferet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokol blev det bromodeoxyuridin (BrdU)-baserede assay anvendt til kvantitativt at måle HeLa-cellernes resektionsrespons på bestrålingsinduceret skade. De genererede ssDNA-spor visualiseres som forskellige foci efter immunofluorescensfarvning (figur 1A). De identificerede foci blev derefter kvantificeret og udtrykt som den samlede integrerede intensitet af BrdU-farvningen i kernerne (figur 1B, supplerende figur S1, supplerende figur S2 og supplerende figur S3). Det er muligt at måle foci-tallet eller den gennemsnitlige fociintensitet, selvom dette kan være mindre pålideligt end den samlede nukleare intensitet, stort set delvis til den variable størrelse af BrdU-foci.
For at skelne mellem kortrækkende resektion som følge af NHEJ og den langtrækkende resektion af HR blev co-farvning udført ved anvendelse af et anti-PCNA-antistof til at identificere celler, der går gennem S-fase (figur 1 og supplerende figur S4). PCNA udgør DNA-klemmen, der fungerer som en processivitetsfaktor for DNA-polymerase og er afgørende for replikation. PCNA er fremtrædende i kernen og når maksimal ekspression under S-fasen af cellecyklussen. Derfor er PCNA-signalet i den tidlige S-fase lavt og har en granulær fordeling. I modsætning hertil er PCNA-farvningen i sen S-fase ret stærk (figur 1A). Ved første analyse af PCNA-signalet (S-fase) skal kernerne identificeres, og PCNA-intensiteten måles.
De resulterende værdier afbildes derefter som et scatter plot for bedst at bestemme afskæringsintensiteten for at diskriminere mellem de PCNA-positive og PCNA-negative kerner (supplerende figur S4A). De PCNA-negative resultater fjernes derefter fra datasættet for at muliggøre den BrdU-intensitetsbaserede analyse på grund af det lave BrdU-signal uanset tilstanden (supplerende figur S4B). Under disse eksperimentelle forhold har de PCNA-negative kerner en basal integreret intensitet af BrdU-foci på 900 vilkårlige enheder (A.U.). Denne værdi når imidlertid 1800 A.U. i PCNA-positive kerner (figur 1B). Dette repræsenterer en 100% stigning i mængden af det integrerede signal fra BrdU-foci. Forøgelse af BrdU-intensitet kan derefter korreleres med en stigning i DNA-resektion, hvilket er mere udtalt og effektivt, når celler gennemgår S- og G2-faser og bestråles.
I denne protokol blev PARP-1-aktiviteten moduleret enten gennem tab af PARP-1 ved anvendelse af en siRNA-knockdown-tilstand eller efter potent hæmning af PARP-1 under anvendelse af Talazoparib (BMN673) (figur 2 og supplerende figur S5) for at demonstrere en stigning i DNA-resektion efter bestråling (5 Gy). Mængderne af resekteret DNA i hver tilstand blev derefter kvantificeret efter IF (figur 2B). I uforstyrret tilstand (siCTRL) er den integrerede intensitet af BrdU-foci pr. kerne ca. 1500 A.U. i de PCNA-positive kerner (figur 2A,B). Efter en effektiv knockdown af PARP-1 ved anvendelse af et siRNA (figur 2C) blev der observeret en signifikant stigning i intensiteten af BrdU-foci til ca. 1900 A.U., hvilket svarer til 26% stigning i intensitet (p ˂ 0,0001). Tilsvarende steg intensiteten af foci efter hæmning af PARP-1 under anvendelse af BMN673 (5 μM endelig koncentration) fra ca. 1750 til 2500 A.U. svarende til 43% stigning i fociintensiteten (p ˂ 0,0001). Således regulerer tab af PARP-1-dyssektion DNA-resektion som rapporteret tidligere13.
Det er vigtigt at huske, at BMN-673 både hæmmer aktiviteten af PARP-1 og fanger den i DNA, og effekten af denne behandling er meget mere skadelig for cellen, hvilket resulterer i den større stigning i BrdU-intensiteten end i siRNA-behandlede celler. Den lille forskel i ubehandlede og siCTRL-intensiteter viser, hvordan enhver behandling, såsom siRNA-transfektion, kan påvirke responsen og outputtet af et assay. Det kan yderligere demonstrere vigtigheden af at bruge de korrekte kontroller for hver tilstand.
Figur 1: BrdU-focidannelse er mere tilbøjelig til at forekomme i PCNA-positive celler end i replikerende celler. (A) Repræsentative billeder af BrdU-focidannelse og PCNA-farvning efter 5 Gy-bestråling og 3 timers frigivelse. En zoomet firkant, der viser markerede BrdU-foci, er til stede i hjørnet af hvert BrdU-billede. Skalastænger = 5 μm. (B) Kvantificering af BrdU-kerneintensiteten i ubehandlede (uden BMN-673) HeLa-celler. Dataene viser gennemsnittet ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). Forkortelser: BrdU = 5-brom-2′-deoxyuridin; PCNA = prolifererende celle nukleart antigen; IR = bestråling; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; A.U. = vilkårlige enheder; s.e.m. = standardfejl i middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Poly(ADP-ribose) polymerase-1 knockdown eller hæmning resulterer i øget BrdU foci dannelse i replikerende celler. (A) Repræsentative billeder af BrdU foci dannelse og PCNA farvning i ubehandlede HeLa celler, behandlet med 5 μM BMN-673, siCTRL og siPARP-1, efterfulgt af 5 Gy bestråling og 3 timers frigivelse. En zoomet firkant, der viser markerede BrdU-foci, er til stede i hjørnet af hvert BrdU-billede. Skalastænger = 5 μm. (B) Kvantificering af BrdU-kerneintensiteten i ubehandlede HeLa-celler, behandlet med 5 μM BMN-673, siCTRL og siPARP-1 efterfulgt af 5 Gy-bestråling, viser dataene gennemsnittet ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). (C) Western blot for at validere siRNA-knockdown af PARP-1. F1-23 PARP-1-antistoffet genkender automodificeret PARP-1, hvilket resulterer i siCTRL-båndets smurte udseende og det solide udseende af det katalytisk hæmmede PARP-1 i BMN-673-behandlede prøver. Forkortelser: PARP-1 = poly(ADP-ribose) polymerase 1; BrdU = 5-brom-2′-deoxyuridin; PCNA = prolifererende celle nukleart antigen; IR = bestråling; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; A.U. = vilkårlige enheder; siCTRL = siRNA-kontrol; siPARP-1 = siRNA for at slå PARP-1 ned; s.e.m. = standardfejl i middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Buffer A (Pre-Extraction Buffer) 30 ml | ||
| Reagens | Lydstyrke | Endelig koncentration |
| H2O | 18 ml | |
| RØR (pH 7.500 mM) | 600 μL | 10 mM |
| NaCl (4 M) | 750 μL | 100 mM |
| MgCl2 (1 m) | 90 μL | 3 mM |
| EGTA (500 mM) | 60 μL | 1 mM |
| Trition X-100 (10%) | 1,5 ml | 0.50% |
| Saccharose (1 m) | 9 ml | 300 mM |
| Buffer B (Cytoskeleton Stripping Buffer) 30 ml | ||
| Reagens | Lydstyrke | Endelig koncentration |
| H2O | 25.035 ml | |
| Tris pH 7,5 (1 M) | 300 μL | 10 mM |
| NaCl (4 M) | 75 μL | 10 mM |
| MgCl2 (1 m) | 90 μL | 3 mM |
| Tween20 (10%) | 3 ml | 1% |
| 10% Natriumdeoxycholcat | 1,5 ml | 0.50% |
| Reagens | Lydstyrke |
| 16% PFA | 2,5 ml |
| PBS 1x | 7,5 ml |
Tabel 1.
Supplerende figur S1: Visuel repræsentation af celleprofilsoftwaren og Speckle-tællerørledningen del 1. (A) Skærmbillede viser det vindue, der bruges til at identificere de forskellige kanalfiler på de billeder, der skal analyseres. Disse billeder viser celleprofilgrænsefladen. (B) Skærmbillede af menuen Identificer primære objekter for at identificere kernerne. De fremhævede værdier er de almindeligt ændrede værdier for bedst at identificere kerner. Forkortelser: BrdU = 5-brom-2′-deoxyuridin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Visuel repræsentation af celleprofilsoftwaren og Speckle-tællerørledningen del 2. (A) Skærmbillede af menuen Identificer primære objekter for at identificere BrdU-foci i kernerne. (B) Skærmbillede af menuen Mål objektintensitet til måling af BrdU- og PCNA-kerneintensiteten. Forkortelser: BrdU = 5-brom-2′-deoxyuridin; PCNA = prolifererende celle nukleart antigen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S3: Visuel repræsentation af celleprofilsoftwaren og Speckle-tællerørledningen del 3. (A) Repræsentation af kerneidentifikationen ved hjælp af celleprofiler efter optimering. (B) Repræsentation af BrdU-foci-identifikationen. (C) Skærmbillede er en zoom-in på en celle i det oprindelige vindue. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S4: Scatter plot af PCNA-positive og PCNA-negative celler. (A) Et eksempel på et PCNA-spredningsplot, der bruges til at skelne PCNA-positive fra PCNA-negative celler. PCNA-intensiteten fra en enkelt tilstand blev plottet, og sondringen mellem de to populationer identificeret. Den grønne fremhæver de PCNA-positive celler, den røde repræsenterer de PCNA-negative celler. Dette gøres for hvert enkelt eksperiment og tilstand. B) Kvantificering af BrdU-kerneintensiteten i PCNA-negative ubehandlede HeLa-celler, behandlet med 5 μM BMN-673, siCTRL og siPARP-1 dataene viser gennemsnittet ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). Forkortelser: PARP-1 = poly(ADP-ribose) polymerase 1; BrdU = 5-brom-2′-deoxyuridin; IR = bestråling; PCNA = prolifererende celle nukleart antigen; A.U. = vilkårlige enheder; siCTRL = siRNA-kontrol; siPARP-1 = siRNA for at slå PARP-1 ned; s.e.m. = standardfejl i middelværdien. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S5: BrdU-signal uden bestråling. (A) Repræsentative billeder af BrdU-focidannelse og PCNA-farvning uden bestråling. Skalastænger = 5 μm. En zoomet firkant, der viser markerede BrdU-foci, er til stede i hjørnet af hvert BrdU-billede. B) Kvantificering af brdU-kerneintensiteten i PCNA-positive ubehandlede Hela-celler, behandlet med 5 μM BMN-673, siCTRL og siPARP-1 dataene viser gennemsnittet ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). C) Kvantificering af BrdU-kerneintensiteten i PCNA-negative ubehandlede HeLa-celler, behandlet med 5 μM BMN-673, siCTRL og siPARP-1 dataene viser gennemsnittet ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). Forkortelser: PARP-1 = poly(ADP-ribose) polymerase 1; BrdU = 5-brom-2′-deoxyuridin; PCNA = prolifererende celle nukleart antigen; IR = bestråling; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; A.U. = vilkårlige enheder; siCTRL = siRNA-kontrol; siPARP-1 = siRNA for at slå PARP-1 ned; s.e.m. = standardfejl i middelværdien. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende video 1: Brug af celleprofil og Speckle Counting-rørledningen til at analysere BrdU-farvning til måling af DNA-resektion. Denne video viser brugen af Cell Profiler og Speckle-tællerørledningen. Det viser, hvordan man importerer og analyserer billeder med dette værktøj specifikt til denne protokol. Forkortelse: BrdU = 5-brom-2′-deoxyuridin. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir beskriver en metode, der gør brug af IF-farvning til at måle variationer i DNA-resektion i cellulo. Den nuværende standard for observation af en effekt på DNA-resektion er gennem RPA-farvning; Dette er imidlertid en indirekte metode, der kan påvirkes af DNA-replikation. Tidligere er en anden BrdU-inkorporeringsbaseret DNA-resektion IF-teknik blevet beskrevet til klassificering af de resulterende intensiteter i BrdU-positive og BrdU-negative celler. Denne metode gjorde det muligt for celler, der ikke gennemgår HR, at tælles som positive på grund af baggrund eller mitokondriel farvning, hvilket resulterer i en høj BrdU-intensitet14,15,16. Den primære nyhed ved den metode, der er beskrevet i dette papir, er tilsætningen af PCNA-farvning, som muliggør selektivitet for S- og G2-faser i cellecyklussen, hvilket sikrer, at det resulterende BrdU-signal skyldes resektion og dermed homologistyret reparation.
Det kritiske trin i denne protokol er forekstraktionen; uden dette vil BrdU-foci ikke være synlige, og hvis det gøres forkert, vil cellerne løsne sig fuldstændigt. Forkert forberedte buffere vil resultere i ufuldstændig præekstraktion, såsom delvis cytoskeletal fjernelse eller øget baggrundssignal. Det er meget vigtigt at respektere varigheden af inkubation med pre-ekstraktionsbufferne, øget varighed i bufferne kan resultere i, at cellerne løsner sig fra dækslipet. Det er vigtigt, at hvis denne protokol udføres med dårligt klæbende celler, skal du forbehandle dæksedlerne med polylysin for at reducere celleløsning under forekstraktion. Efterfølgende, uden methanolfiksering, vil PCNA-signalet ikke være synligt.
En anden vigtig variabel i denne protokol er blokeringsbufferen: inkompatible blokeringsbuffere vil resultere i tab af BrdU-signal. For eksempel vil 10% føtalt kvægserum i 1x PBS-blokerende buffer fungere, når det ikke kombineres med methanolfiksering; Når det kombineres med methanolfiksering som krævet til PCNA-farvningen, reduceres BrdU-signalet imidlertid betydeligt. Det er muligt, at andre blokeringsmidler og metoder fungerer med denne protokol; 3% BSA i 1x PBS gav de bedste resultater. En sidste væsentlig komponent i denne teknik er brugen af en DNA-skadekilde; uden dette vil der være lidt eller intet nukleart BrdU-signal (supplerende figur S5). Erfaringen har vist, at bestråling er en glimrende kilde til skade for denne metode. Men hvis der ikke er adgang til en bestråler, kan radiomimetiske lægemidler som neocarzinostatin anvendes i stedet.
Celleprofil er et nyttigt og alsidigt værktøj, der muliggør nem og konsekvent analyse af de billeder, der produceres i denne teknik. Indstillingerne kan tilpasses til både størrelsen på de identificerede objekter og den tærskel, hvormed den gør det (Supplerende video 1). Da den nukleare intensitet af BrdU-farvningen er den ønskede udlæsning, er nøgletilpasningen i identifikationen af kernerne fra DAPI-filerne. Analysen af billederne fra hver betingelse skal udføres separat, da resultaterne opnås i form af en enkelt csv-fil, der indeholder celle- og billednumre, men ikke tilstandsnavne. For at afgøre, om analysebetingelserne er passende, skal du bruge funktionen Start testtilstand og sørge for, at øjeikonet er åbent i de ønskede trin. Luk dette ikon, når du kører den faktiske analyse, da det vil resultere i pop op-vinduer og bremse programmet. I Start testtilstand kan brugerne gå frem og tilbage og ændre indstillingerne efter behov for korrekt at identificere først kernerne og derefter BrdU-foci.
Når du er tilfreds med den resulterende identifikation, skal du bruge de samme indstillinger for hver tilstand inden for det samme eksperiment; Dette kan kræve erhvervelse af et testbillede for hver betingelse, inden hele batchen analyseres for at sikre, at indstillingerne overholder hver betingelse. Det er vigtigt at bemærke, at afhængigt af billedoptagelse kan der være variation i celleprofilindstillingerne mellem brugere og mellem softwareversioner. Derfor er det vigtigt at gennemgå testfasen for at bestemme de ideelle parametre til specifikke eksperimenter. Når man forbereder sig på at tegne resultaterne, skal de PCNA-positive celler (S-fase)-positive celler identificeres. For at gøre dette måles PCNA-intensiteten på samme måde som BrdU-intensiteten, og de resulterende værdier afbildes som et scatter-plot for bedst at visualisere afskæringsintensitetsværdien for PCNA-positive celler. De PCNA-negative resultater fjernes derefter fra datasættet for at muliggøre BrdU-intensitetsgrafering. De medfølgende supplerende tal viser skærmbilleder fra programmet, der fremhæver de mest optimerede indstillinger (supplerende figur S1, supplerende figur S2 og supplerende figur S3).
En mulig ændring af protokollen er det anvendte PCNA-antistof; to forskellige PCNA-antistoffer blev testet med succes, den ene anført her og en anden, som ikke længere er i produktion - et rottemonoklonalt antistof (Bulldog Bio PCA16D10). Endelig skal brugerne dække dæksedlerne med parafilm under antistofinkubation. Det er ikke strengt nødvendigt, selv om et betydeligt større volumen antistofopløsning ville være påkrævet for at dække dæksedlen helt uden dette. En anden metode er at placere et ark parafilm omkring en glasplade, placere dråber af antistofopløsningen på parafilmen og forsigtigt placere dækslipcellesiden nedad på dråben af antistofopløsningen. Denne glasplade kan derefter placeres i et fugtigt kammer ved 4 °C natten over til primær inkubation og i mørke ved stuetemperatur til sekundær inkubation. Denne metode er fuldstændig funktionel, selvom den øger tiden for håndtering af dækslipsene betydeligt og som følge heraf øger sandsynligheden for at tabe eller bryde dæksedlen.
En alternativ metode til at måle resektion er ved brug af DNA-kæmmende SMART-metoden; mens denne teknik giver meget klare resultater, er den meget mere kompliceret, kræver mere tid og er dyrere17. SMART-metoden kræver ekstraktion af DNA'et uden at beskadige det, efterfulgt af at strække dette DNA på dæksedler, der skal efterfølges af en IF. BrdU IF-metoden er til sammenligning både enkel og omkostningseffektiv og kræver ikke en større investering end omkostningerne ved antistoffet. Denne metode giver en indledende måde at måle resektion på, der er mere præcis end blot at måle RPA-focidannelse, hvilket kan relateres til dens virkninger på mange cellulære funktioner. RPA fosforyleres imidlertid på specifikke rester under resektion som en del af DNA-skaderesponsen.
Enkeltmolekylebilleddannelse afslørede for nylig fosforyleret RPA (pRPA) som en negativ resektionsregulator18. Derfor kan denne metode på lang sigt gøres endnu mere præcis ved at koble PCNA/fosforyleret RPA-farvning med BrdU-billeddannelse ved hjælp af passende antistoffer og optimerede farvningsbetingelser. Den præsenterede metode giver imidlertid en repræsentation af resektion, der observeres uafhængigt af de proteiner, der er involveret i resektionsprocessen, hvilket negerer bias, der kan forekomme fra ændringer i deres signal som reaktion på behandlingen. Denne teknik giver ikke kun en metode til at bestemme, om et protein er involveret i resektion, men også til at afgøre, om celledød som følge af lægemiddelbehandling er relateret til hypo / hyperresektion. Disse oplysninger kan være gavnlige for at forstå ikke kun de mekanistiske aspekter af DNA-reparation, men også den biologiske mekanisme, der ligger til grund for den lægemiddelinducerede celledød.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Marie-Christine Caron for fremragende teknisk rådgivning. Dette arbejde støttes af finansiering fra Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. har en Tier 1 Canada Research Chair i DNA Repair and Cancer Therapeutics. J.O'S er en FRQS ph.d.-studerende stipendiat, og S.Y.M er en FRQS postdoc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
References
- Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J.
- Ronato, D. A., et al. Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection. Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).
- Hu, Y., et al. PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair. Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).
- Satoh, M. S., Lindahl, T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).
- Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).
- Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
- Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy. Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).
- Noordermeer, S. M., van Attikum, H. PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells. Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).
- Caron, M. C., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks. Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).
- Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells. Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).
- Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).
- Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
- Huertas, P., Cruz-García, A. Single molecule analysis of resection tracks. Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).
- Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. RPA phosphorylation inhibits DNA resection. Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).
