Summary
Forskellige modeller af midten cerebral arterie okklusion (MCAo) anvendes i eksperimentel slagtilfælde forskning. Her beskrives en eksperimentel slagtilfældemodel af forbigående MCAo via den eksterne halspulsåre (ECA), som har til formål at efterligne human slagtilfælde, hvor cerebrovaskulær trombbus fjernes på grund af spontan blodprop lysis eller terapi.
Abstract
Slagtilfælde er den tredje mest almindelige årsag til dødelighed og den hyppigste årsag til erhvervet voksen handicap i de udviklede lande. Til dato, terapeutiske muligheder er begrænset til en lille andel af slagtilfælde patienter inden for de første timer efter slagtilfælde. Nye terapeutiske strategier er ved at blive grundigt undersøgt, især for at forlænge den terapeutiske tidsvindue. Disse nuværende undersøgelser omfatter studiet af vigtige patofysiologiske veje efter slagtilfælde, såsom post-slagtilfælde betændelse, angiogenese, neuronal plasticitet, og regenerering. I løbet af det sidste årti har der været stigende bekymring over den ringe reproducerbarhed af eksperimentelle resultater og videnskabelige resultater blandt uafhængige forskningsgrupper. For at overvinde den såkaldte "replikationskrise" er der et presserende behov for detaljerede standardiserede modeller for alle procedurer. Som en indsats inden for "ImmunoStroke" forskningskonsortium (https://immunostroke.de/), foreslås en standardiseret musemodel af forbigående mellem cerebral arterie okklusion (MCAo). Denne model gør det muligt fuldstændig restaurering af blodgennemstrømningen ved fjernelse af glødetråden, der simulerer den terapeutiske eller spontane blodprop lysis, der forekommer i en stor del af menneskelige slagtilfælde. Den kirurgiske procedure for denne "glødetråd" slagtilfælde model og værktøjer til sin funktionelle analyse er påvist i den ledsagende video.
Introduction
Slagtilfælde er en af de mest almindelige årsager til død og handicap på verdensplan. Selv om der hovedsageligt er to forskellige former for slagtilfælde, iskæmisk og hæmoragisk, 80-85% af alle slagtilfælde tilfælde er iskæmisk1. I øjeblikket er kun to behandlinger tilgængelige for patienter med iskæmisk slagtilfælde: farmakologisk behandling med rekombinant væv plasminogen aktivator (rtPA) eller mekanisk trombektomi. Men på grund af den smalle terapeutiske tidsvindue og flere udelukkelseskriterier kan kun et udvalgt antal patienter drage fordel af disse specifikke behandlingsmuligheder. I løbet af de sidste to årtier har præklinisk og translationel slagtilfældeforskning fokuseret på studiet af neuroprotektive tilgange. Men, alle forbindelser, der nåede kliniske forsøg har hidtil vist nogen forbedringer for patienten2.
Da in vitro-modeller ikke nøjagtigt kan reproducere alle hjerneinteraktioner og patofysiologiske mekanismer af slagtilfælde, er dyremodeller afgørende for præklinisk slagtilfældeforskning. Det er imidlertid ikke muligt at efterligne alle aspekter af human iskæmisk slagtilfælde i en enkelt dyremodel, da iskæmisk slagtilfælde er en meget kompleks og heterogen sygdom. Af denne grund er der udviklet forskellige iskæmiske slagtilfældemodeller over tid i forskellige arter. Fotothrombose af cerebral arterioles eller permanent distal okklusion af den midterste cerebral arterie (MCA) er almindeligt anvendte modeller, der fremkalder små og lokalt definerede læsioner i neocortex3,4. Udover dem, den mest almindeligt anvendte slagtilfælde model er sandsynligvis den såkaldte "glødetråd model", hvor en forbigående okklusion af MCA er opnået. Denne model består af en forbigående introduktion af en sutur glødetråd til oprindelsen af MCA, hvilket fører til en brat reduktion af cerebral blodgennemstrømning og den efterfølgende store infarkt af subkortikale og kortikale hjerneområder5. Selvom de fleste slagtilfælde modeller efterligneR MCA okklusioner 6, "glødetråd model" giver mulighed for præcis afgrænsning af den iskæmiske tid. Reperfusion ved fjernelse af glødetråd efterligner det menneskelige kliniske scenario med cerebral blodgennemstrømning restaurering efter spontane eller terapeutiske (rtPA eller mekanisk trombektomi) blodprop lysis. Til dato er forskellige ændringer af denne "glødetrådsmodel" blevet beskrevet. I den mest almindelige tilgang, først beskrevet af Longa et al. i 19895indføres en siliciumbelagt glødetråd via den fælles halspulsåre (CCA) til oprindelsen af MCA7. Selv om det er en meget anvendt tilgang, denne model tillader ikke fuldstændig restaurering af blodgennemstrømningen under reperfusion, som CCA er permanent ligated efter fjernelse af glødetråd.
I løbet af det seneste årti har et stigende antal forskergrupper været interesseret i at modellere slagtilfælde hos mus ved hjælp af denne "glødetrådsmodel." Imidlertid er den betydelige variation i denne model og den manglende standardisering af procedurerne nogle af årsagerne til den høje variation og dårlige reproducerbarhed af de eksperimentelle resultater og videnskabelige resultater, der hidtil er rapporteret2,8. En potentiel årsag til den nuværende "replikationskrise", der henviser til den lave reproducerbarhed blandt forskningslaboratorier, er de ikke-sammenlignelige slaginfarktmængder mellem forskningsgrupper, der anvender den samme eksperimentelle metode9. Faktisk, efter at have gennemført den første prækliniske randomiserede kontrollerede multicenterforsøgsundersøgelse10, var vi i stand til at bekræfte, at manglen på tilstrækkelig standardisering af denne eksperimentelle slagtilfældemodel og de efterfølgende resultatparametre var hovedårsagerne til svigt af reproducerbarhed i prækliniske undersøgelser mellem uafhængige laboratorier11 . Disse drastiske forskelle i de resulterende infarktstørrelser udgør på trods af brug af den samme slagmodel med rette ikke kun en trussel mod bekræftende forskning, men også for videnskabelige samarbejder på grund af manglen på robuste og reproducerbare modeller.
I lyset af disse udfordringer havde vi til formål at udvikle og detaljeret beskrive proceduren for en standardiseret forbigående MCAo-model, som anvendes til forskningsindsatsen i forskningskonsortiet "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/). Dette konsortium har til formål at forstå de hjerneimmune interaktioner, der ligger til grund for de mekanistiske principper for slagtilfældegendannelse. Derudover præsenteres histologiske og relaterede funktionelle metoder til analyse af slagtilfælde. Alle metoder er baseret på etablerede standarddriftsprocedurer, der anvendes i alle forskningslaboratorier i ImmunoStroke konsortiet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De forsøg, der blev rapporteret i denne video, blev udført i kølvandet på de nationale retningslinjer for brug af forsøgsdyr, og protokollerne blev godkendt af de tyske regeringsudvalg (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland). Ti uger gamle han-mus til C57Bl/6J blev anvendt og anbragt under kontrolleret temperatur (22 ± 2 °C), med en 12 timers lys mørk cyklusperiode og adgang til pelleteret mad og vand ad libitum.
1. Udarbejdelse af materiale og instrumenter
- Tilslut varmetæppet for at opretholde temperaturen i operationsområdet og musens kropstemperatur under anæstesi ved 37 °C.
- Autoklave saks og sammenkrøkker, forberede 70% ethanol opløsning og holde tilgængelige dexpanthenol øje salve, flere stykker bomuld, og 5-0 belagt flettet polyester sutur klar til brug. Forbered en 1 mL sprøjte med 0,9% saltvandsopløsning (uden nål) for at holde dyrets snitsted hydreret. Forbered anæstesi gas (100% O2 + isoflurane).
- Klargør en holder til laser Doppler-sonden ved at skære spidsen af en 10 μL pipetspids (3-5 mm længde).
BEMÆRK: Alle instrumenter steriliseres ved hjælp af en varm perle sterilisator. Overflader desinficeres også før og efter operationen med en mikrobiel desinfektionsmiddelspray. Før operationen desinficeres områderne omkring musenes hoved og bryst med en sårdesinficeringsspray.
2. Forberedelse af laser Doppler
- Indsprøjt smertestillende midler til musen 30 min før operationen (4 mg/kg Carprofen og 0,1 mg/kg Buprenorphin, intraperitoneally).
- Bedøve musen ved at placere den i induktionskammeret med en isofluranestrømningshastighed på 4% indtil ophør af spontan kropsbevægelse og vibrissae.
- Placer musen i en udsat position i operationsområdet med næsen i anæstesimasken. Isofluranekoncentrationen holdes ved 4% i endnu et minut, og reducer den derefter og hold den på 2%.
- Indstil den tilhørende feedbackstyrede varmepude til vedligeholdelse af musens kropstemperatur ved 37 °C, og indsæt forsigtigt rektalsonden for at overvåge temperaturen under de kirurgiske procedurer.
- Påfør dexpanthenol øjensalve på begge øjne.
- Desinficer hud og hår omkring venstre øje og øre med 70% ethanol.
- Skær hovedbunden mellem venstre øre og øjet (1 cm lang) for at udsætte kraniebenet.
- Skær og pensioner den tidsmæssige muskel for at visualisere MCA under kraniet.
- Fix med lim den ydre del af spidsen holder laser Doppler sonde / fiber på toppen af venstre MCA med lim. Lim derefter huden for at lukke såret omkring spidsholderen. Påfør 2-3 dråber hærde lim for at fremskynde processen. Sørg for, at laseren Doppler fiber ikke er limet og kan nemt fjernes fra spidsen indehaveren til enhver tid.
3. Forbigående MCAo model (okklusion)
- Drej musen i liggende stilling. Sæt snuden i anæstesi kegle og fastsætte poterne med tape.
- Desinficer huden og håret omkring brystet og lav et 2 cm langt midterlinje snit i nakken.
- Brug sammentrækninger til at trække huden og de submandibulære kirtler fra hinanden. Brug retraktorer til at holde sternomastoid muskel, udsætte det kirurgiske felt og finde den venstre fælles halspulsåren (CCA). Dissekere CCA fri for bindevæv og omgivende nerver (uden at skade vagal nerve) og udføre en forbigående ligation før bifurcation.
- Dissekere den ydre halspulsåren (ECA) og binde en permanent knude på den mest distale synlige del. Placer en anden sutur under REVISIONSRETTEN, tæt på bifurcation, og forberede en løs knude, der skal anvendes senere.
- Dissekere den indre halspulsåre (ICA) og placere en mikrovaskulær klip på det, 5 mm over bifurcation. Sørg for ikke at beskadige vagalnerven.
- Skær et lille hul i Revisionsretten mellem de stramme og løse ligationer; pas på ikke at skære hele Revisionsretten over.
- Indfør glødetråden, og fremrykke den mod CCA. Stram den løse ligation i Revisionsretten omkring lumen for kort at fastgøre glødetråden i denne position og undgå blødning, når du fjerner det mikrovaskulære klip.
- Fjern det mikrovaskulære klip, og indsæt glødetråden gennem ICA' en, indtil MCA'ens oprindelse er nået, ved at detektere en skarp reduktion (>80 %) i hjerneblodgennemstrømningen målt ved laseren Doppler. Fastgør glødetråden i denne position ved yderligere at stramme knuden omkring Revisionsretten.
BEMÆRK: Når glødetråden går i den rigtige retning, går den glat, og der skal ikke observeres modstand. - Optag laser Doppler-værdier før og efter indsættelse af glødetråd.
- Fjern retraktoren og flyt sternomastoid muskel og submandibulære kirtler, før suturing såret. Fjern laser dopplersonden, og læg dyret i et bjærgningskammer ved 37 °C i 1 time (indtil glødetråden fjernes).
4. Forbigående MCAo model (Reperfusion)
- Bedøve musen ved at placere den i induktionskammeret med en isofluranestrømningshastighed på 4% indtil ophør af spontan kropsbevægelse og vibrissae.
- Påfør dexpanthenol øjensalve på begge øjne.
- Placer musen i en udsat position i operationsområdet med snuden i anæstesimasken. Isofluranekoncentrationen holdes ved 4% i endnu et minut, og reducer den derefter og hold den på 2%. Fix dyrets poter med tape.
- Sæt laser Doppler sonden ind i sondeholderen.
- Fjern sår sutur, bruge kraften til at trække huden og de submandibulære kirtler fra hinanden. Brug retraktorer til forsigtigt at trække sternomastoid muskel og udsætte det kirurgiske felt.
- Løsn ECA suturen, der strammer glødetråden, og træk forsigtigt glødetråden. Undgå at beskadige glødetrådens silikonegummibelægning under fjernelsen.
- Tæt binde ECA sutur.
- Bekræft stigningen i hjerneblodgennemstrømningen i laser Doppler-enheden (>80% af den oprindelige værdi før reperfusion).
- Optag laser Doppler værdier før og efter fjernelse af glødetråd.
- Åbn den forbigående ligation før bifurcation fra CCA.
- Fjern retraktoren, og flyt sternomastoid muskel og submandibulære kirtler, før suturing såret. Anbring dyret i et bjærgningskammer ved 37 °C i 1 time for at komme sig efter bedøvelse.
- Efter genopretning skal musene returneres til deres bure i et temperaturstyret rum.
- Pas på dyrene ved at tilføje våde madpiller og hydrogel i små petriskåle på burgulvet indtil dag 3 efter operationen.
- Indsprøjt analgesi hver 12. time i 3 d efter operationen (4 mg/kg Carprofen og 0,1 mg/kg Buprenorphin).
5. Sham operation
- Udfør alle procedurer som beskrevet ovenfor, herunder ligationen af arterierne og indførelsen af glødetråden (trin 1-3.7).
- Fjern glødetråden umiddelbart efter dens indsættelse. Læg derefter dyret i genopretningskammeret i 1 time.
- Placer dyret i operationsområdet igen, og fjern den forbigående ligation af CCA for at sikre fuldstændig cerebral blodgennemstrømning restaurering.
- Sy såret, og læg dyret i et bjærgningskammer ved 37 °C i 1 time for at komme sig efter bedøvelse. Efter genopretning skal musene returneres til deres bure i et temperaturstyret rum.
- Pas på dyrene ved at tilføje våde madpiller og hydrogel i små petriskåle på burgulvet indtil dag 3 efter operationen.
- Indsprøjt analgesi hver 12. time i 3 d efter operationen (4 mg/kg Carprofen og 0,1 mg/kg Buprenorphin).
6. Neuroscore
- Udfør Neuroscore altid på samme tid af dagen, og brug kirurgisk tøj til at opretholde en "neutral lugt" mellem de enkelte kirurger.
- Lad musene hvile i 30 minutter i rummet med et "åbent" bur før testen.
- Overhold hvert element i tabel 1 og tabel 2 for 30 s.
7. Intracardiac perfusion
- Forbered en 20 mL sprøjte indeholdende fosfat-buffered saltvand (PBS)-heparin (2 U/mL) og placere den 1 m over bænken for at lette tyngdekraften drevet perfusion. (VALGFRIT: Udfør intracardiac perfusion med 4% paraformaldehyd (PFA) ved hjælp af en 20 mL sprøjte, der indeholder 4% PFA i PBS, pH 7.4).
- Intrperitoneally 100 μL ketamin og xylazin (henholdsvis 120 og 16 mg/kg kropsvægt). Vent 5 min og bekræft ophør af spontan kropsbevægelse og vibrissae.
- Fastgør dyret i en liggende position, og desinficer abdominalkropsoverfladen med 70% ethanol.
- Lav et 3 cm langt snit ind i maven; skære mellemgulvet, ribbenene og brystbenet for at visualisere hjertet helt.
- Lav et lille snit i højre atrium, og indsæt perfusion kanylen i venstre ventrikel.
- Gennemforbrug med 20 mL PBS-heparin.
- Efter perfusion halshugge dyret og fjern hjernen.
- Frys hjernen på pulveriseret tøris og opbevar ved -80 °C, indtil den er yderligere brugt.
8. Infarct volumetry
- Til kryosektion skal du bruge en kryostat til at skære hjernen i 20-μm-tykke sektioner hver 400 μm. Placer sektionerne på dias, og gem diasene ved −80 °C, indtil de bruges.
- Farvning af Cresyl violet (CV)
- Farvningsopløsningen forberedes ved omrøring og opvarmning (60 °C) 0,5 g CV-acetat i 500 ml H2O, indtil krystallerne er opløst. Når opløsningen er afkølet, skal du opbevare den i en mørk flaske. Genopvarm til 60 °C, og filtrer før hver brug.
- Lad rutsjebanerne tørre ved stuetemperatur i 30 min. Fordyb dem i 95% ethanol i 15 min, i 70% ethanol i 1 min, og derefter i 50% ethanol i 1 min.
- Fordyb rutsjebanerne i destilleret vand i 2 min; genopfriske det destillerede vand og placere rutsjebanerne i vandet i 1 minut. Derefter nedsænkes diasene i den forvarmede farvningsopløsning i 10 min ved 60 °C. Vask rutsjebanerne to gange i destilleret vand i 1 minut.
- Fordyb rutsjebanerne i 95% ethanol i 2 min. Læg dem i 100% ethanol i 5 min; 100% ethanol og placere dias igen i ethanol i 2 min. Derefter dækker du diasene med et monteringsmedium.
- Analyse (Figur 4C)
- Scan dias og analysere den indirekte infarkt volumen ved Swanson metode12 at korrigere for ødem ved hjælp af følgende ligning:
(Iskæmisk område) = (iskæmisk region)-((ipsilateral halvkugle)-(kontralateral halvkugle))
- Scan dias og analysere den indirekte infarkt volumen ved Swanson metode12 at korrigere for ødem ved hjælp af følgende ligning:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den model, der er beskrevet her, er en ændring af den almindeligt anvendte "glødetråd" slagtilfælde model, som består i at indføre en silicium-belagt glødetråd gennem Revisionsretten til forbigående blokere oprindelsen af MCA (Figur 1). Efter fjernelse af glødetråden ophører kun blodgennemstrømningen i Revisionsretten permanent, hvilket muliggør fuldstændig recanalisering af CCA og ICA. Dette giver mulighed for en passende reperfusion af hjernen (Figur 2), svarende til den situation, der observeres efter vellykket farmakologisk trombolyse eller mekanisk trombektomi hos menneskelige patienter. Desuden beskriver dette arbejde også en metode til måling af cerebral blodgennemstrømning under både okklusion og reperfusion procedurer ved fastsættelse af en kanyle forbundet til laser Doppler sonde på kraniet over MCA område.
Den samlede dødelighed af den kirurgiske procedure er <5%, når den udføres af en uddannet kirurg. På tidlige tidspunkter efter MCAo, dyr generelt præsentere alvorlige posturale og bevægelse underskud, generel svaghed, og tab i kropsvægt13. Disse alvorlige underskud er forbigående, og dyrene viser forbedret aktivitet efter ca. 1 uge; derfor er underskuddene mere specifikke for fokale neurologiske symptomer.
Adfærdsmæssige underskud efter MCA okklusion blev vurderet af den sammensatte Neuroscore14; generelle og fokale underskud blev målt 24 timer og 3 d efter operationen. Den generelle Neuroscore integrerer 5 elementer (tabel 1), herunder evaluering af pels, ører, øjne, kropsholdning og spontan aktivitet med en maksimal score på 18. Omdrejningspunktet Neuroscore består af 7 elementer (tabel 2), herunder evaluering af kroppens symmetri, gangart, klatring, kredser adfærd, forelimb symmetri, obligatorisk cykling, og whiskers svar, med en maksimal score på 28. Den sammensatte skala varierer fra 0 (ingen underskud) til 46 (alvorlige nedskrivninger). Stroke dyr præsenteret en betydelig ændring i komposit og brændpunkt Neuroscore, men ikke i den generelle Neuroscore, sammenlignet med falske dyr (Figur 3).
Infarkt volumetry blev også udført ved hjælp af Cresyl Violet farvning af koronar seriel hjerne sektioner 24 timer efter slagtilfælde induktion. Infarktvolumen gennemsnit var 61,69 mm3, svarende til 48% af den berørte hjernehalvdel (Figur 4). Når det udføres af en uddannet kirurg, den samlede variation af denne slagtilfælde model er lav, med en variationskoefficient på <6%. Læsionsområdet omfatter somatosensoriske og motoriske cortex samt subkortikale strukturer som striatum (figur 4).
Figur 1: Ordning for adgang og intraluminal MCA-okklusion. Glødetråden (stiplede linje) indsættes mellem de proksimale og distale suturknuder i Revisionsretten og avancerede langs ICA, indtil den når MCA'ens oprindelse (se indsat). Når Revisionsretten er på plads, er den ligated med en sutur til at fastsætte glødetråden. Forkortelser: ACA = forreste cerebral arterie; BA = basilar arterie; CCA = almindelig halspulsåre; ECA = ekstern halspulsåre; ICA = indre halspulsåre; MCA = midterste cerebral arterie; PCA = posterior kommunikere arterie; PTG = pterygopalatine arterie. Dette tal er blevet ændret fra Jackman etal. 15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Blodgennemstrømningen under okklusion og reperfusion. Blodgennemstrømningen registreres før og efter indsættelse af glødetråd og før og efter fjernelse af glødetråd. En reduktion i blodgennemstrømningen blev observeret under okklusion og genoprettelse af blodgennemstrømningen under reperfusion. Hver farve repræsenterer et dyr. Forkortelser: MCA = midt cerebral arterie; CBF = cerebral blodgennemstrømning; A.U. = vilkårlige enheder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Neuroscore for funktionelle underskud efter tMCAo. (A) I alt, (B) brændpunkt, og (C)generelle Neuroscore før og 24 timer og 3 d efter tMCAo. Åbne bjælker: sham; Sorte bjælker: tMCAo. n=10 pr. gruppe. * p < 0,05. Forkortelser: tMCAo = forbigående midterste cerebral arterie okklusion; BL = før tMCAo. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Volumetrisk infarktanalyse og infarktresultat 24 timer efter tMCAo. (A) Repræsentative cresyl violet-farvede koronar hjerne sektioner hver 400 μm ved 24 timer efter tMCAo. Stiplede linjer afgrænser læsionsområdet. (B) Analyse af infarktvolumen på 10 hjerner (hver prik, der repræsenterer en enkelt hjerne) 24 timer efter tMCAo. Den vandrette røde linje repræsenterer middelværdien (61,69 mm3), fejllinjer angiver standardafvigelse (3,78 mm3). (C) Repræsentativt billede for infarktvolumenberegning fra en cresylviolet koronarsektion. Blå = Kontralateral halvkugle; Rød = Ipsilateral halvkugle; Bleg stribet område = iskæmisk region. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Tidspunkt for scoring | score | ||
| Generel neuroscore | Hår | 0. Hår pænt og rent | |
| 1. Lokaliseret piloerection og beskidt hår i 2 kropsdele (næse og øjne) | |||
| 2. Piloerection og snavset hår i >2 kropsdele | |||
| Ører (mus på en åben bænk top) | 0. Normal (ører strækkes sideværts og bag, de reagerer ved at rette op efter støj) | ||
| 1. Strakt sideværts, men ikke bagud (en eller begge), reagerer de på støj | |||
| 2. Samme som 1. INGEN reaktion på støj. | |||
| Øjne (mus på OBT) | 0. Åbn, rengør og følg hurtigt det omgivende miljø | ||
| 1. Åben og karakteriseret ved vandig slim. Langsomt følge det omgivende miljø | |||
| 2. Åben og præget af mørkt slim | |||
| 3. Ellipsoidal formet og karakteriseret ved mørkt slim | |||
| 4. Lukket | |||
| Kropsholdning (placer musen på håndfladen og sving forsigtigt) | 0. Musen står i opretstående stilling med ryggen parallelt med håndfladen. Under gyngen står den hurtigt. | ||
| 1. Musen står pukkelrygget. Under gyngen flader den kroppen for at få stabilitet. | |||
| 2. Hovedet eller en del af bagagerummet ligger på håndfladen. | |||
| 3. Musen ligger på den ene side, næppe i stand til at genvinde den opretstående stilling. | |||
| 4. Musen ligger i en udsat position, ikke i stand til at genvinde den opretstående stilling. | |||
| Spontaneos aktivitet (mus på OBT) | 0.Musen er opmærksom og udforsker aktivt. | ||
| 1.Musen synes vågen, men det er roligt og trægt. | |||
| 2.Musen udforsker intermitterende og trægt. | |||
| 3.Musen er somnolent og følelsesløs, få bevægelser på stedet. | |||
| 4.No spontane bevægelser | |||
| Samlet score for generel scoring | |||
| (normal=0 max=18) | |||
Tabel 1: Generel neuroscore. Dyr modtog mellem 0 og 4 point, afhængigt af sværhedsgraden, for hvert af de fem generelle målte underskud. Scorerne på de forskellige områder tilføjes derefter for at give en samlet generel score fra 0 til 18. Denne tabel er blevet ændret fra Clark et al.14 . Forkortelse: OBT = åben bordplade.
| Tidspunkt for scoring | score | ||
| Focal Neuroscore | Kropssymmetri (mus på OBT, observere næse-hale linje) | 0. Normal (Krop: normal kropsholdning, bagagerum forhøjet fra bænken, med for og hindlimbs hælder under kroppen. Hale: lige) | |
| 1. Let asymmetri (Krop: læner sig på den ene side med for og hindlimbs hælder under kroppen. Hale: let bøjet) | |||
| 2. Moderat asymmetri (Krop: læner sig på den ene side med for og hindlimbs strakt ud. Hale: let bøjet) | |||
| 3. Fremtrædende asymmetri (Krop: bøjet, på den ene side ligger på OBT. Hale: bøjet) | |||
| 4. Ekstrem asymmetri (Krop: meget bøjet, på den ene side ligger konstant på OBT. Hale: meget bøjet) | |||
| Gangart (mus på OBT. Observeret uforstyrret) | 0. Normal (gangart er fleksibel, symmetrisk og hurtig) | ||
| 1. Stiv, ufleksibel (pukkelrygget gåtur, langsommere end normal mus) | |||
| 2. Limping, med asymmetriske bevægelser | |||
| 3. Skælvende, drivende, faldende | |||
| 4. Går ikke spontant (når stimuleret ved forsigtigt at skubbe musen går ikke længere end 3 trin) | |||
| Klatring (mus på en 45o overflade. Placer musen i midten af gribefladen) | 0. Normal (mus klatrer hurtigt) | ||
| 1. Klatrer med belastning, lemmer svaghed til stede | |||
| 2. Holder fast i hældning, glider eller klatrer ikke | |||
| 3. Glider ned ad skråning, mislykket indsats for at forhindre mislykkes | |||
| 4. Slides straks, ingen indsats for at forhindre mislykkes | |||
| Cirkling adfærd (mus på OBT, gratis observation) | 0. Fraværende cirkling adfærd | ||
| 1. Overvejende one-side sving | |||
| 2. Cirkler til den ene side, men ikke konstant | |||
| 3. Cirkler konstant til den ene side | |||
| 4. Drejning, svajende eller ingen bevægelse | |||
| Forelimb symmetri (mus suspenderet af halen) | 0. Normal | ||
| 1. Let asymmetri: mild bøjning af kontralateral forben | |||
| 2. Markeret asymmetri: markant bøjning af kontralaterale lemmer, kroppen bøjer lidt på den ipsilaterale side | |||
| 3. Fremtrædende asymmetri: kontralateral forben klæber til bagagerummet | |||
| 4. Let asymmetri, ingen krops-/lemmer bevægelse | |||
| Obligatorisk cirkling (forben på bænken, hindlimbs suspenderet af halen: det afslører tilstedeværelsen af den kontralaterale lemmer parese) | 0. Fraværende. Normal forlængelse af begge forben | ||
| 1. Tendens til at dreje til den ene side (musen strækker sig begge forben, men begynder at vende sig helst til den ene side) | |||
| 2. Cirkler til den ene side (musen vender mod den ene side med en langsommere bevægelse i forhold til raske mus) | |||
| 3. Drejer til den ene side trægt (musen vender sig mod den ene side ikke at udføre en komplet cirkel) | |||
| 4. Går ikke videre (den forreste del af bagagerummet ligger på bænken, langsomme og korte bevægelser) | |||
| Whisker respons (mus på OBT) | 0. Normal | ||
| 1. Let asymmetri (musen trækker sig langsomt, når den stimuleres på den kontralaterale side) | |||
| 2. Fremtrædende asymmetri (intet svar, når det stimuleres til den kontralaterale side) | |||
| 3. Fraværende respons kontralateralt, langsom respons, når stimuleret ipsilateralt | |||
| 4. Manglende reaktion bilateralt | |||
| Samlet score for brændpunkter | |||
| (normal=0 max=28) | |||
Tabel 2: Focal Neuroscore. Dyr modtog mellem 0 og 4 point afhængigt af sværhedsgraden for hvert af de syv generelle målte underskud. Scorerne på de forskellige områder tilføjes derefter for at give en samlet brændscore fra 0 til 28. Denne tabel er blevet ændret fra Clark et al.14 . Forkortelse: OBT = åben bordplade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende protokol beskriver en eksperimentel slagtilfælde model baseret på konsensus aftale af en tysk multicenter forskningskonsortium ("ImmunoStroke") at etablere en standardiseret forbigående MCAo model. Den forbigående MCAo-model, der er etableret ved at indføre en siliciumbelagt glødetråd gennem Revisionsretten til MCA's oprindelse, er en af de mest anvendte slagtilfældemodeller for at opnå arteriel reperfusion efter en afgrænset okklusionsperiode. Derfor kan denne procedure betragtes som en translationelt relevant stregmodel.
Den "glødetrådsmodel", der præsenteres i videoen, har nogle fordele sammenlignet med andre tidligere beskrevne slagmodeller, såsom ikke at kræve kraniotomi og opnå fuldstændig reperfusion af forbigående det okkluderede fartøj. Men kompleksiteten af det kirurgiske indgreb kan betragtes som en begrænsning, da det omfatter invasiv kirurgi og en præcis manipulation af de forskellige arterier i nærheden af luftrøret og vagalnerven. Dyrets lange eksponering for bedøvelse kan også være en kritisk faktor at overveje, da virkningen af bedøvelsesmidler på neuroprotektion og slagtilfælderesultat allerede er veldokumenteret16. Endelig, på trods af kompleksiteten af denne kirurgiske procedure, kan det afsluttes i ca. 20 min, når det udføres af en uddannet kirurg.
I modsætning til den tidligere beskrevne "glødetråd" slagtilfælde protokoller17, den metode, der er beskrevet her også tillader måling af cerebral blodgennemstrømning under okklusion og reperfusion faser. Overvågning af blodgennemstrømningen under reperfusion kan være en vigtig parameter for at forhindre reperfusionsskader på slagtilfælde18, som er kendt for at forårsage skadelige konsekvenser hos patienter, der gennemgår farmakologiske eller endovaskulære indgreb til recanalisering af de tromboserede kar. På trods af uoverensstemmelserne mellem konsekvenserne af cerebral blodgennemstrømning restaurering efter MCAo19, variabiliteten af blodgennemstrømningen restaurering efter slagtilfælde kan påvirke patofysiologiske og biokemiske begivenheder i hjernen, samt infarkt volumen og neurologiske underskud af slagtilfælde mus20. Derfor er fuldstændig restaurering af blodgennemstrømningen og dens registrering i denne model krav for at sikre reproducerbare infarkte blandt mus, især i translationelle slagtilfældestudier.
Den samlede dødelighed under den kirurgiske procedure er mindre end 5% og er primært forårsaget af bedøvelse komplikationer, blødninger, eller offer på grund af foruddefinerede udelukkelseskriterier. Denne slagtilfælde model præsenterer dog en moderat dødelighed inden for de første 24-48 timer efter slagtilfælde induktion, hvilket kan øge antallet af dyr, der er nødvendige pr forsøg for at opnå en tilstrækkelig kohorte af slagtilfælde mus. Med hensyn til infarktvolumen fremkalder denne model store infarkter med læsioner, der omfatter op til 50% af halvkuglen. Det producerer også hjerneødem, der påvirker forskellige hjerneområder, herunder kortikale og subkortikale regioner.
For at opnå en lav variation og høj reproducerbarhed af slagtilfældemodellen bør der tages hensyn til flere udelukkelseskriterier, herunder: 1) driftstid > 20 min; 2) >20% af blodgennemstrømningen, når CCA er ligated (trin 3.3); 3) reduktion af blodgennemstrømningen under okklusion < 80% af den oprindelige præ-okklusionsværdi; og 4) blodgennemstrømningen stiger 10 min efter reperfusionshastigheden < 80% i forhold til værdien før reperfusion. For en erfaren og uddannet kirurg udelukkes ingen dyr på grund af operationstidspunktet. Men, 10-15% af dyrene viser en 20% reduktion i blodgennemstrømningen ved CCA ligation, og 5-10% viser ingen tilstrækkelig reduktion eller stigning i blodgennemstrømningen under okklusion eller reperfusion, henholdsvis. Derfor er succesraten efter udelukkelse af dyr baseret på disse kriterier ca. 75-85%.
Derudover undersøges dyr dagligt efter MCAo (kropsvægt, temperatur og grundlæggende fysiologisk adfærd) for at kontrollere for sygdom, smerte eller ubehagsadfærd. Ud over denne generelle pleje er der udviklet flere tests til specifik adfærdsanalyse efter fokal hjerne iskæmi, på trods af alle kendte tests for at evaluere sensorimotorisk dysfunktion, såsom Rotarod-testen21, Sticky label test22, Corner test23eller cylindertesten24. Her blev dyr udvalgt til etablering af denne slagtilfældemodel evalueret for fokale og generelle underskud, da glødetrådsmodellen også fremkalder cytokinsygeadfærd uafhængigt af fokale (sensoriske eller motoriske) underskud25. Samlet set er den "glødetråd" slagtilfælde model beskrevet her er en værdifuld model for grundlæggende og translationel slagtilfælde forskning. Denne model foreslås som en standardiseret slagmodel, der skal bruges til at harmonisere slagtilfælde modeller på tværs af laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker alle vores samarbejdspartnere i ImmunoStroke Consortia (FOR 2879, Fra immunceller til slagtilfælde opsving) for forslag og diskussioner. Dette arbejde blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands Excellence Strategy inden for rammerne af München Cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) og under tilskuddene LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 og LL-112/1-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
References
- Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M.
- O'Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Zhang, Z., et al. A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 17 (2), 123-135 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- McNutt, M.
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2084-2097 (2017).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Jackman, K., Kunz, A., Iadecola, C. Modeling focal cerebral ischemia in vivo. Methods in Molecular Biology. 793, 195-209 (2011).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4038 (2012).
- Rha, J. H., Saver, J. L. The impact of recanalization on ischemic stroke outcome: a meta-analysis. Stroke. 38 (3), 967-973 (2007).
- Liu, J., et al. Transient filament occlusion of the middle cerebral artery in rats: does the reperfusion method matter 24 hours after perfusion. BMC Neuroscience. 13, 154 (2012).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 259 (2), 211 (1968).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4 (10), 1560-1564 (2009).
- Zhang, L., et al. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 207-214 (2002).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
- Roth, S., Yang, J., Cramer, J., Malik, R., Liesz, A. Detection of cytokine-induced sickness behavior after ischemic stroke by an optimized behavioral assessment battery. Brain, Behavior, and Immunity. 91, 668-672 (2021).
